DE60033243T2

DE60033243T2 - Teststreife für einen amperometrischen biosensor

Info

Publication number: DE60033243T2
Application number: DE60033243T
Authority: DE
Inventors: D. Christopher Carmel WILSEY; W. David Carmel BURKE
Original assignee: Roche Diagnostics Operations Inc
Current assignee: Roche Diagnostics Operations Inc
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 2000-12-14
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2020-12-15
Also published as: EP1244809A2; AU2579901A; EP1244809B1; CA2393503C; US6541216B1; DE60033243D1; JP2007147638A; JP2003518249A; ATE353106T1; WO2001046457A2; WO2001046457A3; CA2393503A1; ES2279776T3

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft einen amperometrischen Biosensor, der bei der Bestimmung von Gehalten an 3-Hydroxybuttersäure in Fluiden verwendet wird.
Hintergrund und Kurzdarstellung der Erfindung
3-Hydroxybuttersäure (nachstehend „3-HBA") wird durch unvollständigen Fettsäuremetabolismus in der Leber unter Bedingungen erzeugt, die mit der beeinträchtigten Nutzung oder ungenügenden Zufuhr von Kohlenhydraten verbunden sind. Immer wenn erhöhte Mengen an Fetten metabolisiert werden, wie wenn die Kohlenhydrataufnahme eingeschränkt ist, kann die Konzentration von Ketonkörpern, wie 3-HBA, Aceton und Acetoessigsäure, zunehmen. Wenn Ketonkörper im Blut in einer übermäßigen Menge vorhanden sind, wird der Zustand als Ketose bezeichnet.
Diabetes mellitus ist eine Erkrankung, die mit Ketose verknüpft ist. Diabetes mellitus ist eine Störung des Glucosemetabolismus. Bei Insulinmangel-Diabetes ist der Glucosemetabolismus ausreichend beeinträchtigt, so dass Fettsäuren genutzt werden, um die Energiebedürfnisse des Körpers zu erfüllen. Wenn übermäßige Mengen an Fettsäuren metabolisiert werden, sammeln sich Ketonkörper im Blut, d. h. Ketose, und werden im Urin ausgeschieden, d. h. Ketonurie. Außerdem werden die Ketonkörper aus dem Körper in Kombination mit normalen basischen Ionen ausgeschieden, wodurch die Leistungsfähigkeit des Körpers, Kohlendioxid zu kombinieren, verringert und systemische Azidose, d. h. erhöhte Azidität des Bluts, verursacht wird. Der Begriff Ketoazidose bezeichnet die kombinierten Zustände von Ketose und Azidose, die mit Diabetes verknüpft sind. Bei erhöhten Niveaus ist 3-HBA symptomatisch für Ketoazidose.
Der Nachweis von Ketoazidose bei einem Patienten mit Diabetes mellitus ist dahingehend günstig, dass er oft die Notwendigkeit zu einer Änderung der Insulindosierung oder anderer Behandlungsvorgehensweisen anzeigt. Ein Ansatz, um das Vorhandensein oder die Konzentration von Ketonkörpern in einer Probe zu bestimmen, war es, mit der Probe eine kolorimetrische Untersuchung durchzuführen. Beispielsweise ist es bekannt, das Vorhandensein oder die Konzentration von Ketonkörpern zu bestimmen, indem eine flüssige Probe mit einer Indikatorreagenszusammensetzung in Kontakt gebracht wird, welche beim Kontakt mit der Probe einen Farbübergang durchmacht. Siehe beispielsweise die US-Patentschriften Nrn. 4,803,158; 5,326,697; 5,510,245; und 5,190,863.
Amperometrische Untersuchungen für Ketonkörper sind auch verwendet worden. Siehe beispielsweise PCT/US98/21815, eingereicht am 16. Okt. 1998, und Batchelor et al., Amperometric Assay for the Ketone Body Hydroxybutyrate, Analytic Chimica Acta, 289–294 (1989). Diese Untersuchungen nutzen Enzyme, um die Oxidation von 3-HBA zu katalysieren, die oxidierbare Form eines Cofaktors und ein Oxidationsmittel, wie beispielsweise ein Chinon. Ebenso offenbaren Antischia et al., Anal. Chim. Acta, 345, 17–28, 1997 ein amperometrisches Verfahren zur Bestimmung von 3-HBA.
Biosensor und Verfahren der vorliegenden Erfindung sind in den beigefügten Ansprüchen definiert. Der Biosensorteststreifen dieser Erfindung ist mit im Handel erhältlichen amperometrischen Sensoren zur Glucosemessung kompatibel. Der Teststreifen umfasst ein Reagens, das ein Film eines getrockneten Reagens ist, das derart gegenüber der Probe reaktiv ist, dass ein elektrisches Ausgangssignal generiert wird, das den Gehalt an 3-Hydroxybuttersäure (nachstehend „3-HBA") in der Probe angibt. Das Reagens umfasst ein Hexacyanoferrat(III)salz, eine katalytische Menge eines ersten Enzyms, die wirksam ist, um die Oxidation von 3-HBA in der Probe zu katalysieren, einen Mediator, der dem ersten Enzym entspricht, und eine katalytische Menge eines zweiten Enzyms, das wirksam ist, um die elektrochemische Oxidation einer reduzierten Form des Cofaktors zu katalysieren, wobei das erste Enzym Hydroxybutyratdehydrogenase ist.
Der Teststreifen enthält mindestens zwei elektrisch leitende Leiterbahnen, die voneinander isoliert sind. Jede der Leiterbahnen ist so ausgelegt, dass sie in elektrischem Kontakt mit dem Reagens ist. Eine der Leiterbahnen nimmt den Elektronentransfer aus dem Reagens auf, wobei die Menge des Elektronentransfers den Gehalt an 3-HBA in der Probe anzeigt.
Es wird auch ein Verfahren zum Bestimmen von Information, die den Gehalt an 3-HBA in einer Probe anzeigt, bereitgestellt, welches mit im Handel erhältlichen amperometrischen Sensoren zur Glucosemessung kompatibel ist. Das Verfahren umfasst das Umsetzen der Probe mit dem vorstehend definierten Reagens in dem Teststreifen. Das Reagens generiert ein elektrisches Signal, das den Gehalt an 3-HBA in der Probe anzeigt. Das elektrische Signal wird dann gemessen, und der Gehalt an 3-HBA in der Probe wird unter Verwendung der Information, die das gemessene elektrische Signal umfasst, bestimmt.
Zusätzliche Merkmale und Vorteile der Erfindung werden Fachleuten bei der Erwägung der folgenden ausführlichen Beschreibung und bevorzugten Ausführungsformen, welche den besten Modus zur Durchführung der Erfindung, wie er derzeit wahrgenommen wird, veranschaulichen, offensichtlich.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine auseinander gezogene perspektivische Ansicht eines Teststreifens, die den Streifen zeigt, der ein erstes isolierendes Substrat, elektrisch leitende Leiterbahnen, die geformt sind, dass sie auf einem ersten isolierenden Substrat liegen, ein Testreagens, das nach den Leiterbahnen ausgerichtet ist, ein zweites isolierendes Substrat, eine hydrophile Beschichtung und eine Abdeckung einschließt;
2 ist eine perspektivische Ansicht des Teststreifens aus 1;
3 ist eine Querschnittsansicht entlang der Linien 28-28 aus 2, welche die relativen Positionen von Elektroden, Reagens und hydrophilem Film zwischen den ersten und zweiten isolierenden Substraten zeigt;
4 ist eine Querschnittsansicht entlang der Linien 29-29 aus 2, welche die Abdeckung, den hydrophilen Film, die Kanten der zweiten Öffnung des zweiten Substrats und das erste isolierende Substrat, die zusammenwirken, um eine Testkammer zu definieren, und das Reagens, das in der Testkammer angebracht ist, zeigt; und
5 ist ein Diagramm, das Eichkurven für verschiedene Partien von Teststreifen zeigt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Das Gebiet der Elektrochemie basiert auf dem Phänomen, dass viele Metalle, Metallionen und konjugierte Moleküle leicht Elektronen aufnehmen und/oder abgeben. Verbindungen weisen ein Standardpotential auf, welches das Energieniveau ist, bei dem die Verbindung mit gleicher Wahrscheinlichkeit Elektronen abgibt oder aufnimmt. Ob eine Verbindung oxidiert oder reduziert wird, hängt davon ab, ob das an die Verbindung angelegte Potential größer oder kleiner als ihr Standardpotential ist. Die vorliegende Erfindung baut auf eine elektrochemische Technik, die als Amperometrie bekannt ist, welche das Anlegen eines Potentials und Sammeln der sich bewegenden Elektronen als Strom beinhaltet.
