WO2009002225A2 - Многофункциональное устройство для диагностики и способ тестирования биологических объектов - Google Patents
Многофункциональное устройство для диагностики и способ тестирования биологических объектов Download PDFInfo
- Publication number
- WO2009002225A2 WO2009002225A2 PCT/RU2008/000389 RU2008000389W WO2009002225A2 WO 2009002225 A2 WO2009002225 A2 WO 2009002225A2 RU 2008000389 W RU2008000389 W RU 2008000389W WO 2009002225 A2 WO2009002225 A2 WO 2009002225A2
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- light
- screens
- group
- screen
- sample
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
- G01N21/251—Colorimeters; Construction thereof
- G01N21/253—Colorimeters; Construction thereof for batch operation, i.e. multisample apparatus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
- G01N21/255—Details, e.g. use of specially adapted sources, lighting or optical systems
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N2021/1738—Optionally different kinds of measurements; Method being valid for different kinds of measurement
- G01N2021/174—Optionally different kinds of measurements; Method being valid for different kinds of measurement either absorption-reflection or emission-fluorescence
Definitions
- the invention relates to a device for scanning diagnostic results in medicine, veterinary medicine, food control, forensic science and other areas of diagnostics related to the analysis of biologically active components.
- the invention relates to devices for scanning various types of objects deposited on a solid carrier, for example, made in the form of biochips, or to devices for recording biological objects in solutions placed in cuvettes, multiplates or hybridization chambers, chromatographic media, gels.
- a solid carrier for example, made in the form of biochips
- devices for recording biological objects in solutions placed in cuvettes, multiplates or hybridization chambers, chromatographic media, gels are examples of the art.
- optical signals obtained during the diagnosis of biological samples There are many technical solutions associated with the formation and registration of optical signals obtained during the diagnosis of biological samples. Colorimetric or fluorescent labels are most often used to record a signal and identify objects. Highly specialized optical devices designed to operate in one of the measurement modes of the optical signal interacting with the test sample are widespread. Such modes include measuring optical transmittance, measuring the reflection signal from the surface of the sample, measuring the level of fluorescence, luminescence, or measuring the signal of the resonant interaction of molecules in the BRET [1] or FRET modes.
- biological samples can be placed on a solid basis, for example, made in the form of slides [2] or biochips [3].
- biological samples are examined in solutions placed in open cells of multiplates [1] or in sealed cuvettes, for example, for hybridization [4].
- Multifunctional devices are mainly used for mass screening in large test laboratories, clinics or scientific laboratories.
- the test sample can be placed in a cuvette or in a microplate.
- a monochromator and many optical filters are introduced into the device.
- the transmission of optical signals through optical fibers allows you to convert optical systems to work in different modes.
- the device uses a mechanism for moving the position of the microboard under the control of the processor, which additionally controls the choice of wavelength.
- the known method [6] in which the sample is detected in different modes and calculate the detection result for one or many samples.
- the analysis results are obtained using photoluminescence, chemiluminescence, measurement of absorption or scattering of light.
- the device is made on a block basis. Optical fibers are used to transmit optical signals.
- the device is designed to measure in microboards with many individual cells.
- an illumination pattern of a sample placed in microboards and an optical signal measurement circuit in the modes of measuring fluorescence, luminescence, and also measuring light absorption are formed.
- two-coordinate displacement is used under computer control.
- a device for measuring luminescence and fluorescence [1] which provides the ability to create at least three options for the excitation of luminescence and fluorescence and signal absorption due to the formation of different optical schemes.
- a common drawback of the considered devices is the large number of optical elements, the complexity of the design and the need to use accurate mechanisms for moving objects along the XY coordinates, mechanisms for switching filters and the optical signal path, as well as the loss of optical signals when transmitting signals through optical fibers.
- Another group of devices for diagnosing biological objects is associated with the construction of structures that allow the measurement of fluorescence signals in solutions in real time, for example, in the analysis of hybridization or amplification.
- Known optical device [8] for monitoring PCR reactions in cells installed in a block with temperature control The emission light flux from each cell, formed using a Fresnel lens, is recorded by a CCD detector.
- a device for amplification and detection of nucleic acids in real time [9, 10].
- a device for ip-situ detection of luminescence of biological objects is known [2]. The device uses a drive that moves the sample in the coordinate coordinates under the control of a computer.
- a device for the hybridization of nucleic acids on the solid surface of biochips placed inside a liquid cell [4].
- the optical scheme for illuminating the working surface of the biochip is based on the dark-field principle.
- the presented schemes for measuring optical signals in real time relate to highly specialized devices, do not involve working with biological samples immobilized on biochips, do not contain elements that contribute to increasing the signal-to-noise ratio, and are made according to standard schemes.
- a large number of scanners or microscopes operating on the confocal principle are known in which a UV radiation stream is incident on the face of the surface of the solid support of the object and causing fluorescence of the sample [3, 11 - 18].
- the device contains a large number of additional elements, has a small image size, and requires moving along the coordinates of the solid support on which the object under study is placed, or moving the optical system relative to a stationary object.
- fluorescence is formed by passing the light flux of ultraviolet radiation from the back of the biochip through a transparent solid sample carrier in the direction of the receiving CCD matrix.
- a flux of UV light falls on the surface of the carrier in the direction perpendicular to the surface of the biochip [19] or at an angle to the surface of the carrier [20].
- absorbing elements are introduced into the optical device circuits. From the prior art, which are included only as information sources, it is known that absorbing elements are used in optical systems for controlling the quality of the surface of semiconductor wafers [27-28], used in optical schemes for confocal microscopes [29], and used in cell monitoring systems in flow systems, using measurement of the reflected fluorescence signal [30].
- a confocal laser microscope is known [33], in which a corner reflector mounted on the opposite side of the object under study and lenses mounted on the front and back surfaces of the object under study are used to form a plane-parallel beam of light incident on the corner reflector, which returns incident light and directs the incident light him to the object under study, increasing the contrast of the image of the object.
- the closest technical solution to the invention is presented in patent RU 2182328 [24].
- the microscope allows operation in the dark field mode when measuring fluorescence signals and in the mode of transmission of the light flux through a transparent sample carrier. Disadvantages of this system are the small working field of illumination (diameter about 10 mm) and the influence of scattered radiation, worsening the signal-to-noise ratio.
- the objective of the invention is to simplify and reduce the cost of the optical system while maintaining the ability to convert optical circuits to select different modes of operation of the device when scanning the objects under study and at the same time increasing the signal-to-noise ratio.
- Another objective is to increase the scanning efficiency by constructing an optical system that allows the illumination of the largest possible working field of the biochip, cell or microplate to be formed.
- the next objective of the present invention is to develop a device design that provides the ability to work not only in a multi-mode process, but also with the ability to measure the parameters of samples placed in different environments or immobilized on different surfaces in real time.
- the object of this invention is a device for scanning diagnostic results and a method for conducting diagnostics.
- the possibility of changing the diagnostic modes is carried out by installing or changing elements located along the axis of the optical system and / or along the light beams generated by the light sources.
- the installed elements are made in the form of screens with an absorbing, reflecting, retroreflective or light-scattering surface, which allows to improve the signal-to-noise ratio by reducing the spurious background and / or increasing the level of the measured signal.
- An additional increase in the signal-to-noise ratio is provided by a light-absorbing surface located on the surface of the sample illuminators.
- the device contains optical radiation sources that form the illumination of the working field, an optical system, a detector, a mount for the holder of the sample, a solid carrier of the test sample.
- the device will have at least two light sources, forming the illumination of the working field, the optical system, the detector, the mount of the sample holder, the solid carrier of the test sample, and additionally contains the first and second group of screens, the first group containing at least one screen, and the second group contains at least , two screens.
- the screens of the first and second groups are installed behind the rear surface of the solid sample carrier, and the illuminators installed above the working surface of the sample carrier are equipped with absorbing elements for damping reflected light from the front surface of the sample carrier and screen surfaces.
- the screens of the first group are located perpendicular to the optical axis of the recording system, and the screens of the second group are located perpendicular to the optical axes of the illuminators.
- a further aspect of the present invention is that the front surface of the first screen included in the first group is configured to reflect or retroreflect the light fluxes coming from the first and second illuminators.
- the sample holder is configured to mount the first screen of the first group at a minimum distance from the rear surface of the solid carrier of the test sample. This distance can range from 0.01 mm to 10 mm. Preferably, about 0.1 mm, which protects the surface of the mirror from mechanical damage.
- the second screen of the first group is located relative to the rear surface of the solid sample carrier relative to the rear surface of the solid sample carrier at a distance exceeding the distance from the point of intersection of the lower boundary of the light flux and the side border of the optical cone of the recording system.
- the front surface of the second screen of the first group is provided with a light-absorbing layer.
- the third screen of the first group is located behind the second screen, and the front surface of the third screen is made diffusing in the form of a white matte surface.
- a further aspect of the invention is that the device further comprises first, second and third screens of the second group, located along the trajectories of the axes of the light flux at such a distance from the rear surface of the solid medium that the edge of the screens does not intersect the optical cone of the recording system, and the front surfaces of the first, second and the third screen of the second group are made of reflective, retroreflective and absorbing materials, respectively.
- the device comprises attachment points for the first, second and third screens of the first and second groups, which enable insertion or removal of the first and second screens from the optical axis trajectory.
- the attachment site of the first and second screens of the second group provides the ability to replace screens by removing screens from the trajectories of the optical axes of the illuminators or additionally contains a swivel connection between the mount and the screen holder and provides both the ability to replace screens by removing screens from the paths of the optical axes of the illuminators and the ability to rotate installed screens relative to the trajectories of the optical axes of the illuminators for removing screens from light beams when changing modes and work.
- Another object of the present invention is a method for diagnostic tests of a sample immobilized on a solid basis or placed in a reaction volume.
- a diagnostic mode is selected from the group including the measurement of fluorescence, luminescence, scattering or transmission of light
- one or more screens are introduced into the trajectory of the optical axes of the illuminators and / or into the trajectory of the optical axis of the recording system
- the test object is placed in the sample holder, they introduce it into the trajectory of the optical axes of the illuminators and the recording system
- the shooting conditions are selected, the first image is received and stored ue object outputted from the object trajectory of the optical axes of the lights and a recording system, is obtained and storing the second image, a differential image is formed between the first and second image, pixel-multiplied difference image on the normalization coefficients and launch processing program acquired image.
- FIG. 2 Block diagram of
- FIG. 3 Scheme of the formation of a collimated light beam.
- FIG. 4 Diagram of a device for diagnosing objects immobilized on a solid surface of a transparent carrier.
- FIG. 5 Device diagram with combined use of absorbing and reflecting screens for diagnostics of objects immobilized on a solid surface of a transparent carrier.
- FIG. 6 Device diagram providing a four-fold increase in the fluorescence or luminescence signal
- FIG. 7 Scheme of conversion of the supply light to the surface of the carrier on which the samples are placed in the form of clusters with probes.
- FIG. 8 Diagram of a device that allows scanning media with objects painted with colorimetric marks.
- FIG. 9 Section of a cuvette designed to operate the device in
- FIG. 10 Block diagram of the algorithm for processing the received data.
- FIG. 11 Images of clusters consisting of 13 points deposited on the surface of a modified glass chip in two signal measurement options. Where a) measurement without the use of a reflecting mirror; b) measurement using a reflective mirror, as shown in FIG. 6. Block diagram
- the technical problems of the invention related to increasing the signal-to-noise ratio and expanding the operating modes of the device can be performed by introducing additional screens and providing the ability to input and output screens from the trajectories of the optical axes of the device.
- the signal-to-noise ratio is increased by choosing the optical properties of the surface of these screens, and the mode selection is expanded by introducing not only screens with an absorbing surface, but also by using screens with reflective, retroreflective, and light-emitting surfaces.
- the structural block diagram of the device is shown in FIG. 1.
- the device consists of an optical receiving system (10) connected to the input of the recording and control system (80), the first ( ⁇ lrion) and the second (316) illuminators forming a luminous flux with an angle of divergence of the cone 2 ⁇ , the optical axis of the illuminators are located at an angle ⁇ to the optical axis (15) of the receiving system (10), which has a light collection angle ⁇ .
- the device further comprises a first (50) and a second (60a, 606) group of screens, as well as a mount (40) of carriers (41) of the objects under study.
- the device contains the following main components: an optical system (10), consisting of a first (11) and a second (12) part, between which a first (14) light filter, a photosensitive detector (21), a recording and control system (80) are installed, which includes a signal conversion unit (82), a computer (83) for collecting and processing data from a photosensitive detector (21), as well as for generating control signals to turn off or switch device nodes, such as a power source (84) )
- the device includes a display (81) of the first ( ⁇ l Corporation) and second (316) illuminators, a mount (40) (not shown in FIG.
- the screens of the first group are located along the optical axis (15), and the screens of the second group are located symmetrically with respect to the path of the optical axis (15) and are placed along the optical paths of the light fluxes (16a) and (166) formed by the first (3 Ia) and the second (316 ) illuminators.
- the device operates as follows. Light from the first (Zl réelle) and second (316) illuminators falls on the front surface (42) of the carrier (41) of the object under study at sharp angles ranging from ( ⁇ - ⁇ ) to ( ⁇ + ⁇ ) with respect to the optical axis ( fifteen). The luminescence light of the sample is collected by the optical system (10) and sent to a photosensitive detector (21). Part of the light penetrates through the transparent carrier (41) of the sample and enters the zone of arrangement of the screens included in the first (50) and second group (61a, 616). Depending on the selected operating mode, different types of screens of the first (50) and second (61a, 616) groups are installed. A simple replacement or removal of absorbing, reflective or retroreflective screens from the trajectories of the optical axes is the most easily implemented and leads to improved operational characteristics of the device.
- the centers of the first group of screens (50) are aligned with the optical axis (15) of the device, and the surfaces of the screens are perpendicular to the optical axis devices.
- the centers of the second group of screens (61a, 616) are aligned with the trajectories of the optical axes (16a, 166) of the illuminators, and the surfaces of the screens of the second group are perpendicular to the trajectories of the optical axes 16a and 166.
- the second group of screens is placed relative to the rear surface of the solid sample carrier at a distance (19) greater than the distance from the rear surface (43) of the sample carrier (41) to the point of intersection of the lower boundaries (22a, 226) of the light fluxes and side borders (24a, 246) optical cone (18) of the optical system (10).
- the reflected light from the screens (60a, 606) of the second group will not fall on the front surface (55) of the second screen of the first group and, at the same time, the reflected light from the front surface of the screens (60a, 606) of the second group will not be collected by the optical system ( 10).
- the carrier (41) of the investigated object is placed strictly perpendicular to the optical axis (15) of the device so that the working space on which the studied object is located is located inside the field of view AB of the recording optical system (10), and the working surface is aligned with the front focal plane of the first part (11) optical system (10).
- the device for positioning and mounting (40) of the carrier (41) of the object of study is made with the possibility of changing media in manual or automatic modes.
- the field of view AB on the working surface of the carrier (41) is illuminated using two identical, symmetrically located relative to the optical axis of the device, sources of exciting radiation (Zla, 316).
- the design of the fixture holders is made with the possibility of manual or automatic change of fixtures.
- the device implements the principle of dark-field lighting.
- the optical axis (16a, 166) of the illuminators makes an acute angle ⁇ with the optical axis (15) of the device, and the relation ( ⁇ - ⁇ )> ⁇ / 2 is fulfilled.
- the exciting radiation including specularly reflected from the object
- the angle ⁇ and the distance from the illuminators ( ⁇ necessarily, 316) to the test object can be changed during the adjustment of the device to improve the uniformity of lighting. 2, the extreme rays AD (246) and BC (24a) collected by the recording optics are dotted.
- the exciting radiation is absorbed, fluorochrome molecules bound to the object fluoresce.
- NA sin ( ⁇ / 2).
- the access door of the CD limits the field of view of the optical system.
- the formation of the telecentric path of the rays is necessary for the correct operation of the first interference filter (14).
- the light passes through a band-pass interference filter (14), the spectral characteristics of which are selected so as to pass the maximum of the useful signal (the fluorescence of the label) on the one hand, and to ensure the minimum penetration of spurious background light onto the detector (21).
- the last condition is provided mainly by three factors: a) the minimum penetration of the exciting light into the recording channel. This factor is influenced by the angle of incidence of the exciting light beam ⁇ , the angle of divergence of the beam ⁇ , the quality of the surfaces of the object and mirrors (the absence of stray light scattering), the total absorption of the exciting radiation inside the device, b) the minimum integral of the transmission spectrum of the exciting (32a, 326) and recording (14) light filters, as well as the ability of the light filter (14) to suppress exciting radiation; c) the minimum intrinsic fluorescence of the material of the carrier (41) of the object and the filter (14) in the passband of the filter (14).
- the design of the device allows you to change the filters (14) in manual or automatic mode.
- the light passing through the filter (14) is collected by the second part (12) of the optical system, in the rear focal plane of which there is a photosensitive layer of a matrix of photosensitive elements (21), for example, a CCD matrix.
- the parameters of the optical systems are selected so that the image ⁇ 'completely fills the matrix (21), the inlet PQ of the second part (12) of the optical system is equal to the outlet KM of the first, and the numerical apertures are as large as possible.
- the photosensitive elements of the matrix (21) convert the light signal into an electric one. Further, this signal is read, converted linearly, digitized and transmitted by an electronic device (82) to a computer (83), on the display of which an image of the working area of the object is formed.
- the first 11 and second 12 parts of the optical system (10) are high-quality optical systems (lenses) with high light transmission, largely free of geometric and chromatic aberrations. Chromatic aberrations are less able to influence the accuracy of measurements, since optics operates in quasi-monochromatic light emitted by a light filter 14. Inaccurate focusing that occurs when changing wavelengths does not affect the operation, because the depth of field of the optical system is quite large (of the order of 0.5-0.7 mm). Among the other characteristics of the lenses, one can distinguish: resolution, contrast transfer coefficient, integral and spectral transmittance of light, light scattering coefficient, drop in illumination (light collection) over the image field.
- the first part (11) of the optical system (10) a lens with a large focal length is used, which allows you to expand the size of the working area.
- the size of the working area of an object can vary within wide limits (for example, from 10 to 90 mm).
- projection is advisable to use projection as the first part (11) of the optical system or photographic lenses commercially available from industry.
- Important parameters are focal length, working distance, linear field of view, numerical aperture, entrance and exit hatches.
- the focal length of photo and projection lenses can vary from 50 to software mm. aperture from 0.17 to 0.26, field of view from 36x24 mm to 90x60 mm, working distance from 45 to 95 mm.
- the working segment (distance from the first lens to the focal plane) of the lens 11 should be large enough so as not to impede the passage of light from the illuminators.
- the resolution of the first optical system should be at least 20 lines per 1 mm.
- a lens specially designed to work with photosensitive arrays for example, a TV lens or a digital camera lens. It is enough to use a lens with a fixed focal length (monofocal) and with manual aperture setting. It is advisable to use TV lenses with a focal length of 25 to 12 mm, designed for a 2/3 "or 1/2" matrix. TV lenses must be selected with high resolution (“megapixel”), designed for machine vision (minimum geometric aberrations).
- the lens used must be designed to work with a matrix of a certain size. However, it can also be used with smaller matrices. For example, a lens marked 2/3 "can also work with 1/2", 1/3 "matrices, etc.
