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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung einer Lichtmenge
für jeden
mehrerer in einer Ebene angeordneter Mikropunkte. Insbesondere betrifft
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Ablesen von Fluoreszenz
auf einem Biochip, auf dem biologische Substanzen, wie beispielsweise DNAs
oder Proteine, die mit einer zeitaufgelösten fluoreszierenden Substanz
markiert sind, als ein Array mit einer hohen Punktdichte angeordnet
sind.
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M.
Neumann et al. offenbaren in „Capillary array
scanner for time-resolved detection and identification of fluorescently
labelled DNA fragments", Journal
of Chromatography A, Elsevier science, NL, vol. 871, Nr. 1–2, 25.
Februar 2000 (2000-02-25), Seiten 299–310 ein Verfahren, bei dem
ein Kapillar-Array-Scanner zur zeitaufgelösten Erfassung von Fluoreszenzmarkierten
DNA-Fragmenten, der ein konfokales Fluoreszenzmikroskop umfaßt, das
eine räumliche
Trennung der individuellen Kanäle
ohne ein Übersprechen
zuläßt, und
ein X-Y-Mikroskop-Abtasttisch
verwendet wird, der ein diskontinuierliches bidirektionales Abtasten
ermöglicht.
Das Verfahren umfaßt
einen ersten Schritt eines Bestrahlens eines ersten Punktes mit
einem Erregungslicht und einen zweiten Schritt eines Erfassens von
Fluoreszenz vom ersten Punkt, wobei diese beiden Schritte für einen
zweiten Punkt wiederholt werden.
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Bei
momentan praktizierten Verfahren zur Analyse von chemischen und
physikalischen Eigenschaften biologischer Substanzen, wie beispielsweise
der DNA und von Proteinen, wird häufig Fluoreszenz verwendet.
Bei diesen Verfahren wird ein Biochip verwendet, auf dem biologische
Substanzen, wie beispielsweise DNAs oder Proteine mit einem eine
Fluoreszenzsubstanz umfassenden Marker markiert und in einem Mikropunkt-Array
hoher Dichte angeordnet sind. Um diese Punkte zu lesen, wird eine
Fluoreszenzlesevorrichtung benötigt,
welche die Punkte mit einem Laserstrahl abtastet, um die auf jedem
Punkt auf dem Biochip vorliegende fluoreszierende Markierung anzuregen,
so daß die
angeregte Fluoreszenz von jedem Punkt gelesen werden kann.
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7 ist
eine schematische Ansicht einer herkömmlichen Fluoreszenz-Lesevorrichtung.
Ein Biochip 101 ist durch eine rechtwinklige Glasplatte
gegeben, deren Oberfläche
mit DNAs versehen ist, die mit einer Fluoreszenzsubstanz Cy3 markiert
sind (Anregungswellenlänge:
552 nm, Fluoreszenzwellenlänge:
565 nm, Dauer: 1,3 ns), die als Mikropunkte in einer Matrix entlang
der x- und y-Richtung ausgerichtet sind. Der Biochip 101 wird
auf einem Tisch 121 angeordnet, der sich schrittweise mittels
eines Antriebsmotors für
die y-Richtung 103 in die y-Richtung bewegt. Ein über dem
Biochip 101 angeordneter Lesekopf 111 wird mittels
eines Antriebsmotors 114 für die x-Richtung kontinuierlich
in die x-Richtung bewegt. Ein von einer Laserlichtquelle 104 ausgesandter
Laserstrahl 110 wird über
den Lesekopf 111 auf den Biochip 101 eingestrahlt.
Die auf dem Biochip 111 erzeugte Fluoreszenz wird mittels
eines Photomultipliers 116 über den Lesekopf 111 erfaßt. Die
Leselichtquelle 104 emittiert einen Laserstrahl bei einer Wellenlänge von
552 nm, die sich zur Anregung des Markers Cy3 eignet.
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Beim
Lesen des Biochips 101 wird der Lesekopf 111 unter
der Steuerung eines Kontrollrechners 108 mittels des Antriebsmotors 114 für die x-Richtung längs einer
x-Achsenschiene 122 kontinuierlich in die x-Richtung bewegt.
In ähnlicher
Weise wird der Tisch 121, der den Biochip 101 trägt, unter
der Steuerung des Kontrollrechners 108 schrittweise entlang
einer y-Achsenschiene 123 in
die y-Richtung bewegt.