Es wurde gefunden, dass Hexacyanoferrat(III)(Ferricyanid-) salze als Mediatoren verwendet und in einen amperometrischen Biosensorteststreifen, der ein elektrisches Ausgangssignal generiert, das den Gehalt an 3-HBA in der Probe angibt, eingebracht werden können. Die Verwendung von Hexacyanoferrat(III)salzen als Mediatoren in einem Teststreifen für 3-HBA ist vorteilhaft, da der entsprechende Teststreifen mit vorhandenen amperometrischen Glucosemessgeräten kompatibel ist, was das Testen auf Ketone und Glucose in einem Messgerät ermöglicht. Der Begriff Mediator, wie er in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet wird, umfasst Oxidationsmittel, die in der Lage sind, eine elektrochemische, reversible Redoxreaktion durchzumachen. Die oxidierte Form des Mediators muss in der Lage sein, mindestens ein Elektron aus einer Reaktion aufzunehmen, an der ein Enzym, ein Analyt (oder ein Cofaktor, der aus der Analytreaktion hergestellt wird) und die oxidierte Form des Mediators beteiligt sind.
Diese Mediatoren können bei der Herstellung eines amperometrischen Biosensorteststreifens für einen Analyten, wie 3-HBA, welcher ein elektrisches Signal generiert, das den Gehalt an 3-HBA in der angewendeten Probe anzeigt, verwendet werden. Der Teststreifen ist geformt, dass er biologische Proben aufnimmt, wie Vollblut, Serum, Plasma und dergleichen. Der Teststreifen schließt ein Reagens ein, das ein Film eines getrockneten Reagens ist, welches einen Mediator, eine katalytische Menge eines ersten Enzyms, die wirksam ist, um die Oxidation von 3-HBA in der Probe zu katalysieren, einen Cofaktor, der dem ersten Enzym entspricht, und eine katalytische Menge eines zweiten Enzyms, das wirksam ist, um die elektrochemische Oxidation einer reduzierten Form des Cofaktors zu katalysieren, umfasst, wobei das erste Enzym Hydroxybutyratdehydrogenase ist.
Die Reagenszusammensetzung wird in eine Biosensorteststreifenvorrichtung eingebracht, die den Gehalt an 3-Hydroxybuttersäure (nachstehend „3-HBA") in der Probe bestimmt. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein wird angenommen, dass die Reagenszusammensetzung mit 3-HBA in einem binären Reaktionsschema reagiert. Die erste Reaktion umfasst die Oxidation von im Wesentlichen dem 3-HBA in der Probe, und die zweite Reaktion umfasst die elektrochemische Oxidation eines oder mehrerer reduzierter Reaktionsprodukte, die sich aus der ersten Reaktion ergeben. Die elektrochemische Oxidation generiert einen Strom, dessen Stärke die Menge an 3-HBA in der Blutprobe anzeigt. Die Reagenszusammensetzung umfasst den Mediator Ferricyanid, die Enzyme 3-Hydroxybutyratdehydrogenase und Diaphorase (die jeweils eine der Reaktionen katalysieren) und den Cofaktor NAD⁺. Demgemäß reagieren die 3-Hydroxybutyratdehydrogenase und Diaphorase bei einer Untersuchung auf Vorhandensein oder Konzentration von 3-HBA in einer Probe nacheinander, wie in dem folgenden Reaktionsschema gezeigt.
Das Prinzip wird ausgenutzt, dass, wenn eine Probe, die den Analyten 3-HBA enthält, zum Reagens gegeben wird, der Analyt oxidiert wird und die oxidierte Form des Cofaktors reduziert wird. Dieser Cofaktor wechselwirkt dann mit einem zweiten Enzym, und der oxidierte Mediator wird reduziert. Es wird zugelassen, dass die Reaktion einen Punkt erreicht, wo zusätzliche Zeit für die exakte Bestimmung der Analytenkonzentration nicht notwendig ist.
Nachdem die Reaktionen beendet sind, legt eine Spannungsquelle (z. B. eine Batterie) eine Potentialdifferenz zwischen einer Arbeits- und einer Gegenelektrode an. Wenn die Potentialdifferenz angelegt wird, müssen die Menge an oxidierter Form des Mediators an der Gegenelektrode und die Potentialdifferenz ausreichen, um diffusionsbegrenzte Elektrooxidation der reduzierten Form des Mediators an der Oberfläche der Arbeitselektrode zu bewirken. Ein Messgerät zum Messen von Strom misst den diffusionsbegrenzten Strom, der durch die Oxidation der reduzierten Form des Mediators an der Oberfläche der Arbeitselektrode generiert wird, wodurch der gemessene Strom mit der Konzentration von 3-HBA in der Probe korreliert wird.
Somit stellen der Teststreifen und das Verfahren, das das Reagens der vorliegenden Erfindung nutzt, dem Benutzer ein bequemes und einfaches Verfahren zum Bestimmen der Gehalte an 3-HBA im Blut bereit. Der Teststreifen und das Verfahren beseitigen im Wesentlichen die Nachteile, dass der Benutzer getrenntes Instrumentarium zum Testen auf Blutglucose und auf 3-HBA kaufen oder verwenden muss. Die Teststreifenvorrichtung ist in ähnlicher Weise wie der Teststreifen aufgebaut, der in der US-Patentschrift Nr. 5,997,817 von Crismore et al. beschrieben wird. Es ist jedoch klar, dass der Teststreifen den Biosensoren, die in den US-Patentschriften Nrn. 5,288,636 von Pollmann et al. und 5,762,770 von Pritchard et al. offenbart werden, ebenso wie einer beliebigen Zahl von im Handel erhältlichen architektonischen Umgebungen für Sensoren zur Messung von Glucose ähnlich sein kann, ohne über den Umfang der vorliegenden Offenbarung hinauszugehen.
Speziell Bezug nehmend auf die 1 und 2, schließt der Biosensorteststreifen der vorliegenden Erfindung ein erstes isolierendes Substrat 1, ein zweites isolierendes Substrat 7, elektrisch leitende Leiterbahnen 5, 6, die zwischen den Substraten 1, 7 gelegen sind, ein Testreagens 12, einen im Allgemeinen hydrophilen Film 25 in allgemeiner Ausrichtung nach dem Testreagens 12 und eine Abdeckung 13, die über dem Film 25 angeordnet ist, ein. Reagens 12, wie es hier nachstehend erläutert wird, umfasst die Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung. Außerdem wird der Teststreifen aus Rollen von Material hergestellt. Somit erfordert die Auswahl von Materialien für den Aufbau der Teststreifen die Verwendung von Materialien, die ausreichend flexibel für die Rollenverarbeitung sind, aber die immer noch starr genug sind, so dass sie eine anwendbare Starrheit für den fertig gestellten Teststreifen ergeben.
Das erste Substrat 1 schließt eine erste Oberfläche 22 ein, die die leitfähigen Leiterbahnen 5, 6 und eine gegenüberliegende zweite Oberfläche 23 trägt. Siehe 1. Das erste Substrat 22 schließt ferner eine Einbuchtung 2, eine Kerbe 3 und ein Lüftungsloch 4, das sich zwischen den ersten und zweiten Oberflächen 22, 23 erstreckt, ein. Das Substrat 1 kann aus einer weiten Vielzahl isolierender Materialien aufgebaut sein. Nicht begrenzende Beispiele für isolierende Materialien, die wünschenswerte elektrische und strukturelle Eigenschaften bereitstellen, schließen Vinylpolymere, Polyimide, Polyester und Styrolharze ein. Das erste isolierende Substrat 1 ist 7 mil dicker MELINEX^® 329 Kunststoff, ein Polyester, der von DuPont (3411 Silverside Road, PO Box 15391, Wilmington, Delaware 19850) erhältlich ist.
Wie in 1 gezeigt, werden die elektrisch leitenden Leiterbahnen 5 und 6 auf die erste Oberfläche 22 des ersten isolierenden Substrats 1 hingelegt. Leiterbahn 5 kann eine Arbeitselektrode sein, und Leiterbahn 6 kann eine Gegenelektrode sein. Die Leiterbahnen 5, 6 sind aus elektrisch leitenden Materialien aufgebaut. Genauer gesagt kann die Leiterbahn aus Palladium, Platin, Gold, Kohlenstoff und Titan aufgebaut sein. Die Leiterbahn 6 kann aus Palladium, Platin, Gold, Silber, Silber enthaltenden Legierungen, Nickel-Chrom-Legierungen, Kohlenstoff, Titan und Kupfer aufgebaut sein.
Die elektrisch leitenden Leiterbahnen 5 und 6 werden auf einer isolierenden Verstärkung, wie Polyimid oder Polyester, abgeschieden, um die Möglichkeit des Reißens des Elektrodenmaterials während der Handhabung und Herstellung der Teststreifen zu verringern. Ein Beispiel für solche leitfähigen Leiterbahnen ist eine Palladiumbeschichtung mit einem Oberflächenwiderstand von weniger als 5 Ohm pro Quadrat auf dem Polyimid UPILEX von UBE INDUSTRIES, LTD., Japan, welches vorbeschichtet mit Gold, Palladium oder Platin von TECHNI-MET, Connecticut, USA, erhältlich ist.