- a wide range of monochrome CCDs and CMOS sensors with sizes from 1/6" to 1 are currently available. , 8 “and more. The most common sizes are 1/3" (diagonal 6 mm), 1/2 "(diagonal 8 mm) and 2/3" (diagonal 11 mm). Matrices from 1 "and more are expensive, and matrices 1/4" or less have a small dynamic range and large noise.
- the focal length of the TV lens is selected based on the size of the working area A'B 'of the object of study, the focal length of the first lens and the size of the matrix. It is important that the entrance door PQ of the second lens is approximately equal to the exit door KM of the first lens and the light transmitting diameter of the interference filter 14.
- the interference light filters (32a, 326) located on the illuminators have a passband from 40 to 60 nm.
- the light filter (14) has bandwidth from 30 to 50 nm. It is very important that the overlap integral of the transmission spectra of the filters (32a, 326) and (14) is minimal, because The signal-to-noise ratio of the device directly depends on this. Filters should have a guaranteed attenuation of light outside the passband equal to 10 6 , but about 10 actually (according to the manufacturer).
- the criterion for the selection of a pair of filters (14) and (32) is empirically established as the absence of a visible glow of light emitting diodes (LEDs), evaluated visually in a dark room, when the filter (14) is superimposed on the filter (32) when the illuminator is turned on at maximum power.
- LEDs light emitting diodes
- LEDs are used to create fluorescence scanners or a microscope oriented to scanning biochips [24, 34]. Using LEDs, it is possible to provide illumination of the sample and excitation of its fluorescence for different fluorescence recording schemes. Due to the small size of the LEDs, they can be placed next to the lens or in the lens housing, or use optical fibers to transmit exciting light from distant light sources, create illumination incident at an angle to the front or back of the biochip, or form a beam that is perpendicular to the back surface of a transparent solid support [35].
- FIG. 3 shows a diagram of the formation of a collimated beam using a black cylinder made in the body of the illuminator.
- Fig. 3a shows the radiation pattern (indicatrix) of LED radiation (34).
- Fig presents the indicatrix of the LED radiation installed in the black cylinder (36) in the holder (33) of the LED in accordance with Fig.Zv.
- the distance H between the front surface of the LED holder (33) and the end of the LED lies in the range from 1 to 5 mm, which ensures the formation of a beam of light flux satisfying the condition of permissible beam divergence, at which the angle ⁇ does not exceed the maximum permissible angle specified in the technical conditions of use used filter (32) (usually the angle of divergence ⁇ lies in the range from 4 to 7.5 degrees).
- the hole length (holder thickness) is selected in such a way as to allow only rays that satisfy the condition of permissible beam divergence. That is, so that the angle ⁇ does not exceed the maximum permissible angle specified in the technical operating conditions of the used filter (32) (usually 5 degrees).
- Each illuminator (31a, 316), which forms a luminous flux with a certain spectral band of exciting light, consists of three main elements - an opaque casing (37), an interference filter (32) and a holder (33) containing an ordered LED array.
- the opaque casing (37) limits the light beam so as to illuminate the area slightly larger than the field of view AB.
- the casing (37) is coated externally and internally with a black matte light-absorbing layer (38).
- the holder (33) is a metal plate, the thickness of which is selected in a special way.
- An ordered array of round through holes is formed in the plate, the diameter of which corresponds to the diameter of the LED (preferably 5.0 mm or 3.0 mm).
- the axis of the holes is perpendicular to the front surface of the holder. The entire surface of the holder
- An ordered array of holes has the properties of rotational symmetry of the 6th or 4th order (hexagonal or orthogonal packaging).
- the shape and dimensions of the LED array thus formed are selected so that its (array) projection onto the plane of the object approximately matches the shape of the working area of the object under study.
- the LED array can form a circle, oval, rectangle, square, polygon, triangle.
- the shape of the array is chosen taking into account the size and shape of commercially available interference filters.
- the filter should completely cover all the openings of the array, without restricting the light. Round filters with external diameters of 25 mm, 30 mm, 50 mm are preferred, as the most mass-produced and, therefore, cheap.
- the filter (32) is closely adjacent to the front surface of the holder (33), located strictly perpendicular to the longitudinal axes of the LED.
- the LED holder has a round groove for accurate fixation of the filter, which is also an optical shutter that prevents the lateral propagation of LED light.
- the illuminator thus assembled is a distributed emitter. The uniformity and intensity of illumination of the measurement zone increases due to the application of light spots from each LED. The use of two symmetrically arranged illuminators increases the uniformity and power of lighting.
- the distance from the illuminators ( ⁇ la, 316) to the center of the working area in which the object under study is located is selected so that the light spot formed on the surface of the object with one LED approximately corresponds to the minimum size of the illuminated area.
- the angle of incidence of rays ⁇ can vary from 40 to 60 degrees and depends on the parameters (working distance, numerical aperture) of the first part (11) of the optical system (10). The larger the angle ⁇ (see Fig. 1), the smaller the distance from the rear surface of the object’s carrier to the screens (more compact design), but the lower the illumination of the object.
- the distance between the illuminators ( ⁇ l réelle, 316) and the front surface of the carrier (42), as well as the angle ⁇ can be changed slightly during the adjustment of the device.
- the optical axis of the illuminators (16a, 166) after adjustment may not pass through the center of the object, conjugated with the optical axis (15).
- Strip interference filters (32a, 326) distinguish such a spectral range of light that is necessary for excitation of fluorescence labels.
- Dominant wavelengths of produced UV and visible LEDs 365 ⁇ 375 nm; 405 ⁇ 5 nm; 475 ⁇ 5 nm; 505 nm; 525 nm; 565 nm; 575 nm; 595 nm; 625 ⁇ 5 nm; 660 nm; White light.
- the radiation power of the LEDs is selected in the range from 10 to 25 mW.
- the LEDs are selected so that their dominant radiation wavelength falls into the passband of the filter and maximally corresponds to the maximum of the excitation spectrum of fluorochrome. Using an array of LEDs not only greatly increases the intensity of the exciting light, but also significantly increases the uniformity of illumination of the working area of the object.
- the power source (84) allows four LED power modes or a combination of them:
- the power source (84) contains a switchable electronic circuit for synchronizing the LED power with a signal that controls the duration of the electronic shutter of the photosensitive matrix (21). Turning on synchronization allows you to power the LED (illuminate the subject) only for a short exposure time of the frame (no more than 10 seconds). In this case, the average LED supply current can be increased several times (up to 4 times), which in turn increases the illumination intensity of the object by approximately the same amount. Turning off synchronization puts the illuminator in continuous mode, for example, when there is a continuous frame-by-frame input of images into a computer.
- the possibility of changing the diagnostic modes is carried out by installing or changing screens located along the path of the axis of the optical system, and / or along the path of light beams formed light sources.
- the installed screens allow you to: a) improve the signal-to-signal ratio noise due to absorption of spurious light fluxes, b) to increase the level of the useful signal due to the double passage of light fluxes through the test sample upon reflection or retroreflection of light fluxes, c) to form different combinations of screens of the first and second groups, which allows to simultaneously suppress spurious radiation and amplify signal during the formation of the reflected light flux.
- the first screen of the first group (51) comprises a reflective or retroreflective surface.
- the second screen (52) of the first group contains an absorbing surface.
- the third screen (53) of the first group is made with a light-scattering surface.
- the screens of the first group, installed along the optical axis (15), are made with a planar surface that is perpendicular to the optical axis (15).
- the screens of the second group contain screens with a reflective, retroreflective or absorbing surface.
- the first screens (61a, 616) of the second group with a reflecting surface can be made in the form of planar plates or made in the form of a concave spherical or parabolic surface with a linear focus, which is placed perpendicular to the optical axes (16a, 166) of the illuminators and parallel to the side surface of the carrier (41 )
- the second screens (62a, 626) of the second group are made with a retroreflective surface and are made of plates with a planar surface.
- the third screens (63a, 636) of the second group contain an absorbing surface and can have a planar, concave (cylindrical, parabolic) or angular shape.
- the screen holders of the first (50) and second (61a, 616) groups are configured to display or insert screens in the path of the optical axes by removing or replacing the screen, as well as by rotating the screens relative to the optical axis.
- the holder of the first screen (51) of the first group can be made in the form of a separate unit or structurally combined with the holder of the carrier (41) of the test sample.
- the holder of the first screen of the first group can be structurally associated with the attachment of additional elements that perform the function of controlling the temperature of the cell during the PCR reaction and / or hybridization reaction.
- the screens of the second group can be introduced into the mounting structure of the screens of the second group, which makes it possible to change the position angle of the plane of the first (61a, 616) and / or second screen (62a, 626) with respect to the trajectories of the axes of the light flux (16a, 166) or the holder of the screens can be made in the form of a combined structure, which may include mounting several screens, with the possibility of their separate introduction or removal from the path of the optical axis.
- Figure 4 shows an example of a variant of the device for the diagnosis of objects immobilized on a solid surface of a transparent carrier (41). Biochips, tissue sections, and cells can be classified as such objects.
- the screens of the first and second groups are provided with an absorbing layer.
- the device comprises an optical system (10) consisting of a first (11) and a second (12) part, between which a first (14) light filter is installed, a photosensitive detector (21), a recording and control system (80) (shown in figure 2) , the first (Zla) and the second (316) illuminators equipped with second light filters (32a, 326), a mount (40) of the carrier (41) of the object of study, a second screen (52), included in the first (50) group of screens, two third screen (63a, 636) included in the second group (60a, 606) of screens.
- the rays exit the illuminator in the form of a diverging beam with an angle ⁇ .
- the exciting light enters the working area of the object, where it excites the fluorescence of the dye (s).
- Part of the light flux passes through a transparent medium and enters the space behind the rear surface of the medium, which contains the screens of the first and second groups, which in this recording mode act as light absorbers.
- the first level is used to suppress reflected light in the design of fixture holders (33a, 336), in which the inner surfaces of the cylindrical holes through which radiation from individual LEDs passes are covered with a first absorber layer.
- the light absorber may be in the form of an absorbent coating
- the diode holder is made of duralumin, holes are drilled to install light-emitting diodes, and then blackened by known technologies.
- the second level of damping is provided by absorbing elements (38a, 386), used to damp the light reflected from the surface of the carrier (41) and the holders of the screens of the second group (60a, 606).
- Absorbing elements are placed on the end surfaces of the housings (37a, 376) in which the LED holders are fixed (33a, 336).
- Absorbing elements (38a, 386) may have a rectangular or square shape.
- the surface of the elements (38a, 386) can be made in the form of a planar, concave cylindrical or parabolic shape. It is preferred that the blanking screen be larger or larger equal to the size of the light beam reflected from the surface (42) of the sample carrier.
- the end surface of the casing (37a, 376), on which the absorbent coating is applied, can act as an absorbing element, the paint or the surface of the casing can be chemically modified to absorb light.
- the third level of damping of light fluxes which can worsen the signal-to-noise ratio, is located behind the rear surface of the transparent carrier (41).
- the main part of the exciting light beam passing through a transparent solid carrier (41) is absorbed by absorbers (66a, 666), which are placed on the front surfaces of third screens (63a, 636), which are part of the second (60a, 606) group of screens.
- the screens (63a, 63b) may take the form of a plate, corner, parabola or concave cylinder.
- the first (61a, 616) and second (62a, 626) screens are removed from the trajectories (16a, 166) of the optical axes of the illuminators. The conclusion can be made by turning the screens (61, 62) around the hinges (69a, 696).
- a planar screen (52) equipped with an absorbing layer (55) is introduced into the trajectory of the optical axis (15).
- Screen (52) is included in the first group of screens (50).
- the central part of the screen (52) is aligned with the axis (15) of the optical system (10).
- the absorbent layer can be made on the basis of an absorbent material included in the group consisting of films formed by a chemical method, a composition comprising a carrier and a dispersed pigment, polymeric or textile materials provided with an adhesive layer.
- Figure 5 shows a variant of the device with the combined use of absorbing and reflective screens for the diagnosis of objects immobilized on a solid surface of a transparent carrier (41). Biochips, tissue sections, and cells can be classified as such objects.
- this solution relates to a specific type of optical microscope and does not imply the possibility of its use in scanners with a wide working field or in scanners with a multi-mode mode of operation.
- this device does not have scattered light absorbers.
- the device uses a combined use of absorbing and reflective screens.
- the difference from the previously considered circuit shown in FIG. 4 consists in the fact that beams of incident light passing through a transparent carrier (41) are reflected from the mirror surface of the screens (61a, 616), which in this mode are installed perpendicular to the incident light stream.
- the front surface of the screens is provided with a reflective layer (64a, 646).
- the screens (61a, 616) are introduced into the trajectory of the optical axes of the illuminators (16a, 166) either by means of rotary mechanisms using hinges (69a, 696), or they are installed in stationary holders (not shown in Fig. 5).
- the reflecting surface (64a, 646) can be made in the form of a mirror deposited on a glass screen or a mirror sprayed on a polymer media, or made in the form of a film with a sprayed reflective surface provided with an adhesive layer.
- the light reflected from the back surface of the carrier (43) and other structural elements is extinguished on the screen (52), the surface of which is equipped with an absorbing layer (55), which helps to increase the signal-to-noise ratio.
- FIG. 5 Another embodiment of the device, which can be performed on the basis of the design depicted in FIG. 5, relates to the combined use of absorbing and retroreflective screens for diagnosing objects immobilized on a solid surface of a transparent carrier (41).
- the screens (61a, 616) are removed from the trajectories (16a, 166) of the passage of light fluxes and open the front surface of the second screens (62a. 626) included in the group of second (60) screens located behind the rear surface (43) of the carrier (41) sample.
- the front surface of the second screens (62a, 62b) is provided with a retroreflective layer.
- the installation of retroreflective coatings allows you to return the luminous flux that enters the prisms, glass balls or other retroreflective structures. Due to total internal reflection, the course of the light beam is refracted inside the retroreflective elements, after which the flow returns and falls on the back side (43) of the sample carrier (41). As a result, the illumination of the working area of the object increases up to two times. In proportion to illumination, fluorescence increases as many times.
- the increase in the intensity of the fluorescent signal exceeds the increase in the background, since a significant part of the scattered light, which determines the level of the background signal, decreases under the action of an absorber (55) applied to the screen (52) and absorbers (38a, 386) deposited on the illuminator casing, which ultimately ultimately leads to an increase in signal-to-noise ratio.
- retroreflective layer it is preferable to use retroreflective materials made in the form of panels, sheets or films provided with an adhesive layer. It is known the use of retroreflective elements in the manufacture of retroreflective panels [46] and retroreflective elements made in the form of a sheet [47]. Known flexible retroreflective materials that contain a retroreflective structure with a flat front surface and with many located on its back surface of the main and additional retroreflective elements [48].
- the ZM series 3990 VIP film [53] is a microprism-based material that provides higher retroreflectivity. Films coated with a retroreflective layer are provided with a self-adhesive composition and stick at room temperature. The longest service life is achieved with a sticker on a pre-prepared aluminum surface of the screen.
- the retroreflective surface of materials based on the use of cubic angle prisms is made by casting or molding prismatic elements on the bottom surface of a very thin substrate. Depending on the type of material, 7300 to more than 15500 prisms are located on one square centimeter of surface (20).
- Figure 6 shows a variant of the device, which provides a four-fold increase in the fluorescence signal or luminescence.
- the first screen (51) is included in the optical channels, which is included in the first group of screens (50), which overlaps both the trajectory (15) of the optical system (10) and the trajectory (16a, 166) of the optical flows of light emitters ( ⁇ l réelle, 316).
- the shield (51) may comprise either a mirror coating or a retroreflective coating.
- the screen holder (51) can be made in the form of a separate unit or structurally combined with the carrier holder (41) of the test sample.
- the distance between the back surface of the carrier (41) and the front surface of the reflecting or light-returning layer is chosen as minimal as possible, for example, 0, lmm.
- a mirror or retroreflective element with its surface completely covers the field of view of the optical system (10).
- the exciting light passes through the studied object two times - in the forward and reverse (due to reflection or retroreflection) directions. In this case, the illumination increases almost twice.
- light fluorescence emitted in the direction of the mirror is reflected from it and also enters the recording optical system, which additionally almost doubles the light collection. As a result, the total increase in fluorescence light flux increases up to four times.
- FIG. 7a and 76 show schemes for converting incident light (22) onto the upper surface (42) of a carrier (41) on which samples are placed in the form of clusters (2) with probes (1) onto which molecules equipped with fluorescent labels hybridize.
- a feed light conversion circuit using a mirror surface of the screen is shown in FIG. 7a and in the embodiment where the surface of the screen is provided with a retroreflective surface - in Fig. 7b.
- the fluorescence signal penetrates through the transparent carrier (41) and, reflected from the mirror layer (64) placed on the screen (61), returns through the back (43) surface of the transparent carrier with a second fluorescence signal (27) in addition to the first signal (26 )
- the total signal entering the optical system (10) can theoretically be four times larger than in conventional schemes of fluorescence scanners.
- Fig presents a variant with a retroreflective surface (67) deposited on the screen (62) using an adhesive layer (68).
- the fluorescence signal penetrates through the transparent carrier (41) and, reflected from the retroreflective layer (67), returns through the transparent carrier to the second signal (30).
- the total signal entering the optical system (10) can theoretically be four times larger than in conventional schemes of fluorescence scanners.
- this technical solution allows the light flux to be returned through the rear surface (43) of the carrier (41) and to increase the additional illumination of the object not four times, as in the case of a mirror, but from two to three times, depending on the type of retroreflective material and the value of the angle of inclination ⁇ .
- a retroreflective coating is significantly cheaper than a mirror one.
- a mirror or a retroreflective surface falls into the field of view of the optical system (10); therefore, high demands are made on the quality of their surface.
- the surface should not diffuse diffuse light. Otherwise, the background will increase due to the penetration of the exciting radiation into the recording channel. And although the background is subtracted during image processing, the dynamic range of the signal narrows. Dust particles adsorbed on the surface of a mirror or retroreflective surface are capable of scattering light and appearing on the primary image (see. Image processing procedure). However, they appear in the same way on the “fifth cadre” without an object and are not present in the difference frame.
- FIG. Figure 8 shows an embodiment of a device that allows scanning media with objects painted with colorimetric marks.
- the configuration is used for transparent objects containing non-fluorescent dyes (for example, biochips with clusters manifested during the peroxidase color reaction).
- the absorption of light of a certain wavelength or white light is recorded.
- the light-absorbing screen (52) is removed from the path of the optical axis (15) and a matte white diffusely scattering screen (53) is introduced into the path.
- the diffusing screen (53) can be installed instead of the light-absorbing screen (52), or in front of the screen (52), or pre-installed behind the screen (52). In the latter case, when the screen (52) is displayed, the front surface of the light-diffusing screen (53) is introduced into the trajectory (15) of the optical system (10).
- the third (39a) and fourth (396) light sources, or a self-luminous (emitting) screen (54), which provides the possibility of illuminating the diffusing front surface, are additionally introduced into the device the third screen (53) from the front or from the front of the screen (53) or from the back of the screen (53), as shown in FIG. 8.
- the illuminators (39a, 396) are arranged so that the light is directed at an angle ⁇ 2 directly to the front surface of the diffuser screen (53), however, the principle of dark-field illumination is maintained.
