DE60101977T2

DE60101977T2 - Selenocosmia huwena Toxin und Verwendung als Analgetikum

Info

Publication number: DE60101977T2
Application number: DE60101977T
Authority: DE
Inventors: Song-Ping Liang
Original assignee: Xiamen Bioway Biotech Co Ltd
Current assignee: Xiamen Bioway Biotech Co Ltd
Priority date: 2000-04-11
Filing date: 2001-04-10
Publication date: 2004-12-23
Anticipated expiration: 2021-04-11
Also published as: US20030013647A1; CN1307900A; EP1161951A1; CN1133461C; ES2215100T3; DE60101977D1; US6670329B2; EP1161951B1

Description

Hintergrund
Analgetika und andere Arzneimittel, die den Schmerz lindern, sind entscheidende Therapeutika, die die Lebensqualität von Kranken und ihren Pflegern enorm verbessern. Analgetika lindern nicht nur den Schmerz, sondern auch die Furcht, Anspannung, Angst und unangenehme Empfindungen, die durch akuten Schmerz verursacht werden. Existierende Analgetika können in zumindest zwei Kategorien eingeordnet werden, die nicht-steroidalen entzündungshemmenden Arzneistoffe (NSAIDs = Non-Steroidal Antiinflammatory Drugs) als auch die narkotischen Analgetika. Die NSAIDs (beispielsweise Acetylsalicylsäure) hemmen die Prostaglandin-Synthese, wodurch die Empfindlichkeit von Nervenenden sinkt. NSAIDs werden in erster Linie dazu verwendet, Entzündungsschmerz und andere Arten von dumpfem Schmerz zu lindern. Narkotische Analgetika (beispielsweise Morphin) wirken auf Opiat-Rezeptoren des Zentralnervensystems vom μ-Typ, hauptsächlich im Thalamencephalon und in der Hirnrinde, um stechenden Schmerz ebenso wie dumpfen Schmerz zu lindern. Obwohl sie in breitem Umfang zur Behandlung von Schmerz verwendet werden, beispielsweise im Spätstadium von Krebspatienten und bei postoperativen Patienten, sind narkotische Analgetika in hohem Maße Sucht erregend und stehen mit ernsthaften Entzugssymptomen in Verbindung. Ihre Dosierung muss kontinuierlich erhöht werden, um ihre analgetischen Wirkungen aufrechtzuerhalten. Weitere narkotische Analgetika weisen einen nur geringen, falls überhaupt vorhandenen therapeutischen Wert für Schmerz auf, der durch eine Nervenverletzung verursacht wurde.
Li M. et al. (M. Li et al., Toxicon 38 (2000), 153–162) beschreiben das Klonieren und die Expression von Huwenotoxin-1 (HWTX-1) in E. coli. Das HWTX-1-Peptid, wie in 1 von Li M. et al. beschrieben, entspricht dem Selenocosmia-huwena-Peptid von SEQ ID NO: 1 der vorliegenden Erfindung. HWTX-1 wird als Toxin beschrieben, das die Öffnungswahrscheinlichkeit einer Acetylcholin-induzierten Kanalaktivität reduziert und letztendlich den Kanal blockiert, was darauf hinweist, dass der nikotinerge Acetylcholin-Rezeptor der Wirkort dieses Toxins sein mag. Es wird jedoch nicht offenbart, dass HWTX-1 irgendeine Wirksamkeit zur Reduktion von Schmerz aufweist.
In Liang et al. (S.-P. Liang et al., Toxicon 38 (2000), 1237–1246) wird beschrieben, dass HWTX-1 eine präsynaptische Aktivität aufweist, die die Freisetzung von Neurotransmittern aus den Nervenenden sowohl der cholinergen Synapse als auch der adrenergen Synapse bewirkt. Auch in dieser Entgegenhaltung wurde eine Wirksamkeit zur Schmerzreduktion nicht offenbart.
Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung basiert teilweise auf der Erkenntnis, dass gereinigtes HWAP-I-Polypeptid der chinesischen Vogelspinne, Selenocosmia huwena, ein sehr wirksames Analgetikum ist. Demgemäß betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Reduktion der Schmerzwahmehmung bei einem Patienten. Das Verfahren schließt die Verabreichung einer wirksamen Menge eines gereinigten Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz, die zumindest zu 70%, 80%, 90%, 92% oder 95% mit SEQ ID NO: 1 identisch ist, an den Patienten ein. Das aufgereinigte Polypeptid kann HWAP-I sein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist. Das Polypeptid kann als eine epidurale oder als parenterale Lösung verabreicht werden. Zusätzlich kann das aufgereingte Polypeptid lokal verabreicht werden (beispielsweise durch Injektion oder topische Verabreichung). Das aufgereinigte Polypeptid kann als pharmazeutische Zusammensetzung formuliert werden, beispielsweise mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger in einer sterilen Lösung, beispielsweise einer sterilen Salzlösung.
Gemäß eines weiteren Aspektes betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Hemmung der Kalziumkanalaktivität in einem Subjekt bzw. einem Patienten. Das Verfahren schließt die Verabreichung einer wirksamen Menge eines aufgereinigten Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz von zumindest 70%, 80%, 90%, 92% oder 95% Identität mit SEQ ID NO: 1 an den Patienten ein. Das aufgereinigte Polypeptid kann HWAP-I sein, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist. Das Polypeptid kann als eine epidurale oder als parenterale Lösung verabreicht werden. Zusätzlich kann das aufgereinigte Polypeptid lokal verabreicht werden (beispielsweise durch Injektion oder durch topische Verabreichung). Das aufgereinigte Polypeptid kann als pharmazeutische Zusammensetzung formuliert bzw. zubereitet werden, beispielsweise mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger in einer sterilen Lösung, beispielsweise einer sterilen Salzlösung. Das Verfahren kann das Niveau der Kalziumkanalaktivität in einem lokalen Bereich eines Subjektes um beispielsweise zumindest 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 70 % oder mehr unter Verwendung eines hier beschriebenen Assays reduzieren.
Gemäß eines weiteren Aspektes betrifft die Erfindung einen Herstellungsgegenstand. Der Gegenstand schließt Folgendes ein: i) einen Behälter; ii) ein gereinigtes Polypeptid, das sich in dem Behälter befindet und eine Aminosäuresequenz aufweist, die zumindest 70%, 80%, 90%, 92% oder 95% mit SEQ ID NO: 1 identisch ist und iii) eine Markierung, die sich an dem Behälter befindet und Verabreichungsvorschriften des aufgereinigten Polypeptids umfasst. Das aufgereinigte Polypeptid kann HWAP-I sein, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 aufweist. Das aufgereinigte Polypeptid kann als pharmazeutische Zusammensetzung formuliert werden, beispielsweise mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, in einer sterilen Lösung, beispielsweise einer sterilen Salzlösung. Die Instruktionen können Anweisungen für die Verabreichung des aufgereinigten Polypeptids an ein Subjekt bereitstellen, beispielsweise für eine epidurale, intrathekale, parenterale oder lokale Verabreichung. Die Instruktionen können anzeigen, dass die Behandlung in einer Schmerzlinderung bei einem Subjekt besteht oder die Kalziumkanalaktivität in einem Subjekt reduziert.
Gemäß eines noch weiteren Aspektes betrifft die Erfindung isolierte Nukleinsäuren, die eine Sequenz einschließen, die zumindest zu 70%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95% mit SEQ ID NO: 2 oder 3 identisch ist. Die isolierte Nukleinsäure kann mit SEQ ID NO: 2 oder 3 identisch sein. Weiterhin kann die isolierte Nukleinsäure einen Strang aufweisen, der unter hochstringenten Bedingungen an eine einsträngige Sonde hybridisiert, deren Sequenz aus SEQ ID NO: 2 oder 3 oder dem Komplement bzw. der Komplementärsequenz von SEQ ID NO: 2 oder 3 besteht. Ebenfalls eingeschlossen sind Nukleinsäuren, die weiterhin einen heterologen Promotor funktionell verbunden mit der HWAP-I-verwandten Sequenz enthalten. Der heterologe Promotor kann ein prokaryotischer oder eukaryotischer Promotor und/oder ein induzierbarer Promotor sein. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Bereitstellung eines Kalziumkanalhemmers. Das Verfahren schließt Folgendes ein: Bereitstellen von Zellen, die eine heterologe Nukleinsäuresequenz aufweisen, die ein Polypeptid kodieren, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die zumindest zu 70%, 80%, 90% oder 95% mit SEQ ID NO: 1 identisch ist und wahlweise einen heterologen Promotor, der funktionell mit der kodierenden Sequenz verbunden ist; Kultivieren der Zellen in einem Medium; Extrahieren des Polypeptids aus den Zellen oder dem Medium, um dadurch einen Kalziumkanalhemmer bereitzustellen.