Die elektrisch leitenden Leiterbahnen 5 und 6 stellen die Elektroden des Biosensorteststreifens dar. Diese Elektroden müssen ausreichend getrennt sein, so dass die elektrochemischen Vorgänge an der einen Elektrode nicht die elektrochemischen Vorgängen an der anderen Elektrode stören. Die Entfernung zwischen den Elektroden 5 und 6 beträgt etwa 1,2 Millimeter (mm).
Bei dem Teststreifen, der in 1 gezeigt wird, ist die elektrisch leitende Leiterbahn 5 die Arbeitselektrode, und die elektrisch leitende Leiterbahn 6 ist eine Gegenelektrode oder Referenzelektrode. Die Leiterbahn 6 ist eine Referenzelektrode, wenn sie aus typischen Materialien für eine Referenzelektrode, wie Silber/Silberchlorid, hergestellt ist. Die Leiterbahn 5 ist eine Arbeitselektrode, die aus Palladium hergestellt ist, und die Leiterbahn 6 ist eine Gegenelektrode, die auch aus Palladium hergestellt ist und im Wesentlichen von derselben Größe wie die Arbeitselektrode ist.
Anordnungen mit drei Elektroden sind auch möglich; wobei der Streifen eine zusätzliche elektrisch leitende Leiterbahn einschließt, die zwischen leitfähiger Leiterbahn 6 und Lüftungsloch 4 angeordnet ist. Bei einer Anordnung mit drei Elektroden ist die leitfähige Leiterbahn 5 eine Arbeitselektrode, Leiterbahn 6 ist eine Gegenelektrode, und die dritte Elektrode zwischen Leiterbahn 6 und Lüftungsloch 4 ist eine Referenzelektrode.
Die Leiterbahnen 5, 6 stellen die Elektroden des Teststreifens dar. Die Leiterbahnen 5, 6 werden von Spulen (nicht gezeigt) abgewickelt und auf eine Breite von etwa 1,5 mm vorgeschnitten. Die Leiterbahnen 5, 6 werden dann mit der ersten Oberfläche 22 von Substrat 1 gekuppelt. Die Leiterbahnen 5, 6 sind auf Upilex-Verstärkung (erhältlich von Courtalds-Andus Performance Filmsare), die auf Oberfläche 22 von Substrat 1 hingelegt ist, so dass die UPILEX-Verstärkung an Oberfläche 22 angrenzt. Während der direkten Potentialanregung wird ein reduzierter Mediator hauptsächlich an der Arbeitselektrode oxidiert, während die Gegenelektrode in erster Linie dazu dient, den Stromkreis zu vervollständigen.
Das zweite Substrat 7 überdeckt die Leiterbahnen 5, 6. Das zweite Substrat 7 weist eine erste Oberfläche 8 und eine zweite Oberfläche 9, die auf die leitfähigen Leiterbahnen 5, 6 zu zeigt, auf. Wie in 1 gezeigt, wird das zweite Substrat 7 geformt, dass es erste und zweite Öffnungen 10, 11 einschließt. Die erste Öffnung 10 legt Abschnitte der Leiterbahnen 5, 6 zur elektrischen Verbindung mit einem Messgerät (nicht gezeigt) frei, welches einige elektrische Eigenschaften einer Probe misst, nachdem die Probe mit Reagens 12 des Teststreifens gemischt wurde. Die zweite Öffnung 11 schließt eine Kante ein, die einen Rand einer Kapillartestkammer definiert. Ferner erstreckt sich eine Einbuchtung 19, die allgemein fluchtend mit der Einbuchtung 2 des ersten Substrats 1 angeordnet ist, von der zweiten Öffnung 11 zu einer Kante des zweiten Substrats 7. Das zweite Substrat 7 wird mit dem ersten Substrat 1 und Leiterbahnen 5, 6 mittels eines Klebstoffs, wie ein Schmelzkleber, gekuppelt. Ein nicht begrenzendes Beispiel für einen solchen Kleber ist DYNAPOL^® S-1358 Kleber, erhältlich von Hüls America, Inc., Somerset, NJ, US.
Wie in den 3 und 4 gezeigt, bedeckt Abdeckung 13 einen Abschnitt der ersten Oberfläche 8 und zweiten Öffnung 11. Die Abdeckung 13 schließt eine erste Oberfläche 16 und eine zweite Oberfläche 17 ein, die mit der ersten Oberfläche 8 des zweiten Substrats 7 gekuppelt ist. Die Abdeckung 13 schließt ferner ein Fenster 18 ein, das allgemein fluchtend mit der zweiten Öffnung 11 des zweiten Substrats 7 angeordnet ist. Das Fenster 18 ist so bemessen und angeordnet, dass das Fenster 18 die gesamte Breite der Leiterbahn 5 und mindestens etwa zehn Prozent der Breite von Leiterbahn 6 überdeckt. Außerdem wird eine im Wesentlichen deckende Tinte derart auf die erste Oberfläche 16 in einem Muster 27 bedruckt, dass das Fenster 18 transparent bleibt. Wieder Bezug nehmend auf 1, schließt die Abdeckung 13 eine Einbuchtung 14 und eine Kerbe 15 ein, die in Fenster 18 geformt sind, welche allgemein fluchtend mit Einbuchtung 2 und Kerbe 3 des ersten Substrats 1 geformt und angeordnet sind. Die Kerben 2, 15 können als ein im Allgemeinen dreieckiger Ausschnitt aus den betroffenen Kanten mit einer Länge von etwa 0,6 bis 1,3 mm und einem Winkel an der gegenüberliegenden Spitze von etwa 70° bis 110° definiert werden. Es ist klar, dass die Abmessungen und der Aufbau der Kerbe gemäß dieser Offenbarung variieren können.
Die Abdeckung 13 kann aus einem Kunststoffmaterial aufgebaut sein, wie eine transparente oder durchscheinende Polyesterfolie, die eine Dicke von etwa 2 mil (0,05 mm) bis 6 mil (0,15 mm) Dicke aufweist. Die Abdeckung 13 ist aus MELINEX^® 351 (Polyester, der Titanoxid enthält, wodurch für Lichtundurchlässigkeit gesorgt wird) aufgebaut, das mit einem Haftkleber beschichtet wurde. Ein nicht begrenzendes Beispiel für einen geeigneten Klebstoff ist 3 M 9458 Acrylkunststoff, erhältlich von 3M, Identification and Converter Systems Division, St. Paul. MN, US.
Außerdem ist die Abdeckung 13 entweder intrinsisch hydrophil oder wurde derart modifiziert, dass die Abdeckung 13 eine hydrophile Oberfläche besitzt, welche in Richtung auf das zweite Substrat 7 orientiert ist. Die Oberfläche 17 wird durch den hydrophilen Film 25 modifiziert, welcher auf den Klebstoff der Oberfläche 17 angeordnet wird. Der hydrophile Film 25 wird hydrophil gemacht, indem beispielsweise der Film mit einer Beschichtung, die ein Detergens enthält, oder einer photo-vernetzten Matrix von hydrophilem Polymer beschichtet wird. Der Film kann auch durch Plasmabehandlung oder durch Plasma induzierte, kovalente Modifikation der Oberfläche mit Sulfonyl- oder Salpetrig-Gruppen modifiziert werden. Der hydrophile Film 25 wird mit einem Gemisch aus VITEL (The Goodyear Tire & Rubber Co., Akron, OH, US) und RHODAPEX^® (Rhodia, Cranbury, NJ, US) Netzmittel mit einer ungefähren Dicke von 4 mil (0,1 mm) beschichtet.
Die Kapillartestkammer wird durch die zweite Oberfläche 17 von Abdeckung 13, welche daran gekuppelt den hydrophilen Film 25 aufweist, die Kanten der zweiten Öffnung 11 des zweiten Substrats 7 und die erste Oberfläche 22 des Substrats 1 definiert. Die Testkammer ist angeordnet, dass sie einen Abschnitt der Leiterbahnen 5, 6 für die Anwendung von Reagens 12 auf die freiliegenden Oberflächen der Leiterbahnen 5, 6 freilegt. Die Länge und Breite dieser Kapillartestkammer werden durch die Länge und Breite von Öffnung 11 definiert, und die Höhe der Testkammer wird durch die Dicke des zweiten Substrats 7 definiert. Die Testkammer wird als eine Rechteck von etwa 3,2 mm auf der einen Seite und etwa 6,7 mm auf der anderen Seite erzeugt. Das Ausmaß, bis zu dem die Leiterbahnen 5, 6 freiliegen, bestimmt die Oberfläche für jede Elektrode. Die Arbeits- und Gegenelektroden 5, 6 weisen jeweils im Wesentlichen äquivalente Oberflächen von etwa 5 mm² auf. Es ist jedoch klar, dass das Ausmaß des Freiliegens der Leiterbahnen 5, 6 variieren kann, solange die zweite Öffnung 11 mindestens etwa 10 % der Breite jeder Leiterbahn 5, 6 freilegt.