- the screen is uniformly illuminated by illuminators (39a, 396) and scatters light in all directions, including toward the object of the back surface (43) of the sample carrier (41).
- interference filters (32) may or may not be present, because the degree of monochromaticity of the light emitted by the LED (band about 100 nm) is sufficient for some tasks.
- the filter (14) is removed from the path (15) of the rays.
- the dominant wavelength of the light emitted by the illuminators should correspond to the maximum of the dye absorption spectrum. For example, for the color peroxidase reaction with dimethylaminobenzidine, this should be blue light (dominant wavelength of the LED 470 - 490 nm).
- biochips are mainly performed on solid substrates made of glass, polymers, metals, mica, and combinations thereof.
- the material of which the object is made does not fluoresce under the influence of exciting radiation.
- exciting radiation when working with glass slides, it is advisable to use exciting radiation with a maximum in the region of 625 nm - 635 nm.
- At least one thin (1 mm thick) standard spectrophotometric cuvette can act as a carrier of the object of study.
- the fluorescence of the solution of the object in the cuvette or the absorption of light by a dye at a certain wavelength is measured (the variant shown in Fig. 8).
- a comparison cuvette can be installed.
- the object carrier may be a flow cell.
- the device can operate as real-time PCR (Real Time PCR). In this case, a specialized PCR camera will act as the carrier of the object.
- the proposed device can be arbitrarily oriented in space, in particular, the optical axis (15) can be located in a horizontal or vertical plane. This allows the use of both closed and open cuvettes, cells, microplates.
- FIG. 9 An example of one embodiment of a device that includes, but is not limited to other embodiments of the invention, is shown in FIG. 9.
- the light is directed at an angle ⁇ to the surface of the cell in which the amplification reaction is carried out.
- Incident light from two light sources (Zla, 316) is refracted on the front surface (44) of the cell. Part of the light is reflected from the front surface of the first cell wall and returns to the front surface of the opposite source, equipped with absorbing material (38), to exclude spurious background.
- Another part of the light penetrates through the first wall of the cell made of a transparent material, and then, being refracted through the interface between the first inner side (45) of the first cell wall and the solution (46) in which amplification is carried out, it penetrates into the solution, where it causes fluorescence of markers hybridizing with probes (1), which are provided with clusters (2) of biomolecules. Having penetrated through the solution, the light is refracted at the second interface between the inner part (47) of the second cell wall and the solution for amplification. Part of the refracted light returns to the solution (46). The other part penetrates through the transparent material (48) of the second cell wall and is refracted at the interface between the air space and the rear surface (49) of the second cell wall.
- the cell holder (57) is further provided with a heater (58) or a Peltier element in order to carry out temperature control during the hybridization or amplification reaction.
- the above device diagrams do not limit other options for placing other objects immobilized, for example, in a microplate.
- the device can be mounted vertically, horizontally or can work in a configuration when the optical system is located at the bottom of the device in order to illuminate the back surface of the microcards.
- the first screen of the first group which is installed in the sample holder, or use the second screen of the first group in combination with the first or second screens of the second group, or use the second screen of the first group in combination with the third screens of the second groups.
- a third screen of the first group is used in combination with third screens of the second group.
- FIG. 10 shows an algorithm for a data processing method.
- the final image of the object is formed as follows.
- the object of study is placed in the device.
- conditions are selected using the device (82) shooting (exposure duration, signal amplification) so that the brightness of the pixels of the photosensitive matrix does not occur (12).
- An empty frame contains information only about the noise signal, because useful is missing.
- a blank frame captures weak background light, the glow of dust particles on the mirror and other optics, thermal noise and “hot pixels” of the photosensitive matrix, a constant stand (“black level shift”) in the signal, and other noise that is not related to the object.
- the “fifth frame” is subtracted pixel by pixel from the main frame and the result is stored. This procedure minimizes measurement errors. It is correct, because the signal conversion in the node (82) occurs in a linear manner.
- the resulting difference frame is multiplied pixel by pixel by the corresponding normalization coefficients in order to align the image with the field of view AB.
- the resulting difference frame is multiplied pixel by pixel by the corresponding normalization coefficients in order to align the image with the field of view AB.
- the frame finally formed in this way can be saved by the computer.
- Several frames from one object can be summed with averaging to reduce random noise and then processed by the corresponding programs according to the given algorithms.
- the image processing procedure in the photometric version occurs in the same way as in the fluorescent version. From the first image where there is no object (bright background), the image with the object is subtracted (there are dark spots). As a result, a negative (light spots on a dark background) image of the object appears, which is then aligned by multiplication by a normalization matrix.
- the reference object should be a thin (no more than 0.5 mm) transparent transparent uniformly fluorescent layer fixed on a transparent non-fluorescent carrier similar to a biochip carrier.
- a transparent non-fluorescent carrier similar to a biochip carrier.
- it can be a thin ( ⁇ 0, l mm), transparent, fluorescent, uniform in thickness (no worse than 1%) plastic film attached to the surface of a non-fluorescent plate made of plastic, optical glass or quartz.
- a thin plane-parallel plate of colored fluorescent optical glass can be a liquid layer containing fluorescent molecules, and located between two strictly parallel transparent non-fluorescent plates. The distance between the plates is about 0.1 - 0.2 mm.
- it can be a molecular layer of fluorochrome, immobilized on the surface of a transparent, non-fluorescent plate, having a strictly uniform distribution over the surface.
- One or more (preferably) reference objects are captured.
- pixel-by-pixel multiplication by normalization coefficients is not performed or they are assumed to be equal to unity.
- the received frames are summed with averaging (i.e., they are added pixel by pixel and divided by the number of frames, if necessary, the picture is smoothed according to known mathematical procedures).
- the result is an averaged reference frame that characterizes mainly uneven illumination of the object by illuminators (31) and uneven light collection (at the edges of the field of view) by the recording system (10).
- the brightness value of the “reference” pixel is selected, which will be normalized. This may be the brightest pixel of the reference frame or the average brightness value per frame, etc.
- a coefficient is calculated equal to the quotient of dividing the brightness value of the “reference” pixel by the brightness value of this pixel.
- the calculated normalization coefficients are stored in the form of an ordered array (normalization matrix), which is a kind of “passport” of the device and is stored for the entire time of its operation.
- the image of the reference object is not used. Instead, an image of a matte screen is taken.
- each pair of illuminators its own array of normalization coefficients is calculated.
- the coefficients are calculated individually for each instance of the device, stored and used throughout the entire time of its operation. If the instrument is being rearranged, for example, due to a repair, then the normalization matrices must be recalculated again.
- the signal converting node (82) contains the matrix operation control circuits (21), performs analog-to-digital conversion of the brightness signal from each matrix cell (21), sets the shooting parameters (frame exposure, gain, etc.), interacts with a computer (receiving and transmitting data) via a given interface (for example, a USB bus), synchronizes the operation of illuminators, controlling the operation of power sources.
- a computer receiving and transmitting data
- a given interface for example, a USB bus
- FIG. 11 shows images of a cluster of 13 points deposited on the surface of a modified glass chip in two signal measurement options.
- the device diagram shown in FIG. 4 was used.
- Two light fluxes from light sources (Zla) and (316) illuminate the surface of the glass slide (41) with the applied probes and form a dark field at which the emitted flux does not enter the optical system (10).
- the reflected radiation from the surface of the slide is absorbed on the surface of the damping elements (38a) and (386).
- Luminous fluxes pass through a transparent slide with a deposited sample and are absorbed by dampers (66a) and (666) located perpendicular to the trajectory of the light flux. Additionally, scattered light is damped on the surface (55).
- dampers (66a) and (666) located perpendicular to the trajectory of the light flux. Additionally, scattered light is damped on the surface (55).
- the use of such a complex allows to reduce the background level and obtain an image of points with probes with the maximum signal-
- the device circuit shown in FIG. 6 In the second measurement variant, the device circuit shown in FIG. 6. In this measurement scheme, the device design was used, containing a mirror (54) located behind the back surface of the slide. This design solution allows you to increase the signal level up to four times. The result of such signal amplification is shown in FIG. 116.
- the device is designed to detect the fluorescence of fluoxoprom (ov) molecules immobilized on the surface or in a thin layer of an object, as well as to measure the absorption or scattering of colorimetrically colored biochip clusters.
- This device can work with transparent, translucent, opaque, black and mirror surfaces. In the design of the device there is no mechanical scanning of the object of study in the coordinates of X.
- the device can work as a fluorimeter and photometer - measure fluorescence and absorption of solutions. For example, measure the concentration of DNA, protein, etc. in solution or to control the amount of extracted DNA generated during PCR.
- the device allows kinetic measurements with characteristic times, depending on the speed of the electronic device 82 (typically 0.1 sec). For this, the mode of continuous input of images (for example, a video stream) with the subsequent processing of each frame is used.
- the device can work in arbitrary orientation in space, because the object is fixed in the positioning device.
- the device created according to the invention has several significant advantages compared with known solutions. It has a very simple design, does not impose high requirements on the optical components used, and, most importantly, does not impose any special conditions for introducing fluorochrome excitation radiation and / or outputting fluorescence radiation. In addition, the device allows you to conduct all kinds of biochemical studies, and the manufacture of the main components of the device does not require high costs.
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Многофункциональное
устройство
для измерения
флуоресценции,
люминесценции,
и
пропускания
света в диагностических
целях. Носитель
исследуемого
образца выполнен
в
виде биочипа,
ячейки, кюветы,
или микроплаты
Устройство
дополнительно
содержит первую
и
вторую группу
экранов. Экраны
установлены
за задней поверхностью
твердого носителя
образца,
а осветители
исследуемого
образца снабжены
поглощающими
элементами
для гашения
отраженного
света
от передней
поверхности
носителя образца
и поверхностей
экранов. Держатели
экранов
обеспечивают
возможность
поочередной
установки светоотражающих
или световозвращающих
экранов
таким
образом, чтобы
обеспечить
максимальный
сигнал флуоресценции,
или люминесценции.
Рассеивающий
экран
обеспечивает
режим измерения
пропускания
света через
исследуемый
образец. Светопоглощающие
экраны,
размещенные
за задней поверхностью
образца в комбинации
со светопоглощающими
элементами,
размещенными
на
источниках
света, с верхней
стороны образца,
обеспечивают
повышение отношение
сигнал/шум.
Устройство
позволяет
осуществлять
измерение сигналов
как на поверхности
биочипов, так
и в растворах
при
проведении
реакции гибридизации
или реакции
амплификации.
Устройство
и метод обработки
данных
диагностики
пригодны для
массового скрининга
образцов биологических
материалов.
Description
Многофункциональное устройство для диагностики и способ тестирования биологических объектов. Область техники
Изобретение относится к устройству для сканирования результатов диагностики в медицине, ветеринарии, контроле пищевых продуктов, в криминалистике и других сферах диагностики, связанной с анализом биологически активных компонентов. В частности, изобретение относится к устройствам сканирования разных типов объектов, нанесенных на твердый носитель, например, выполненных в виде биочипов, или к устройствам регистрации биологических объектов в растворах, размещенных в кюветах, мультиплатах или гибридизационных камерах, хроматографических носителях, гелях. Уровень техники
Существует много технических решений, связанных с формированием и регистрацией оптических сигналов, полученных в процессе диагностики биологических образцов. Для регистрации сигнала и идентификации объектов чаще всего используют колориметрические или флуоресцентные метки. Широко распространены узкоспециализированные оптические устройства, предназначенные для работы в одном из режимов измерения оптического сигнала, взаимодействующего с исследуемым образцом. К таким режимам можно отнести измерение оптического пропускания, измерение сигнала отражения от поверхности образца, измерение уровня флуоресценции, люминесценции или измерение сигнала резонансного взаимодействия молекул в режимах BRET [1] или FRET.
В диагностических устройствах биологические образцы могут быть размещены на твердой основе, например, выполненной в виде слайдов [2] или биочипов [3]. В других вариантах, биологические образцы исследуют в растворах, размещенных в открытых ячейках мультиплат [1] или в герметичных кюветах, например, для проведения гибридизации [4].
Многофункциональные устройства в основном используют для проведения массовых скринингов в больших тестовых лабораториях, клиниках или научных лабораториях.
Известно многофункциональное устройство для измерения люминесценции, флуоресценции и поглощения [5]. Исследуемый образец может быть размещен в кювете или в микроплате. В устройство введен монохроматор и множество оптических фильтров. Передача оптических сигналов через оптические волокна позволяет преобразовывать оптические системы для работы в разных режимах. В устройстве используется механизм перемещения положения микроплаты под управлением процессора, который дополнительно управляет выбором длины волны.
Известен метод [6], в котором образец детектируют в разных режимах и вычисляют результат детектирования для одного или множества образцов.
Результаты анализа получают, используя фотолюминесценцию, хемилюминесценцию, измерение поглощения или рассеяния света. Устройство выполнено по блочному принципу. Для передачи оптических сигналов использованы световоды. Устройство предназначено для измерения в микроплатах с множеством индивидуальных ячеек.
В устройстве [7] с помощью оптических волокон и оптических элементов сформирована схема освещения образца, размещенного в микроплатах и схема измерения оптического сигнала в режимах измерения флуоресценции, люминесценции, а также измерения поглощения света. Для измерения в разных ячейках микроплат используется двухкоординатное перермещение под управлением компьютера.
Известно устройство для измерения люминесценции и флуоресценции [1], которое обеспечивает возможность создания не менее трех вариантов возбуждения люминесценции и флуоресценции и поглощения сигналов за счет формирования разных оптических схем.
К общему недостатку рассмотренных устройств можно отнести большое количество оптических элементов, сложность конструкции и необходимость использования точных механизмов для перемещения объектов по ХУ координатам, механизмов для переключения фильтров и хода оптического сигнала, а также потерю оптических сигналов при передаче сигналов через световоды.
Другая группа устройств диагностики биологических объектов связана с построением конструкций, позволяющих измерять сигналы флуоресценции в
растворах в режиме реального времени, например, при анализе гибридизации или амплификации.
Известно оптическое устройство [8] для мониторинга ПЦР реакции в ячейках, установленных в блок с регулировкой температуры. Эмиссионный световой поток от каждой ячейки, формируемый с помощью линзы Френеля, регистрируется ПЗС детектором. Известно устройство для амплификации и детектирования нуклеиновых кислот в реальном времени [9, 10]. Известно устройство для iп-situ детекции люминесценции биологических объектов [2]. В устройстве используют привод, осуществляющий перемещение образца в ХУ координатах под управлением компьютера. Известно устройство для гибридизации нуклеиновых кислот на твердой поверхности биочипов, размещенных внутри жидкостной ячейки [4]. Оптическая схема освещения рабочей поверхности биочипа построена на темнопо льном принципе.
Приведенные схемы измерения оптических сигналов в режиме реального времени относятся к узкоспециализированным устройствам, не предполагают работы с биологическими образцами, иммобилизованными на биочипах, не содержат элементов, способствующих увеличению отношения сигнал-шум, и выполнены по стандартным схемам.
Известно большое количество сканеров или микроскопов, работающих на конфокальном принципе, в которых формируется поток ультрафиолетового излучения падающий на лицевую часть поверхности твердого носителя объекта и вызывающий флуоресценцию образца [3, 11 - 18]. Для формирования конфокального принципа изображения устройство содержит большое число дополнительных элементов, имеет малый размер изображения и требует перемещения по координатам ХУ твердого носителя, на котором помещен исследуемый объект, или перемещения оптической системы относительно неподвижного объекта.
Известны устройства, в которых флуоресценцию формируют, пропуская световой поток ультрафиолетового излучения с задней стороны биочипа через прозрачный твердый носитель образца в направлении к приемной ПЗС матрице. Поток УФ-света падает на поверхность носителя в направлении перпендикулярном к поверхности биочипа [19] или под углом к поверхности носителя [20].
Известны оптические сканеры и микроскопы, использующие темнопольный принцип формирования изображения для контроля поверхности [21-22], в том
числе с использованием регистрации флуоресценции [23-26]. Однако в устройствах обращается мало внимания вопросам повышения отношения сигнал- шум и возможности работы в нескольких режимах измерения, например, с возможностью измерения флуоресценции и поглощения светового потока при регистрации колориметрических меток. Во многих оптических схемах формируется узкий световой пучок, что требует применения устройств перемещения слайдов или биочипов в координатах ХУ.
Для того чтобы снизить уровень паразитного излучения и повысить отношение сигнал-шум, в схемы оптических устройств вводят поглощающие элементы. Из уровня техники, которые включены лишь как источники информации, известно, что поглощающие элементы используют в оптических системах контроля качества поверхности полупроводниковых пластин [27-28], применяют в оптических схемах конфокальных микроскопов [29], используют в системах контроля клеток в проточных системах, использующих измерение отраженного сигнала флуоресценции [30].
В некоторых устройствах вопросы повышения уровня сигналов решают, в том числе, за счет формирования двойного прохождения светового потока через исследуемый образец. Известны варианты микроскопов [31-32], в которых формируют двойное прохождение пучка света через исследуемый образец с помощью двух объективов, имеющих идентичные оптические характеристики и дополнительного зеркала, которое размещено с обратной стороны исследуемого объекта за вторым объективом для отражения потока света, проходящего через исследуемый образец. Известен конфокальный лазерный микроскоп [33], в котором использован уголковый отражатель, установленный с противоположной стороны исследуемого объекта и линзы, установленные с лицевой и задней поверхности исследуемого объекта для формирования плоско-параллельного пучка света, падающего на уголковый отражатель, который возвращает падающий свет и направляет его на исследуемый объект, увеличивая контрастность изображения объекта. Наиболее близкое техническое решение, к рассматриваемому изобретению, представлено в патенте RU 2182328 [24]. Микроскоп позволяет работу в режиме темного поля при измерении сигналов флуоресценции и в режиме пропускания светового потока через прозрачный носитель образца. Недостатками этой системы
являются малое рабочее поле освещения (диаметр около 10мм) и влияние рассеянного излучения, ухудшающее отношение сигнал-шум.
Анализ уровня техники показал, что существует необходимость в разработке более простого и надежного устройства для работы в разных режимах диагностики, в том числе и в режимах реального времени с улучшенными характеристиками отношения сигнал- шум.
Задачей изобретения является максимальное упрощение и удешевление оптической системы с сохранением возможности преобразования оптических схем для выбора разных режимов работы устройства при сканировании исследуемых объектов и при одновременном увеличении отношения сигнал-шум.
Другой задачей является повышение эффективности сканирования за счет построения оптической системы, позволяющей формировать освещение максимально большого рабочего поля биочипа, ячейки или микроплаты.
Следующей задачей настоящего изобретения является разработка конструкции устройства, обеспечивающей возможность работы не только в мультирежимном процессе, но и с возможностью измерения параметров образцов, размещенных в разных средах или иммобилизованных на разных поверхностях в режиме реального времени.
Объектом данного изобретения является устройство для сканирования результатов диагностики и способ проведения диагностики.
В рассматриваемом изобретении возможность смены режимов диагностики осуществляется за счет установки или смены элементов, расположенных вдоль оси оптической системы, и/или вдоль световых пучков, сформированных источниками света. Причем устанавливаемые элементы выполнены в виде экранов с поглощающей, отражающей, световозвращающей или светорассевающей поверхностью, что позволяет улучшить соотношение сигнал-шум за счет уменьшения паразитного фона и/или увеличения уровня измеряемого сигнала.