Ein "gereinigtes Polypeptid" wie hierin verwendet betrifft ein Polypeptid, das von anderen Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren, mit denen es natürlich assoziiert ist, abgetrennt wurde. Das Polypeptid kann zumindest 10%, 20%, 50%, 70%, 80% oder 95% der aufgereinigten Zubereitung nach Trockengewicht darstellen.
Eine "isolierte Nukleinsäure" ist eine Nukleinsäure der Struktur, die mit derjenigen irgendeiner natürlich vorkommenden Nukleinsäure nicht identisch ist oder zu derjenigen irgendeines Fragmentes einer natürlich vorkommenden genomischen Nukleinsäure, die mehr als drei getrennte Gene überspannt. Der Begriff deckt deswegen beispielsweise (a) eine DNA ab, die die Sequenz eines Teiles eines natürlich vorkommenden genomischen DNA-Moleküls aufweist, jedoch nicht von den beiden kodierenden Sequenzen flankiert wird, die diesen Teil des Moleküls im Genom des Organismus flankieren, in dem es natürlicherweise vorkommt; (b) eine Nukleinsäure, die in einen Vektor oder in die genomische DNA eines Prokaryoten oder Eukaryoten in einer Weise integriert ist, dass das sich ergebende Molekül mit irgendeinem natürlich vorkommenden Vektor oder genomischer DNA nicht identisch ist; (c) ein separates Molekül, beispielsweise cDNA, ein genomisches Fragment, ein Fragment erzeugt durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder ein Restriktionsfragment; und (d) eine rekombinante Nukleotidsequenz ab, die Teil eines Hybridgenes ist, d. h. ein Gen, das ein Fusionsprotein kodiert. Speziell aus dieser Definition ausgeschlossen sind Nukleinsäuren, die in Gemischen aus unterschiedlichen (i) DNA-Molekülen, (ii) transfizierten Zellen oder (iii) Zellklonen vorliegen: Wie diese beispielsweise in einer DNA-Bibliothek, beispielsweise einer cDNA oder einer genomischen DNA-Bibliothek auftreten.
Die "prozentuale Identität" zweier Aminosäuresequenzen oder zweier Nukleinsäuren wird unter Verwendung des Algorithmus von Karlin und Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264–68, 1990, wie modifiziert in Karlin und Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–77, 1993, bestimmt. Ein solcher Algorithmus ist in den NBLAST- und XBLAST-Programmen (Version 2.0) von Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403–10, 1990, enthalten. Die BLAST-Nukleotidrecherche kann mit dem NBLAST-Programm, Score = 100, Wortlänge-12 durchgeführt werden, um Nukleotidsequenzen zu erhalten, die mit den Nukleinsäuremolekülen der vorliegenden Erfindung homolog sind. BLAST-Proteinrecherchen können mit dem XBLAST-Programm, Score = 50, Wortlänge = 3 durchgeführt werden, um Aminosäuresequenzen zu gewinnen, die mit den Proteinmolekülen der vorliegenden Erfindung homolog sind. Wenn Lücken zwischen zwei Sequenzen existieren, kann Gapped BLAST verwendet werden, wie in Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17): 3389–3402, 1997, beschrieben. Wenn die BLAST- und Gapped-BLAST-Programme verwendet werden, können die Voreinstellungsparameter der jeweiligen Programme verwendet werden (beispielsweise XBLAST und NBLAST). Siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff "hybridisiert unter stringenten Bedingungen" Hybridisierungsbedingungen in 6X Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei ungefähr 45°C, gefolgt von einer oder mehreren Waschungen in 0,2 X SSC, 0,1% SDS bei 50°–65°C.
Der Begriff "heterolog" betrifft ein Polypeptid, das in einem Kontext künstlich eingebracht wird. Ein heterologes Polypeptid kann mit der endogenen Einheit identisch sein, die natürlich vorliegt. In Unterscheidung von einer endogenen Einheit kann ein heterologes Polypeptid ein Polypeptid aufweisen, das es zumindest auf einer Seite flankiert, die es in einem natürlich vorkommenden Polypeptid nicht flankiert. In ähnlicher Weise betrifft der Begriff "Hybrid" ein Polypeptid, das Aminosäuresequenzen umfasst, abgeleitet von entweder (i) zumindest zwei unterschiedlichen natürlich vorkommenden Sequenzen und Derivaten, Varianten und multiplen Mutanten hiervon; oder (ii) von einer künstlichen Sequenz und einer natürlich vorkommenden Sequenz und einem Derivat, einer Variante oder einer multiplen Mutante hiervon.
Die Details einer oder mehrerer Ausführungsformen der Erfindung sind in den begleitenden Zeichnungen und in der unten dargelegten Beschreibung ausgeführt. Weitere Merkmale, Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden sich aus der Beschreibung und den Zeichnungen und aus den Ansprüchen ergeben.
Ausführliche Beschreibung
Der Schmerz ist ein Symptom einer Vielzahl von Beschwerden. Schmerz kann sowohl chronisch als auch akut sein. Er kann sich als Folge von Verletzungen, Traumata, bestimmten Krebserkrankungen und dergleichen ergeben. Zusätzlich kann sich ein neuropathischer Schmerz aus mehreren getrennten Ätiologien ergeben. Neuropathischer Schmerz kann als Folge eines chirurgischen Eingriffs am Auge, einer Zahnbehandlung (Wurzelkanal), einer Verbrennung, einer Sudeck-Dystrophie, einer Post-Herpes-Neuralgie, einer diabetischen Neuropathie, Arthritis und dergleichen auftreten. Die Erfinder haben herausgefunden, dass HWAP-I und verwandte Polypeptide zur Behandlung und Linderung von Schmerzen bei Patienten nützliche Wirkstoffe sind.
HWAP-I
Die Polypeptidsequenz von Selenocosmia huwena HWAP-I ist:
Die natürlich vorkommende Nukleinsäuresequenz, die HWAP-I kodiert, ist folgende:
Eine bevorzugte synthetische Nukleinsäuresequenz, die HWAP-I kodierts, ist folgende:
HWAP-I verwandte Polypeptide
Polypeptide, die mit HWAP-I verwandt sind, können durch mehrere Verfahren gewonnen werden. Beispielsweise können HWAP-I verwandte Polypeptide aus dem Gift von Spinnen aufgereinigt werden, beispielsweise aus der Spinnentierfamilie Theraphosidae, beispielsweise Spezies der Gattungen Acanthoscurria (beispielsweise Acanthoscurria gomesiana), Aphonopelma (beispielsweise Aphonopelma chalcodes, Aphonopelma sp.), Brachypelma (beispielsweise Brachypelma smithii), Coremiocnemis (beispielsweise Coremiocnemis validus), Dugesiella (beispielsweise Dugesiella sp.), Eurypelma (beispielsweise Eurypelma californicum), Grammostola (beispielsweise Grammostola spatulata), Hysterocrates (beispielsweise Hysterocrates gigas), Scodra (beispielsweise Scodra griseipes) oder Selenocosmia. Das Polypeptid kann beispielsweise folgend dem unten zum Extrahieren von HWAP-I beschriebenen Verfahren extrahiert und dann beispielsweise durch Edman-Abbau sequenziert werden. Synthetische Oligonukleotide können synthetisiert werden, um eine Nukleinsäure zu erzeugen, die das Polypeptid kodiert.
Ein weiteres Verfahren zur Gewinnung verwandter HWAP-I-Polypeptide ist eine Nukleinsäure-Hybridisierung mit Oligonukleotiden oder Nukleinsäure-Fragmenten, die die HWAP-I-Sequenz aufweisen, beispielsweise die natürliche Sequenz, die das HWAP-I-Polypeptid kodiert. Beispielsweise kann eine Bibliothek von zu den Spinnentieren gehörenden genomischen oder cDNA-Klonen unter niedrigstringenten Bedingungen mit der Nukleinsäure-Sonde hybridisiert werden. Die Stringenzbedingungen werden so moduliert, dass das Hintergrundsignal reduziert und das Signal von potentiell Positiven erhöht wird, wie es in der Technik routinemäßig angewandt wird (siehe beispielsweise Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1–6.3.6). So identifizierte Klone können sequenziert werden, um zu verifizieren, dass diese eine mit HWAP-I verwandte Polypeptidsequenz kodieren.