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Die 8A bis 8E sind
schematische Diagramme, die die Leseordnung der jeweiligen Punkte
auf dem Biochip 101 gemäß einem
herkömmlichen
Leseverfahren zeigen. Die Punkte sind in einer zweidimensionalen
Matrix entlang der x- und y-Richtung angeordnet. Ein schwarzer Punkt
gibt einen Punkt wieder, dessen Fluoreszenz gelesen wurde, während ein
weißer
Punkt einen Punkt wiedergibt, dessen Fluoreszenz noch nicht gelesen
wurde.
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Wie
in den 8A bis 8C gezeigt
ist, werden die Punkte 119 auf dem Biochip 101 mit
dem Laserstrahl mit einer konstanten Rate bestrahlt. Die Bestrahlung
durch den Laserstrahl sowie das Lesen der durch die Bestrahlung
mit dem Laserstrahl hervorgerufenen Fluoreszenz finden gleichzeitig
und kontinuierlich statt. Wie in 8C gezeigt
ist, kehrt der Lesekopf 111 zum linken Ende derselben Reihe zurück, sobald
das Abtasten einer einzelnen Reihe in der x-Richtung beendet ist. Dann wird der
Tisch 121 stufenweise versetzt, um den Biochip 101 über eine der
Auflösung
entsprechenden Strecke in die y-Richtung zu befördern. Dann wird die nächste Reihe
kontinuierlich in der x-Richtung abgetastet, wie in den 8D und 8E ge zeigt
ist. Durch Wiederholen dieser Schrittreihen wird die gesamte Fläche des
Biochips 101 vollständig
abgetastet.
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Wenn
eine fluoreszierende Substanz wie beispielsweise Cy3 zur Markierung
einer biologischen Substanz verwendet wird, sollte die Fluoreszenz
während
der Einstrahlung eines Erregungslichts gelesen werden, da die Dauer
der Fluoreszenz kurz ist und lediglich einige wenige ns beträgt. Obwohl
das Element zur Erfassung der Fluoreszenz mit einem optischen Filter
oder dergleichen versehen ist, der lediglich die Wellenlänge der
Fluoreszenz durchläßt und das
Erregungslicht sperrt, ist es schwierig, lediglich die Fluoreszenz
zu erfassen, wobei das Anregungslicht vollständig abgehalten wird, da die
Intensität
der Fluoreszenz der fluoreszierenden Markierung außerordentlich
schwach ist und lediglich ungefähr
1/1000000 der Intensität
des anregenden Laserstrahls beträgt.
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Daher
sollte eine zeitaufgelöste
fluoreszierende Substanz, wie beispielsweise Europium (Dauer: 400 μS), mit einer
im Vergleich zu beispielsweise Cy3 (Dauer: 1,3 ns) sehr großen Fluoreszenzdauer verwendet
werden. Abhängig
von der relativen Dauer behält
die zeitaufgelöste
fluoreszierende Substanz, die mit der Strahlung des Laserstrahls
angeregt wurde, den Anregungszustand auch noch nach der Bestrahlung
durch den Laserstrahl bei. Durch Verwenden dieser Eigenschaft können die
Bestrahlung mittels des Laserstrahls und das Lesen der Fluoreszenz asynchron
ausgeführt
werden, so daß das
Lesen der Fluoreszenz nach der Anregung durch die Bestrahlung mit
Licht stattfindet, wodurch eine Verschlechterung des S/R-Verhältnisses
verhindert wird, die durch Erfassen des anregenden Laserstrahls
während
des Lesens der Fluoreszenz hervorgerufen wird. Jedoch kann das S/R-Verhältnis der
Erfassung der Fluoreszenz der Punkte selbst bei einer Verwendung
einer derartigen zeitaufgelösten
Fluoreszenzsubstanz als Markierung ungünstig sein, da die zeitaufgelösten Fluoreszenzsubstanzen
auf dem Biochip mittels einer herkömmlichen Fluoreszenzlesevorrichtung
entlang des Einstrahlungswegs des Laserstrahls gelesen werden und
somit aufgrund der längeren
Dauer resultierende Restfluoreszenz zu einem Rauschen werden und
mit dem Lesen des benachbarten Punktes interferieren kann.