Дополнительное увеличение отношения сигнал-шум обеспечивает светопоглощающая поверхность, размещенная на поверхности осветителей образца.
Устройство содержит источники оптического излучения, формирующие освещение рабочего поля, оптическую систему, детектор, узел крепления держателя образца, твердый носитель исследуемого образца. Для решения поставленных задач устройство одержит, по меньшей мере, два источника света,
формирующие освещение рабочего поля, оптическую систему, детектор, узел крепления держателя образца, твердый носитель исследуемого образца, а также дополнительно содержит первую и вторую группу экранов, причем первая группа содержит, по крайней мере, один экран, а вторая группа содержит, по меньшей мере, два экрана. Экраны первой и второй группы установлены за задней поверхностью твердого носителя образца, а осветители, установленные над рабочей поверхностью носителя образца, снабжены поглощающими элементами для гашения отраженного света от передней поверхности носителя образца и поверхностей экранов. Экраны первой группы расположены перпендикулярно оптической оси регистрирующей системы, а экраны второй группы расположены перпендикулярно оптическим осям осветителей.
Следующим аспектом данного изобретения является то, что лицевая поверхность первого экрана, входящего в первую группу, выполнена с возможностью отражения или световозвращения световых потоков, поступающих от первого и второго осветителей. Держатель образца выполнен с возможностью крепления первого экрана первой группы на минимальном расстоянии от задней поверхности твердого носителя исследуемого образца. Это расстояние может лежать в пределах от 0,01мм до 10 мм. Предпочтительно, порядка 0,1мм, что позволяет предохранить поверхность зеркала от механических повреждений. Второй экран первой группы размещен относительно задней поверхности твердого носителя образца на расстоянии, превышающем расстояние от точки пересечения нижней границы светового потока и боковой границы оптического конуса регистрирующей системы, до задней поверхности твердого носителя образца. Лицевая поверхность второго экрана первой группы, снабжена светопоглощающим слоем. Третий экран первой группы размещен за вторым экраном, а лицевая поверхность третьего экрана выполнена светорассеивающей в виде белой матовой поверхности.
Следующим аспектом изобретения является то, что устройство дополнительно содержит первый, второй и третий экраны второй группы, размещенные вдоль траекторий осей световых потоков на таком расстоянии от задней поверхности твердого носителя, чтобы край экранов не пересекал оптический конус регистрирующей системы, причем лицевые поверхности первого, второго и третьего экрана второй группы выполнены из отражающих, световозвращающих и поглощающих материалов соответственно.
Дополнительным аспектом изобретения является то, что устройство содержит узлы крепления первого, второго и третьего экранов первой и второй группы, которые обеспечивают возможность введения или выведения из траектории оптической оси регистрирующей системы первого и второго экранов. Узел крепления первого и второго экранов второй группы обеспечивает возможность замены экранов посредством выведения экранов из траекторий оптических осей осветителей или дополнительно содержит шарнирное соединения между узлом крепления и держателем экрана и обеспечивает как возможность замены экранов посредством выведения экранов из траекторий оптических осей осветителей, так и возможность поворота установленных экранов относительно траекторий оптических осей осветителей для выведения экранов из световых пучков при смене режима работы.
Другим объектом данного изобретения является способ проведения диагностических тестов образца, иммобилизованного на твердой основе или размещенного в реакционном объеме. В соответствии с указанным способом выбирают режим диагностики из группы, включающей измерение флуоресценции, люминесценции, рассеяния или пропускания света, поочередно вводят в траекторию оптических осей осветителей и/или в траекторию оптической оси регистрирующей системы один или несколько экранов, помещают объект исследования в держатель образца, вводят его в траекторию оптических осей осветителей и регистрирующей системы, по предварительному изображению на дисплее подбирают условия съемки, получают и запоминают первое изображение объекта, выводят объект из траекторий оптических осей осветителей и регистрирующей системы, получают и запоминают второе изображение, формируют разностное изображение между первым и вторым изображением, попиксельно умножают разностное изображение на нормировочные коэффициенты и запускают программу обработки полученного изображения. Перечень фигур Фиг. 1 Структурная схема универсального сканера биочипов. Фиг. 2 Блок схема устройства, подключенного к управляющей системе.
Фиг. 3 Схема формирования коллимированного пучка света. Где а) диаграмма направленности (индикатриса) излучения СИД; б) индикатриса излучения СИД установленного в черном цилиндре; в) сечение держателя СИД.
Фиг. 4 Схема устройства для диагностики объектов, иммобилизованных на твердой поверхности прозрачного носителя.
Фиг. 5 Схема устройства с комбинированным применением поглощающих и отражающих экранов для диагностики объектов, иммобилизованных на твердой поверхности прозрачного носителя.
Фиг. 6 Схема устройства, обеспечивающая четырехкратное увеличение сигнала флуоресценции или люминесценции
Фиг. 7 Схема преобразования подающего света на поверхность носителя, на котором размещены образцы в виде кластеров с зондами. Где: а) схема преобразования подающего света с применением зеркальной поверхности экрана; б) схема преобразования подающего света с применением световозвращающей поверхности экрана.
Фиг. 8 Схема устройства, позволяющего обеспечить сканирование носителей с объектами, окрашенными колориметрическими метками. Фиг. 9 Сечение кюветы, предназначенной для работы устройства в режиме
ПЦР в реальном времени.
Фиг. 10 Блок-схема алгоритма обработки полученных данных. Фиг. 11 Изображения кластеров, состоящих из 13 точек, нанесенных на поверхность модифицированного стеклянного чипа в двух вариантах измерения сигнала. Где а) измерение без применения отражающего зеркала; б) измерение с применением отражающего зеркала, как это представлено на фиг. 6. Структурная схема
В процессе разработки устройства было обнаружено, что технические задачи изобретения, связанные с повышением отношения сигнал-шум и с расширением режимов работы устройства, можно выполнить за счет введения дополнительных экранов и обеспечения возможности ввода и вывода экранов из траекторий оптических осей устройства. Причем повышение отношения сигнал- шум осуществляется за счет выбора оптических свойств поверхности данных экранов, а расширение выбора режимов осуществляется за счет введения не только экранов с поглощающей поверхностью, но и за счет применения экранов с отражающей, световозвращающей и светоизлучающей поверхностями.
Структурная блок-схема устройства приведена на фиг. 1. Устройство состоит из оптической приемной системы (10), подключенной ко входу регистрирующей и управляющей системы (80), первого (Зlа) и второго (316)
осветителей, формирующих световой поток с углом расходимости конуса 2β, оптические оси осветителей расположены под углом α к оптической оси (15) приемной системы (10), которая имеет угол сбора света γ. Устройство дополнительно содержит первую (50) и вторую (60а, 606) группы экранов, а также узел крепления (40) носителей (41) исследуемых объектов.
Более подробно структурная схема устройства приведена на фиг. 2. Устройство содержит следующие основные компоненты: оптическую систему (10), состоящую из первой (11) и второй (12) части, между которыми установлен первый (14) светофильтр, светочувствительный детектор (21), регистрирующую и управляющую систему (80), в состав которой входит узел преобразования сигналов (82), компьютер (83) для сбора и обработки данных, поступающих от светочувствительного детектора (21), а также для выработки управляющих сигналов на отключение или переключение узлов устройства, например, таких как источник питания (84). В состав устройства входит дисплей (81) первый (Зlа) и второй (316) осветители, узел крепления (40) (на фиг.2 не показан) носителя (41) объекта исследования, первую группу экранов (50), вторую группу экранов (61а, 616). Причем экраны первой группы расположены вдоль оптической оси (15), а экраны второй группы расположены симметрично относительно траектории оптической оси (15) и размещены вдоль оптических траекторий световых потоков (16а) и (166), формируемых первым (3 Ia) и вторым (316) осветителями.
Устройство работает следующим образом. Свет от первого (Зlа) и второго (316) осветителей падает на лицевую поверхность (42) носителя (41) объекта исследования под острыми углами, лежащими в диапазоне от (α-β) до (α+β) по отношению к оптической оси (15). Свет люминесценции образца собирается оптической системой (10) и направляется на светочувствительный детектор (21). Часть света проникает через прозрачный носитель (41) образца и поступает в зону расположения экранов, входящих в первую (50) и вторую группу (61а, 616). В зависимости от выбранного режима работы осуществляют установку разных типов экранов первой (50) и второй (61а, 616) группы. Простая замена или вывод поглощающих, отражающих или световозвращающих экранов из траекторий оптических осей является наиболее легко реализуемой и приводит к улучшению эксплутационных характеристик устройства.
Центры первой группы экранов (50) совмещены с оптической осью (15) устройства, а поверхности экранов расположены перпендикулярно оптической оси
устройства. Центры второй группы экранов (61а, 616) совмещены с траекториями оптических осей (16а, 166) осветителей, а поверхности экранов второй группы расположены перпендикулярно траекториям оптических осей 16а и 166.
Причем вторую группу экранов размещают относительно задней поверхности твердого носителя образца на расстоянии (19), превышающем расстояние от задней поверхности (43) носителя образца (41) до точки пересечения нижних границ (22а, 226) световых потоков и боковых границ (24а, 246) оптического конуса (18) оптической системы (10). В этом случае отраженный свет от экранов (60а, 606) второй группы не будет попадать на лицевую поверхность (55) второго экрана первой группы и, одновременно, отраженный свет от лицевой поверхности экранов (60а, 606) второй группы не будет собираться оптической системой (10).
Носитель (41) исследуемого объекта размещен строго перпендикулярно оптической оси (15) устройства таким образом, чтобы рабочее пространство, на котором размещен исследуемый объект, располагалось внутри поля зрения AB регистрирующей оптической системы (10), а рабочая поверхность совмещалась с передней фокальной плоскостью первой части (11) оптической системы (10). Устройство позиционирования и крепления (40) носителя (41) объекта исследования выполнено с возможностью смены носителей в ручном или автоматическом режимах. Поле зрения AB на рабочей поверхности носителя (41) освещается с помощью двух одинаковых, симметрично расположенных относительно оптической оси устройства, источников возбуждающего излучения (Зlа, 316). Конструкция держателей осветителей выполнена с возможностью ручной или автоматической смены осветителей. В устройстве реализован принцип темнопольного освещения. Оптическая ось (16а, 166) осветителей составляет острый угол α с оптической осью (15) устройства, при этом выполняется соотношение (α-β)>γ/2. В этом случае возбуждающее излучение (в том числе зеркально отраженное от объекта) не попадает в оптическую систему (10). Угол α и расстояние от осветителей (Зlа, 316) до исследуемого объекта можно менять в процессе юстировки устройства для улучшения равномерности освещения. На фиг.2 пунктиром показаны крайние лучи AD (246) и ВС (24а), собираемые регистрирующей оптикой. При поглощении возбуждающего излучения молекулы флуорохрома, связанные с объектом, флуоресцируют. Свет
флуоресценции собирается первой частью (11) оптической системы (10), имеющей числовую апертуру NA=sin(γ/2). Входной люк CD ограничивает поле зрения оптической системы. На ее выходе имеет место телецентрический ход лучей, т.к. рабочая поверхность объекта совмещена с передней фокальной плоскостью первой части (11) оптической системы. Формирование телецентрического хода лучей необходимо для корректной работы первого интерференционного светофильтра (14). Далее, в случае измерения флуоресценции, свет проходит через полосовой интерференционный светофильтр (14), спектральные характеристики которого выбираются таким образом, чтобы с одной стороны пропустить максимум полезного сигнала (света флуоресценции метки), а с другой — обеспечить минимум проникновения паразитного фонового света на детектор (21).
Последнее условие обеспечивается, в основном, тремя факторами: а) минимальным проникновением возбуждающего света в канал регистрации. На этот фактор влияют угол падения пучка возбуждающего света α, угол расходимости пучка β, качество поверхностей объекта и зеркал (отсутствие паразитного рассеяния света), общее поглощение возбуждающего излучения внутри прибора, б) минимальным интегралом перекрывания спектров пропускания возбуждающего (32а, 326) и регистрирующего (14) светофильтров, а также способностью светофильтра (14) подавлять возбуждающее излучение; в) минимальной собственной флуоресценцией материала носителя (41) объекта и светофильтра (14) в полосе пропускания светофильтра (14). Конструкция устройства позволяет менять светофильтры (14) в ручном или автоматическом режиме. Свет, прошедший через светофильтр (14), собирается второй частью (12) оптической системы, в задней фокальной плоскости которой находится фоточувствительный слой матрицы светочувствительных элементов (21), например, ПЗС-матрицы. Заметим, что размер поля зрения AB связан с размером изображения AΕ\ формируемого на поверхности матрицы, соотношением AB=AΕ"x(Fl/F2), где Fl - фокусное расстояние первой части (11) оптической системы, а F2 - фокусное расстояние второй части (12) оптической системы. Параметры оптических систем выбираются таким образом, чтобы изображение АΕ' полностью заполняло матрицу (21), входное отверстие PQ второй части (12) оптической системы равнялось выходному отверстию KM первой, а числовые апертуры были максимально большими.
Светочувствительные элементы матрицы (21) преобразуют световой сигнал в электрический. Далее этот сигнал считывается, преобразуется линейным образом, оцифровывается и передается электронным устройством (82) в компьютер (83), на дисплее которого формируется изображение рабочей области объекта.
Оптическая система.
Первая 11 и вторая 12 части оптической системы (10) представляют собой высококачественные оптические системы (объективы) с высоким светопропусканием, свободные в значительной степени от геометрических и хроматических аберраций. Хроматические аберрации в меньшей степени способны влиять на точность измерений, т.к. оптика работает в квазимонохроматическом свете, выделяемом светофильтром 14. Неточность фокусировки, возникающая при смене длин волн, не сказывается на работе, т.к. глубина резкости оптической системы достаточно велика (порядка 0,5-0,7 мм). Среди прочих характеристик объективов можно выделить: разрешающую способность, коэффициент передачи контраста, коэффициент интегрального и спектрального пропускания света, коэффициент светорассеяния, падение освещенности (светосбора) по полю изображения.
Большинство известных оптических систем для формирования первой части оптической системы (11) используют короткофокусные объективы с небольшим рабочим отрезком. Это приводит к сокращению пространства между первой частью (11) оптической системы и поверхностью носителя (41) объекта исследования. Сокращение пространства создает проблемы с формированием освещения рабочей зоны. В известном патенте RU 2182328 [24] в одном из вариантов устройства держатели осветителей устанавливают непосредственно на объектив. Такое решение не позволяет включать между первой частью оптической системы и поверхностью носителя образца вспомогательные элементы, например, конструкции держателей ячеек или нагреватели ячеек для регистрации процессов в режиме реального времени. В предлагаемом устройстве в качестве первой части (11) оптической системы (10) использован объектив с большим фокусным расстоянием, что позволяет расширить размеры рабочей области. Размер рабочей области объекта можно варьировать в широких пределах (например, от 10 до 90 мм). В качестве первой части (11) оптической системы целесообразно использовать проекционный
или фотографический объективы, серийно выпускаемые промышленностью. Важными параметрами являются фокусное расстояние, рабочий отрезок, линейное поле зрения, числовая апертура, входной и выходной люки. Например, фокусное расстояние фото- и проекционных объективов может меняться от 50 до ПО мм. апертура от 0,17 до 0,26, поле зрения от 36x24 мм до 90x60 мм, рабочий отрезок от 45 до 95 мм.
Рабочий отрезок (расстояние от первой линзы до фокальной плоскости) объектива 11 должен быть достаточно большим, чтобы не препятствовать прохождению света от осветителей. Разрешение первой оптической системы должно быть не менее 20 линий на 1 мм.
В качестве второй оптической системы целесообразно выбирать объектив, специально рассчитанный на работу со светочувствительными матрицами, например, ТВ-объектив или объектив цифровой камеры. Достаточно использовать объектив с фиксированным фокусным расстоянием (монофокальный) и с ручной установкой диафрагмы. ТВ-объективы целесообразно использовать с фокусным расстоянием от 25 до 12 мм, рассчитанными на матрицу 2/3" или 1/2". ТВ- объективы необходимо выбирать с высоким разрешением («мeгaпикceльныe»), предназначенные для машинного зрения (минимум геометрических аберраций).
Используемый объектив должен быть рассчитан на работу с матрицей определенного размера. Однако он может использоваться и с матрицами меньшего размера. Например, объектив, имеющий маркировку 2/3"мoжeт также работать с матрицами 1/2", 1/3" и т.д. В настоящее время выпускается широкая номенклатура монохромных ПЗС и КМОП-матриц с типоразмерами от 1/6" до 1,8" и более. Наиболее употребительными являются размеры 1/3" (диагональ 6 мм), 1/2" (диагональ 8 мм) и 2/3" (диагональ 11 мм). Матрицы от 1" и более дороги, а матрицы 1/4" и менее имеют малый динамический диапазон и большие шумы.
Линейное увеличение, даваемое системой равно Г=F1/F2. Поэтому фокусное расстояние ТВ-объектива выбирают исходя из размеров рабочей зоны А'В' объекта исследования, фокусного расстояния первого объектива и размеров матрицы. Важно, чтобы входной люк PQ второго объектива примерно равнялся выходному люку KM первого объектива и светопропускающему диаметру интерференционного светофильтра 14.
Интерференционные светофильтры (32а, 326), расположенные на осветителях имеют полосу пропускания от 40 до 60 нм. Светофильтр (14) имеет
полосу пропускания от 30 до 50 нм. Очень важно, чтобы интеграл перекрывания спектров пропускания светофильтров (32а, 326) и (14) был минимальным, т.к. от этого напрямую зависит соотношение сигнал/шум устройства. Фильтры, должны иметь гарантированное ослабление света вне полосы пропускания равное 106, а о фактически 10 (по данным производителя). Эмпирически установлен критерий подбора пары фильтров (14) и (32) как отсутствие видимого свечения светоизлучающих диодов (СИД), оцениваемое визуально в темном помещении, при наложении светофильтра (14) на светофильтр (32) при включенном на максимальную мощность осветителе. Используемые технические решения позволяют работать с ПЗС-матрицами без охлаждения. Осветитель
Для того чтобы реализовать возможности сканирования больших поверхностей в простых оптических системах, необходимо добиваться максимальной равномерности освещенности объекта. Эта задача не является тривиальной. Существуют ограничения в использовании лазерных источников из- за резкой неравномерности плотности излучения по сечению лазерного пучка, а также ламп, формирующих широкий спектр светового потока, из-за необходимости ведения в конструкцию элементов, которые увеличивают ее габариты и стоимость. Более предпочтительными в настоящее время являются осветители на основе матриц СИД, имеющие малую стоимость и габариты.
Известно применение СИД для создания флуоресцентных сканеров или микроскопа, ориентированного на сканирование биочипов [24, 34]. С помощью СИД возможно обеспечить освещение образца и возбуждение его флуоресценции для разных схем регистрации флуоресценции. Из-за малых размеров СИД их можно размещать рядом с объективом или в корпусе объектива, или использовать световоды для передачи возбуждающего света от удаленных источников света, создавать освещение, падающее под углом к лицевой или к задней поверхности биочипа или формировать пучок, который направлен перпендикулярно задней поверхности прозрачного твердого носителя [35].