Das Reagens 12 für 3-HBA ist in der Testkammer derart angeordnet, dass es die Arbeitselektrode 5 bedeckt. Das Reagens 12 wird als ein Film von im Allgemeinen einheitlicher Dicke über die gesamte Bodenoberfläche der Testkammer angeordnet. Das Reagens 12 bietet dem Inneren der Testkammer eine hydrophile Oberfläche dar. Das Reagens 12 wird erzeugt, dass es eine Lüftung allgemein fluchtend mit Lüftungsloch 4 des ersten Substrats 1 einschließt. Siehe 3. Die Lüftungen weisen eine Abmessung von etwa 1,8 auf 0,5 mm auf, um zu ermöglichen, dass Luft aus der Testkammer entweicht.
Der Teststreifen, welcher das Reagens 12 der vorliegenden Erfindung enthält, wird mit dem Verfahren hergestellt, das in der US-Patentschrift Nr. 5,997,817 beschrieben ist. Es wird erwogen, dass Variationen und Modifikationen an dem Verfahren der Herstellung in Betracht gezogen werden und nicht über den Umfang der vorliegenden Offenbarung hinaus gehen.
Das Reagens 12 wird zur Messung von 3-HBA in einer Probe von menschlichem Blut formuliert. Das Reagens 12 ist derart gegenüber der Probe reaktiv ist, dass ein elektrisches Ausgangssignal generiert wird, das den Gehalt an 3-HBA in der Probe angibt. Das Reagens 12 umfasst einen Mediator, Enzyme und einen Cofaktor. Das Reagens 12 umfasst ferner Filmbildner, wie sie zur Verleihung von Dauerhaftigkeit und Bereitstellung von Hydrophilie erforderlich sind. Es ist klar, dass, sofern nicht anders angegeben, sich alle Konzentrationen von Komponenten, die nachstehend aufgeführt werden, auf die Konzentration einer gegebenen Substanz in einem nassen Reagens vor dem Abscheiden und Trocknen des Reagens zu dem Teststreifen beziehen.
Wie zuvor erläutert, ist ein Mediator, der zur Verwendung in Reagens 12 geeignet ist, in der Lage, eine elektrochemische, reversible Redoxreaktion durchzumachen. Die oxidierte Form des Mediators muss in der Lage sein, mindestens ein Elektron aus einer Reaktion aufzunehmen, an der ein Enzym, ein Analyt (oder ein Cofaktor, der aus der Analytreaktion hergestellt wird) und die oxidierte Form des Mediators beteiligt sind. Der Mediator ist ein Hexacyanoferrat(III)salz, wie beispielsweise Kaliumhexacyanoferrat(III), nachstehend „Ferricyanid". Da Ferricyanid auch in Teststreifen für Sensoren zur Messung von Glucose enthalten ist, arbeiten die 3-HBA-Teststreifen der vorliegenden Erfindung günstigerweise auf demselben Instrumentarium wie ein entsprechender Glucose-Teststreifen. Ein Beispiel für einen entsprechenden Glucose-Teststreifen wird in US-Patentschrift Nr. 5,997,817 beschrieben, deren Offenbarung hier durch die Bezugnahme eingeschlossen ist.
Der Konzentrationsbereich des Analyten, der gemessen werden soll, und die Diffusionseigenschaften des Mediators durch das Reagens und die Probe regeln die erforderliche Menge an Mediator in dem Reagens. Genauer gesagt muss die Menge an reduzierter Form des Mediators ausreichen, um zu gewährleisten, dass der Strom, der während der Elektroreduktion erzeugt wird, durch die Reduktion der oxidierten Form des Mediators an der Oberfläche der Arbeitselektrode begrenzt ist. Die Löslichkeit des Mediators und der Einfluss von übermäßigem Mediator auf die Stabilität des Produkts regeln im Allgemeinen die Obergrenze für die Konzentration an dem Mediator. Das Reagens zum Analysieren von 3-HBA schließt etwa 112,8 mM bis 56,4 mM Hexacyanoferrat(III)salz, basierend auf 329,26 mg/mmol, ein, um den 3-HBA-Gehalt in einer Probe von menschlichem Vollblut mit einem Volumen von etwa 3,5 bis 7 Mikroliter (μL) zu messen. Es ist klar, dass mehr als 7 μL Probe auf den Teststreifen abgesetzt werden können, aber dass die Konzentration von Hexacyanoferrat(III)salz in dem gelösten Reagens lediglich von der Menge der Probe, die in die Testkammer eintritt, abhängt. Es ist jedoch auch klar, dass die Konzentration von Hexacyanoferrat mit dem Volumen von menschlichem Vollblut variiert, das in die Testkammer eintritt.
Das 3-HBA-Testreagens der vorliegenden Erfindung schließt ferner Enzyme ein, die von einem tauglichen Typ sind und in genügender Menge vorliegen, um die Reaktion, an der das Enzym, der Analyt und die oxidierte Form des Mediators beteiligt sind, zu katalysieren. Ein Enzym, das zur Verwendung in dem Reagens geeignet ist, ist wirksam, um die Oxidation von 3-HBA in der Probe zu katalysieren, und ein zweites Enzym ist wirksam, um die elektrochemische Oxidation einer reduzierten Form des Cofaktors zu katalysieren. Das erste Enzym ist eine Dehydrogenase, und ein zweites Enzym ist Diaphorase. Genauer gesagt ist das erste Enzym 3-Hydroxybutyratdehydrogenase, die im Handel von Toyobo Co., Ltd. Biochemical Operations Department, Osaka, Japan, und Roche Diagnostics Corporation, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, US, erhältlich ist. Die Diaphorase ist im Handel von Roche Diagnostics Corporation, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, US, erhältlich.
Für den Teststreifen, wie er zur Analyse von 3-HBA entworfen ist, werden zwischen etwa 0,20 und 20 Millionen Einheiten von 3-Hydroxybutyratdehydrogenase und zwischen etwa 0,1 und 10 Millionen Einheiten von Diaphorase pro Liter Reagens eingeschlossen, wo die Reaktion mindestens etwa 15 Sekunden vor dem Anlegen des elektrischen Potentials ablaufen gelassen wird. Stärker bevorzugt wird die Reaktion mindestens etwa 50 Sekunden vor dem Anlegen des elektrischen Potentials ablaufen gelassen. Es ist jedoch klar, dass die Menge an Enzymen, die in dem Reagens eingeschlossen ist, in Abhängigkeit von der gewünschten Stabilität, der Geometrie der Elektroden und den physikalischen Eigenschaften des Reagensfilms variieren können, ohne über den Umfang der vorliegenden Offenbarung hinaus zu gehen.
Außerdem umfasst das Testreagens einen Cofaktor, der mit den Enzymen und dem Mediator zusammenwirkt. Nicht begrenzende Beispiele für geeignete Cofaktoren schließen NAD⁺, NADP⁺, NADH₂, NADPH₂ und Phenazinmethosulfat ein. Vorzugsweise ist der Cofaktor NAD⁺. NAD⁺ ist im Handel von Roche Diagnostics Corporation, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, US, erhältlich. Das Reagens zum Analysieren von 3-HBA schließt etwa 21,1 μM bis 43 μM NAD⁺, basierend auf 663,44 g/mol, ein, um den 3-HBA-Gehalt in einer Probe von menschlichem Vollblut mit einem Volumen von etwa 3,5 bis 7 Mikroliter (μL) zu messen. Es ist klar, dass mehr als 7 μL Probe auf den Teststreifen abgesetzt werden können, aber dass die Konzentration von NAD⁺ in dem gelösten Reagens lediglich von der Menge der Probe, die in die Testkammer eintritt, abhängt. Es ist jedoch auch klar, dass die Konzentration von NAD⁺ mit dem Volumen von menschlichem Vollblut variiert, das in die Testkammer eintritt.
Um die Solubilisierung des Mediators zu verbessern, können verschiedene „Füllstoff" substanzen in dem Reagens enthalten sein. Ein Füllstoff ist hier als ein unlösliches teilchenförmiges Material von mikroskopischer Größe definiert, das gleichmäßig in der gesamten Reagensmatrix während des Vermischens des Reagens dispergiert wird. Der bevorzugte Füllstoff ist ein Metalloxid, das bei dem angelegten Potential oder relativ zum Potential des Mediators oder der Mediatoren keine Elektronen aufnimmt oder abgibt. Das Reagens 12 schließt einen Füllstoff, wie Titanoxid, ein, der in einer Menge von etwa 0,2 bis 2,0 % (nasse Masse nasse Masse) und vorzugsweise mit etwa 0,22 % (nasse Masse:nasse Masse) vorhanden ist.