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Angesichtes
der oben erwähnten
Probleme ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
zum Lesen von Fluoreszenz bereitzustellen, mit dem eine durch die
Restfluoreszenz von einem benachbarten Punkt verursachte Verschlechterung des
S/R-Verhältnisses,
die aus der Verwendung der zeitaufgelösten Fluoreszenzmarkierung
resultiert, verhindert werden kann, um ein Lesen der Fluoreszenz
mit einem hohen S/R-Verhältnis
zu realisieren.
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Abriß der Erfindung
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Um
die obengenannte Aufgabe zu lösen, wird
gemäß dem erfindungsgemäßen Fluoreszenzableseverfahren
Fluoreszenz durch Einstrahlen von Erregungslichtlicht auf mehrere
Punkte, die in vorgegebenen Intervallen angeordnet sind, wobei jeder Punkt
eine Substanz umfaßt,
die mit einer zeitaufgelösten
Fluoreszenzsubstanz markiert ist, und Erfassen der von jedem der
mehreren Punkte erzeugten Fluoreszenz gelesen, wobei das Verfahren
umfaßt: einen
ersten Schritt des Beleuchtens eines ersten Punktes mit Erregungslicht
während
einer vorgegebenen Zeitspanne; einen zweiten Schritt eines Erfassens
von Fluoreszenz, die von dem ersten Punkt erzeugt wird, nachdem
er mit dem Erregungslicht beleuchtet wurde; einen dritten Schritt
eines Beleuchtens eines zweiten Punktes mit Erregungslicht, wobei der
zweite Punkt vom ersten Punkt um eine Strecke entfernt ist, die
das Doppelte oder ein Mehrfaches der Strecke zwischen benachbarten
Punkten beträgt; und
einen vierten Schritt eines Erfassens von Fluoreszenz, die von dem
zweiten Punkt erzeugt wird, nachdem er mit Erregungslicht beleuchtet
wurde, wobei der dritte und der vierte Schritt wiederholt werden, um
die Fluoreszenz aller Punkte zu erfassen.
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Die
mehreren Punkte können
in einer zweidimensionalen Matrix entlang der x- und y-Richtung, in einem
konzentrischen Muster oder in einem Spiralmuster angeordnet sein.
Ein zweiter Punkt, der vom ersten Punkt um eine Strecke entfernt
ist, die das Doppelte oder ein Mehrfaches der Strecke zwischen benachbarten
Punkten beträgt,
ist typischerweise zwei Punkte vom ersten Punkt entfernt, der gerade einer
Fluoreszenzerfassung unterzogen wurde.
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Die
zeitaufgelöste
Fluoreszenzsubstanz gemäß der vorliegenden
Erfindung betrifft eine Fluoreszenzsubstanz, die für eine Dauer
von 10 ns oder länger
andauert. Beispiele der zeitaufgelösten Fluoreszenzsubstanz umfassen
Europium (Anregungswellenlänge
326 nm, Fluoreszenzwellenlänge
612 nm, Dauer 400 μs)
und Luziferin. Um die Empfindlichkeit der Detektion zu verbessern,
ist eine längere
Dauer erstrebenswert.
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Gemäß dem oben
beschriebenen Verfahren kann eine unerwünschte Erfassung des Erregungslichts
sowie eine unerwünschte
Erfassung der von einem bereits erfaßten Punkt ausgesandten zeitaufgelösten Fluoreszenz
vermieden werden, wodurch das S/R-Verhältnis der Fluoreszenzdetektion
deutlich verbessert wird.
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Gemäß einem
Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung wird Fluoreszenz durch Einstrahlen von Erregungslicht
auf mehrere Punkte abgelesen, die auf einer Linie in vorgegebenen
Intervallen angeordnet sind, wobei jeder Punkt eine Substanz umfaßt, die
mit einer zeitaufgelösten
Fluoreszenzsubstanz markiert ist, und Detektieren der von jedem der
mehreren Punkte erzeugten Fluoreszenz, wobei ein Arbeitsvorgang
eines Einstrahlens von Erregungslicht auf einen Punkt während einer
vorgegebenen Zeitspanne und eines nachfolgenden Detektierens von
Fluoreszenz, welche von diesem Punkt erzeugt wurde, nacheinander
für jeden
n-ten Punkt ausgeführt
wird (wobei n eine ganze Zahl größer oder gleich
2 ist), und dann, wenn der Arbeitsvorgang das Ende der Linie erreicht,
das Verfahren zum Anfang der Linie zurückkehrt und für jeden
n-ten Punkt (wobei n eine ganze Zahl größer oder gleich 2 ist) beginnend
bei einem Punkt der einer Fluoreszenzdetektion noch nicht unterzogen
wurde, wiederholt wird.