В устройствах при использовании интерференционной оптики необходимо формировать параллельный пучок света. Эту проблему решают введением дополнительных коллимационных линз [36-37] параболических рефлекторов [38], комбинаций щелевых экранов и цилиндрических линз [39], а также с помощью
комбинаций матриц СИД с матрицами, состоящими из множества линз [40]. К недостаткам таких решений можно отнести дополнительное увеличение стоимости осветителей и увеличение количества конструктивных узлов.
В процессе разработки устройства было обнаружено, что смещение индивидуального СИД от внешней поверхности держателя СИД вовнутрь цилиндрического отверстия, в которое установлен СИД, имеющий цилиндрическую форму и сферическую или параболическую линзу на торце, позволяет в случае нанесения поглощающего материала на стенки отверстия сформировать коллимированный пучок света без применения дополнительных линз или сложных конструктивных решений. Таким образом, устраняется часть паразитного фона, которая возникала бы при облучении поверхности объекта источником, рассеивающим свет на окружающие поверхности осветителя и держателя образца.
На фиг. 3 представлена схема формирования коллимированного пучка с помощью черного цилиндра выполненного в корпусе осветителя. На фиг.За представлена диаграмма направленности (индикатриса) излучения СИД (34). На фиг 36 представлена индикатриса излучения СИД установленного в черном цилиндре (36) в держателе (33) СИД в соответствии с фиг.Зв. Расстояние H между лицевой поверхностью держателя СИД (33) и торцом СИД лежит в пределах от 1 до 5 мм, что обеспечивает формирование пучка светового потока удовлетворяющего условию допустимой расходимости пучка, при котором угол β не превышает предельно допустимого угла, указанного в технических условиях эксплуатации используемого светофильтра (32) (обычно угол расходимости β лежит в пределах от 4 до 7,5 градусов). Длина отверстия (толщина держателя) подобрана таким образом, чтобы пропускать только лучи, удовлетворяющие условию допустимой расходимости пучка. То есть, чтобы угол β не превышал предельно допустимого угла, указанного в технических условиях эксплуатации используемого светофильтра (32) (обычно 5 градусов). Необходимо отметить, что в данном устройстве поглощается не более 10% излучаемого света. Каждый ocвeтитeль(31a, 316), формирующий световой поток с определенной спектральной полосой возбуждающего света, состоит из трех основных элементов - светонепроницаемого кожуха (37), интерференционного светофильтра (32) и держателя (33), содержащего упорядоченный массив СИД.
Светонепроницаемый кожух (37) ограничивает световой пучок таким образом, чтобы освещать площадку немного большую, чем поле зрения AB. Кожух (37) покрыт снаружи и изнутри черным матовым светопоглощающим слоем (38).
Держатель (33) представляет собой металлическую пластину, толщина которой выбирается специальным образом. В пластине сформирован упорядоченный массив круглых сквозных отверстий, диаметр которых соответствуют диаметру СИД (предпочтительно 5,0 мм или 3,0 мм). Оси отверстий перпендикулярны передней поверхности держателя. Вся поверхность держателя
(33) и отверстий (36) покрыта черным матовым светопоглощающим слоем. Упорядоченный массив отверстий обладает свойствами поворотной симметрии 6-го или 4-го порядка (гексагональная или ортогональная упаковка).
Благодаря этому достигаются максимальная плотность монтажа СИД и (или) равномерность освещения. В отверстия плотно монтируются круглые СИД стандартного типоразмера (диаметром 5,0 мм или 3,0 мм). Металлический держатель (33) служит теплоотводящим элементом. Круглые отверстия позволяют в процессе изготовления осветителя поворачивать СИД относительно их продольной оси на произвольный угол, располагая их в совокупности так, чтобы обеспечить максимальную равномерность освещения рабочей области объекта.
Форма и размеры образованного таким образом массива СИД выбирается так, чтобы его (массива) проекция на плоскость объекта примерно соответствовала форме рабочей области исследуемого объекта. Массив СИД может образовывать форму круга, овала, прямоугольника, квадрата, многоугольника, треугольника.
Вместе с тем, форму массива выбирают с учетом размера и формы серийно выпускающихся интерференционных светофильтров. Светофильтр должен полностью покрывать все отверстия массива, не ограничивая свет. Предпочтительным являются светофильтры круглой формы, с внешними диаметрами 25 мм, 30 мм, 50 мм, как наиболее массово производимые и, следовательно, дешевые.
Светофильтр (32) плотно примыкает к передней поверхности держателя (33), располагаясь строго перпендикулярно продольным осям СИД. С этой целью держатель СИД имеет круглую проточку для точной фиксации светофильтра, являющуюся одновременно оптическим затвором, препятствующим боковому распространению света СИД.
Собранный таким образом осветитель является распределенным излучателем. Равномерность и интенсивность освещения зоны измерения возрастает за счет наложения световых пятен от каждого СИД. Применение двух симметрично расположенных осветителей повышает равномерность и мощность освещения.
Расстояние от осветителей (З lа, 316) до центра рабочей зоны, в которой размещен исследуемый объект, выбирается таким образом, чтобы световое пятно, формируемое на поверхности объекта одним СИД, примерно соответствовало минимальному размеру освещаемой зоны. Угол падения лучей α может меняться от 40 до 60 градусов и зависит от параметров (рабочего отрезка, числовой апертуры) первой части (11) оптической системы (10). Чем больше угол α (см.фиг.l), тем меньше расстояние от задней поверхности носителя объекта до экранов (компактнее конструкция), но тем меньше освещенность объекта. Расстояние между осветителями (З lа, 316) и лицевой поверхностью носителя (42), а также угол α можно менять незначительно во время юстировки устройства. При этом оптические оси осветителей (16а, 166) после настройки могут не проходить через центр объекта, сопряженный с оптической осью (15). Предпочтительное расстояние между осветителями (Зlа, 316) и центром объекта исследования составляет порядка 70 мм при угле α=55° для объектов, размещенных на биочипах размером 26x76мм.
Конструкция устройства выполнена с возможностью смены осветителей, предназначенных для возбуждения флуоресценции различных флуорохромов. Полосовые интерференционные светофильтры (32а, 326) выделяет такой спектральный диапазон света, который необходим для возбуждения флуоресценции метки.
Доминантные длины волн выпускаемых СИД УФ и видимого диапазона: 365÷375 нм; 405±5 нм; 475±5 нм; 505 нм; 525 нм; 565 нм; 575 нм; 595 нм; 625±5 нм; 660 нм; белый свет. Мощность излучения СИД выбирают в диапазоне от 10 до 25 мВт. СИД выбираются таким образом, чтобы их доминантная длина волны излучения попадала в полосу пропускания фильтра и максимально соответствовала максимуму спектра возбуждения флуорохрома. Использование массива СИД не только многократно повышает интенсивность возбуждающего
света, но и значительно увеличивает равномерность освещения рабочей области объекта.
Питание СИД.
Источник питания (84) позволяет осуществлять четыре режима питания СИД или их комбинацию:
1. Последовательное включение СИД и питание их высокостабильным током. Все диоды работают в одинаковых условиях.
2. Последовательное включение СИД и питание их стабильным по амплитуде импульсным током с ШИМ (широтно-импульсная модуляция). Амплитуда тока равна максимально допустимой для данного СИД согласно ТУ.
Позволяет регулировать интенсивность света осветителя (31) не изменяя спектр свечения СИД.
3. Параллельное включение СИД и питание их стабильным током. Позволяет индивидуально подстраивать интенсивность свечения каждого СИД для улучшения равномерности освещения.
4. Параллельное включение СИД и питание их стабильным по амплитуде импульсным током с ШИМ. Позволяет, как подстраивать свечение каждого СИД, так и регулировать светоотдачу осветителя (31).
Источник питания (84) содержит отключаемую электронную цепь синхронизации питания СИД с сигналом, управляющим длительностью работы электронного затвора светочувствительной матрицы (21). Включение синхронизации позволяет питать СИД (освещать объект) только на короткое время экспозиции кадра (не более 10 сек). При этом средний ток питания СИД может быть увеличен в несколько раз (до 4 раз), что в свою очередь примерно во столько же раз увеличивает интенсивность освещения объекта. Отключение синхронизации переводит работу осветителя в непрерывный режим, например, когда ведется непрерывный покадровый ввод изображений в компьютер.
Конструкция экранов
В рассматриваемом изобретении возможность смены режимов диагностики, которые входят в группу, состоящую из режимов измерения флуоресценции, люминесценции, рассеяния и пропускания света, осуществляется за счет установки или смены экранов, расположенных вдоль траектории оси оптической системы, и/или вдоль траектории световых пучков, сформированных источниками света. Причем устанавливаемые экраны позволяют: а) улучшить соотношение сигнал-
шум за счет поглощения паразитных световых потоков, б) повысить уровень полезного сигнала за счет двухкратного прохождения световых потоков через исследуемый образец при отражении или световозвращении световых потоков, в) формировать разные комбинации из экранов первой и второй группы, что позволяет одновременно гасить паразитное излучение и усиливать сигнал при формировании отраженного светового потока. Указанные возможности реализуются за счет поочередного ввода или вывода экранов первой и/или второй группы из траектории оптической оси (15) и/или из траекторий световых пучков (16а, 166), генерируемых источниками света (Зlа, 316). С этой целью, в рамках данного изобретения, первый экран первой группы (51) содержит отражающую или световозвращающую поверхность. Второй экран (52) первой группы содержит поглощающую поверхность. Третий экран (53) первой группы выполнен со светорассеивающей поверхностью. Экраны первой группы, устанавливаемые вдоль оптической оси (15), выполнены с планарной поверхностью, которая перпендикулярна оптической оси (15).
Экраны второй группы содержат экраны с отражающей, световозвращающей или поглощающей поверхностью. Первые экраны (61а, 616) второй группы с отражающей поверхностью могут быть выполнены в виде планарных пластин или выполнены в виде вогнутой сферической или параболической поверхности с линейным фокусом, который размещен перпендикулярно оптическим осям (16а, 166) осветителей и параллельно боковой поверхности носителя (41). Вторые экраны (62а, 626) второй группы выполнены со световозвращающей поверхностью и изготовлены из пластин с планарной поверхностью. Третьи экраны (63а, 636) второй группы содержат поглощающую поверхность и могут иметь планарную, вогнутую (цилиндрическую, параболическую) или уголковую форму.
Держатели экранов первой (50) и второй (61а, 616) групп выполнены с возможностью выведения или введения экранов в траектории оптических осей за счет съема или замены экрана, а также за счет поворота экранов относительно оптической оси.
Держатель первого экрана (51) первой группы может быть выполнен в виде отдельного узла или конструктивно объединен с держателем носителя (41) исследуемого образца. В том случае, если вместо планарного носителя (41) образца используют плоские кюветы для проведения реакций гибридизации или
реакций ПЦР, то держатель первого экрана первой группы может быть конструктивным образом связан с креплением дополнительных элементов, выполняющих функции регулирования температуры кюветы при проведении реакции ПЦР и/или реакции гибридизации. В конструкцию крепления экранов второй группы может быть введен дополнительный шарнирный элемент (69а, 696), приведенный на фиг.4, который обеспечивает возможность изменения угла положения плоскости первого (61а, 616) и/или второго экрана (62а, 626) по отношению к траектории осей светового потока (16а, 166) или держатель экранов может быть выполнен в виде комбинированной конструкции, которая может содержать крепление нескольких экранов, с возможностью их раздельного введения или выведения из траектории оптической оси.
Ниже приведены примеры построения устройств (вариантов) для разных режимов измерения с разными объектами исследования. Данные примеры включают, но не ограничивают других вариантов, которые могут быть выполнены на основе предложенных решений.
Диагностика объектов, иммобилизованных на твердой поверхности прозрачного носителя.
На фиг.4 приведен пример варианта устройства для диагностики объектов иммобилизованных на твердой поверхности прозрачного носителя (41). К таким объектам могут быть отнесены биочипы, срезы тканей, клетки. В данном варианте экраны первой и второй группы снабжены поглощающим слоем. Устройство содержит оптическую систему (10), состоящую из первой (11) и второй (12) части, между которыми установлен первый (14) светофильтр, светочувствительный детектор (21), регистрирующую и управляющую систему (80) (приведенную на фиг.2), первый (Зlа) и второй (316) осветители, снабженные вторыми светофильтрами (32а, 326), узел крепления (40) носителя (41) объекта исследования, второй экран (52), входящий в первую (50) группу экранов, два третьих экрана (63а, 636), входящих во вторую группу (60а, 606) экранов. Лучи выходят из осветителя в виде расходящегося пучка с углом β. Под полем зрения здесь понимается часть плоскости объекта, изображаемая на светочувствительной матрице (21) A'B\ Поэтому, при отсутствии виньетирования, поле зрения имеет размеры ГrА'В', где Г=F1/F2 - величина увеличения оптической системы (10). Так как светочувствительные матрицы имеют прямоугольную
форму, поле зрения также имеет форму прямоугольника. На фиг. 4 пунктирными линиями (24а, 246) обозначены крайние лучи, формирующие изображение на матрице (21). Очевидно, что все лучи, проходящие внутри конуса, ограниченного пунктиром (24а, 246), будут попадать в регистрирующую оптическую систему (10).
Далее возбуждающий свет попадает в рабочую область объекта, где возбуждает флуоресценцию кpacитeля(eй). Часть световых потоков проходит через прозрачный носитель и попадает в пространство за задней поверхностью носителя, в котором размещены экраны первой и второй группы, которые в данном режиме регистрации выполняют функцию поглотителей света.
Существенным отличием технического решения, используемого в данном изобретении по отношению к известным схемам гашения паразитного фона [27-30,
41], является включение поглотителей светового потока не только для гашения отраженного сигнала от лицевой поверхности твердого носителя, на которой размещен исследуемый объект.
Согласно изобретению в устройстве сформировано несколько уровней гашения паразитного фона.
Первый уровень использован для гашения отраженного света в конструкции держателей (33а, 336) осветителей, в которых внутренние поверхности цилиндрических отверстий, через которые проходит излучение от индивидиуальных СИД, покрыты первым слоем поглотителя.
Поглотитель света может быть выполнен в виде абсорбирующего покрытия
[42], поглощающей краски или за счет химического чернения внутренней поверхности держателя СИД после выполнения в нем отверстий. В последнем случае держатель диодов выполняют из дюралюминия, сверлят отверстия для установки свето диодов и затем чернят по известным технологиям.
Второй уровень гашения обеспечивают поглощающие элементы (38а, 386), служащие для гашения света, отраженного от поверхности носителя (41) и держателей экранов второй группы (60а, 606). Поглощающие элементы размещены на торцевых поверхностях кожухов (37а, 376), в которых закреплены держатели СИД (33а, 336). Поглощающие элементы (38а, 386) могут иметь прямоугольную или квадратную форму. Поверхность элементов (38а, 386) может быть выполнена в виде планарной, вогнутой цилиндрической или параболической формы. Предпочтительно чтобы размеры гасящего экрана превышали или были
равны размерам светового пучка, отраженного от поверхности (42) носителя образца. В качестве поглощающего элемента может выступить торцевая поверхность кожуха (37а, 376), на которую нанесено абсорбирующее покрытие, краска или поверхность кожуха может быть химически модифицирована для поглощения света.
Третий уровень гашения световых потоков, которые могут ухудшать соотношение сигнал-шум, размещен за задней поверхностью прозрачного носителя (41).
Основную часть пучка возбуждающего света, прошедшую через прозрачный твердый носитель (41), гасят поглотители (66а, 666), которые размещены на лицевых поверхностях третьих экранов (63а, 636), входящих во вторую (60а, 606) группу экранов. Экраны (63a,63б) могут иметь форму пластины, уголка, параболы или вогнутого цилиндра. Для того чтобы поток света поступал на экраны (63a,63б), первый (61а, 616) и второй (62а, 626) экраны выведены из траекторий (16а, 166) оптических осей осветителей. Вывод может быть осуществлен за счет поворота экранов (61, 62) вокруг шарниров (69а, 696).
Для того чтобы фоновое возбуждающее излучение, не поглощенное уловителями, а также рассеянное на элементах конструкции, не попадало в оптическую систему (10), в траекторию оптической оси (15) введен планарный экран (52) снабженный поглощающим слоем (55). Экран (52) входит в первую группу экранов (50). Центральная часть экрана (52) совмещена с осью (15) оптической системы (10).
В общем случае поглощающий слой может быть выполнен на основе абсорбирующего материала, входящего в группу, состоящую из пленок, формируемых химическим способом, композиции, включающей носитель и диспергированный пигмент, полимерных или текстильных материалов, снабженных клеящим слоем.
На фиг.5 приведен вариант устройства с комбинированным применением поглощающих и отражающих экранов для диагностики объектов иммобилизованных на твердой поверхности прозрачного носителя (41). К таким объектам могут быть отнесены биочипы, срезы тканей, клетки.
Известны способы повышения эффективности съема данных с биочипов за счет введения зеркальных слоев либо на лицевую поверхность биочипа [43], либо на заднюю поверхность чипа [44], или чип формируют в виде многослойной
конструкции с созданием внутренних линз и нижней отражающей поверхности [45]. Известен микроскоп [32], в котором формируют двойное прохождение пучка света через прозрачный исследуемый образец с помощью двух объективов, имеющих идентичные оптические характеристики и зеркала. Зеркало размещено с обратной стороны исследуемого объекта за вторым объективом и отражает поток света, проходящий через исследуемый образец.
Однако данное решение относится к конкретному типу оптического микроскопа и не предполагают возможности его применения в сканерах с широким рабочим полем или в сканерах с мультирежимным способом работы. Кроме того, в данном устройстве отсутствуют поглотители рассеянного света.
В предлагаемом варианте устройства используется комбинированное применение поглощающих и отражающих экранов. Отличие от ранее рассмотренной схемы, приведенной на фиг. 4, состоит в том, что пучки падающего света, проходя через прозрачный носитель (41), отражаются от зеркальной поверхности экранов (61а, 616), которые в данном режиме установлены перпендикулярно падающему потоку света. Лицевая поверхность экранов снабжена отражающим слоем (64а, 646). Экраны (61а, 616) вводят в траекторию оптических осей осветителей (16а, 166) либо с помощью поворотных механизмов с использованием шарниров (69а, 696), либо устанавливают экраны в стационарные держатели (на фиг. 5 не представлены).
За счет отражения от зеркальной поверхности экранов пучки света проходят через прозрачный носитель (41) исследуемого объекта второй раз и далее поглощаются на поверхностях поглотителей (38а, 386), размещенных на кожухе осветителей (Зlа, 316). В результате освещенность рабочей области объекта возрастает до двух раз. Пропорционально освещенности во столько же раз возрастает флуоресценция. Значительно улучшается равномерность освещения. Поверхность зеркал не попадает в пространство конуса (18) оптической системы (10). Таким образом, не вносится артефактов в изображение. Вместо планарных поверхностей можно использовать собирающие зеркала для лучшей концентрации отраженного пучка на объекте, как это обсуждалось в разделе о конструкции экранов.
Отражающая поверхность (64а, 646) может быть выполнена в виде зеркала, нанесенного на стеклянный экран или зеркала, напыленного на полимерном
носителе, или выполнена в виде пленки с напыленной отражающей поверхностью, снабженной клеевым слоем.
Отраженный от задней поверхности носителя (43) и других элементов конструкции свет гасится на экране (52), поверхность которого снабжена поглощающим слоем (55), что способствует повышению отношения сигнал-шум.