Wenn Füllstoffe verwendet werden, werden im Allgemeinen Substanzen, wie Polymere in dem Reagens eingeschlossen, um die Viskosität von Reagens 12 anzuheben. Das Reagens 12 schließt das Polymer NATROSOL 250K ein (Hydroxyethylcellulose, erhältlich von Aqualon Oil Field Chemicals, Houston, TX, US). Die Menge an NATROSOL 250K kann von etwa 0,05 bis 0,5 % (nasse Masse nasse Masse) variieren, und die bevorzugte Konzentration beträgt etwa 0,19 % (nasse Masse nasse Masse). Es ist klar, dass eine Vielzahl im Handel erhältlicher Mittel zur Änderung der Viskosität in Übereinstimmung mit der vorliegenden Offenbarung verwendet werden können.
Hydrophile Polymere können dem Reagens sowohl Dauerhaftigkeit als auch Hydrophilie verleihen. Einige nicht begrenzende Beispiele für annehmbare Polymere sind Polyethylenglykol/Polyethylenoxid, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrholidin, Polystyrolsulfonat, Polyvinylacetat und Mikroemulsionen von Vinylacetat. Polyethylenoxid (Union Carbide Corporation, Danbury, CT, US) mit etwa 100 bis 900 Kilodalton mittlerem Molekulargewicht wird bei Konzentrationen von etwa 0,2 % bis 2 % (nasse Masse nasse Masse) verwendet. Das Reagens 12 schließt Polyethylenoxid mit etwa 300 Kilodalton mittlerem Molekulargewicht bei etwa 0,59 % (nasse Masse nasse Masse) ein.
Das Netzmittel wird im Allgemeinen in das Reagens eingeschlossen, um die Oberflächenspannung zu regulieren (vermindern). Nicht begrenzende Beispiele für annehmbare Detergenzien sind DONS (Natriumdioctylsulfosuccinat), verzweigtes Nonyl-phenoxypoly(ethylen-oxy)ethanol (erhältlich von Rhone-Poulenc, Collegeville, PA, als Igepal CO-630 oder von Roche Diagnostics, Biochemicals, Indianapolis, IN, als TRITON X-100). Die Menge und Art des Detergens in dem Reagens reicht aus, um die Oberflächenspannung auf zwischen etwa 20 und 70 dyn/cm zu verringern. Wo die Probe Blut sein soll, sollte die unerwünschte Lyse von Zellen vermieden werden, indem die Gesamtkonzentration des Detergens auf Gehalte von unter etwa 0,3 % (in Abhängigkeit von der Art des Detergens) eingeschränkt wird. Bei dem Teststreifen, der zum Untersuchen von 3-HBA unter Verwendung von Glucosedehydrogenase entworfen wurde, ist TRITON X-100^® in Konzentrationen von höchstens etwa 0,05 % (nasse Masse nasse Masse) vorhanden, wobei etwa 0,035 % (nasse Masse nasse Masse) bevorzugt werden.
Das Reagens 12 kann einen Puffer einschließen. Der Puffer ist von ausreichender Art und in ausreichender Menge, um einen pH-Wert bereitzustellen und aufrecht zu erhalten, wo die Enzymstabilität und -aktivität gleichzeitig optimal sind. Die Aktivität des Enzyms bezieht sich auf die Fähigkeit des Enzyms, die Reaktion zwischen dem Analyten und dem Mediator oder dem Analyten und Analytenderivat bei Multienzymreagenzien zu katalysieren. Die Stabilität des (der) Enzym(s/e) bezieht sich auf die Erhaltung dieser Aktivität im Verlaufe der Zeit und wenn das Reagens verschiedenen Formen der Belastung, wie Wärme und Feuchtigkeit, ausgesetzt ist. Außerdem darf der Puffer kein niedrigeres Oxidationspotential aufweisen als der reduzierte Mediator. Nicht begrenzende Beispiele für geeignete Puffer schließen Pyrophosphatsalze ein, wobei der pH-Wert zwischen etwa 7,8 und 9,0 liegt, wobei etwa 8,7 am stärksten bevorzugt wird. Nicht begrenzende Beispiele für geeignete Pyrophosphatsalze schließen Dinatriumpyrophosphat und Tetranatriumpyrophosphat ein. Wenn sich der optimale pH-Wert für die Enzymaktivität deutlich von dem der Probe unterscheidet, dann sollte der Puffer von einer Konzentration sein, die ausreicht, um den End-pH-wert des rehydratisierten Reagens plus Probe auf das gewünschte Niveau zu bringen. Die Konzentration des Puffers, die im Allgemeinen verwendet wird, beträgt zwischen etwa 50 und 200 mM in dem Reagens. Die bevorzugte Konzentration beträgt etwa 53,6 mM.
Das Reagens kann auch Substanzen enthalten, die die verschiedenen Komponenten stabilisieren. Annehmbare Stabilisatoren für die Enzyme in Kombination mit einem Cofaktor in dem Reagens der vorliegenden Erfindung sind Flavinmononukleotid, Adenosindiphosphat, Magnesiumionen, Laktose, Trehalose und Raffinose. Das Reagens 12 schließt einen Stabilisator, wie Raffinose, in einer Konzentration von etwa 0,5 bis 5 % (nasse Masse:nasse Masse) ein, wobei etwa 0,68 % (nasse Masse:nasse Masse) bevorzugt werden.
Die Dicke des Films eines getrockneten Reagens ist derart, dass in Kombination mit den inhärenten Eigenschaften der Chemie die Empfindlichkeit des Systems für Beeinträchtigung durch Hämatokritschwankungen gemildert wird. Die Filmdicke (wie mit dem Verhältnis von abgegebenem Volumen des nassen Reagens zu der Oberfläche, auf die abgegeben wurde, gemessen) ist derart, dass etwa 10 μL Reagens auf eine Fläche von etwa 22,5 Millimetern im Quadrat abgegeben werden. Das nachstehend beschriebene Reagens, durch die Verwendung des Hauptpolymers Polyethylenoxid und in Kombination mit der Filmdicke mit dem Ergebnis in dem Teststreifen, der eine verringerte Empfindlichkeit für Hämatokritschwankungen besitzt.
Wenn eine Probe, die den Analyten 3-HBA enthält, zu dem Reagens gegeben wird, wird der Analyt oxidiert, und die oxidierte Form des Cofaktors wird reduziert. Dieser Cofaktor wechselwirkt dann mit einem zweiten Enzym, und der oxidierte Mediator wird reduziert. Es wird zugelassen, dass die Reaktion einen Punkt in der Zeit erreicht, wo die Nutzung vor Analyt und oxidiertem Mediator einen Punkt erreicht hat, wo zusätzliche Zeit für die exakte Bestimmung der Analytenkonzentration nicht notwendig ist. Während dieser Inkubationszeit kann es notwendig sein, ein Wechselstrompotential von geringer Größe über die Elektroden anzulegen, um die Größe der Beeinträchtigung auf Grund von Änderungen in der Impedanz zu bestimmen. Siehe beispielsweise internationale Anmeldung Nr. PCT/US98/27203, veröffentlicht am 1. Juli 1999 als internationale Veröffentlichung Nr. WO 99/32881.
Die Oxidation des Analyten und die Reduktion der oxidierten Form des Cofaktors dürfen bis zur Vollständigkeit ablaufen. Der Begriff Vollständigkeit, wie er insgesamt in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet wird, ist definiert als eine ausreichende Reaktion, an der Analyt, Cofaktor und Enzym beteiligt sind, wodurch ein oder mehrere reduzierte Reaktionsprodukte erzeugt werden, und eine ausreichende Reaktion, an der ein oder mehrere reduzierte Reaktionsprodukte, Enzym und Mediator beteiligt sind, wodurch die Analytenkonzentration mit dem diffusionsbegrenzten Strom korreliert wird, der durch Oxidation des Mediators an der Oberfläche der Arbeitselektrode generiert wird.
Nachdem die Reaktionen beendet sind, wird eine Potentialdifferenz zwischen einer Arbeits- und Gegenelektrode angelegt, wodurch diffusionsbegrenzte Elektrooxidation der reduzierten Form des Mediators an der Oberfläche der Arbeitselektrode bewirkt wird. Ein Messgerät zum Messen des Stroms misst den diffusionsbegrenzten Strom, der durch die Oxidation der reduzierten Form des Mediators an der Oberfläche der Arbeitselektrode generiert wird. Der gemessene Strom kann exakt mit der Konzentration von 3-HBA in der Probe korreliert werden, wenn die folgenden Anforderungen erfüllt sind:

1. Die Geschwindigkeit der Oxidation der reduzierten Form des Mediators wird durch die Geschwindigkeit der Diffusion der reduzierten Form des Mediators zur Oberfläche der Arbeitselektrode geregelt.