Ein weiteres Hybridisierungs-basiertes Verfahren verwendet eine Amplifizierungsreaktion (beispielsweise die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)). Oligonukleotide, beispielsweise degenerierte Oligonukleotide werden so designed, dass sie an die HWAP-I-Sequenz hybridisieren. Die Oligonukleotide werden als Primer verwendet, um eine HWAP-I-artige Sequenz aus Matrizen-Nukleinsäure aus einer zu den Spinnentieren gehörenden Spezies, beispielsweise einer Theraphosidae-Spezies, zu amplifizieren. Das amplifizierte Fragment kann kloniert und/oder sequenziert werden.
Bei einem anderen Verfahren wird eine HWAP-I-artige Sequenz aus einer Sequenzdatenbank identifiziert, beispielweise einer Protein- oder Nukleinsäure-Datenbank unter Verwendung einer hierin offenbarten Sequenz als Abfrage.
Sequenzvergleichsprogramme können dazu verwendet werden, die Nukleotid- oder Aminosäure-Sequenzen zu vergleichen und zu analysieren. Ein solches Software-Paket ist die BLAST-Programmreihe des National Center for Biotechnology Institute (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/; Altschul et al. (1997), Nuc. Acids Research 25: 3389–3402). Synthetische Oligonukleotide können synthetisiert werden, um eine Nukleinsäure zu erzeugen, die das Polypeptid kodiert.
Wenn einmal eine Nukleinsäure, die ein HWAP-I-verwandetes Polypeptid kodiert, erzielt wurde, kann das Polypeptid selbst charakterisiert und als Analgetikum verwendet werden. Beispielsweise wird die kodierende Nukleinsäure in einen Expressionsvektor kloniert und das kodierte Polypeptid wird wie für HWAP-I unten beschrieben aufgereinigt.
Eine Herstellung von HWAP-I oder eines verwandten Polypeptids kann unter Verwendung von analgetischen Tests an Tieren ausgewertet werden, beispielsweise dem Heißplattentest (hot plate test), dem Schwanz-Zuck-Test (tail flick test), dem Krümmungstest (writhing test), dem Pfotendrucktest (paw pressure test), dem elektrischen Stimulationstest, dem Schwanz-Wegzieh-Test (tail withdrawal test) oder dem Formalintest (Rogues et al. (1995), Methods in Enzymology 248: 263–283). Tiermodelle der Schmerzreaktion schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Axotomie, das Schneiden oder Abtrennen eines Axons; chronische Konstriktionsverletzung (Chronic Constriction Injury = CCI), ein Modell eines neuropathischen Schmerzes, das die Ligation des Ischiasnerv in den Nagetieren, beispielsweise Ratten mit einschließt; oder die intraplantare Injektion von Freund'schem Adjuvants als Modell für Arthroseschmerz. Weitere Tiermodelle der Schmerzreaktion sind beispielsweise im ILAR Journal (1999), Bd. 40, Nr. 3 (Gesamtausgabe) beschrieben. Insbesondere können die unten beschriebenen Tests (siehe Beispiele) verwendet werden.
Assays für HWAP-I
Zusätzlich kann die Herstellung von HWAP-I oder eines verwandten Polypeptids bezüglich seines Vermögens, die präsynaptische Aktivität oder die Kalzium-Kanalfunktion zu hemmen, ausgewertet werden. Diese Verfahren wurden früher verwendet, um aufgereinigtes HWAP-I zu untersuchen.
Assay der Hemmung der präsynaptischen Aktivität. Die Zubereitung wurde auf isolierte Nerven-Synapsenzubereitungen des Meerschweinchen-Ileums aufgebracht. Der Assay wurde gemäß des Verfahrens von Harry (1964), J. Pharm. Pharmacol. 16: 332–336) (siehe ebenfalls beispielsweise Liang et al. (2000), Toxicon 38: 1237) durchgeführt. 4-cm-Segmente wurden aus dem Ileum bzw. Dünndarm eines Meerschweinchens ausgeschnitten, im Bereich ungefähr 15 cm entfernt von der ileozökalen Kreuzung. Die Segmente wurde in ein 10 ml Bad mit einer Wassermantelglas angeordnet, äquilibriert bei 32°C, das Tyrode's-Lösung (136,7 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 1,82 mM CaCl₂; 1,19 mM NaHCO₃; 1,05 mM MgCl₂, 0,41 mM NaH₂PO₄, 5,6 mM Glukose) enthält. 95% O₂ und 5 % CO₂ wurden durch die Lösung gesprudelt, Impulse von rechtwinkligem Strom, 0,05 ms Dauer und mit einer Stärke von 25 Volt wurden auf die Segmente unter Verwendung von Platin-Elektroden aufgebracht. Die intraluminale Elektrode wurde an die Anode angeschlossen. Die Kontraktion der Segmente wurde mit einem Zweikanal-Physiologierekorder (Chengdu Instruments Model NO. LMS-2B) aufgezeichnet. Vor dem Assay wurden die Segmente in Tyrode's-Lösung für 30 Minuten äquilibriert. Um die Aktivität einer HWAP-I-Polypeptidzubereitung oder eines Polypeptids eines verwandten Polypeptids zu bestimmen, wurde die Zubereitung zugesetzt, beispielsweise während die Zuckungsreaktion des Ileum-Segments überwacht wurde. Eine wirksame HWAP-I-Präparation ist dazu in der Lage, die Zuckungsreaktion zu hemmen, beispielsweise bei einer Konzentration von ungefähr weniger als 100 μM, 10 μM oder 1 μM.
Ein weiterer geeigneter Assay ist der Maus-Phrenikus-Diaphragma-Assay (Liang (1997), Science in China (Reihe C) 40: 449). Die Maus-Phrenikus-Diaphragma-Präparation wurde in einer kleinen Plexiglaskammer angeordnet und in Tyrode's-Lösung mit 95% O₂ und 5 CO₂, die bei 30–32°C hindurchsprudelten, eingetaucht. Eine elektrische Stimulation wurde auf den Phrenikus mit einer Ansaug-Elektrode oder direkt auf den Muskel aufgebracht. Der elektrische Impuls betrug 0,2 Hz (supramaximal 0,2 ms, Rechteckwelle). Die Zuckungsreaktionen wurden durch einen mechanisch-elektrischen Wandler in elektrische Signale überführt, amplifiziert bzw. verstärkt und mit einem Diagrammschreiber aufgezeichnet. Die Anwendung von nativem HWAP-I hat eine Hemmung der indirekten Zuckungsreaktion zur Folge. Bei 1 × 10^–5 g/ml blockierte natives HWAP-I die neuromuskuläre Übertragung für 14,3 ± 3,2 Minuten.
Zusätzliche Assays können mit Krötenherz und Ratten-Vas-deferens durchgeführt werden (beispielsweise wie in Liang et al. (2000) Toxicon 38: 1237 beschrieben).
Ca²⁺-Kanal-Hemm-Assay. HWAP-I ist ein wirkungsvoller Hemmstoff des Hochspannungs-aktivierten Ca¹⁺-Kanals, der in Prostaglandin-E₁-differenzieiten NG108-15-Zellen exprimiert wird (beispielsweise erhältlich von Shanghai Cell Institute). Die Zellen wurden in 90% Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) mit 10% neugeborenem Kalbs-Serum, Hypoxanthinaminopterin-Thymidin-Ergänzung und Penicillin-Streptomycin modifiziert. Die Zellen wurden auf Platten für elektrophysiologische Experimente überführt und mit 1% Kalbsserum und 98% DMEM kultiviert. Prostaglandin E₁ (10 μM) und 3-Isobutyl-1-methylxanthin (50 μM) wurden dem Medium zugesetzt. Makroskopische Ca¹⁺-Kanalströme (filtriert bei 10 kHz, digitalisiert bei 3 kHz mit einem EPC-9-Patch-Clamp-Amplifier, HEKA Electronics, Deutschland) wurden bei Raumtemperatur unter Verwendung von Ba²⁺ als Ladungsträger aufgezeichnet. Die Zellen wurden bei einem Potential von –40 mV gehalten und darauf auf 0 mV depolarisiert. Bei 10 μM war HWAP-I ein wirkungsvoller Hemmstoff des Ca²⁺-Stromes. Die Hemmung war Dosis-abhängig. Der EC₅₀ für die Hemmung betrug ungefähr 100 nM (EC₅₀ ungefähr 100 nM). HWAP-I ist für diesen Kanal hochspezifisch, weil der durch niedrige Spannung aktivierte Ca²⁺-Kanal nicht beeinträchtigt wurde.
Verfahren zur Gewinnung des HWAP-I-Polypeptids
HWAP-I oder ein HWAP-I-verwandtes Polypeptid kann durch die nachfolgenden nichteinschränkenden Verfahren gewonnen werden: (i) Extraktion aus Spinnengift; (ii) Festphasensynthese; und (iii) Aufreinigung aus einem rekombinanten Expressionssystem.