Другой вариант устройства, который может быть выполнен на основе конструкции, изображенной на фиг.5, относится к комбинированному применению поглощающего и световозвращающих экранов для диагностики объектов иммобилизованных на твердой поверхности прозрачного носителя (41). В данном варианте экраны (61а, 616), выводятся из траекторий (16а, 166) прохождения световых потоков и открывают лицевую поверхность вторых экранов (62а. 626), входящих в группу вторых (60) экранов, расположенных за задней поверхностью (43) носителя (41) образца.
Лицевая поверхность вторых экранов (62a,62б) снабжена световозвращающим слоем. Установка световозвращающих покрытий позволяет возвратить световой поток, который попадает внутрь призм, стеклянных шариков или других световозращающих структур. За счет полного внутреннего отражения происходит преломление хода пучка света внутри световозвращающих элементов, после чего поток возвращается и падает на обратную сторону (43) носителя (41) образца. В результате освещенность рабочей области объекта возрастает до двух раз. Пропорционально освещенности во столько же раз возрастает флуоресценция.
Увеличение интенсивности флуоресцентного сигнала превышает увеличение фона, поскольку значительная часть рассеянного света, определяющего уровень фонового сигнала, снижается под действием поглотителя (55), нанесенного на экран (52), и поглотителей (38а, 386), нанесенных на кожух осветителя, что в конечном итоге приводит к повышению отношения сигнал-шум.
В качестве световозвращающего слоя предпочтительно использовать световозвращающие материалы, выполненные в виде панелей, листов или пленок, снабженных клеевым слоем. Известно применение световозвращающих элементов в изготовлении световозвращающих панелей [46] и световозвращающих элементов, выполненных в форме листа [47]. Известны гибкие световозвращающие материалы, которые содержат световозвращающую структуру с плоской лицевой поверхностью и с
множеством расположенных на ее тыльной поверхности основных и дополнительных световозвращающих элементов [48].
Наиболее предпочтительно использовать в качестве световозвращающих материалов покрытия, разработанные фирмой ЗМ. Фирма предлагает широкий спектр мультислойных световозвращающих покрытий, которые выполнены с применением сфер [49], микроструктурированных поверхностей [50-52].
Наиболее перспективны световозвращающие пленки алмазного типа. Например, пленка серии 3990 VIP фирмы ЗМ [53] представляет собой материал на основе микропризм, которые обеспечивают более высокую световозвращающую способность. Пленки с нанесенным световозвращающим слоем снабжены самоклеящим составом и наклеиваются при комнатной температуре. Наиболее продолжительный срок службы достигается при наклейке на предварительно подготовленную алюминиевую поверхность экрана.
Световозвращающая поверхность материалов, основанная на использовании кубических уголковых призм, изготавливается методом литья или формовки призматических элементов на нижней поверхности очень тонкой подложки. В зависимости от типа материала, на одном квадратном сантиметре поверхности размещается от 7300 до более чем 15500 призм (20).
На фиг.6 приведен вариант устройства, который обеспечивает четырехкратное увеличение сигнала флуоресценции или люминесценции. В соответствии со схемой, приведенной на фиг. 6, в оптические каналы введен первый экран (51), входящий в первую группу экранов (50), который перекрывает как траекторию (15) оптической системы (10), так и траектории (16а, 166) оптических потоков излучателей света (З lа, 316). В данной конфигурации экран (51) может содержать или зеркальное покрытие или световозвращающее покрытие. Держатель экрана (51) может быть выполнен в виде отдельного узла или конструктивно объединен с держателем носителя (41) исследуемого образца. При этом расстояние между задней поверхностью носителя (41) и лицевой поверхностью отражающего или свето возвращающего слоя выбирают минимально возможным, например, 0, lмм. Зеркало или световозвращающий элемент своей поверхностью полностью перекрывает поле зрения оптической системы (10). Возбуждающий свет проходит через исследуемый объект два раза - в прямом и обратном (за счет отражения или световозвращения) направлениях. При этом освещенность возрастает почти в два раза. Кроме того, свет флуоресценции,
испускаемый в направлении зеркала, отражается от него и также попадает в регистрирующую оптическую систему, что дополнительно почти удваивает светосбор. В результате общее увеличение потока света флуоресценции возрастает до четырех раз. Отличие от известных решений, например от использования биочипов или кювет с зеркальной поверхностью, заключается в том, что отношение сигнал-шум улучшается за счет поглощения рассеянного света, отраженного от верхней поверхности биочипов или кювет, поглощающими элементами (38а, 386), размещенными на держателях источников света (Зlа, 316).
На фиг. 7а и 76 представлены схемы преобразования падающего света (22) на верхнюю поверхность (42) носителя (41) на котором размещены образцы в виде кластеров (2) с зондами (1), на которые гибридизуются молекулы, снабженные флуоресцентными метками. Схема преобразования подающего света с применением зеркальной поверхности экрана, представлена на фиг. 7а и в варианте, когда поверхность экрана снабжена световозвращающей поверхностью - нa фиг.7б.
В случае работы с зеркальным экраном, поток света (22), отразившись от отражающей зеркальной поверхности, формирует отраженный поток (23), который вызывает дополнительную флуоресценцию образца. В свою очередь сигнал флуоресценции проникает через прозрачный носитель (41) и, отразившись от зеркального слоя (64), размещенного на экране (61), возвращается через заднюю (43) поверхность прозрачного носителя вторым сигналом флуоресценции (27) дополнительно к первому сигналу (26). Таким образом, общий сигнал, поступающий в оптическую систему (10), теоретически может быть в четыре раза больше, чем в обычных схемах сканеров флуоресценции. На фиг 76 представлен вариант со световозвращающей поверхностью (67), нанесенной на экран (62) с помощью клеящего слоя (68).
Падающий поток (22), отразившись от световозвращающей поверхности (67) отраженным потоком (28), вновь вызывает флуоресценцию образца. В свою очередь сигнал флуоресценции проникает через прозрачный носитель (41) и, отразившись от световозвращающего слоя (67), возвращается через прозрачный носитель вторым сигналом (30). Таким образом, общий сигнал, поступающий в оптическую систему (10), теоретически может быть в четыре раза больше, чем в обычных схемах сканеров флуоресценции.
Однако с учетом поглощения и рассеяния света на носителе образца и с учетом эффективности работы световозвращающей поверхности, которая снижается при увеличении угла наклона α падающего потока (22), данное техническое решение позволяет обеспечить возврат светового потока через заднюю поверхность (43) носителя (41) и повысить дополнительную освещенность объекта не в четыре раза, как в случае с зеркалом, а от двух до трех раз, в зависимости от типа световозвращающего материала и величины угла наклона α. Однако, световозвращающее покрытие существенно дешевле зеркального.
Зеркало или световозвращающая поверхность попадает в поле зрения оптической системы (10), поэтому к качеству их поверхности предъявляются повышенные требования. В частности, поверхность не должна диффузно рассеивать свет. В противном случае возрастет фон из-за проникновения возбуждающего излучения в канал регистрации. И хотя фон вычитается в процессе обработки изображения, динамический диапазон сигнала сужается. Частички пыли, адсорбированные на поверхности зеркала или световозвращающей поверхности, способны рассеивать свет и проявляться на первичном изображении (см. Процедуру обработки изображений). Однако они точно так же проявляются на «пycтoм кaдpe» без объекта и в разностном кадре не присутствуют.
На фиг. 8 приведен вариант устройства, которое позволяет обеспечить сканирование носителей с объектами, окрашенными колориметрическими метками. Конфигурация применяется для прозрачных объектов, содержащих не флуоресцирующие красители (например, биочипы с кластерами, проявляемыми в ходе пероксидазной цветной реакции). В этом случае регистрируется поглощение света определенной длины волны или белого света. В данной конфигурации светопоглощающий экран (52) выводится из траектории оптической оси (15) и в траекторию вводится белый матовый, диффузно рассеивающий экран (53). Рассеивающий экран (53) может быть установлен вместо светопоглощающего экрана (52), или перед экраном (52), или предварительно установлен за экраном (52). В последнем случае при выведении экрана (52) лицевая поверхность светорассеивающего экрана (53) вводится в траекторию (15) оптической системы (10).
В устройство дополнительно введены третий (39а) и четвертый (396) источники света, или самосветящийся (излучающий) экран (54), который обеспечивает возможность освещения рассеивающей лицевой поверхности
третьего экрана (53) с лицевой стороны или с торцевой стороны экрана (53) или с задней стороны экрана (53), как это представлено на фиг. 8.
Осветители (39а, 396) расположены так, что свет направляется под углом α2 непосредственно на лицевую поверхностью светорассеивающего экрана (53), однако принцип темнопольного освещения сохраняется.
Экран равномерно освещается осветителями (39а, 396) и рассеивает свет во всех направлениях, в том числе в сторону предмета задней поверхности (43) носителя (41) образца. В осветителях интерференционные светофильтры (32) могут присутствовать, а могут и отсутствовать, т.к. степени монохроматичности света, испускаемого СИД (полоса около 100 нм), оказывается для некоторых задач достаточно.
В регистрирующей оптической системе светофильтр (14) убирается из траектории (15) хода лучей. Доминантная длина волны испускаемого осветителями света должна соответствовать максимуму спектра поглощения красителя. Например, для цветной пероксидазной реакции с диметиламинобензидином это должен быть синий свет (доминантная длина волны СИД 470 - 490 нм).
Объект исследования, иммобилизованный на поверхности (42) носителя
(41), находится в фокальной плоскости оптической системы (10). Его изображение резкое. Изображение поверхности экрана (53) оказывается сильно размытым
(нерезким) и, таким образом, неравномерности освещения дополнительно сглаживаются. В отсутствие носителя (41) с исследуемым образцом в траектории оптической системы, например, на этапе измерения фона, в кадре имеется равномерный яркий фон. Когда носитель (41) с объектом исследования введен в траекторию оптической системы (10), на белом фоне резко видны более темные кластеры (пятна) с красителем, т.к. при прохождении света сквозь объект часть его поглощается.
Чтобы во время измерения не перегрузить светочувствительную матрицу (21) значительно снижают мощность излучения осветителей (39а, 396). Особенности объектов исследований
Известно, что биочипы в основном выполняют на твердых подложках, изготовленных из стекла, полимеров, металлов, слюды и их комбинаций.
Наиболее широко распространены биочипы, выполненные на твердой основе, в качестве которой используют микроскопные предметные стекла с
размером 26x76мм [54]. Поверхность стекол либо модифицируется, либо зонды иммобилизуются на немодифицированную поверхность. Модификация поверхности силанами слабо влияет на прозрачность слайдов, поэтому стеклянные слайды могут быть использованы как для формирования биочипов с использованием колориметрических меток [55], так и с использованием флуоресцентных меток [56].
Для повышения чувствительности анализа важно, чтобы материал, из которого изготовлен объект, не флуоресцировал под действием возбуждающего излучения. В частности, при работе со стеклянными слайдами целесообразно использовать возбуждающее излучение с максимумом в районе 625 нм - 635 нм.
В качестве носителя объекта исследования может выступать, по крайней мере, одна тонкая (толщина 1 мм) стандартная спектрофотометрическая кювета. В этом случае измеряется флуоресценция раствора объекта в кювете или поглощение света красителем на определенной длине волны (вариант, представленный на фиг. 8). В случае измерения поглощения возможна установка кюветы сравнения. Носителем объекта может быть проточная кювета. Устройство может работать как ПЦР в реальном времени (Rеаl Тimе PCR). В этом случае в качества носителя объекта будет выступать специализированная камера ПЦР. Предлагаемое устройство может быть произвольно ориентировано в пространстве, в частности, оптическая ось (15) может располагаться в горизонтальной или вертикальной плоскости. Это позволяет использовать как закрытые, так и открытые кюветы, ячейки, микроплашки.
Пример одного из вариантов устройства, который включает, но не ограничивает других вариантов изобретения, приведен на фиг. 9. Согласно изобретению свет направляют под углом α к поверхности ячейки, в которой осуществляют реакцию амплификации. Падающий свет от двух источников света (Зlа, 316) преломляется на лицевой поверхности (44) ячейки. Часть света отражается от лицевой поверхности первой стенки ячейки и возвращается на лицевую поверхность противоположного источника, снабженную поглощающим материалом (38), для исключения паразитного фона. Другая часть света проникает через первую стенку ячейки, выполненной из прозрачного материала, и далее, преломившись через границу раздела между первой внутренней стороной (45) первой стенки ячейки и раствором (46), в котором осуществляется амплификация, проникает внутрь раствора, где вызывает
флуоресценцию маркеров, гибридизующихся с зондами (1), которыми снабжены кластеры (2) биомолекул. Проникнув через раствор, свет преломляется на второй границе раздела между внутренней частью (47) второй стенки ячейки и раствором для амплификации. Часть преломленного света возвращается в раствор (46). Другая часть проникает через прозрачный материал (48) второй стенки ячейки и преломляется на границе раздела между воздушным пространством и задней поверхностью (49) второй стенки ячейки. Пройдя через промежуток между задней поверхностью ячейки и лицевой поверхностью первого экрана первой группы, свет отражается от зеркальной поверхности (54) экрана, который приклеен клеевым слоем (56) к держателю ячейки (57), и возвращается через воздушный промежуток и вторую стенку ячейки в раствор для амплификации. Тем самым осуществляется двойной проход пучка света через раствор, что вызывает увеличение сигнала флуоресценции. Держатель ячейки (57) дополнительно снабжен нагревателем (58) или элементом Пельтье для того, чтобы осуществить регулирование температуры при реакции гибридизации или амплификации.
Приведенные схемы устройства не ограничивают других вариантов размещения других объектов иммобилизованных, например, в микроплате. Для удобства работы пользователя устройство может быть закреплено вертикально, горизонтально или может работать в конфигурации, когда оптическая система размещена в нижней части устройства, для того чтобы освещать заднюю поверхность микроплат.
Описание процедуры обработки изображения.
В зависимости от задач диагностики для измерения флюоресценции или люминесценции используют первый экран первой группы, который устанавливают в держатель образца, или используют второй экран первой группы в комбинации с первыми или вторыми экранами второй группы, или используют второй экран первой группы в комбинации с третьими экранами второй группы. Для измерения пропускания или рассеяния используют третий экран первой группы в комбинации с третьими экранами второй группы.
На фиг. 10 приведен алгоритм способа обработки данных. Окончательное изображение объекта формируется следующим образом. Объект исследования помещается в устройство. По предварительному изображению, получаемому на дисплее (81) компьютера, с помощью устройства (82) подбираются условия
съемки (длительность экспозиции, усиление сигнала), чтобы не происходило насыщения яркости пикселей светочувствительной матрицы (12).
Производится захват изображения компьютером. Кадр с изображением объекта запоминается. В этом кадре присутствует как полезный сигнал от объекта, так и накладывающийся на него шумовой сигнал.
Затем объект удаляется из устройства и производится съемка «пycтoгo кaдpa» при тех же условиях. Пустой кадр содержит информацию только о шумовом сигнале, т.к. полезный отсутствует. Пустой кадр фиксирует слабый фоновый свет, свечение частичек пыли на зеркале и других элементах оптики, тепловые шумы и «гopячиe пикceли» светочувствительной матрицы, постоянную подставку (сдвиг «ypoвня чepнoгo») в сигнале и другие помехи, не связанные с объектом.
Далее «пycтoй кaдp» вычитается попиксельно из основного кадра и результат запоминается. Эта процедура минимизирует погрешности измерения. Она корректна, т.к. преобразование сигналов в узле (82) происходит линейным образом.
Получившийся разностный кадр умножается попиксельно на соответствующие нормировочные коэффициенты, для того чтобы выровнять изображение по полю зрения AB. Для того, чтобы учесть (компенсировать) неравномерность освещения поля зрения возбуждающим светом и неравномерность сбора света флуоресценции регистрирующей системой (10).
Окончательно сформированный таким образом кадр может быть сохранен компьютером. Несколько кадров от одного объекта могут быть суммированы с усреднением для уменьшения случайных шумов и далее обработаны соответствующими программами по заданным алгоритмам.
Заметим, что процедура обработка изображения в фотометрическом варианте происходит так же, как и во флуоресцентном варианте. Из первого изображения, где нет объекта (яркий фон), вычитается изображение с объектом (имеются темные пятна). В результате возникает негативное (на темном фоне светлые пятна) изображение объекта, которое далее выравнивается умножением на нормировочную матрицу.
Получение нормировочных коэффициентов.
Для расчета нормировочных коэффициентов необходимо использовать эталонный объект. Предполагается, что эталонный объект имеет идеально
равномерное распределение плотности излучения света флуоресценции по своей поверхности. В нашем случае эталонный объект должен представлять собой тонкий (не более 0,5 мм), прозрачный однородно флуоресцирующий по площади слой, закрепленный на прозрачном не флуоресцирующем носителе, аналогичном носителю биочипа. Например, это может быть тонкая (<0,l мм), прозрачная, флуоресцирующая, однородная по толщине (не хуже 1%) пластиковая пленка, прикрепленная к поверхности не флуоресцирующей пластины из пластика, оптического стекла или кварца. Или тонкая плоскопараллельная пластина цветного флуоресцирующего оптического стекла. Или это может быть слой жидкости, содержащий флуоресцирующие молекулы, и находящийся между двумя строго параллельными прозрачными не флуоресцирующими пластинами. Расстояние между пластинами порядка 0,1 - 0,2 мм. Или это может быть молекулярный слой флуорохрома, иммобилизованного на поверхности прозрачной не флуоресцирующей пластины, имеющий строго равномерное распределение по поверхности.
Заметим, что теоретически, в отсутствие аппаратных погрешностей, яркость свечения всех пикселей изображения эталонного объекта должна была бы быть одинакова. Однако вследствие неравномерности освещения объекта осветителями (31), неравномерности сбора света флуоресценции оптической системой (10) и других причин (наличия фона возбуждающего света, наличия погрешностей преобразования света в аналоговый электрический сигнал и его аналого- цифрового преобразования, электронные шумы), яркости пикселей изображения эталонного объекта различаются.
Процедура попиксельной нормировки позволяет существенно, не менее чем в 15 раз, уменьшить общую погрешность измерений. Она заключается в следующем.
Производится съемка одного или нескольких (предпочтительно) эталонных объектов. При обработке эталонных изображений попиксельное умножение на нормировочные коэффициенты не производится или они полагаются равными единице. Полученные кадры суммируются с усреднением (т.е. попиксельно складываются и делятся на число кадров, при необходимости картинка сглаживается по известным математическим процедурам). В результате получается усредненный эталонный кадр, характеризующий, в основном,
неравномерность освещения объекта осветителями (31) и неравномерность сбора света (у краев поля зрения) регистрирующей системой (10).
Выбирается значение яркости «этaлoннoгo» пикселя, на который будет производиться нормировка. Это может быть самый яркий пиксель эталонного кадра или среднее значение яркости по кадру и т.д.
Для каждого пикселя эталонного кадра рассчитывается коэффициент, равный частному от деления значения яркости «этaлoннoгo» пикселя на значение яркости данного пикселя. Очевидно, что при попиксельном умножении (каждый пиксель на свой коэффициент) на эти нормировочные (выравнивающие) коэффициенты, значения яркости всех пикселей эталонного кадра станут равными значению «этaлoннoгo» пикселя. Таким образом, происходит выравнивание изображения по полю зрения.