2. Der erzeugte Strom wird durch die Oxidation der reduzierten Form des Mediators an der Oberfläche der Arbeitselektrode begrenzt.

Der Teststreifen der vorliegenden Erfindung genügt den vorstehenden Anforderungen, indem er Reagens 12 einsetzt, das einen bereitwillig reversiblen Mediator einschließt, und das Reagens mit der oxidierten Form des Mediators in einer Menge versorgt, die ausreicht, um zu gewährleisten, dass der erzeugte Strom während der diffusionsbegrenzten Elektrooxidation durch die Oxidation der reduzierten Form des Mediators an der Oberfläche der Arbeitselektrode begrenzt ist. Damit der Strom, der während der Elektrooxidation erzeugt wird, durch die Oxidation der reduzierten Form des Mediators an der Oberfläche der Arbeitselektrode begrenzt ist, muss die Menge der oxidierten Form des Mediators an der Oberfläche der Gegenelektrode immer die Menge der reduzierten Form an der Oberfläche der Arbeitselektrode übersteigen.
Somit stellen der Teststreifen und das Verfahren, das das Reagens der vorliegenden Erfindung nutzt, dem Benutzer ein bequemes und einfaches Mittel zum Bestimmen der Gehalte an 3-HBA im Blut bereit. Teststreifen und Verfahren beseitigen im Wesentlichen die Nachteile, dass der Benutzer getrenntes Instrumentarium zum Testen auf Blutglucose und auf 3-HBA kaufen oder verwenden muss.
Ein Protokoll für die Herstellung von 1 Liter eines Reagens zur Bestimmung von 3-HBA, das die Enzyme Hydroxybutyratdehydrogenase und Diaphorase und den Mediator Ferricyanid nutzt, wird nachstehend gezeigt.
Schritt 1: Eine Lösung von NATROSOL (250K) in deionisiertem Wasser wird hergestellt, indem 1,90 g NATROSOL K auf die Oberfläche von 430 g deionisiertem Wasser gegeben werden, während mit einem Kreiselmischer und Flügelrad bei einer Geschwindigkeit von mindestens etwa 400 Umdrehungen pro Minute (Upm) für eine Dauer von mindestens etwa 30 Minuten gemischt wird.
Schritt 2: In die Lösung aus Schritt 1 werden 6,1 g Polyethylenoxid (300 Kilodalton mittleres Molekulargewicht) (Union Carbide 750NF) dispergiert, indem das Pulver allmählich über die Oberfläche der Lösung gegeben wird, während bei einer Geschwindigkeit von mindestens etwa 400 Upm für eine Dauer von mindestens etwa 60 Minuten gemischt wird.
Schritt 3: In das Gemisch aus Schritt 2 werden 6,8 g Raffinose dispergiert, indem das Pulver allmählich über die Oberfläche der Lösung gegeben wird, während bei einer Geschwindigkeit von mindestens 400 Upm für eine Dauer von mindestens 10 Minuten gemischt wird.
Schritt 4: Das Gemisch aus Schritt 3 wird gepuffert, indem 58,8 g Dinatriumpyrophosphat (wasserfrei) und 73,1 g Tetranatriumpyrophosphat (wasserfrei) zugegeben werden, während bei einer Geschwindigkeit von 400 Upm für eine Dauer von mindestens 20 Minuten gemischt wird. Der End-pH-wert von 8,7 wird überprüft. Diese Unterform wird ab diesem Zeitpunkt als die „Polymermatrix" bezeichnet.
Schritt 5: Eine Suspension von Titanoxid wird hergestellt, indem 2,3 g Titanoxidpulver über 377,8 g deionisiertem Wasser abgegeben werden, während mit einem Kreiselmischer und Flügelrad bei einer Geschwindigkeit von mindestens 600 Upm mindestens 20 Minuten lang gemischt wird. Diese Unterform wird ab diesem Zeitpunkt als die „Füllstoffsuspension" bezeichnet.
Schritt 6: Die Füllstoffsuspension aus Schritt 5 wurde mit der Polymermatrix aus Schritt 4 vereinigt. Diese Kombination wird vorgeformt, indem die Füllstoffsuspension durch ein grobes (200 μm) Sieb filtriert wird, um alle großen, nicht dispergierten Teilchen von Titanoxid vor oder während des Vereinigungsschritts zu entfernen.
Schritt 7: Als Nächstes werden 13,3 g Kaliumferricyanid zu dem Reagens aus Schritt 6 gegeben. Das Reagens wird mit mindestens 500 Upm mindestens 20 Minuten lang mischen gelassen oder bis es für das endgültige Zusammensetzen zum Reagens (Schritt 13) bereit ist. Diese Matrix wird ab diesem Zeitpunkt als die „Reagensgrundlage" bezeichnet.
Schritt 8: Eine getrennte Lösung wird hergestellt, indem 200.000 Einheiten des Enzyms β-Hydroxybutyratdehydrogenase in 100 g deionisiertem Wasser dispergiert werden, während mit einer Geschwindigkeit von mindestens 200 Upm unter Verwendung einer Rührplatte und eines Magnetrührers gerührt wird.
Schritt 9: Zu der Lösung aus Schritt 8 werden 200.000 Einheiten des Enzyms Diaphorase gegeben und 10 Minuten lang mischen gelassen. Diese Lösung wird nachstehend als die „Enzymlösung" bezeichnet. Die resultierende Lösung wird bei etwa 4 °C bis 10 °C gekühlt, bis sie zum Einbringen in das endgültige Reagens (Schritt 13) bereit ist.
Schritt 10: Eine getrennte Lösung wird hergestellt, indem 96 mg Magnesiumchlorid-Hexahydrat in 50 g deionisiertem Wasser gelöst werden.
Schritt 11: In der Lösung aus Schritt 10 werden 200 mg Cofaktor NAD⁺ gelöst, während bei 200 Upm 5 Minuten lang gemischt wird.
Schritt 12: In der Lösung aus Schritt 11 werden 145 mg Flavinmononukleotid gelöst, während bei 200 Upm 5 Minuten lang gemischt wird. Diese wird nachstehend als die „Cofaktorlösung" bezeichnet. Die Cofaktorlösung wird bei etwa 4 °C bis 10 °C gekühlt, bis sie zum endgültigen Einbringen in das Reagens (Schritt 13) bereit ist.
Schritt 13: Das endgültige Reagens wurde zusammengesetzt, indem die Enzymlösung aus Schritt 9 und Cofaktorlösung aus Schritt 12 zu der Reagensgrundlage aus Schritt 7 gegeben wurde. Das endgültige Reagens wurde mit einer verminderten Geschwindigkeit von 400 Upm mindestens 15 Minuten lang gerührt.
Schritt 14: Das endgültige Reagens wird mit der Zugabe von 0,35 g Triton X-100 und mindestens 15 Minuten lang Rühren bei 400 Upm vor der Abgabe fertig gestellt.
Der Teststreifen der vorliegenden Erfindung wird mit dem Verfahren hergestellt, das in der US-Patentschrift Nr. 5,997,817 beschrieben ist. Zu dem Teststreifen für die 3-HBA-Bestimmung wurden 10 μL Reagens, das nachdem vorstehend beschriebenen Protokoll hergestellt worden war, zu der Oberfläche der Testkammer, die die Elektroden trägt, gegeben. Die Menge an Reagens kann von etwa 3 bis 10 μL schwanken, wobei die bevorzugte Abgabe etwa 10 μL beträgt. Diese Menge an Reagens bedeckt im Wesentlichen die Oberflächen der Elektroden. Der resultierende Film eines Reagens enthält ausreichend Ferricyanid und Enzyme (β-Hydroxybutyratdehydrogenase und Diaphorase), um die Oxidation von 3-HBA (aus einer Probe von menschlichem Vollblut) und die Reduktion von Ferricyanid zu katalysieren, wodurch die exakte und präzise Bestimmung der 3-HBA-Konzentration nach einer anfänglichen Inkubation (vor dem Anlegen eines Potentials) innerhalb etwa 60 Sekunden ermöglicht wird.