Extraktion aus Spinnengift. HWAP-I wurde aus dem Gift der chinesischen Vogelspinne Selenocosmia huwena durch das folgende Verfahren isoliert. Erwachsene weibliche Selenocosmia-huwena-Spinnen wurden im Hügelland von Ningming, Guangxi, China, gesammelt. Die Spinnen wurden in Holzboxen gehalten, die mit einem Kunststoffnetz bedeckt waren und es wurde ihnen täglich Wasser verabreicht. Kakerlaken, kleine Mäuse und kleine Frösche wurden zur Fütterung der Spinnen verwendet. Das Gift wurde alle 3–4 Tage durch das folgende Verfahren gewonnen. Eine Spinne wurde mit einer Pinzette immobilisiert. Ein Bündel biegsamer Polyvinyl-Kunststoffröhrchen (2 mm Innendurchmesser × 45 mm), festgehalten von einer weiteren Pinzette, wurde dazu verwendet, die Spinne dazu zu provozieren, das Rohr fest zu ergreifen, das Rohr mit ihrem Reißzahn zu durchbohren und Gift nach innen zu injizieren. Das Verfahren kann beispielsweise wiederholt werden, um das Eingreifen beider Reißzähne sicherzustellen. Das Gift wurde aus dem Rohr mit einer Pipette entfernt. Das Rohgift wurde gefriergetrocknet, um ein wasserfreies bzw. trockenes, weißes Pulver zu gewinnen.
Das Pulver wurde mit Wasser rehydratisiert und auf eine C4-Umkehrphasen-HPLC-Säule gefüllt. (Waters Co., USA, Delta Pack C4-300A, 30 × 0,46 cm), äquilibriert mit 0,1% Trichloressigsäure (TCA). Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten von 0% bis 70 % Acetonitril mit 0,1% TCA über den Verlauf von 120 Minuten bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,7–1,0 ml/Minute und bei einer Temperatur von 45°C eluiert. Der Haupt-Peak, der HWAP-I enthielt, wurde identifiziert und lyophilisiert. Die Probe wurde darauf durch die Ionenaustausch-Chromatographie auf einer WCX-1-Ionenaustauscher-HPLC-Säule (Shim-pack, Japan, 5 × 0,4 cm), äquilibriert in 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,6) aufgereinigt. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten von 0% bis 46% 1 M Natriumacetat (pH 7,0) über den Verlauf von 30 Minuten bei einer Strömungsgeschwindigkeit von ungefähr 0,8 ml/Minute eluiert. Der zweite Haupt-Peak, detektiert bei einer UV-Absorption von 220 Nanometer, entsprach HWAP-I. Die Probe wurde auf einer YWG-C 18-Säule entsalzt und lyophilisiert bzw. gefriergetrocknet. Die Probe war zumindest ungefähr 98% rein. Sie wanderte als einzelne Spezies auf einem SDS-Page-Gel und durch IEF-Elektrophorese. Eine Massenspektroskopie zeigte an, dass ihr Molekulargewicht 3749,3 Dalton betrug, was mit dem vorhergesagten Molekulargewicht von 3750 Dalton übereinstimmt.
Festphasensynthese. HWAP-I wurde synthetisch unter Verwendung von Fmoc-Aminosäurepentafluorphenylestern auf einer Festphasensynthese-Standardlaborstation hergestellt. Die Aktivierung des EDA-PEG-PS-Harzes und die allgemeinen Synthesevorschriften wurden gemäß des Verfahrens von Atherton et al. (1989), Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Oxford University Press 47–122, durchgeführt. Das Harz wurde durch Reaktion mit 4-Hydroxymethylphenoxyessigsäure-OPfp und HOBt aktiviert. Die erste Aminosäure (das Carboxy-terminale Leucin) wurde an die Hydroxy-Gruppen des aktivierten Harzes durch Katalyse mit Dimethylaminopyridin (DMAP) gekoppelt. Die Kopplungsausbeute wurde durch das Verfahren von Sarin et al. (1981), Analytical Biochemistry 34: 595, bestimmt. 200 ml Fmoc-Leucin-Harz (0,23 mmol/g) wurden als das Ausgangsmaterial für die sequentielle Synthese der Aminosäuresequenz von HWAP-I verwendet. Fmoc-Aminosäure-Pentafluorphenylester (3–4facher Überschuss), gelöst in DMF, wurden in jeder Kopplungsreaktion verwendet, um den Umfang der Kopplung und den Prozentsatz des ungekoppelten Amins zu bestimmen und um zu entscheiden, ob eine zweite Kopplung notwendig war. Während der Synthese wurden Trp3, Lys4, Glu19, Gly30 und Ala33 zweimal gekoppelt und Val3 wurde dreimal gekoppelt. Nach 32 Kopplungsschritten wurde das 33-Restepeptid-Harz erhalten und eine Probe des Peptidharzes wurde zur Aminosäure-Analyse entfernt.
Ein Gemisch aus Trifluoressigsäure-thioanisol-ethandithiol-anisol (95 : 5 : 3 : 2; v/v/v/v) wurde zur Spaltung des Polypeptids vom Harz verwendet. Die Reaktion wurde unter Stickstoff bei Dunkelheit für 4 Stunden durchgeführt. Das Harz wurde dann durch einen Sinterglastrichter filtriert und drei- oder viermal mit Trifluoressigsäure gewaschen. Das Filtrat wurde gesammelt und unter Vakuum abgedampt. Das gespaltene und entschützte Peptid-Produkt wurde mit wasserfreiem Ether gewaschen und darauf unter Hochvakuum abgedampft.
Das Verfahren von Saxena et al. (1970), Biochemistry 188: 366, wurde dazu verwendet, die drei Disulfid-Brücken von HWAP-I korrekt zu bilden. 28 mg des synthetisierten Produktes wurden in 2,5 ml Tris-HCl-Puffer (50 mmol/l, pH 6,2) gelöst, der 6 mol/l Guanidinhydrochlorid und 200 mmol/l DTT enthielt. Das Gemisch wurde für 40 Minuten bei 37°C inkubiert. Ein ml der obigen Reaktionslösung wurde darauf 1 ml Tris-HCl-Puffer (1,5 mol/l, pH 8,0) zugesetzt, der 0,3 mmol/l oxidiertes Glutathion und 3,0 mmol/l reduziertes Glutathion enthielt. Die Mischlösung wurde darauf bei 4°C inkubiert und mit einem Magnetrührer für 5 Tage gerührt. Das richtig oxidierte Peptid wurde zuletzt durch HPLC aufgereinigt, wie beispielsweise oben beschrieben wurde.
Das Verfahren von Zhang et al. (1993), J. Protein Chem. 12: 735, wurde zur Reduktion und S-Carboxymethylierung des synthetisierten Peptids verwendet. Das S-carboxylierte Peptid wurde durch Umkehrphasen-HPLC, beispielsweise wie oben beschrieben, gereinigt.
Die Analyse der Aminosäurezusammensetzung wurde unter Verwendung eines MilliGen Model 6600 ProSequencer durchgeführt. Das synthetische und das native HWAP-I wurde in 0,5 ml 20 mmol/l Phosphatpuffer (90% H₂O/10% D₂O) mit einer Endkonzentration von 4 mmol/l gelöst.
Die 1D-NMR-Analyse wurde unter Verwendung eines 500-MHz-Magnetfeldes auf einem Bruker AM-500 NMR Spektrometer, ausgestattet mit einem Aspect 3000 Computer, durchgeführt. Die 1H-NMR-Spektren wurden bei 27°C aufgezeichnet. 36000 Datenpunkte wurden erfasst (128 Ablesungen pro Einzelprobe). Die Spektrumbreite betrug 6494 Hz (12.987 ppm). Die Lösungsmittelunterdrückung wurde durch Verwendung des Vorsättigungsverfahrens durchgeführtt.
Rekombinante Expression. Das HWAP-I-Gen wurde unter Verwendung zweier synthetischer Oligonukleotide konstruieit, die unter Verwendung eines Beckman Oligo 1000 DNA Synthetisierers (Applied Biosystem) synthetisiert wurden. Die Sequenz der beiden 108-mere war wie folgt:
Die Codon-Verwertung wurde optimiert, um ein hohes Expressionsniveau in E. coli zu erzielen. Nach Bestätigung der Sequenz des synthetischen Genes durch Didesoxy-Sequenzierung mit einem ABI 376 Sequenzierer wurde die Oligonukleotid-Kassette in pGEX-KT (Pharmacia, GST-Genfusionsvektor) ligiert. Das rekombinante Plasmid wurde pGH genannt. Das sich ergebende Konstrukt schließt eine Nukleinsäuresequenz ein, die Glutathion-S-Transferase (GST) und eine Thrombin-Spaltstelle einschließt, die die GST-Komponente von den HWAP-I-kodierenden Sequenzen trennt.