Вычисленные нормировочные коэффициенты запоминаются в виде упорядоченного массива (нормировочной матрицы), которая является своеобразным «пacпopтoм» прибора и сохраняется на все время его эксплуатации.
В фотометрическом варианте при вычислении нормировочных коэффициентов изображение эталонного объекта не используется. Вместо него берется изображение матового экрана.
Для каждой пары осветителей рассчитывается свой массив нормировочных коэффициентов. Коэффициенты вычисляются индивидуально для каждого экземпляра прибора, сохраняются и используются в течение всего времени его эксплуатации. Если происходит переюстировка прибора, например, вследствие ремонта, то нормировочные матрицы должны пересчитываться заново.
Узел преобразования сигналов Узел преобразования сигналов (82) содержит схемы управления работой матрицы (21), производит аналого-цифровое преобразование сигнала яркости от каждой ячейки матрицы (21), задает параметры съемки (экспозицию кадра, усиление и т.д.), осуществляет взаимодействие с компьютером (прием и передачу данных) по заданному интерфейсу (например, шине USB), синхронизирует работу осветителей, управляя работой источников питания.
На фиг. 11 представлены изображения кластера, состоящего из 13 точек, нанесенного на поверхность модифицированного стеклянного чипа в двух вариантах измерения сигнала.
В первом варианте измерения использовалась схема устройства, приведенная на фиг.4. Два световых потока от источников света (Зlа) и (316) освещают поверхность стеклянного слайда (41) с нанесенными зондами и формируют темновое поле, при котором излучаемый поток не поступает в оптическую систему (10). Отраженное излучение от поверхности слайда поглощается на поверхности гасящих элементов (38а) и (386). Световые потоки проходят через прозрачный слайд с нанесенным образцом и поглощаются гасителями (66а) и (666), расположенными перпендикулярно траектории световых потоков. Дополнительно, рассеянный свет гасится на поверхности (55). Применение такого комплекса позволяет снизить уровень фона и получить изображение точек с зондами с максимальным отношением сигнал-шум представленное на фиг 1 Ia.
Во втором варианте измерения использовалась схема устройства, приведенная на фиг. 6. В данной схеме измерения использовалась конструкция устройства, содержащая зеркало (54), расположенное за задней поверхностью слайда. Такое конструктивное решение позволяет увеличить уровень сигнала до четырех раз. Результат такого усиления сигнала представлен на фиг 116. Промышленная применимость
Устройство предназначено для регистрации флуоресценции молекул флyopoxpoмa(oв), иммобилизованных на поверхности или в тонком слое объекта, а также для измерения поглощения или рассеяния колориметрически окрашенных кластеров биочипов.
Данное устройство может работать с прозрачными, полупрозрачными, непрозрачными, черными и зеркальными поверхностями. В конструкции устройства отсутствует механическое сканирование объекта исследования в координатах ХУ.
Устройство может работать в качестве флуориметра и фотометра - измерять флуоресценцию и поглощение растворов. Например, измерять концентрацию ДНК, белка и т.д. в растворе или контролировать количество выделенной ДНК, наработанной в ходе ПЦР.
Устройство позволяет проводить кинетические измерения с характерными временами, зависящими от быстродействия электронного устройства 82 (типично 0,1 сек). Для этого используется режим непрерывного ввода изображений (например, видеопотока) с последующей обработкой каждого кадра.
Устройство может работать в произвольной ориентации в пространстве, т.к. объект фиксируется в устройстве позиционирования.
Устройство, созданное согласно изобретению, обладает рядом значительных преимуществ по сравнению с известными решениями. Оно имеет очень простую конструкцию, не предъявляет высоких требований к применяемым оптическим компонентам и, что особенно важно, не ставит никаких специальных условий для ввода излучения возбуждения флуорохрома и/или вывода флуоресцентного излучения. Кроме того, устройство позволяет проводить всевозможные биохимические исследования, а изготовление основных узлов устройства не требует высоких затрат.
Литература:
I. Реukеrt M. еt аl. Аррагаtus fоr mеаsuriпg iп раrtiсulаг lumiпеsсепt апd/оr fluогеsсепt гаdiаtiоп. US Раtепt 6,949,754 (Sерtеmbеr 27, 2005). 2. Frооt H. Fluогеsсепt miсrоапаlуtiсаl sуstеm апd mеthоd fоr dеtесtiпg апd idепtifуiпg оrgапiс mаtеriаls. US Раtепt 4,087,685 (Мау 2, 1978).
3. Реrоv А. еt аl. Вiосhiр sсаппеr dеviсе. US Раtепt 6,329,661 (Dесеmbеr И, 2001).
4. Тrulsоп M. еt аl. Mеthоd апd аррагаtus fоr imаgiпg а sаmрlе оп а dеviсе. US Раtепt Аррl. 20050281708 (Dесеmbеr 22, 2005).
5. Giеbеlеr R. еt аl. Орtiсаl sуstеm fоr а sсаппiпg fluоrоmеtеr. US Раtепt 6,236,456 (Мау 22, 2001).
6. Моdliп D. еt аl. Мulti-mоdе light dеtесtiоп sуstеm. US Раtепt 6,825,921 (Nоvеmbеr 30, 2004). 7. Fеrпапdеs J. еt аl. Мutli-fuпсtiопаl рhоtоmеtеr with mоvаblе liпkаgе fоr rоutiпg орtiсаl fibеrs. US Раtепt 5,436,718 (JuIy 25, 1995).
8. Gаmbiпi M. еt аl. Iпstrumепt fоr mопitоriпg роlуmеrаsе сhаiп rеасtiоп оf DNA. US Раtепt 7,008,789 (Маrсh 7, 2006).
9. Вiсkеl R. еt аl. Dеviсе fоr thе аmрlifюаtiоп апd dеtесtiоп оf пuсlеiс асids. US Раtепt Аррl. 20060078929 (Арril 13, 2006).
10. Rеmасlе J. еt аl. Rеаl-timе PCR оf tаrgеts оп а miсrо-аrrау. WO2006053770 (2006-05-26).
I I. Реrоv А. 14. Реrоv А. еt аl. Роrtаblе biосhiр sсаппеr dеviсе. US Раtепt 6,407,395 (Juпе 18, 2002).
12. Барский В.Е Флуоресцентный микроскоп. Патент RU 2166201(2001.04.27).
13. Yоkоkаwа N. еt аl. Меthоd апd арраrаtus fоr геаdiпg fluоrеsсепсе. US Раtепt 6,646,271 (Nоvеmbег 11, 2003). 14. Маthiеs R. еt аl. Lаsеr ехсitеd сопfосаl miсrоsсоре fluоrеsсепсе sсаппеr апd mеthоd. US Раtепt 5,091,652 (Fеbшаrу 25, 1992).
15. Нuеtоп I. еt аl. Нigh-sрееd fluоrеsсепсе sсаппеr. US Раtепt 5,459,325 (Осtоbеr 17, 1995).
16. Кurеshу F. еt аl. Мiсrоаrrау dеtесtоr апd mеthоds. US Раtепt 7,354,389 (Арril 8, 2008 ).
17. Wапg J. еt аl. Fluоrеsсепt miсrоаrrау апаlуzеr. US Раtепt 7,042,565 (Мау 9, 2006).
18. Тапааmi T. Вiосhiр rеаdеr апd fluоrоmеtriс imаgiпg арраrаtus. US Раtепt Аррl. 20060029523 (Fеbruаrу 9, 2006). 19. Wапg J. еt аl. ССD-bаsеd biосhiр rеаdеr. US Раtепt 7,173,701 (Fеb 6, 2007).
20. Катеркамп А. Устройство и способ проведения количественного анализа сродства с использованием флюоресцентных меток. Патент RU 2158916 (2000.11.10).
21. Веvis С. еt аl. Dаrkfiеld iпsресtiоп sуstеm hаviпg рhоtоdеtесtоr аrrау. US Раtепt 7,061,598 (Juпе 13, 2006).
22. Реtеrsоп T. еt аl. Usе оf light sсаttеriпg раrtiсlеs iп dеsigп, mапufасturе, апd quаlitу сопtrоl оf smаll vоlumе iпstrumепts, dеviсеs, апd рrосеssеs. US Раtепt 6,714,299 (Маrсh 30, 2004).
23. Оldhаm M. еt аl. Соmbiпаtiоп rеаdеr. US Раtепt 6,970,240 (Nоvеmbеr 29, 2005).
24. Барский В.Е и др. Флуоресцентный микроскоп. Патент RU 2182328 (2002.05.10).
25. Montagu J. еt аl.Rеаdiпg оf fluоrеsсепt аrrауs. US Раtепt Аррl. 20060127946 (Juпе 15, 2006). 26. Аlbеrtsоп D. G. еt аl. Widе fiеld imаgе fоr quапtitаtivе апаlуsis оf miсrоаrrауs. US Раtепt Аррl. 20050260741 (Nоvеmbеr 24, 2005).
27. Сhhibbеr R. еt аl. Меthоd апd арраrаtus fоr illumiпаtiпg а substrаtе duriпg iпsресtiоп. US Раtепt Аррl. 20050146719 (JuIy 7, 2005).
28. Xu J. еt аl. Dеfесt rеviеw sуstеm апd mеthоd. US Раtепt Аррl. 20050094136 (Мау 5, 2005).
29. Engelhardt J. еt аl. Орtiсаl sуstеm iп thе rау раth оf а сопfосаl fluогеsсепсе miсrоsсоре. US Раtепt 6,785,302 (Аugust 31, 2004). 30. Iпсе С. Sуstеm апd mеthоd fоr imаgiпg thе rеflесtапсе оf а substrаtе. US
Раtепt Аррl. 20060241364 (Осtоbеr 26, 2006).
31. Мuеllеr G. еt аl. Орtiсаl sуstеm fоr tгапsmittеd-light miсrоsсору with iпсidепt illumiпаtiоп. US Раtепt 4,515,445 (Мау 7, 1985).
32. Мuеllеr G. еt аl. Miсrоsсоре fоr rеflесtеd-light апd tгапsmittеd-light miсrоsсору. US Раtепt 7,081 ,994 (JuIy 25, 2006).
33. ElHs G. еt аl. Сопfосаl lаsеr sсаппiпg trапsmissiоп miсrоsсоре. US Раtепt 5,035,476 (JuIy 30, 1991).
34. Yеrshоv G. еt аl .Вiосhiр rеаdеr with епhапсеd illumiпаtiоп апd biоаrrау роsitiопiпg арраrаtus. US Раtепt 6,620,623 (Sерtеmbеr 16, 2003). 35. Dоuglаs-Наmiltоп D. еt аl. Моtilitу sсаппеr апd mеthоd. US Раtепt
4,896,967 (Jапuаrу 30, 1990).
36. Наrt S. Light еmittiпg diоdе (LED) аrrау fоr ехсitаtiоп еmissiоп mаtriх (EEM) fluогеsсепсе sресtrоsсору. US Раtепt 6,985,224 (Jапuаrу 10, 2006).
37. Рапаgоtасоs G. еt аl. Шumiпаtоr аssеmblу. US Раtепt 7,163,318 (Jапuаrу 16, 2007).
38. Stора J. еt аl. Lеd light аssеmblу. US Раtепt Аррl. 20030156416 (Аugust 21, 2003).
39. Тsiкоs С. еt аl. Рlапаr LЕD-bаsеd illumiпаtiоп аrrау (PLIA) сhiрs. U. S. Раtепt 6,959,870 (Nоvеmbеr 1, 2005). 40. Lее К. LED раскаgе, disрlау рапеl,' illumiпаtiоп sуstеm апd рrоjесtiоп sуstеm еmрlоуiпg thе sаmе. US Раtепt Аррl. 20060146297 (JuIy 6, 2006).
41. Rао N. еt аl. Орtiсаl mеthоd апd арраrаtus fоr iпsресtiпg lаrgе аrеа рlапаr оbjесts. US Раtепt Аррl. 20020088952 (JuIy 11, 2002).
42. Харрис Д. и др. Композиция покрытия, поглощающего УФ излучение. Заявка RU 2003133667 (2005.05.10).
43. Garini Y. Орtiсаl dеtесtiоп mеthоd fоr imрrоvеd sепsitivitу. US Раtепt 6,552,794 (Арril 22, 2003).
44. Мiсrоаrrау Нigh Sепsitivitу Мirrоr Substrаtеs . Материалы фирмы ТеlеСhеm Iпtеrпаtiопаl Iпс. (http://arrayit.com/Products/Substrates/MiiΥθr/mirror.html).
45. Matsushita T. еt аl. Соmропепt, арраrаtus, апd mеthоd fоr апаlуziпg mоlесulеs. US Раtепt 6,999,166 (Fеbruаrу 14, 2006).
46. Велигдан Д. Светоперенаправляющая панель. Заявка RU 2001104428 (2003.04.10). 47. Араки Й. Светоизлучающий световозвращающий лист и способ его изготовления. Патент RU 2204154 (2003.05.10).
48. Молохина Л. и др. Гибкий световозвращающий материал. Патент RU 2183336 (2002.06.10).
49. Моri Y. Rеtrоrеflесtivе shееt соmрrisiпg miсrоsрhеrеs, thе diаmеtеr апd rеfrасtivе iпdех оf whiсh bеiпg sресifiсаllу геlаtеd tо thе rеfrасtivе iпdiсеs оf lауеrs diгесtlу iп сопtасt thеrеwith. 5,962,121 (Осtоbеr 5, 1999).
50. Smith К. еt аl. Сubе соmеr саvitу bаsеd rеtгогеflесtоrs with trапsраrепt fϊll mаtеriаl. US Раtепt Аррl. 20010033907 (Осtоbеr 25, 2001).
51. Smith К. еt аl. Flехiblе сubе-соrпег rеtrоrеflесtivе shееtiпg. US Раtепt Аррl. 20020126382 (Sерtеmbеr 12, 2002).
52. Smith К. Rеtrоrеflесtivе shееtiпg hаviпg high rеtгогеflесtапсе аt lоw оbsеrvаtiоп апglеs. US Раtепt Аррl. 20070081245 (Аргil 12, 2007).
53. ЗМ Diаmопd Grаdе VIP Rеflесtivе Shееtiпg Sеriеs 3990. Техническое описание фирмы Мiппеsоtа Мiпiпg апd Мапufасturiпg (ЗМ) Рrоduсt Вullеtiп 3990 November 2003 (http://multimedia.mmm.comA)
54. Zеlепу R. еt аl. Аutотаtiс iтаgiпg апd апаlуsis оf тiсгоаrгау biосhiрs. US Раtепt 6,215,894 (Аргil 10, 2001).
55. Белецкий И. П. и др. Набор праймеров для детекции и/или идентификации трансгенных последовательностей ДНК в растительном материале и его содержащих продуктах (варианты), праймер (варианты), пара праймеров (варианты), способ детекции и/или идентификации с их использованием (варианты) и устройство для осуществления способа. Патент RU2265668 (2005.12.10).
56. Мирзабеков А. Д. и др. Способ идентификации трансгенных последовательностей ДНК в растительном материале и продуктах на его основе, набор олигонуклеотидов и биочип для осуществления этого способа. Патент RU 2270254 (2006.02.20).
Claims
1. Устройство для измерения флуоресценции, люминесценции, рассеяния и пропускания света в диагностических целях, которое содержит, по меньшей мере, два источника света, формирующие освещение рабочего поля, оптическую систему, детектор, узел крепления держателя образца, твердый носитель исследуемого образца, отличающееся тем, что содержит первую и вторую группу экранов, причем первая группа содержит, по крайней мере, один экран, а вторая группа содержит, по меньшей мере, два экрана, где экраны установлены за задней поверхностью твердого носителя образца, а осветители снабжены поглощающими элементами для гашения отраженного света от передней поверхности носителя образца и поверхностей экранов.
2. Устройство по п.l, отличающееся тем, что экраны первой группы расположены перпендикулярно оптической оси регистрирующей системы, а экраны второй группы расположены перпендикулярно оптическим осям осветителей.
3. Устройство по п.l, отличающееся тем, что первый экран, входящий в первую группу, выполнен с возможностью отражения или световозвращения световых потоков первого и второго осветителей и установлен на минимальном расстоянии от задней поверхности твердого носителя исследуемого образца в пределах от 0,01 до 10мм.
4. Устройство по п.З, отличающееся тем, что лицевая поверхность первого экрана снабжена отражающим или световозвращающим слоем.
5.Уcтpoйcтвo по п.З, отличающееся тем, что узел крепления держателя твердого носителя образца обеспечивает возможность установки первого экрана первой группы за задней поверхностью твердого носителя и возможность его выведения из поля зрения AB.
6. Устройство по п.l, отличающееся тем, что второй экран первой группы размещен относительно задней поверхности (43) твердого носителя образца на расстоянии, превышающем расстояние (19) от точки пересечения нижних границ (22а, 226) световых потоков и боковых границ оптического конуса (18) регистрирующей системы.
7. Устройство по п.6, отличающееся тем, что лицевая поверхность второго экрана первой группы, снабжена светопоглощающим слоем.
8. Устройство по п.l, отличающееся тем, что третий экран первой группы размещен за вторым экраном первой группы.
9. Устройство по п.8, отличающееся тем, что лицевая поверхность третьего экрана выполнена в виде светорассеивающей поверхности.
10. Устройство по п.8, отличающееся тем, что дополнительно содержит узел крепления второго и третьего экранов первой группы и обеспечивает возможность выведения второго экрана из зоны оптического конуса регистрирующей системы.
11.Устройство по п.l, отличающееся тем, что дополнительно содержит, по меньшей мере, один третий источник света.
12. Устройство по п.l 1, отличающееся тем, что третий источник света освещает лицевую поверхность третьего экрана или торцевые поверхности третьего экрана или заднюю поверхность третьего экрана.
13. Устройство по п.l, отличающееся тем, что дополнительно содержит узлы крепления первых и вторых экранов второй группы, которые обеспечивают возможность введения и выведения экранов из траектории оптических осей осветителей.
14. Устройство по п. 13, отличающееся тем, что узел крепления первого и второго экранов второй группы выполнен с использованием шарнирного соединения между узлом крепления и экраном и обеспечивает возможность поворота экранов относительно оптической оси осветителя.
15. Устройство по п.l, отличающееся тем, что первые экраны второй группы экранов снабжены светоотражающим слоем, а вторые экраны второй группы экранов снабжены световозвращающей поверхностью.
16. Устройство по п.l, отличающееся тем, что дополнительно содержит третьи экраны второй группы, которые размещены за первыми и вторыми экранами второй группы, причем лицевая поверхность третьих экранов снабжена поглощающим слоем.
17. Устройство по п.l, отличающееся тем, что экран представляет собой планарный лист, уголковый, цилиндрический или параболический элемент, снабженный отражающей, светопоглощающей или световозвращающей поверхностью.
18. Устройство по п. 17, отличающееся тем, что световозвращающая поверхность выполнена в виде слоя шариков, зубцов треугольной или пирамидальной формы или частиц с высокой отражающей поверхностью.
19. Устройство по п.18, отличающееся тем, что световозвращающая поверхность выполнена на основе многослойных покрытий установленных на лицевой плоскости экрана с использованием клея.