Um eine gleichmäßig verteilte, homogene Reagensschicht beim Trocknen der Oberfläche der Testkammer, die die Elektroden trägt, zu gewährleisten, wird die Oberfläche mit einem 150 Watt-Koronalichtbogen, der bei 1/40.000 Zoll ergriffen ist, unmittelbar vor der Anwendung des Reagens behandelt. Diese Anwendung wird mit dem Material gemacht läuft durch eine Verarbeitungsstraße von etwa 6,5 Meter pro Minute. Diese Behandlung erhöht die Oberflächenenergie des Zielgebiets, wodurch das Ausbreiten des nassen Reagens vor dem Trocknen begünstigt wird. Der Koronalichtbogen wird maximal etwa 5 Minuten und stärker bevorzugt weniger als etwa 45 Sekunden vor der Abgabe des Reagens auf das Material angelegt. Nachfolgend auf das Anlegen des Lichtbogens und vor dem Abgeben des Reagens wird die Koronabehandlung auf der Oberfläche der Abstandshalterschicht verringert, wo kein Reagens erwünscht ist.
Diese Koronadissipation wird durch die Anwendung eines Films von deionisiertem Wasser derart erreicht, dass das Wasser mit der Oberfläche der Abstandshalterschicht in Kontakt kommt, aber nicht mit der Oberfläche der Grundschicht, die die Elektroden trägt, in Kontakt kommt. Der Film aus Wasser, welcher auf die Oberfläche der Abstandshalterschicht aufgebracht wird, ist ausreichend dünn, dass er entweder durch Infrarot oder mechanische Konvektionsverfahren getrocknet wird, bevor das Material das Gebiet der Abgabe des Reagens erreicht.
Das Reagens wird dann unter Erwärmen auf etwa 70 °C getrocknet. Das Trocknen entfernt mindestens etwa 98 des Wassergehalts des Reagens. Das verbleibende Wasser wird während des nachfolgenden Trocknens in einer Vorrichtung zum endgültigen Verpacken zu Spurengehalten verringert. Der resultierende, trockene Film eines Reagens enthält zwischen 1 und 5 tausend Einheiten der Aktivität pro Enzym pro Gramm.
Ein nicht begrenzendes Beispiel für Komponenten, die verwendet werden, um 100 g Reagens der vorliegenden Erfindung zu erzeugen, ist nachstehend in Tabelle 1 aufgeführt. TABELLE 1
Die einzelnen Teststreifen werden in Verbindung mit dem Folgenden verwendet:

1. eine Spannungsquelle in elektrischer Verbindung mit den Arbeits- und Gegenelektroden und in der Lage, eine elektrische Potentialdifferenz zwischen den Arbeits- und Gegenelektroden zu liefern, die ausreicht, um diffusionsbegrenzte Elektrooxidation der reduzierten Form des Mediators an der Oberfläche der Arbeitselektrode zu bewirken; und
2. ein Messgerät in elektrischer Verbindung mit den Arbeits- und Gegenelektroden und in der Lage, den diffusionsbegrenzten Strom zu messen, der durch die Oxidation der reduzierten Form des Mediators erzeugt wird, wenn die vorstehend angegebene elektrische Potentialdifferenz angelegt wird.

Das Messgerät ist normalerweise derart ausgelegt, dass es einen Algorithmus, wie nachstehend erläutert, auf die Messung des Stroms anwendet, wodurch eine Analytenkonzentration bereitgestellt und visuell angezeigt wird. Eine solche Spannungsquelle, Messgerät und Biosensorsystem sind das Thema der US-Patentschriften Nrn. 4,963,814; 4,999,632; 4,999,582; und 5,243,516 und von WO 99/32881.
Der Teststreifen, der das Reagens der vorliegenden Erfindung einschließt, kann verwendet werden, um die Konzentration eines Analyten in einer flüssigen Probe zu bestimmen, indem die folgenden Schritte durchgeführt werden:

a. Kontaktieren der flüssigen Probe mit dem Reagens, das im Wesentlichen gleiche Oberflächen der Arbeits- und Gegenelektroden im Wesentlichen bedeckt;
b. Ermöglichen, dass die Reaktion zwischen dem Analyten und der oxidierten Form des Mediators bis zur Vollständigkeit läuft, und Messen der Hintergrundsimpedanz, wobei ein niedriges (57 mV Amplitude) Wechselstrompotential mittlerer bis hoher Frequenz (100 Hz +) zur internen Kalibrierung während der Inkubationszeit verwendet wird;
c. nachfolgend Anlegen eines Gleichspannungsunterschieds zwischen den Elektroden, der ausreicht, um die diffusionsbegrenzte Elektrooxidation der reduzierten Form des Mediators an der Oberfläche der Arbeitselektrode zu bewirken;
d. danach Messen des resultierenden diffusionsbegrenzten Stroms; und
e. Korrelieren der Strommessung mit der Konzentration des Analyten in dem Fluid.

Viele Fluide, die 3-HBA enthalten, können analysiert werden. Beispielsweise kann 3-HBA in menschlichen Körperfluiden, wie Vollblut, Blutserum, Urin und Zerebrospinalfluid, gemessen werden. Ebenso kann 3-HBA gemessen werden, das sich in Nahrungsmittelprodukten, Fermentationsprodukten und in Umweltsubstanzen, welche potentiell Umweltverunreinigungen enthalten, findet.
Wenn Analyte gemessen werden, die sich in menschlichen Körperfluiden, insbesondere Vollblut, finden, sollte die Potentialdifferenz, die zwischen den Elektroden angelegt wird, höchstens etwa 500 Millivolt betragen. Wenn eine Potentialdifferenz über etwa 500 Millivolt zwischen den Elektroden angelegt wird, kann die Oxidation der Oberfläche der Arbeitselektrode (bei Palladium) und einiger Blutkomponenten unerträglich werden, wodurch eine exakte und präzise Korrelation von Strom zu Analytenkonzentration verhindert wird. Bei einer Untersuchung von 3-HBA in einer Vollblutprobe, bei der die oxidierte Form des Mediators Ferricyanid ist, kann eine Potentialdifferenz von etwa 150 Millivolt bis 500 Millivolt zwischen den Elektroden angelegt werden, um diffusionsbegrenzte Elektrooxidation der reduzierten Form des Ferricyanids an der Oberfläche der Arbeitselektrode zu erzielen. Etwa 300 Millivolt Potentialdifferenz werden zwischen den Elektroden angelegt.
Der Strom, der aus der Oxidation der reduzierten Form des Mediators generiert wird, kann zu jeder Zeit ab 0,5 Sekunden bis 30 Sekunden, nachdem die Potentialdifferenz zwischen den Elektroden angelegt wurde, gemessen werden. Bei weniger als etwa 0,5 Sekunden wurde der diffusionsbegrenzte Strom nicht erreicht. Nach etwa 30 Sekunden wird die Konvektion von Bedeutung, wodurch die Messung einer diffusionsbegrenzten Stroms beeinträchtigt wird.
Der Strom, der während der Untersuchung eines Analyten aus einer flüssigen Probe gemessen wird, kann mit der Konzentration des Analyten in der Probe mittels Anwenden eines Algorithmus durch das Messgerät zur Messung des Stroms korreliert werden. Der Algorithmus kann ein einfacher sein, wie mit dem folgenden Beispiel veranschaulicht: [Analyt] = Ci7,5 + dwobei [Analyt] für die Konzentration des 3-HBA-Analyten in der Probe (siehe 5) steht, i der Strom (in Mikroampere) ist, der bei 9,0 Sekunden nach dem Anlegen der Potentialdifferenz, die zwischen den Elektroden angelegt wird, gemessen wurde, C die Steigung der Linie ist: z. B. 0,483 bei Versuch A und 0,528 bei Versuch B, und d der Achsenabschnitt ist: z. B. –2,82 bei Versuch Trial A und –1,23 bei Versuch B. Deshalb werden die Konzentrationen von 3-HBA bei den Versuchen A und B wie folgt bestimmt:

Versuch A: [3-HBA] = Strom × 0,483 – 2,82
Versuch B: [3-HBA] = Strom × 0,528 – 1,23

Indem Messungen mit bekannten Konzentrationen von 3-HBA-Analyt durchgeführt werden, können Eichkurven aufgestellt werden, wie in 5 gezeigt. Diese Eichung wird im Lesespeicher (ROM) des Messgeräts gespeichert und ist auf eine spezielle Partie von Biosensoren anwendbar.
Bei dem Verfahren zur Analyse von 3-HBA aus einer Probe von menschlichem Vollblut, werden 5 μL Vollblut zu dem vorstehend beschriebenen Reagens 12 gegeben. Die Reaktion wird bis zu einem stabilen Punkt ablaufen gelassen, was eine stabile Konzentration an Ferrocyanid erzeugt. Während dieser Zeit wird Wechselstrom mit 57 mV Amplitude und 2 kHz Frequenz angelegt, um die Hintergrundsimpedanz zu bestimmen. Etwa fünfzig Sekunden nach der Zugabe der Vollblutprobe wird ein Gleichspannungsunterschied von etwa 300 Millivolt zwischen den Elektroden angelegt, wodurch an der Oberfläche der Arbeitselektrode Ferrocyanid zu Ferricyanid oxidiert wird. Die Strommessungen werden in Abständen von 0,5 Sekunden von 1 Sekunde bis 9,0 Sekunden durchgeführt, nachdem die Potentialdifferenz zwischen den Elektroden angelegt wurde. Diese Strommessungen werden mit der Konzentration von 3-HBA in der Blutprobe korreliert.