E. coli DH 5α, der pGH beherbergt, wurde kultiviert und mit IPTG induziert. Kurz gesagt wurden Bakterien bis zu O. D._550nm ~ 1,0–1,5 gezüchtet und darauf mit 0,1 mM IPTG für 4 Stunden bei 37°C induziert. Die Zellen wurden bei 4000 g für 10 Minuten geerntet, einmal mit PBS gewaschen, darauf in Lyse-Puffer suspendiert, der aus 1% Triton X-100, PBS, 2 mM EDTA und dem Proteaseinhibitor PMSF (1 mM) bestand, und mit 1 mg/ml Lysozym für 30 Minuten inkubiert. Nach Digestion bzw. Verdauung der DNA mit DNase I wurde das Lysat bei 27.000 g für 30 Minuten zentrifugiert. Eine Aufreinigung des Fusionsproteins (GST-HWAP-I) wurde in einem einstufigen Verfahren unter Verwendung einer Affinitätschromatographie mit Glutathion-Sepharose 4B unter den beschriebenen Bedingungen erreicht (Smith und Corcoran, 1990). Das GST-HWAP-I wurde mit 5 mM GSH, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 eluiert. Das Eluat, das GST-HWAP-1 enthielt, wurde mit Thrombin gespalten und rHWAP-I wurde aus dem Spaltgemisch unter Verwendung einer Größenausschluss-HPLC auf einer Shimpac Diol-150 7,9 × 250 mm Säule aufgereinigt. Die Säule wurde mit 0,2 M NH₄AC, pH 6,0, bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,6 ml/Minute eluiert. Die rHWAP-I-enthaltende Fraktion wurde weiterhin durch Umkehrphasen-HPLC in einer Vydac 4,6 × 250 mm C4 Säule aufgereinigt. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten von 30–65% Acetonitril, das 0,1% TFA enthielt, bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1,0 ml/Minuten eluiert.
Die Aminosäuresequenz des gereinigten rHWAP-I wurde unter Verwendung des von Liang und Laursen (1990), Analytical Biochemistry 188: 366, beschriebenen Verfahrens analysiert. Kurz gesagt wurde ein Edman-Abbau auf einem Mi1liGen/Biosearch Model 6600 proSequenzer unter Verwendung einer vorgepackten Aminophenylglasperlenkapillarsäule zur Immobilisierung und Sequenzierung durchgeführt. rHWAP-I weist ein zusätzliches amino-terminales Dipeptid, G-S, auf als Folge der Thrombin-Spaltsequenz. Natives HWAP-I wurde als Kontrolle für die Analyse verwendet. Eine Massenspektrometrieanalyse des rHWAP-I wurde unter Verwendung eines MALDI-TOF Massenspektrometers (Micromass Corp.) durchgeführt.
rHWAP-I wurde zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml in einer Lösung gelöst, die aus 0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 6 M Guanidin HCl, 2 mM EDTA, 100 mM DTT bestand. Die Reduktion wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Zur Renaturierung wurde das Lösungssystem, das aus 0,1 M Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA und 4 mM GSSG bestand, schrittweise in einer reduzierten Peptid-Lösung, die 100 mal verdünnt war, gebildet. Die Endkonzentration an Guanidin-HCl betrug 1 M. Die Probe wurde langsam für 24 Stunden bei 4°C gerührt. Renaturiertes rHWAP-I wurde weiterhin durch Umkehrphasen-HPLC auf einer Vydac 2,1 × 150 mm C₁₈-Säule aufgereinigt. Die Elution wurde mit einem linearen Gradienten von 0–37% Acetonitril durchgeführ, das 0,1% TFA enthielt, bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,6 ml/Minute. Die gesamten HPLC- Reaktionen wurden unter Verwendung eines Waters 2010 HPLC Trennsystems mit einem 990-Model UV Detektor durchgeführt.
rHWAP-I kann folgend den oben beschriebenen Verfahren reduziert und reoxidiert werden, um hochspezifische Aktivitäten zu erzielen.
Reoxidiertes rHWAP-I wies dieselbe Leistungsfähigkeit wie natives HWAP-I auf (beispielsweise aus Gift aufgereinigt) im Maus Phrenikus-Diaphragma-Assay zur Hemmung der neuromuskulären Übertragung. Bei 1 × 10^–5 g/ml blockierten sowohl rHWAP-I als auch natives HWAP-I die neuromuskuläre Transmission für ähnliche Zeitspannen (14,3 ± 3,2 Minuten für natürliches HWAP-I; 14,9 ± 4,3 Minuten für rHWAP-I).
Formulierung
Eine Zusammensetzung, die eine wirksame Menge an HWAP-I enthält, kann einem Subjekt verabreicht werden, das einer Behandlung bedarf. Die Zusammensetzung kann parenteral, intravenös, topisch, oral, bukkal, nasal, rektal, subkutan, intramuskulär oder intraperitoneal verabreicht werden. Bei einer Ausführungsform kann die Zusammensetzung beispielsweise in die cerebrospinale Flüssigkeit injiziert werden.
Die Zusammensetzung zur Behandlung wird so formuliert, dass sie mit dem Verabreichungsweg kompatibel ist. Die Zusammensetzung kann als Tablette, Kapsel, Lösung, Pulver, Inhalation, Lotion, Tinktur, Pastille, Suppositorium und transdermales Pflaster fomuliert sein. Siehe beispielsweise Journal of Pharmaceutical Sciences (1963), 52: 918 u. folgende.
Eine Lösung zur parenteralen, intradermalen oder subkutanen Verabreichung kann Folgendes einschließen: ein steriles Verdünnungsmittel, beispielsweise Wasser, Salzlösung, Glycerin, fette Öle, Polyethylenglycole, Propylenglycol oder andere synthetische Lösungsmittel; ein antibakterielles Mittel, beispielsweise Benzylalkohol oder Methylparabene; ein Antioxidans, beispielsweise Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; einen Komplexbildner; ein Puffermittel, beispielsweise Acetat oder Phosphat. Die Lösung kann in Ampullen, Einmalspritzen oder Kunststoff- oder Glas-Vials aufbewahrt werden.
Eine Formulierung zur Injektion oder zur intravenösen Verabreichung kann einen Träger einschließen, der ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium ist. Geeignete Träger schließen Wasser, physiologische Salzlösung, bakteriostatisches Wasser, Cremophor EL^TM (BASF, Parsippany, NJ), Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), Ethanol, Polyole (beispielsweise Glycerol, Glycol, Propylenglycol und dergleichen), und Gemische hiervon ein. Diese Zusammensetzungen müssen steril und flüssig sein, um eine Injektion zu ermöglichen. Die Fluidität kann mit einer Beschichtung, wie beispielsweise Lecithin oder einem Tensid, aufrechterhalten werden. Eine mikrobielle Kontamination kann durch Aufnahme antibakterieller oder antifungaler Mittel, beispielsweise von Parabenen, Chlorbutanol, Phenol, Ascorbinsäure und Thimerosal bzw. Thiomersal vermieden werden. Zucker und Polyalkohole bzw. mehrwertige Alkohole, beispielsweise Mannitol, Sorbitol, Natriumchlorid, können dazu verwendet werden, die Isotonizität in der Zusammensetzung aufrechtzuerhalten.
Die Sterilität kann durch Filtersterilisation der Lösung sichergestellt werden. Alternativ kann die Lösung aus Bestandteilen erzeugt werden, die individuell Filter-sterilisiert wurden. Ein Filter-sterilisierter Bestandteil kann vakuumgetrocknet oder gefriergetrocknet sein, um ein steriles Pulver zu erzeugen. Ein solches Pulver kann vor Injektion mit einer sterilen Trägerlösung rehydratisiert werden.