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Des
weiteren wird gemäß einem
Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung Fluoreszenz durch Einstrahlen von Erregungslicht auf mehrere Punkte
abgelesen, die auf einer Linie in vorgegebenen Intervallen angeordnet
sind, wobei jeder Punkt eine Substanz umfaßt, die mit einer zeitaufgelösten Fluoreszenzsubstanz
markiert ist, und Detektieren der von jedem der mehreren Punkte
erzeugten Fluoreszenz, wobei ein Arbeitsvorgang eines Beleuchtens
eines Punktes mit Erregungslicht während einer vorgegebenen Zeitspanne
und eines nachfolgenden Detektierens von Fluoreszenz, welche von
diesem Punkt erzeugt wurde, nacheinander für jeden zweiten Punkt ausgeführt wird,
und dann, wenn das Verfahren das Ende der Linie erreicht, das Verfahren
zum Anfang der Linie zurückkehrt
und für
die verbleibenden Punkte wiederholt wird.
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Die
mit der zeitaufgelösten
Fluoreszenzsubstanz markierte Substanz kann gemäß dem oben beschriebenen Verfahren
zum Ablesen von Fluoreszenz eine biologische Substanz sein.
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Kurzbeschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
eine schematische Ansicht, in der ein Beispiel einer Fluoreszenzlesevorrichtung
gezeigt ist, mit der das erfindungsgemäße Verfahren ausgeführt werden
kann;
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2A und 2B sind
Diagramme zur Darstellung eines konfokalen optischen Systems;
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3 ist
eine Graphik, die Kurvenformen des Abklingens der Fluoreszenz von
Cy3 und Europium zeigt;
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4 ist
eine Graphik, die eine mit einer konfokalen Objektivlinse erfaßte Lichtverteilung zeigt;
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5 ist
ein Diagramm, das Zeitpunkte einer Bestrahlung mit einem Laserstrahl,
einer Erfassung von Fluoreszenz und zum Bewegen des Kopfes zeigt;
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6A bis 6G sind
Diagramme zur Darstellung einer Reihenfolge zum Ablesen von Punkten gemäß der vorliegenden
Erfindung;
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7 ist
eine schematische Ansicht, in der eine herkömmliche Fluoreszenzlesevorrichtung
gezeigt ist; und
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8A bis 8E sind
Diagramme zur Darstellung einer Reihenfolge zum Ablesen von Punkten gemäß einem
herkömmlichen
Verfahren.
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Bevorzugte
Ausführungsformen
der Erfindung
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Im
nachfolgenden wird eine Ausführungsform
zur Ausführung
der vorliegenden Erfindung in Einzelheiten mit Bezugnahme auf die
begleitenden Zeichnungen beschrieben. Darin handelt es sich bei einer
als eine Markierung verwendeten zeitaufgelösten Fluoreszenzsubstanz um
Europium mit einer Anregungswellenlänge von 326 nm, einer Fluoreszenzwellenlänge von
612 nm und einer Dauer von 400 μs.
Jedoch ist die vorliegende Erfindung gleichfalls auf andere zeitaufgelöste Fluoreszenzsubstanzen
anwendbar. Die numerischen, in der vorliegenden Beschreibung dargelegten
Werte dienen lediglich der Veranschaulichung und stellen keine Beschränkung der
vorliegenden Erfindung dar.
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1 ist
eine schematische Darstellung, die ein Beispiel einer Fluoreszenzlesevorrichtung
zeigt, mit der das erfindungsgemäße Verfahren
ausgeführt werden
kann. Ein Biochip 1 ist beispielsweise eine rechteckige
Glasplatte mit 25 mm × 75
mm. Die Oberfläche
des Biochips 1 ist mit Europium-markierten (mit einer zeitaufgelösten Fluoreszenzsubstanz markierten)
DNA-Mikropunkten 2 versehen, die jeweils einen Durchmesser
von 50 μm
aufweisen und in einem Gittermuster in der x- und y-Richtung angeordnet
sind und voneinander um 100 μm
beabstandet sind. Der Biochip 1 wird auf einem Tisch 21 gehalten, der
stufenweise entlang einer y-Achsenschiene 23 und mittels
eines Antriebsmotors 3 für die y-Richtung bewegt wird.