20. Устройство по п. 17, отличающееся тем, что светопоглощающая поверхность экрана выполнена на основе абсорбирующего материала, входящего в группу, состоящую из пленок, формируемых химическим способом, композиции, включающей носитель и диспергированный пигмент, полимерных покрытий, снабженных клеящим слоем.
21. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что свет от источников излучения падает на рабочую поверхность исследуемого образца под углом α к оптической оси регистрирующей системы в диапазоне от 40 до 60 градусов.
22. Устройство по п. 21, отличающееся тем, что источник света содержит светоизлучающие диоды, которые формируют световой поток, границы которого представлены в виде круга, овала, прямоугольника, квадрата, многоугольника, треугольника.
23. Устройство по п. 22, отличающееся тем, что источник света выполнен на основе гексогонально размещенных светодиодов, расположенных на расстоянии от 1 ,0 мм до 5 мм от лицевой поверхности осветителя,
24. Устройство по п.21, отличающееся тем, что источник света выполнен с возможностью смены осветителя.
25. Устройство по п.21, отличающееся тем, что источник света дополнительно содержит светопоглощающее покрытие, которое нанесено на поверхность держателей, содержащих цилиндрические отверстия, в глубине которых закреплены светодиоды и светопоглощающие элементы, которые размещены на поверхности кожуха осветителя.
26. Устройство по п. 25, отличающееся тем, что светопоглощающие элементы выполнены в виде планарной, вогнутой, цилиндрической или параболической формы.
27. Устройство по п. 22, отличающееся тем, что источник света генерирует излучение в диапазоне от 300 до 800 нм.
28. Устройство по п. 27, отличающееся тем, что источник света выполнен из светоизлучающих диодов, излучающих одинаковую длину волны.
29. Устройство по п.l, отличающееся тем, что твердый носитель исследуемого образца выполнен в виде биочипа, ячейки, кюветы, микроплаты.
30. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что исследуемый объект представляет собой биологический образец, иммобилизованный на твердой планарной основе, образец, размещенный внутри объема проточной ячейки, образец, размещенный внутри гибридизационного объема, образец, нанесенный на гибкой основе, приклеенной к твердой планарной основе, образец, иммобилизованный в гелевой основе, образец, связанный с хроматографическим носителем.
31. Устройство по п. 30, отличающееся тем, что биологический образец выбирают из группы, состоящей из ДНК, белков, ферментов, антител, антигенов, клеток.
32. Устройство по п. 30, отличающееся тем, что биологический образец снабжен маркером, который является флуорофором, колориметрической меткой или хемилюминесцентной меткой.
33. Способ проведения диагностических тестов посредством освещения образца, иммобилизованного на твердой основе или размещенного в реакционном объеме, отличающийся тем, что: а) выбирают режим диагностики из группы, включающей измерение флуоресценции, люминесценции, рассеяния или пропускания света, б) поочередно вводят в траекторию оптических осей осветителей и/или в траекторию оптической оси регистрирующей системы один или несколько экранов, в) помещают объект исследования в держатель образца и вводят его в траекторию оптических осей осветителей и регистрирующей системы, г) по предварительному изображению на дисплее подбирают условия съемки и запоминают первое изображение, д) выводят объект из траекторий оптических осей осветителей и регистрирующей системы, е) запоминают второе изображение, ж) формируют разностное изображение между первым и вторым изображением, з) попиксельно умножают разностное изображение на нормировочные коэффициенты и запускают программу обработки полученного изображения.
34. Способ по п. 33 отличающийся тем, что для измерения флюоресценции или люминесценции используют первый экран первой группы, который устанавливают в держатель образца.
35. Способ по п. 33 отличающийся тем, что для измерения флюоресценции или люминесценции используют второй экран первой группы в комбинации с первыми или вторыми экранами второй группы.
36. Способ по п. 33 отличающийся тем, что для измерения флюоресценции или люминесценции используют второй экран первой группы в комбинации с третьими экранами второй группы.
37. Способ по п. 33 отличающийся тем, что для измерения пропускания или рассеяния используют третий экран первой группы в комбинации с третьими экранами второй группы.
38. Способ по п. 33 отличающийся тем, что в качестве эталонного объекта для расчета нормировочного коэффициента используют прозрачный однородно флуоресцирующий по площади слой.
39. Способ по п. 38 отличающийся тем, что флуоресцирующий слой выполнен из пленки закрепленной на носителе выполненного из пластика, оптического стекла или кварца.
40. Способ по п. 38 отличающийся тем, что флуоресцирующий слой выполнен из тонкой плоскопараллельной пластины цветного флуоресцирующего оптического стекла.
41. Способ по п. 38 отличающийся тем, что флуоресцирующий слой выполнен из жидкости, содержащий флуоресцирующие молекулы, и находящийся между двумя строго параллельными прозрачными не флуоресцирующими пластинами.
42. Способ по п. 38 отличающийся тем, что флуоресцирующий слой выполнен из флуорохрома, иммобилизованного на поверхности прозрачной не флуоресцирующей пластины.
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2007123475/28A RU2363948C2 (ru) | 2007-06-25 | 2007-06-25 | Многофункциональное устройство для диагностики и способ тестирования биологических объектов |
RU2007123477/14A RU2371721C2 (ru) | 2007-06-25 | 2007-06-25 | Устройство для диагностики с использованием биочипов |
RU2007123476 | 2007-06-25 | ||
RU2007123476/13A RU2406764C2 (ru) | 2007-06-25 | 2007-06-25 | Устройство для диагностики жидких сред в процессе амплификации и/или гибридизации |
RU2007123477 | 2007-06-25 | ||
RU2007123475 | 2007-06-25 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2009002225A2 true WO2009002225A2 (ru) | 2008-12-31 |
WO2009002225A3 WO2009002225A3 (ru) | 2009-02-26 |
Family
ID=40186193
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/RU2008/000389 WO2009002225A2 (ru) | 2007-06-25 | 2008-06-23 | Многофункциональное устройство для диагностики и способ тестирования биологических объектов |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20100151474A1 (ru) |
WO (1) | WO2009002225A2 (ru) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101788637A (zh) * | 2009-12-31 | 2010-07-28 | 西安开容电子技术有限责任公司 | 导热绝缘材料多功能性能参数测试装置及其设计方法 |
WO2011156432A3 (en) * | 2010-06-07 | 2012-04-26 | Firefly Bioworks, Inc. | Scanning multifunctional particles |
EP2502051A1 (en) * | 2009-11-20 | 2012-09-26 | GE Healthcare Bio-Sciences AB | System and method for increased fluorescence detection |
US9310361B2 (en) | 2006-10-05 | 2016-04-12 | Massachusetts Institute Of Technology | Multifunctional encoded particles for high-throughput analysis |
RU2636513C1 (ru) * | 2017-01-23 | 2017-11-23 | Общество с ограниченной ответственностью "Оптические медицинские системы" | Способ изготовления кюветы для анализа жидких проб |
RU2657294C1 (ru) * | 2016-12-15 | 2018-06-13 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области "Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского" (ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского) | Устройство для количественной оценки флюоресценции и оптических свойств тканей in vivo |
CN109342371A (zh) * | 2018-10-09 | 2019-02-15 | 江西省羽绒制品质量监督检验中心 | 一种逆反射系数测试装置的光路*** |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8101962B2 (en) * | 2009-10-06 | 2012-01-24 | Kuang Hong Precision Co., Ltd. | Carrying structure of semiconductor |
DE102010035104A1 (de) * | 2010-08-23 | 2012-04-05 | Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag | Vorrichtung und Verfahren zur automatischen Fokussierung für die Mikroskopie schwach leuchtender Substrate |
TWI452270B (zh) * | 2011-10-21 | 2014-09-11 | Univ Nat Central | 量測裝置及其量測方法 |
WO2013082123A2 (en) * | 2011-11-28 | 2013-06-06 | University Of Chicago | Method, system, software and medium for advanced image-based arrays for analysis and display of biomedical information |
US9404869B2 (en) | 2012-10-09 | 2016-08-02 | Howard Hughes Medical Institute | Multiview light-sheet microscopy |
US10539772B2 (en) * | 2013-10-09 | 2020-01-21 | Howard Hughes Medical Institute | Multiview light-sheet microscopy |
EP3475753A4 (en) | 2016-06-24 | 2020-04-15 | Howard Hughes Medical Institute | AUTOMATIC ADJUSTMENT OF LIGHT BODY GEOMETRY IN A MICROSCOPE |
SG11201907541TA (en) * | 2017-02-21 | 2019-09-27 | Dots Tech Corp | Systems for allergen detection |
US20210140941A1 (en) * | 2017-03-16 | 2021-05-13 | Case Western Reserve University | Biochip having microchannel provided with capturing agent for performing cytological analysis |
WO2020061327A1 (en) * | 2018-09-21 | 2020-03-26 | The Johns Hopkins University | Characterization platform for scalable, spatially-resolved multispectral analysis of tissue |
US11543353B2 (en) * | 2019-01-18 | 2023-01-03 | Essenlix Corporation | Multi-mode illumination system |
WO2022162634A1 (en) * | 2021-02-01 | 2022-08-04 | Sarine Technologies Ltd. | System and method for characterizing gemstones using fluorescence |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1602176A1 (ru) * | 1988-04-12 | 1995-02-20 | Ленинградский институт текстильной и легкой промышленности им.С.М.Кирова | Устройство для измерения плотности ворсового покрытия полотна |
RU2182328C2 (ru) * | 2000-02-17 | 2002-05-10 | Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН | Флуоресцентный микроскоп |
JP2004286453A (ja) * | 2003-03-19 | 2004-10-14 | Aisin Seiki Co Ltd | 蛍光読取装置 |
US7081994B2 (en) * | 1999-09-09 | 2006-07-25 | Carl Zeiss Jena Gmbh | Microscope for reflected-light and transmitted-light microscopy |
RU2005115052A (ru) * | 2005-05-18 | 2006-11-27 | Андрей Алексеевич Климов (RU) | Способ флуоресцентной наноскопии |
US7173701B2 (en) * | 2004-02-13 | 2007-02-06 | Kaiwood Technology Co., Ltd. | CCD-based biochip reader |
Family Cites Families (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4087685A (en) * | 1977-01-11 | 1978-05-02 | International Business Machines Corporation | Fluorescent microanalytical system and method for detecting and identifying organic materials |
US5091652A (en) * | 1990-01-12 | 1992-02-25 | The Regents Of The University Of California | Laser excited confocal microscope fluorescence scanner and method |
US5436718A (en) * | 1993-07-30 | 1995-07-25 | Biolumin Corporation | Mutli-functional photometer with movable linkage for routing optical fibers |
US5450235A (en) * | 1993-10-20 | 1995-09-12 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Flexible cube-corner retroreflective sheeting |
US20030017081A1 (en) * | 1994-02-10 | 2003-01-23 | Affymetrix, Inc. | Method and apparatus for imaging a sample on a device |
US5459325A (en) * | 1994-07-19 | 1995-10-17 | Molecular Dynamics, Inc. | High-speed fluorescence scanner |
JPH10170710A (ja) * | 1996-12-12 | 1998-06-26 | Minnesota Mining & Mfg Co <3M> | 光再帰性反射シート |
US6825921B1 (en) * | 1999-11-10 | 2004-11-30 | Molecular Devices Corporation | Multi-mode light detection system |
US6818437B1 (en) * | 1998-05-16 | 2004-11-16 | Applera Corporation | Instrument for monitoring polymerase chain reaction of DNA |
US6236456B1 (en) * | 1998-08-18 | 2001-05-22 | Molecular Devices Corporation | Optical system for a scanning fluorometer |
US6280822B1 (en) * | 1999-01-11 | 2001-08-28 | 3M Innovative Properties Company | Cube corner cavity based retroeflectors with transparent fill material |
US6215894B1 (en) * | 1999-02-26 | 2001-04-10 | General Scanning, Incorporated | Automatic imaging and analysis of microarray biochips |
US6329661B1 (en) * | 2000-02-29 | 2001-12-11 | The University Of Chicago | Biochip scanner device |
US6407395B1 (en) * | 2000-02-29 | 2002-06-18 | The University Of Chicago | Portable biochip scanner device |
JP3663125B2 (ja) * | 2000-11-28 | 2005-06-22 | 日立ソフトウエアエンジニアリング株式会社 | 蛍光読み取り方法及び蛍光読み取り装置 |
US6714299B2 (en) * | 2001-07-13 | 2004-03-30 | Genicon Sciences Corporation | Use of light scattering particles in design, manufacture, and quality control of small volume instruments, devices, and processes |
DE10136863A1 (de) * | 2001-07-28 | 2003-02-20 | Berthold Tech Gmbh & Co Kg | Vorrichtung zur wahlweisen Messung von insbesondere Lumineszenz- und/oder Fluoreszenzstrahlung |
US20030031596A1 (en) * | 2001-08-09 | 2003-02-13 | Yokogawa Electric Corporation | Biochip reader and fluorometric imaging apparatus |
US7354389B2 (en) * | 2002-05-28 | 2008-04-08 | Autogenomics, Inc. | Microarray detector and methods |
JP3747890B2 (ja) * | 2002-07-08 | 2006-02-22 | オムロン株式会社 | 光学部品ならびに当該光学部品を用いた光検出装置、光検出方法および分析方法 |
US7061598B1 (en) * | 2002-09-27 | 2006-06-13 | Kla-Tencor Technologies Corporation | Darkfield inspection system having photodetector array |
EP2442150A3 (en) * | 2003-03-06 | 2012-05-23 | 3M Innovative Properties Co. | Lamina comprising cube corner elements and retroreflective sheeting |
US6970240B2 (en) * | 2003-03-10 | 2005-11-29 | Applera Corporation | Combination reader |
DE10315074A1 (de) * | 2003-04-02 | 2004-10-14 | Clondiag Chip Technologies Gmbh | Vorrichtung zur Vervielfältigung und zum Nachweis von Nukleinsäuren |
US7042565B2 (en) * | 2004-02-13 | 2006-05-09 | Kaiwood Technology Co., Ltd. | Fluorescent microarray analyzer |
-
2008
- 2008-06-23 WO PCT/RU2008/000389 patent/WO2009002225A2/ru active Application Filing
-
2009
- 2009-12-22 US US12/645,472 patent/US20100151474A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU1602176A1 (ru) * | 1988-04-12 | 1995-02-20 | Ленинградский институт текстильной и легкой промышленности им.С.М.Кирова | Устройство для измерения плотности ворсового покрытия полотна |
US7081994B2 (en) * | 1999-09-09 | 2006-07-25 | Carl Zeiss Jena Gmbh | Microscope for reflected-light and transmitted-light microscopy |
RU2182328C2 (ru) * | 2000-02-17 | 2002-05-10 | Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН | Флуоресцентный микроскоп |
JP2004286453A (ja) * | 2003-03-19 | 2004-10-14 | Aisin Seiki Co Ltd | 蛍光読取装置 |
US7173701B2 (en) * | 2004-02-13 | 2007-02-06 | Kaiwood Technology Co., Ltd. | CCD-based biochip reader |
RU2005115052A (ru) * | 2005-05-18 | 2006-11-27 | Андрей Алексеевич Климов (RU) | Способ флуоресцентной наноскопии |
Cited By (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9310361B2 (en) | 2006-10-05 | 2016-04-12 | Massachusetts Institute Of Technology | Multifunctional encoded particles for high-throughput analysis |
EP2502051A1 (en) * | 2009-11-20 | 2012-09-26 | GE Healthcare Bio-Sciences AB | System and method for increased fluorescence detection |
EP2502051A4 (en) * | 2009-11-20 | 2013-07-03 | Ge Healthcare Bio Sciences Ab | SYSTEM AND METHOD FOR DETECTING INCREASED FLUORESCENCE |
CN101788637A (zh) * | 2009-12-31 | 2010-07-28 | 西安开容电子技术有限责任公司 | 导热绝缘材料多功能性能参数测试装置及其设计方法 |
CN101788637B (zh) * | 2009-12-31 | 2013-07-10 | 西安开容电子技术有限责任公司 | 导热绝缘材料多功能性能参数测试装置及其设计方法 |
US9290816B2 (en) | 2010-06-07 | 2016-03-22 | Firefly Bioworks Inc. | Nucleic acid detection and quantification by post-hybridization labeling and universal encoding |
US8609337B2 (en) | 2010-06-07 | 2013-12-17 | Firefly Bioworks, Inc. | Nucleic acid detection and quantification by post-hybridization labeling and universal encoding |
WO2011156432A3 (en) * | 2010-06-07 | 2012-04-26 | Firefly Bioworks, Inc. | Scanning multifunctional particles |
US9476101B2 (en) | 2010-06-07 | 2016-10-25 | Firefly Bioworks, Inc. | Scanning multifunctional particles |
RU2657294C1 (ru) * | 2016-12-15 | 2018-06-13 | Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области "Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского" (ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского) | Устройство для количественной оценки флюоресценции и оптических свойств тканей in vivo |
RU2636513C1 (ru) * | 2017-01-23 | 2017-11-23 | Общество с ограниченной ответственностью "Оптические медицинские системы" | Способ изготовления кюветы для анализа жидких проб |
CN109342371A (zh) * | 2018-10-09 | 2019-02-15 | 江西省羽绒制品质量监督检验中心 | 一种逆反射系数测试装置的光路*** |
CN109342371B (zh) * | 2018-10-09 | 2024-05-14 | 江西省检验检测认证总院纺织品检验检测院 | 一种逆反射系数测试装置的光路*** |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2009002225A3 (ru) | 2009-02-26 |
US20100151474A1 (en) | 2010-06-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2009002225A2 (ru) | Многофункциональное устройство для диагностики и способ тестирования биологических объектов | |
CA2294005C (en) | Specimen illumination apparatus with optical cavity for dark field illumination and methods of use | |
US7714301B2 (en) | Instrument excitation source and calibration method | |
US6654119B1 (en) | Scanning spectrophotometer for high throughput fluroescence detection | |
US6794658B2 (en) | Light modulated microarray reader and methods relating thereto | |
US7352459B2 (en) | Scanning Spectrophotometer for high throughput fluorescence detection and fluorescence polarization | |
JP4409426B2 (ja) | マイクロアレイ検出器および方法 | |
US8192686B2 (en) | Apparatus for and method of measuring bio-chips using uniform total internal reflection illumination | |
EP3093649B1 (en) | A combination of a reaction apparatus and an optical instrument monitoring dna polymerase chain reactions | |
CN105974571B (zh) | 显微成像 | |
US6355934B1 (en) | Imaging system for an optical scanner | |
US7354389B2 (en) | Microarray detector and methods | |
US10133048B2 (en) | Laser optical coupling for nanoparticles detection | |
WO2005113832A2 (en) | Wide field imager for quantitative analysis of microarrays | |
JPH11511560A (ja) | 分析器 | |
WO2011096835A1 (ru) | Устройство для анализа люминесцирующих биологических микрочипов | |
RU2371721C2 (ru) | Устройство для диагностики с использованием биочипов | |
RU2406764C2 (ru) | Устройство для диагностики жидких сред в процессе амплификации и/или гибридизации | |
US20050269523A1 (en) | Light modulated microarray reader and methods relating thereto | |
RU2363948C2 (ru) | Многофункциональное устройство для диагностики и способ тестирования биологических объектов | |
JP2022543930A (ja) | 光学システム、及びサンプル面の照明方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 08779209 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A2 |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 08779209 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A2 |