Orale Zusammensetzungen schließen Tabletten, Kapseln, Pastillen, Suspensionen und Lösungen ein. Solche Zusammensetzungen können mit einem inerten Verdünnungsmittel oder einem essbaren Träger hergestellt werden. Kapseln werden durch Kombinieren eines geeigneten Verdünnungsmittels mit der Verbindung und Befüllen der Kapsel mit dem Gemisch hergestellt. Übliche Verdünnungsmittel sind Stärken, beispielsweise pulverförmige Cellulose oder Zucker, beispielsweise Saccharose, Fructose oder Mannitol. Tabletten werden durch Feucht- oder Trockengranulierung oder durch Verpressen hergestellt. Zusätzlich zur erwünschten Verbindung können Zusammensetzungen für Tabletten Folgendes einschließen: ein Bindemittel, beispielsweise mikrokristalline Cellulose oder Gelatine; einen Träger wie beispielsweise Stärke; einen Zucker (beispielsweise Lactose, Fructose, Glucose, Methylcellulose, Ethylcellulose); einen Gummi (beispielsweise Traganth-Gummi, Acacia); ein Sprengmittel (beispielsweise Alginsäure, Primogel oder Maisstärke); ein Gleitmittel (beispielsweise Magnesiumstearat oder Sterote); ein Gleitmittel (beispielsweise kolloidales Siliziumdioxid); ein Süßungsmittel (beispielsweise Saccharose oder Saccharin); ein Aromamittel (beispielsweise Pfefferminze, Methylsalicylat oder Orangenaroma); oder irgendeine Verbindung mit einer ähnlichen Natur. Biologisch abbaubare Polymere, beispielsweise Poly-D-,L-Lactid-co-Glycolid oder Polyglycolid können als Matrix verwendet werden, um die Freisetzung der Zusammensetzung zu verzögern (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5 417 986, 4 675 381 und 4 450 150).
Zur Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen in Form eines Aerosol-Sprays aus einem Druckbehälter oder Dispenser abgegeben, der ein geeignetes Treibmittel, beispielsweise ein Gas, enthält. Die systemische Verabreichung kann ebenfalls transmukosal erfolgen, beispielsweise mit einem Nasenspray oder einem Suppositorium, oder durch eine transdermale Vorrichtung, beispielsweise als Salbe, Creme oder Gel. Solche Verabreichungswege können Formulierungen verwenden, die Detergentien bzw. Tenside, Gallensalze und Fusidinsäure-Derivate enthalten.
Verabreichungswege. Eine Analgesie kann durch epidurale Verabreichung des HWAP-I-Polypeptids erzeugt werden. Das Polypeptid kann durch ein Bolus-Injektion oder durch kontinuierliche Infusion verabreicht werden, um den Kontakt mit dem Epiduralbereich zu verlängern. Das Polypeptid kann für zumindest 3, 8, 12 oder 24 Stunden infundiert werden. Jedoch kann die Dosierung und der Zeitplan der Verabreichung gemäß den Bedürfnissen des speziellen Subjektes modifiziert werden, beispielsweise im Rahmen klinischer Standardvorschriften zur Behandlung des Schmerzes. Das Polypeptid kann ebenfalls durch intrathekale Wege und in den Blutstrom verabreicht werden. Zusätzlich können implantierbare oder am Körper befestigbare Pumpen verwendet werden, um das HWAP-I-Polypeptid in einer kontrollierten Geschwindigkeit zu verabreichen. US-Patent Nr. 4 619 652 beschreibt eine am Körper tragbare Pumpe, die das Polypeptid in einer tonischen Strömungsgeschwindigkeit oder in periodischen Impulsen bereitstellen kann. Ein Injektionsort direkt neben der Pumpe liefert die Verbindung an das gewünschte Areal, beispielsweise den perineuralen Bereich. Alternativ kann eine verlängerte Verabreichung durch in der Technik bekannte Depot- oder Freisetzungsverzögerungsformulierungen erreicht werden.
Dosierung. Eine geeignete Dosierung zur Behandlung muss bestimmt werden. Eine effektive Menge eines Hemmstoffes ist die Menge oder Dosis, die dazu erforderlich ist, ein spinales Muskelatropie-Symptom in einem Subjekt zu lindern. Die Bestimmung der Menge oder der Dosis, die zur Behandlung eines individuellen Subjektes erforderlich ist, ist für den Fachmann auf dem Gebiet, beispielsweise einen Arzt, Apotheker oder Forscher, Routine. Zunächst wird die Toxizität und die therapeutische Wirksamkeit der HWAP-I-Zubereitung bestimmt. Routinevorschriften zur Bestimmung des LD₅₀ (die Dosis letalis für 50% der Population) und des ED₅₀ (die therapeutisch wirksame Dosis in 50% der Population) in nicht-menschlichen Tieren sind verfügbar. Der therapeutische Index wird als das Verhältnis von LD₅₀/ED₅₀ gemessen. Geeignete Verhältnisse sind größer als ungefähr 2, 5, 10, 50 oder 100. Verbindungen, Formulierungen und Verfahren der Verabreichung mit hohen therapeutischen Indizes können bestimmt werden, weil solche Behandlungen eine geringe Toxizität bei Dosen aufweisen, die eine hohe Wirksamkeit bereitstellen. Verbindungen mit toxischen oder unerwünschten Nebenwirkungen können verwendet werden, wenn Mittel zur Abgabe der Verbindung an das betroffene Gewebe, beispielsweise den Epiduralraum, Rückenmarksneuronen und Gehirnstammneuronen verfügbar sind, während die Schädigung gegenüber nicht-betroffenem Gewebe, beispielsweise Endothelgewebe, minimiert wird.
Bei der Formulierung eines Dosierungsbereiches zur Verwendung bei Menschen kann die effektive Dosis einer HWAP-I-Zubereitung aus Studien mit Labortieren bestimmt werden, beispielsweise wie es unten beschrieben ist. Beispielsweise sind therapeutisch wirksame Dosierungen in Zellkultur-Assays ungefähr 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μM oder 10 μM Inhibitor und Bereiche dazwischen. Eine Dosierung kann in einem Tier formuliert werden, so dass sie eine zirkulierende Plasmakonzentration des Inhibitors bzw. Hemmstoffes erreicht, die in diesen Bereich fällt. Eine exemplarische Dosis erzeugt eine Plasmakonzentration, die den IC₅₀ überschreitet (d. h. die Konzentration der Testverbindung, die eine halbmaximale Hemmung eines Symptoms erreicht), wie es in Zellkultur-Assays bestimmt wird. Die zirkulierende Plasmakonzentration kann beispielsweise durch Gewinnung einer Blutprobe und durch Analysieren der Probe mit Hochleistungsflüssigchromatographie oder Massenspektroskopie bestimmt werden.
Alternativ kann die Dosis aus Tests in einem Tiermodell, wie unten beschrieben, geschätzt werden. Die Linderung von Symptomen wird beobachtet, wenn Ratten HWAP-I- Polypeptid in einer Dosis von zumindest ungefähr 10 μg/kg, 20 μg/kg, 40 μg/kg, 80 μg/kg, 120 μg/kg, 180 μg/kg, 240 μg/kg, 300 μg/kg oder 360 μg/kg empfangen. Das Verhältnis der Dosierungen für Tiere und Menschen (auf Grundlage von Milligramm pro Quadratmeter Körperoberfläche) wird von Freireich et al., Cancer Chemother. Rep. 1966, 50, 219, beschrieben. Die Körperoberfläche kann ungefähr aus der Größe und dem Gewicht des Patienten bestimmt werden. Siehe beispielsweise Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, New York, 1970, 537. Eine Wirkdosis zur Behandlung von menschlichen Patienten wird als ungefähr zumindest 3 μg/kg, 30 μg/kg, 120 μg/kg, 180 μg/kg, 240 μg/kg, 300 μg/kg oder 500 μg/kg geschätzt. Das Polypeptid kann mit einer bestimmten Frequenz oder kontinuierlich verabreicht werden, um die lokale Konzentration wirksam zu erhalten, um den Schmerz im Subjekt zu reduzieren. Abhängig vom Verabreichungsverfahren kann die geeignete Dosis variieren, beispielsweise von ungefähr 10 μg kg^–1 Tag^–1 bis ungefähr 10 mg kg^–1 Tag^–1. Die Dosis für einen Patienten kann optimiert werden, während der Patient von einem Arzt, Apotheker oder Forscher betreut wird. Beispielsweise kann eine relativ niedrige Dosis der HWAP-I-Zubereitung initial verabreicht werden. Der Patient kann bezüglich der Symptome und der Schmerzempfindung, wie unten beschrieben, überwacht werden. Die Dosis kann erhöht werden, bis eine geeignete Reaktion erzielt wird. Zusätzlich kann die spezifische Dosiskonzentration für jedes spezielle Subjekt, abhängig vom Alter, dem Körpergewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand, dem Geschlecht und dem speziellen Ernährungszustand des Subjektes, der Verabreichungszeit, dem Verabreichungsweg, der Ausscheidungsrate bzw.- geschwindigkeit und anderen Arzneistoffen abhängig variieren, die in Kombination verabreicht werden.