Ein Lesekopf 11, der Teile eines optischen Systems zur
Bestrahlung mit einem Laserstrahl und ein optisches System zur Erfassung
von Fluoreszenz umfaßt,
werden linear entlang einer x-Achsenschiene 22 mittels
eines Antriebsmotors 14 für die x-Richtung als Steppermotor
bewegt. Die Antriebsmotoren 14 und 3 für die x-
bzw. y-Richtung werden mit einem Kontrollrechner 8 gesteuert.
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Ein
Laserstrahl bei einer Wellenlänge
von 326 nm, der von einer Laserlichtquelle 4 ausgesandt wird, ändert seinen
Verlauf mittels eines total reflektierenden Spiegels 9 so,
daß er
sich längs
eines optischen Weges 10 für das Bestrahlungslicht ausbreitet,
der parallel zur Transferrichtung des Lesekopfes 11 eingerichtet
ist und mit einem Pfeil x bezeichnet ist, so daß er auf einen dichromatischen
Spiegel 12 einfällt.
Da der dichromatische Spiegel 12 so aufgebaut ist, daß er den
Erregungslichtstrahl bei einer Wellenlänge von 326 nm reflektiert
und Licht anderer Wellenlängen
hindurchgehen läßt, wird
der sich längs
des optischen Weges 10 für das Bestrahlungslicht ausbreitende
einfallende Laserstrahl in der Figur vollständig nach unten reflektiert,
so daß er
auf eine konfokale Objektivlinse 13 einfällt. Die
konfokale Objektivlinse 13 ist im Lesekopf 11 angeordnet
und von der Oberfläche
des Biochips 1 um ihre Brennweite beabstandet, so daß der vom
dichromatischen Spiegel 12 reflektierte Laserstrahl verengt
und auf die Oberfläche
des Biochips 1 als Mikropunktlicht eingestrahlt wird und
so daß Licht
von der Oberfläche
des Biochips 1 konvergiert wird.
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Wenn
Licht mit einer anderen Wellenlänge als
ungefähr
326 nm an der Oberfläche
des Biochips 1 erzeugt wird, tritt dieses Licht durch die
konfokale Objektivlinse 13 und auch durch den dichromatischen
Spiegel 12 in der Figur in der Richtung nach oben hindurch,
so daß es
auf den total reflektierenden Spiegel 15 einfällt. Hier ändert sich
der Verlauf des Lichtes so, daß es
sich entlang eines optischen Wegs 16 zur Lichterfassung
ausbreitet, der parallel zum optischen Weg 10 zur Lichteinstrahlung
des Laserstrahls gerichtet ist, wobei das Licht vom Laserkopf 11 abgegeben
wird. Das vom Laserkopf 11 abgegebene Licht breitet sich
entlang des optischen Wegs 16 zur Lichterfassung aus, tritt
durch ein Filter 5, das einen Durchlaßbereich bei ungefähr 612 nm aufweist
(der Wellenlänge
von Europium), eine Diaphragmenlinse 17 und eine Lochblendenplatte 18 hindurch
und fällt
auf einen Photomultiplier 6 ein. Der Photomultiplier 6 erfaßt Photonen
und erzeugt einen TTL-Pegel-Puls (L-Pegel: 0 V, H-Pegel: 2,5 V).
Die Zahl der vom Photomultiplier 6 pro Zeiteinheit ausgegebenen
Pulse ist proportional zur Zahl der Photonen. Der vom Photomultiplier 6 als
ein Photonenpuls 7 für
Europium ausgegebene Puls wird mittels eines Verstärkers 28 verstärkt, mittels
eines A/D-Wandlers 29 in ein Digitalsignal umgewandelt
und zum Kontrollrechner 8 ausgegeben.
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Bei
der Vorrichtung wird ein konfokales optisches System zur Einstrahlung
von Erregungslicht und zum Konvergieren von Fluoreszenz verwendet. Der
Begriff „konfokal" bezieht sich auf
einen Zustand, in dem sich die Lichtquelle und der Lichtdetektor
in einer optisch konjugierten Positionsbeziehung im Verhältnis zur
Objektivlinse befinden; d.h. von einem Punkt auf der Lichtquelle
ausgesandtes Licht wird auf einen Punkt des Detektors konvergiert.