Bei diesem Beispiel des Messens von 3-HBA aus einer Blutprobe werden die Strommessungen zu verschiedenen Zeiten (von 1 Sekunde bis 7,5 Sekunden nach dem Anlegen der Potentialdifferenz) statt an einem einzigen festen Zeitpunkt (wie zuvor beschrieben) durchgeführt, und der resultierende Algorithmus wird durch die folgende Gleichung wiedergegeben: [3-HBA] = C1i1 + C2i2 + C3i3 + ...Cn in + dwobei i1 der Strom ist, der beim ersten Messzeitpunkt (1 Sekunde nach dem Anlegen der 300 Millivolt Potentialdifferenz) gemessen wird, i2 der Strom ist, der beim zweiten Messzeitpunkt (1,5 Sekunden nach dem Anlegen der 300 Millivolt Potentialdifferenz) gemessen wird, i3 der Strom ist, der beim dritten Messzeitpunkt (2 Sekunden nach dem Anlegen der 300 Millivolt Potentialdifferenz) gemessen wird, in der Strom ist, der beim n-ten Messzeitpunkt (in diesem Beispiel beim vierzehnten Messzeitpunkt oder 7,5 Sekunden nach dem Anlegen der 300 Millivolt Potentialdifferenz) gemessen wird, C1, C2, C3 und Cn die Koeffizienten sind, die sich von einer Technik der multivariaten Regressionsanalyse, wie Hauptkomponentenanalyse oder Methode der kleinsten Fehlerquadrate, ableiten, und d der Regressionsabschnitt (in Einheiten der 3-HBA-Konzentration) ist.
Alternativ kann die Konzentration von 3-HBA in der Probe, die gemessen wird, bestimmt werden, indem die Kurve, die durch Auftragen des Stroms i gegen die Messzeit über ein gewisses Zeitintervall (beispielsweise von 1 Sekunde bis 7,5 Sekunden nach dem Anlegen der 300 Millivolt Potentialdifferenz) generiert wird, integriert wird, wodurch die Gesamtladung erhalten wird, die während des Messzeitraums übertragen wird. Die übertragene Gesamtladung ist direkt proportional zur Konzentration von 3-HBA in der Probe, die gemessen wird.
Ferner kann die Messung der 3-HBA-Konzentration für Unterschiede zwischen der Umgebungstemperatur zum Zeitpunkt der tatsächlichen Messung und der Umgebungstemperatur zum Zeitpunkt der Eichung korrigiert werden. Wenn beispielsweise die Eichkurve für 3-HBA bei der Umgebungstemperatur von 23 °C aufgebaut wurde, wird die 3-HBA-Messung unter Verwendung der folgenden Gleichung korrigiert: [3-HBA] korrigiert = [3-HBA] gemessen × (1 – K (T – 23 °C)wobei T die Umgebungstemperatur (in °C) zum Zeitpunkt der Messung der Probe ist und K eine Konstante ist, die sich aus der folgenden Regressionsgleichung ableitet: Y = K (T – 23),wobei Y = [3-HBA] gemessen bei 23 °C – [3-HBA] gemessen bei T ist.
Um den Wert von K zu berechnen, werden viele einzelne 3-HBA-Konzentrationen mit dem Messgerät bei verschiedenen Temperaturen T und bei 23 °C (der Ausgangsfall) gemessen. Als Nächstes wird eine lineare Regression von Y über T – 23 durchgeführt. Der Wert von K ist die Steigung dieser Regression.
Die 3-HBA-Konzentration einer Probe kann mit dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren, das den vorliegenden erfindungsgemäßen Teststreifen nutzt, gemessen werden. Ferner ist, wenn eine Probe von menschlichem Vollblut gemessen wird, der Fehler auf Grund der Einwirkung von Hämatokrit im Bereich von etwa 30 bis 55 % Hämatokrit unbedeutend.
Die vorliegende Erfindung wurde durch Analyte, die oxidiert werden, und Mediatoren, die in Gegenwart einer katalytischen Menge an Enzym reduziert werden, veranschaulicht. Jedoch können in der vorliegenden Erfindung Reagenzien und Verfahren verwendet werden, um die Konzentration eines Analyten in einer flüssigen Probe zu messen, wobei der Analyt reduziert wird und die reduzierte Form eines Mediators in Gegenwart einer katalytischen Menge eines Enzyms (z. B. eine Reduktase) reduziert wird. Nachdem die Reaktion, an der Analyt, Enzym und reduzierte Form des Mediators beteiligt sind, die Vollständigkeit erreicht, wird eine Potentialdifferenz zwischen den Elektroden angelegt. Die Menge der reduzierten Form des Mediators an der Gegenelektrode (in diesem Fall eine Anode statt einer Kathode) und die angelegte Potentialdifferenz müssen ausreichen, um diffusionsbegrenzte Elektroreduktion der oxidierten Form des Mediators an der Oberfläche der Arbeitselektrode (in diesem Fall eine Kathode statt einer Anode) zu bewirken. Der diffusionsbegrenzte Strom, der durch Reduktion der oxidierten Form des Mediators an der Oberfläche der Arbeitselektrode generiert wird, ist mit der Konzentration des Analyten in der Probe, die analysiert werden soll, korreliert.
Auch wenn die Erfindung ausführlich unter Bezug auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen beschrieben wurde, ist es klar, dass es Variationen und Modifikationen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung gibt, der in den folgenden Ansprüchen definiert ist.

Claims

Teststreifenvorrichtung zum Bestimmen von 3-Hydroxybuttersäure in einer Probe, wobei die Vorrichtung umfasst: ein Trägermaterial, mindestens eine Elektrode, die auf dem Trägermaterial angebracht ist, und ein Reagens, das mit der mindestens einen Elektrode in Verbindung steht, wobei das Reagens ein Film eines getrockneten Reagens ist, das derart gegenüber der Probe reaktiv ist, dass ein elektrisches Ausgangssignal generiert wird, das den Gehalt an 3-Hydroxybuttersäure in der Probe anzeigt, wobei das Reagens ein Hexacyanoferrat(III)salz, eine katalytische Menge einer Hydroxybutyratdehydrogenase, die wirksam ist, um die Oxidation von 3-Hydroxybuttersäure in der Probe zu katalysieren, einen Cofaktor, der der Hydroxybutyratdehydrogenase entspricht, und eine katalytische Menge eines zweiten Enzyms, das wirksam ist, um die elektrochemische Oxidation einer reduzierten Form des Cofaktors zu katalysieren, umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das zweite Enzym Diaphorase ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Cofaktor aus der Gruppe bestehend aus NAD⁺, NADP⁺, NADH₂ und NADPH₂ gewählt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei der Cofaktor NAD⁺ ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Hexacyanoferrat(III)salz Kaliumhexacyanoferrat(III) ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Reagens ferner einen Füllstoff umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 6, wobei der Füllstoff ein Metalloxid ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Reagens ferner ein Polymer umfasst, ausgewählt aus Polyethylenglykol/Polyethylenoxid, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidin, Polystyrolsulfonat, Polyvinylacetat und Mikroemulsionen von Vinylacetat.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Reagens ferner ein Netzmittel umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 9, wobei das Netzmittel aus der Gruppe bestehend aus Natriumdioctylsulfosuccinat und Nonyl-phenoxypoly(ethylenoxy)ethanol mit verzweigten Nonylresten gewählt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Reagens ferner einen anorganischen Puffer umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei der Puffer ein Pyrophosphatsalz ist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Reagens ferner Stabilisatoren umfasst, ausgewählt aus Flavinmononukleotid, Adenosindiphosphat, Magnesiumionen, Lactose und Raffinose.
Verfahren zum Bestimmen von Information, die den Gehalt an 3-Hydroxybuttersäure in einer Probe anzeigt, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: Bereitstellen der Teststreifenvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, Kontaktieren des Reagens der Teststreifenvorrichtung mit der flüssigen Probe und Anlegen eines Gleichspannungsunterschieds zwischen den Elektroden, der ausreicht, um ein elektrisches Signal aus dem Reagens zu erzeugen, das den Gehalt an 3-Hydroxybuttersäure in der flüssigen Probe angibt.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Schritt des Anlegens mindestens etwa 15 Sekunden nach dem Schritt des Kontaktierens geschieht.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Schritt des Anlegens etwa 50 Sekunden nach dem Schritt des Kontaktierens geschieht.
Verfahren nach Anspruch 14, ferner umfassend den Schritt des Messens der Hintergrundimpedanz des Analyten und des Reagens.