Verwendungen
Das HWAP-I-Polypeptid kann einem Subjekt verabreicht werden, das unter Schmerz leidet. Die Behandlung kann Teil einer Therapie oder Prophylaxe-Vorschrift sein. Das Subjekt kann unter einem Schmerz aus irgendeiner Vielzahl von Gründen leiden, beispielsweise aufgrund von Schmerz oder einer Schmerz-assoziierten Störung, die hierin offenbart ist. Beispielsweise kann das Subjekt ein Patient mit Schmerz sein, der von einer Gewebsverletzung herrührt, beispielsweise einer Entzündung, Infektion, Ischämie; Schmerz, der mit Muskelskelettstörungen assoziiert ist, beispielsweise Gelenkschmerz; Zahnschmerz, Kopfschmerzen, beispielsweise Migräne; Schmerz, der mit einem chirurgischen Eingriff verbunden ist; Schmerz, der mit Entzündung verbunden ist, beispielsweise Reizdarmsyndrom; oder Brustschmerz. Das Subjekt kann ein Patient mit einem komplexen regionalen Schmerzsyndrom (Complex Regional Pain Syndrome = CRPS), Sudeck-Dystrophie (Reflex Sympathetic Dystrophy = RSD), Kausalgie, Neuralgien, Zentralem Schmerz- und Dysesthesie-Syndrom, Karotidynie, neurogenem Schmerz, refraktorischem zervikobrachialem Schmerzsyndrom, temporo-mandibulärem Syndrom, craniomandibulärem Schmerzdysfunktionssyndrom, chronischem idiopathischem Schmerzsyndrom, Costen-Schmerz-Dysfunktion, akutem Brustschmerzsyndrom, gynäkologischem Schmerzsyndrom, patellofemoralem Schmerzsyndrom, vorderes Knie-Schmerz-Syndrom, wiederauftretendem Abdominalschmerz bei Kindern, Koliken, Unterer-Rücken-Schmerz-Syndrom, neuropathischem Schmerz, Phantomschmerz nach einer Amputation, Phantomzahnschmerz oder Schmerzasymbolie, sein. Das Subjekt kann ein Krebspatient sein, beispielsweise ein Patient mit Hirnkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs, Knochenkrebs oder Prostatakrebs. Weitere Beispiele von Schmerzzuständen schließen Schmerz ein, der durch Niederkunft induziert ist oder postpartaler Schmerz.
Der Fachmann kann ein HWAP-I-Polypeptid der vorliegenden Erfindung gewinnen und aufreinigen und dieses in vollem Umfang auf Grundlage der Anleitung der nachfolgenden speziellen Beispiele verwenden, die lediglich illustrativ sind und den Umfang der Erfindung nicht einschränken sollen.
Beispiel 1
In diesem Beispiel wurde die Wirksamkeit von HWAP-I zur Schmerzlinderung in einem Rattenmodell-System überprüft. Der Verabreichungsweg war epidural, eine Technik, die häufig zur Schmerzlinderung verwendet wird, beispielsweise für Patienten nach einem chirurgischen Eingriff oder bei Krebspatienten im Spätstadium. Dieses Verfahren sieht die effiziente Abgabe eines konzentrierten wirksamen Inhaltsstoffes mit reduzierten Nebenwirkungen vor.
HWAP-I wurde isoliert und aus dem rohen Gift von Selenocosmia huwena wie beschrieben aufgereinigt. Dessen Reinheit wurde durch HPLC und MALDI-TOF Massenspektrometrie als 99,5% bestimmt.
Männliche Spraque-Dawley-Ratten wurden mit 2% Natriumpentobarbital (40 mg/kg, i. p.) anästhetisiert. Die Nackenhaut wurde eingeschnitten, um die Okzipitalmembran freizulegen. HWAP-I, zubereitet in physiologischer Salzlösung, wurde durch ein PE-10 Polyethylenrohr (14 cm) verabreicht, das in den Epiduralraum (Inserttiefe: 7 cm) am Ort der Schwellung an den Hüften der Ratten eingefügt war. Die Einfügungsposition des Rohrs wurde durch anatomische Auswertung nach dem Experiment bestätigt.
Schmerztoleranz-Assays wurden 1–4 Tage nach der Operation durchgeführt. Eine gesunde Ratte wurde in einen befestigten Behälter eingebracht, wobei ihr Schwanz vom Boden des Gefäßes herabhing. Es wurden drei Punkte auf dem Schwanz zur Reizung markiert. Die Lichtintensität wurde so eingestellt, dass die Schwanzzuck-Latenz (Tail Flick Latency = TFL) der Ratte im Zeitraum von 2–4 Sekunden lag. Der Durchschnitt der TFLs, der dreimal vor Arzneistoflbehandlung bestimmt wurde, wurde als Basislinienschmerz-Schwelle der Ratte angenommen. HWAP-I wurde der Ratte unter Verwendung des eingefügten Rohres verabreicht. Nach 20 Minuten wurde die Schmerzschwelle bestimmt. Die analgetische Wirkung (A_E) wurde gemäß der folgenden Formel berechnet:
wobei T_P TLF nach Arzneistoffbehandlung ist und T_B die Basislinienschmerz-Schwelle ist.
Die Obergrenze der erhöhten Schmerzschwelle betrug 200%, um eine Verletzung der Haut des Rattenschwanzes zu vermeiden, während die Basislinienschmerz-Schwelle 3 Sekunden betrug. Die Bestrahlung wurde gestoppt, sobald das TFL 9 Sekunden überschritt.
54 Ratten (160–220 g) jedes Geschlechtes, deren T_B Basisschmerz-Schwellen in 3–4 Sekunden lagen, wurden ausgewählt und zufallsbedingt in 6 Gruppen zu 9 Ratten aufgeteilt. Die Ratten in jeder Gruppe wurden mit HWAP-I in einer Dosis von 120 μg/kg, 180 μg/kg, 240 μg/kg, 300 μg/kg, 360 μg/kg und mit physiologischer Salzlösung in einer Kontollgruppe jeweils behandelt.
Alle fünf Dosierungen von HWAP-I wiesen analgetische Wirkungen auf. Die Schmerzschwelle der Ratten wurde in einer Stunde unter 180 μg/kg HWAP-I um 50–70% erhöht und die Zeitdauer betrug über 3 Stunden. Die Schmerzschwelle wurde um 100% in einer Stunde unter 360 μg/kg HWAP-I erhöht und die Dauer der Schmerzlinderung auf 6 Stunden verlängert. Keine signifikante analgetische Wirkung wurde in der Kontrollgruppe mit der physiologischen Salzlösung beobachtet. Wenn die HWAP-I-Dosierung ungefähr 600 μg/kg betrug, begannen einige Ratten abträgliche Effekte zu zeigen, beispielsweise eine Ataxie in den Hinterläufen. Die meisten konnten in den Normalzustand ohne Folgekrankheiten zurückversetzt werden.
Die analgetische Wirkung von HWAP-I wurde ebenfalls mit Morphinhydrochlorid verglichen. Die analgetische Wirkung von Morphin (200 μg/kg) erreichte ihr Maximum und nahm dann rasch und auf 50% in einer einzigen Stunde im Gegensatz zu einer sechsstündigen Zeitdauer der Schmerzlinderung von HWAP-I ab.
Beispiel 2
Die HWAP-I-Zubereitung wurde dem Subarachnoidalraum durch Injektion zugeführt. Die Verabreichungsmethode kann zur Schmerzlinderung bei Patienten nach einem chirurgischen Eingriff und bei Krebspatienten im Spätstadium verwendet werden.
Das Verfahren war ein Testen unter Verwendung eines experimentellen Rattensystems. Nach einer Anästhesie wurde die Nackenhaut einer Ratte eingeschnitten. Die Okzipitalmembran wurde exponiert und ein Loch mit einem Durchmesser von 1 mm mit einer Nr.-5-Nadel hergestellt. HWAP-I, zubereitet in physiologischer Kochsalzlösung, wurde mit einem PE-10-Polyethylenrohr (14 cm) verabreicht, eingefügt in den Subarachnoidalraum (Tiefe der Einfügung: 7 cm) bis zur Stelle der Schwellung an den Hüften der Ratten. Die Einfügungsposition des Rohres wurde später durch anatomische Untersuchung nach dem Experiment bestätigt.
Die Assays wurden 1–3 Tage nach der Operation durchgeführt. 28 Ratten (130–230 g) jeden Geschlechtes, deren Basisschmerzschwellen innerhalb 2–4 Sekunden lagen, wurden ausgewählt und zufallsbedingt in vier Gruppen von 7 Ratten unterteilt. Die Ratten in jeder Gruppe wurden mit HWAP-I in Dosierungen von 0,6 μg/kg, 1,5 μg/kg bzw. 3,0 μg/kg und mit physiologischer Salzlösung (unter Verwendung eines Volumens von 30 μl) für die Kontrollgruppe behandelt.