Um diesen Zustand zu erreichen, werden, wie in 2A gezeigt ist,
vollständig äquivalente
Linsensysteme sowohl auf der Einstrahlungsseite 26 als
auch auf der Detektionsseite 25 und Lochblenden 18a und 18b vor
der Lichtquelle 4 bzw. dem Detektor 6 vorgesehen,
wobei die Linsensysteme als konfokale Punkte dienen. In der Praxis
wird jedoch der dichromatische Spiegel 12 vorgesehen, um
ein Linsensystem zu verwenden, das sowohl für die Einstrahlungsseite als
auch die Detektionsseite verwendbar ist, wie in 2B gezeigt
ist. Aufgrund dieses Aufbaus wird mit dem vorliegenden konfokalen
System lediglich Fluoreszenz von einer Probe bzw. reflektiertes
Licht erfaßt
(bei dem durchgelassenen Lichtbild handelt es sich nicht um das
konfokale Bild). Da die Lichtquelle und der Detektor miteinander über entsprechende
Punkte korreliert sind, wird für
die Probe lediglich Information von Punkten erhalten. Somit muß die Probe
im Inneren abgetastet werden, um eine zwei- oder dreidimensionale
Information zu erhalten.
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Das
von der Laserlichtquelle 4 ausgegebene Laserlicht bei einer
Wellenlänge
von 326 nm wird in der x-Richtung über den Biochip 1 gerastert,
wobei der Laserkopf 11 mit dem Antriebsmotor 14 für die x-Richtung
angetrieben wird. Wenn das Laserlicht auf einen Punkt eingestrahlt
wird, der eine mit Europium markierte DNA enthält, wird das Europium angeregt
und Fluoreszenz erzeugt. Die Menge des erzeugten Fluoreszenzlichts
hängt von
der Menge der Fluoreszenzsubstanz ab (in diesem Beispiel Europium),
die im Punkt enthalten ist.
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3 ist
eine Grafik, die die Kurvenform des Abklingens der von Cy3 abgegebenen
Fluoreszenz 27 und der von Europium ausgesandten zeitaufgelösten Fluoreszenz 20 zeigt.
Die horizontalen und vertikalen Achsen geben die Zeit nach einer
Bestrahlung mit Erregungslicht bzw. die Fluoreszenzintensität wieder.
Die Fluoreszenzintensität
ist normiert, so daß die
Fluoreszenzintensität
unmittelbar nach einer Bestrahlung mit Erregungslicht eins ist.
Wie in 3 gezeigt ist, bleibt bei einer zeitaufgelösten Fluoreszenzsubstanz,
wie beispielsweise Europium, der Erregungszustand sogar nach der
Einstrahlung eines Laserstrahls für eine gewisse Dauer erhalten.
Diese Eigenschaft kann dazu verwendet werden, die Einstrahlung von
Laser licht und das Ablesen der Fluoreszenz auf asynchrone Weise
auszuführen.
Dementsprechend kann anders als bei herkömmlichem Cy3 oder anderen fluoreszierenden
Substanzen verhindert werden, daß der Erregungslaserstrahl
als Rauschen beim Ablesen der Fluoreszenz erfaßt wird. Somit kann ein höheres S/R-Verhältnis als
das beim Ablesen herkömmlicher
Fluoreszenz (ein S/R-Verhältnis
von ungefähr
10) erhalten werden.
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Jedoch
kann das S/R-Verhältnis
beim Ablesen von Fluoreszenz durch die oben beschriebene Eigenschaft
der zeitaufgelösten
Fluoreszenz verschlechtert werden. Wenn die benachbarten Punkte auf
dem Biochip nacheinander mittels des Lesekopfes 11 in der
x-Richtung entsprechend der herkömmlichen
Abtastungstechnik, die in 8 gezeigt
ist, abgelesen werden, wird eine aus der langen Dauer der zeitaufgelösten Fluoreszenz
des vorhergehenden Punktes resultierende Restfluoreszenz als Rauschen erfaßt.
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4 ist
eine Grafik, in der eine Verteilung der Fluoreszenzintensitäten von
mittels einer Objektivlinse unmittelbar über dem Ursprung konvergiertem
Licht zeigt, wobei ein konfokales System verwendet wird, bei dem
eine Fluoreszenzlichtquelle die gesamte Fläche der x- und y-Ebene mit einer gleichen Intensität abdeckt.
Die Grafik zeigt eine Normalverteilung, in der die Intensitäten im Verhältnis zum
Wert am Ursprung normiert sind. Die Halbwertsbreite beträgt 10 μm. Da die
Größe des Punktes
auf dem Biochip 10 μm × 10 μm ist, ist
die mittlere Intensität
im Bereich von (x, y) = (–5
bis 5, –5
bis 5) die vom Zielpunkt stammende Fluoreszenzintensität und die
mittlere Intensität
im Bereich (x, y) = (5 bis 15, –5
bis 5) die vom benachbarten Punkt stammende Fluoreszenzintensität. Das Verhältnis der
vom benachbarten Punkt stammenden Fluoreszenzintensität zur Fluoreszenzintensität vom Zielpunkt
beträgt
18,91% und das Verhältnis
der Fluoreszenzintensität
mit Ursprung vom zwei Punkte vom Zielpunkt entfernten Punkt beträgt 0,04%.
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Wenn
die Abtastgeschwindigkeit des Lesekopfes 11 in der x-Richtung
1,25 m/s ist, bewegt sich der Kopf in 8 μs zwischen benachbarten Punkten
(10 μm).
Basierend auf der Abklingkurvenform der in 3 gezeigten
Fluoreszenz beträgt
der Anteil der verbleibenden Fluoreszenzintensität innerhalb von 8 μs 91,49%
und 83,71%, wenn sich der Kopf 11 über eine Strecke von 2 Punkten
bewegt (d.h. 16 μs).
In Anbetracht dieser Fluoreszenzabschwächung im Verhältnis zur
Zeit beträgt
der Anteil der in der Fluoreszenz des Zielpunktes enthaltenen Restfluoreszenz
17,30% für
den vorhergehenden Punkt, der gerade abgetastet wurde, und 0,03%
für den
vom Zielpunkt um 2 Punkte entfernten Punkt. Daher ist gemäß der herkömmli chen
Fluoreszenzlesetechnik, bei der Fluoreszenz von in der x-Richtung
aufgereihten Punkten nacheinander abgelesen wird, das S/R-Verhältnis ungefähr 5,8,
so daß sich
aus der Verwendung von zeitaufgelöster Fluoreszenz kein Vorteil
ergibt. Gemäß dem vorliegenden
Verfahren wurde ein Abtasten mit dem Lesekopf 11 zum Minimieren
des Effektes der Restfluoreszenz vom benachbarten Punkt entwickelt.
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Im
nachfolgenden wird ein Verfahren zum Ablesen von Fluoreszenz gemäß der vorliegenden Erfindung
mit Bezugnahme auf die 5 und 6A bis 6G beschrieben. 5 ist
ein Diagramm, in dem der zeitliche Ablauf der Einstrahlung eines
Laserstrahls, der Erfassung von Fluoreszenz und des Antriebs des
Lesekopfes gezeigt sind. 6A bis 6G sind
schematische Diagramme zur Veranschaulichung der Reihenfolge zum
Lesen von Punkten gemäß der vorliegenden
Erfindung. In 6 gibt ein schwarzer
Punkt einen Punkt wieder, dessen Fluoreszenz abgelesen wurde, während ein weißer Punkt
einen Punkt wiedergibt, dessen Fluoreszenz noch nicht abgelesen
wurde.
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Wie
in 5 gezeigt ist, wird der Lesekopf 11 intermittierend
in der x-Richtung bewegt und beispielsweise über jedem zweiten Punkt angehalten. Während der
Lesekopf angehalten ist, finden ein Einstrahlen eines Laserstrahls
und das Ablesen von zeitaufgelöster
Fluoreszenz statt. Das Ablesen der zeitaufgelösten Fluoreszenz wird mit torgesteuerten Ausgangssignalen
vom torgesteuerten Photomultiplier 6 ausgeführt. Der
Lesevorgang wird nach dem Einstrahlen des Laserstrahls durchgeführt, um
den Einfluß des
Erregungslaserstrahls zu vermeiden.
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6A bis 6G zeigen
schematisch die Anordnung der Punkte auf dem Biochip und die Reihenfolge
des Lesens der Punkte. Hier wird die Position eines Punktes, bei
dem es sich um den „m-ten" in der x-Richtung
und um „n-ten" in der y-Richtung handelt,
als (m, n) wiedergegeben. Bei diesem Beispiel wird Fluoreszenz,
wie in den 6A und 6B gezeigt
ist, für
jeden zweiten Punkt, d.h. (1, 1), (3, 1), (5, 1) usw. abgelesen.