Alle drei Dosierungen von HWAP-I wiesen analgetische Wirkungen auf. Bei einer Dosis von 1,5 μg/kg HWAP-I wurde die Schmerzschwelle in einer Stunde für eine Zeitspanne von 1 Stunde um 40–50% erhöht. Bei einer Dosis von 3,0 μg/kg HWAP-I wurde die Schmerzschwelle in einer Stunde für eine Dauer von über 3 Stunden um 100% erhöht. Keine signifikante analgetische Wirkung wurde in der Kontrollgruppe mit physiologischer Salzlösung beobachtet. Wenn HWAP-I in einer Dosis von 8 μg/kg verabreicht wurde, zeigten die Ratten gewisse abträgliche Wirkungen, wie eine Ataxie in den Hinterläufen. Die meisten wurden wiederhergestellt, ohne Folgekrankheit.
Die analgetische Wirkung von HWAP-I wurde ebenfalls mit Morphinhydrochlorid (5 μg/kg) verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Dauer der analgetischen Wirkung von HWAP-I länger als diejenige von Morphium war.
Beispiel 3
Das Schmerzmodell, das durch Formalin induziert wurde, ist zur Evaluierung eines moderaten und kontinuierlichen Schmerzes in Tieren von Nutzen. In diesem Modell wird Formalin in die hinteren Gliedmaßen eines Tieres injiziert. Darauf wird der Schmerz als zwei Phasen überwacht. Die Erstphasenreaktion ist eine akute Phase, die 3–5 Minuten dauert. Die anschließende zweite Phase ist eine Tetanus-Reaktion, die 20–40 Minuten dauert.
Der Schmerzgrad wird einem von vier Graden von 0–3 zugeordnet, gemäß der Reaktion der injizierten Gliedmaßen von Kaninchen, von denen in Grad 0 kein signifikanter Unterschied beobachtet werden kann. Die Schmerzintensität wird durch die nachfolgende Formel ausgewertet:
T₁, T₂ und T₃ stehen für die Dauer einer Reaktion in Grad 1, Grad 2 oder Grad 3 für jeweils 180 Sekunden. Die Schmerzgrade wurden wie folgend bestimmt:

0 – Die injizierte Gliedmaße berührt den Boden dicht und trägt das Gewicht des Tieres. Es besteht kein Unterschied zwischen der Verwendung der beiden vorderen Gliedmaßen und hinteren Gliedmaßen bei dem Tier;
1 – Obwohl die injizierte Gliedmaße den Boden sanft berührt, trägt sie nicht mehr das Gewicht des Tieres. Ein offensichtliches Hinken wird während der Bewegung beobachtet;
2 – Die injizierte Gliedmaße wird vom Tier nicht verwendet, um irgendeine Oberfläche zu berühren;
3 – Das Tier schleckt, benagt oder schüttelt die injizierte Gliedmaße.

Gesunde New-Zealand-Kaninchen (1,5–3,0 kg) jedes Geschlechtes wurden ausgewählt. Ein Katheter wurde chirurgisch in den Epiduralraum jedes Kaninchens für die anschließende Arzneistoffverabreichung eingefügt. 5–6 Stunden nach dem chirurgischen Eingriff wurden die Kaninchen behandelt und ausgewertet.
Die Kaninchen wurden in vier Gruppen aufgeteilt. (1) Kontrollgruppe: 13 Kaninchen wurden nur mit Formalin in eines ihrer hinteren Gliedmaßen ohne irgendeine andere Behandlung injiziert. (2) Physiologische Salz-Kontrollgruppe: 8 Kaninchen wurden mit 500 μl physiologischer Salzlösung durch den Katheter behandelt, der in den Epiduralraum eingefügt wurde. Diese Tiere wurden einer Formalin-Injektion eine Stunde nach Salzverabreichung unterworfen. (3) Morphin-positive Kontrollgruppe: 9 Kaninchen wurden mit Morphinhydrochlorid (250 μg/kg) durch den Katheder behandelt. Diese Tiere wurden einer Formalin-Injektion 30 Minuten nach der Morphin-Verabreichung unterworfen. (4) Behandelte Gruppe: Diese Gruppe wurde in zwei Untergruppen aufgeteilt: Kaninchen wurden mit 25–200 μg/kg HWAP-I durch den Katheder behandelt und darauf nach einer Stunde einer Formalin-Injektion unterworfen. Diese Kaninchen wurden dazu verwendet, die Wirkung variierender HWAP-I-Dosierungen zu überwachen. 25 Kaninchen wurden mit 100 μg/kg HWAP-I durch den Katheder behandelt und darauf einer Formalin-Injektion nach einer vorbestimmten Zeit zwischen 0,5–5 Stunden unterworfen. Diese Kaninchen wurden dazu verwendet, die Zeitdauer der Analgesie, die durch HWAP-I bereitgestellt wurde, zu überwachen.
Diese Experimente zeigten, dass HWAP-I (25–200 μg/kg) eine starke und robuste analgetische Wirkung in diesem Schmerzmodell aufwies. Die analgetischen Wirkungen waren in der zweiten Phase im Vergleich zur ersten Phase am deutlichsten. Unter den verwendeten Konzentrationen wurden keine offensichtlich toxischen Nebenwirkungen beobachtet. Die Zeitdauer der analgetischen Wirkung, wie durch die Epidura verabreicht, betrug 5–6 Stunden.
Beispiel 4
Eine aufgereinigte Zubereitung von HWAP-I wird in steriler physiologischer Salzlösung formuliert und in Teilmengen aufbewahrt, beispielsweise 4-mg-Teilmengen. Die Teilmengen wurden gefriergetrocknet, beispielsweise in Ampullen, zur späteren Verwendung zur Injektion. Vor Verwendung wird eine Ampulle aus 4 mg HWAP-I in 2 ml sterilem Wasser gelöst und darauf durch Injektion in den Vertebralkanal, die Vene oder Muskel oder durch epidurale, intrathekale Verabreichung verabreicht. Diese Vorschrift kann speziell wie folgt verwendet werden:

1) Für Patienten mit Krebs oder AIDS im Spätstadium, wobei die HWAP-I-Zubereitung durch den Vertebralkanal oder Vene verabreicht wird.
2) Für Patienten mit ernsthaftem chronischen Schmerz (der sich beispielsweise aus pathologischen Veränderungen im Rückenmarksgewebe, Osteoartikulation, Gefäß- und Nervenschädigung ergibt), wobei die HWAP-I-Formulierung für eine ausgedehnte Zeitspanne zur Schmerzlinderung verabreicht wird.
3) Für Patienten vor oder nach einem chirurgischen Eingriff und für Patienten in der Niederkunft: Die HWAP-I-Formulierung kann vor oder nach dem Ereignis verabreicht werden, um den Schmerz zu lindern (beispielsweise postchirurgischer Schmerz und/oder durch Geburt induzierter Schmerz).

Beispiel 5
HWAP-I kann in Liposomen-Mikrokapseln zubereitet werden (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4 900 550). Solche Mikrokapseln sind effektive medizinische Träger. Das Liposom umhüllt ein gereinigtes Pulver aus HWAP-I in einer Lipid-Doppelschicht.
Die Zubereitung eines Analgetikums kann oral eingenommen werden, beispielsweise durch Patienten mit rheumatoider Arthritis, Morbus senilis, Migräne und/oder chronischen Kopfschmerzen (die auf eine Neurose zurückzuführen sind); und von Patienten, die unter einer Cervico-Omathralgie, Lumbo-Skelalgie und Acrodynie leiden, die durch Diabetes verursacht ist.
Beispiel 6
HWAP-I kann als Zahn-Tropfenanalgetikum formuliert werden. Das gereinigte Pulver aus lyophilisierem HWAP-I wird in einem Lösungsmittel (beispielsweise steriles destilliertes Wasser) gelöst und als Zahn-Tropfenanalgetikum verpackt, das zur Linderung von Schmerz, induziert durch Zahnlöcher und Endodontitis, verwendet wird.
SEQUENCE LISTING

Claims

Verwendung eines gereinigten Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz, die zumindest zu 70% mit SEQ ID NO: 1 identisch ist, zur Herstellung eines Medikamentes zur Schmerzreduktion.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das gereinigte Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die zumindest zu 80% mit SEQ ID NO: 1 identisch ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das gereinigte Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die zumindest zu 90% mit SEQ ID NO: 1 identisch ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das gereinigte Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein gereinigtes Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die zumindest zu 70% mit SEQ ID NO: 1 identisch ist und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das gereinigte Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die zumindest zu 85% mit SEQ ID NO: 1 identisch ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das gereinigte Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 aufweist.
Herstellungsartikel, der folgendes umfasst: i. einen Behälter; ii. die pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5, 6 oder 7.