Durch Auslassen jedes zweiten Punktes in der x-Richtung beim Ablesen der
Fluoreszenz entsteht kein schädlicher
Effekt durch die vom Punkt, der gerade angeregt wurde, stammende
zeitaufgelöste
Fluoreszenz. Wie in 6B gezeigt ist, bewegt sich
der Lesekopf zurück zum
Anfang derselben Linie zu einem Punkt, der um einen Punkt gegenüber dem
ersten Ablesepunkt (1, 1) in der x-Richtung verschoben ist (d.h.
der Punkt (2, 1), nachdem der Lesekopf das Abtasten bis zum Ende
der Zeile beendet hat. Wie in den 6C und 6D gezeigt
ist, wird derselbe Arbeitsschritt mit denselben Intervallen wiederholt.
Mit anderen Worten werden dieses Mal die Punkte in der Reihenfolge (2,
1), (4, 1), (6, 1) usw. abgelesen. Folglich werden durch zweifaches
Abtasten alle Punkte auf dieser Zeile vollständig abgetastet.
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Als
nächstes
wird der Tisch 21 mittels des Antriebsmotors 3 für die y-Richtung
so bewegt, daß der
Biochip 1 im Verhältnis
zum Lesekopf 11 um einen Punkt in die y-Richtung befördert wird.
Auf ähnliche
Weise wird, wie in den 6E und 6F gezeigt
ist, das Ablesen der Fluoreszenz für die zweite Zeile für jeden
zweiten Punkt in der x-Richtung durchgeführt, d.h. (1, 2), (3, 2), (5,
2) usw. Dann wird durch Zurückbewegen
zum Beginn der zweiten Zeile das Ablesen der Fluoreszenz durch den
Kopf 11 für
die verbleibenden Punkte (2, 2), (4, 2), (6, 2) usw., wie in 6G gezeigt
ist, durchgeführt.
Dieser Arbeitsschritt wird für
alle Punkte auf dem Chip wiederholt. Gemäß diesem Verfahren zum Lesen
von Fluoreszenz steigt das S/R-Verhältnis auf
ungefähr
3000 an. Jedoch verdoppelt sich näherungsweise die zur Beendigung
des Lesens der Fluoreszenz für
alle Punkte erforderliche Zeit.
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Für eine Fluoreszenzmarkierung
mit Cy3 ist das Lesen mit Überspringen
gemäß der vorliegenden Erfindung
nutzlos, da die Dauer der Fluoreszenz für Cy3, d.h. 1,3 ns, im Vergleich
zur Zeit für
die Bewegung des Lesekopfes 11 zum benachbarten Punkt (d.h.
8 μs) ziemlich
kurz ist (3). Das herkömmliche sequentielle Abtasten
kann zum Lesen einer zeitaufgelösten
Fluoreszenz, um ein hohes S/R-Verhältnis zu erhalten, verwendet
werden, indem die Zeit zum Verschieben des Kopfes zwischen den Punkten verlängert wird,
so daß es
der Fluoreszenzdauer der zeitaufgelösten Fluoreszenz angepaßt ist.
Da jedoch die Dauer von Europium (400 μs) 50 mal so lang ist wie die
Zeit zum Bewegen des Lesekopfes in der herkömmlichen Weise (8 μs), benötigt das
Ablesen der Fluoreszenz eine Zeit, die ungefähr 25 mal länger ist als die gemäß dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung. Die zum Ablesen von Fluoreszenz erforderliche
Zeit beträgt
5 Minuten für
ein herkömmliches
Ablesen mit Cy3, 10 Minuten gemäß der vorliegenden Erfindung
und bis zu 250 Minuten gemäß dem herkömmlichen
Verfahren, bei dem eine zeitaufgelösten Fluoreszenzsubstanz verwendet
wird, was offensichtlich unpraktisch ist.
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Durch
Verwenden des erfindungsgemäßen Verfahrens
zum Ablesen von zeitaufgelöster
Fluoreszenz kann das S/R-Verhältnis
gegenüber
einem herkömmlichen
Ableseverfahren deutlich verbessert werden, ohne die Ablesedauer
stark zu verlängern.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung kann das aufgrund der Länge der Halbwertsdauer der
Fluoreszenzintensitätseigenschaften
der zeitaufgelösten Fluoreszenz
erzeugte Fluoreszenzrauschen einer zeitaufgelösten Fluoreszenz deutlich verkürzt werden,
so daß eine
Interferenz mit einem benachbarten Bereich verhindert werden kann
und Daten mit einem hohen S/R-Verhältnis erhalten
werden.