JP6000245B2 - 鎮痛作用とasicチャンネルを阻害する新規ペプチド - Google Patents
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Description
APETx2の術中塗布のりの術後痛みに対し( [Deval et al.、 J. Neurosci.、 31(16): 6059−6066、 2011][36])鎮痛効果を誘導し、一方でPcTx1の中央注射はマウスで強力な鎮痛作用を誘導した([Mazzuca et al.、 2007][28])。これらの2つの毒物の鎮痛作用は、痛み情報の受容及び伝達におけるASICチャンネルの関与を示すものである。
(i)アミノ酸配列
LKCX4QHGKVVTCHRDMKFCYHNTGMPFRNLKLILQGCSSSCSETENNKCCSTDRCNK(配列番号1)
(配列中X 4 は、いずれかのアミノ酸を表す);又は
(ii)配列番号1と少なくとも50%、好ましくは少なくとも70%、好適には少なくとも80%、最も好ましくは少なくとも98%の同一性を示す天然又は合成配列であって、上記配列番号1のペプチドの生物的性質を保持するものであり、即ち、鎮痛効果を誘導し、前記ASIC1a及びASIC1bサブユニットとからなる群から選択される少なくとも1つのサブユニットを含む少なくとも1つのASICチャンネルを阻害する配列、
を有するペプチドである。
PcTx2([Diochot et al.、 2004、 mentioned above] [26])などのペプチドは、2μM濃度でラットで、ヘテロメリックASIC1a+ASIC3チャンネルにより生成される伝達の50%を阻害することができる。
例えば、これらは、前記毒から、逆極性高性能液体クロマトグラフ(RP−HPLC)手段により連続的に分離して得られる。前記ペプチドはまた、DNA組み換え方法、又は化学的合成で製造され得る。
atgaaaactctgctgctgaccttgctggtggtgacaatcgtgtgcctagacttaggatactccctgaaatgt73txx75caacatggtaaagttgtgacttgtcatcgagatatgaagttttgctatcataacactggcatgccttttcgaaatctcaagctcatcctacagggatgttcttcttcgtgcagtgaaacagaaaacaataagtgttgctcaacagacagatgcaacaaatag (配列番号4);
又は
ctgaaatgt10txx12caacatggtaaagttgtgacttgtcatcgagatatgaagttttgctatcataacactggcatgccttttcgaaatctcaagctcatcctacagggatgttcttcttcgtgcagtgaaacagaaaacaataagtgttgctcaacagacagatgcaacaaatag (配列番号22);であり、
ここで73txx75及び10txx12はtac、tat、ttt又はttcを表す。
(a)本発明によるペプチドの鎮痛活性を決定し;
(b)候補化合物の鎮痛活性を決定し;
(c)ステップ(a)及び(b)で得られた鎮痛活性とを比較し;及び
(d)本発明のペプチドと同等又はそれを超える活性を持つ候補化合物を選択するステップ、とを含む。
(a)本発明のペプチドをサンプルと接触させ、前記サンプルとの前記ペプチドの結合を測定し;
(b)候補化合物を添加し、及び前記サンプルと前記ペプチドとの結合への前記化合物の効果を評価し;
(c)前記サンプルと前記ペプチドとの結合を変動させることができる候補化合物を選択する、ステップを含む。
(i)尾/足引っ込め時間(熱侵害測定)([Abott et al.、 1982; Cridland and Henry、 1992] [29、 30])、
(ii)熱/冷プレート閾値(熱侵害測定)([Woolfe and Macdonald、 1944、 Ankier、 1974] [31、 32])、
(iii)フォンフレイフィラメント閾値又はランドール−セリット又は装置ピンチ試験(機械的侵害活性測定)([Kim et al.、 1993] [33])。
(iv)動的重量分布試験(姿勢リンク侵害活性測定)、
(v)自発的侵害挙動の測定、及び/又は1以上のインビトロ試験:例えば、候補化合物の選別を次のように行う、ラベル化(例えば、C14、H3又はI125などの放射性元素ラベル、パーオキシダーゼ又はアルカリ又は酸ホスファターゼの酵素ラべル、FITC又はローダミンなどの蛍光ラベル、抗体、抗原、ビオチン、常磁性イオン、ラテックス粒子などで)した本発明のペプチドを前記サンプルと結合することができる条件下でサンプルと接触させ、前記サンプルに結合した前記ラベル化ペプチドの結合を測定し、および、前記ラベル化ペプチドの活性を模倣する前記化合物が前記レセプター(ASIC1a及びASIC1bサブユニットからなる群から選択される少なくとも1つを含むASICチャンネル)のサイトへの結合を前記ペプチドと競争させる。従って、より少ない量の検出可能なラベル剤が、前記試験化合物が前記ペプチドの活性を模倣せず前記レセプターと結合しないか、より小さい親和性で結合する場合よりも、より強く前記試験化合物が前記ペプチドの活性を、前記レセプターに結合することで模倣する場合に、測定される。又は、競争選別方法は、本発明のペプチドをラベル化する代わりに候補化合物をラベル化することで実施され得る。従って、より高い量の検出可能なラベル剤が、前記試験化合物が前記ペプチドの活性を模倣せず前記レセプターと結合しないか、より小さい親和性で結合する場合よりも、より強く前記試験化合物が前記ペプチドの活性を、前記レセプターに結合することで模倣する場合に、測定される。
毒物及びペプチド毒の生成
凍結乾燥毒は Latoxan (Valence、 France).社から入手した。毒を酢酸(1%)で希釈し、それをSephadexG50樹脂を含むカラムに通して分画した。ペプチド画分を回収し、続いて高性能液体クロマトグラフ(HPLC)システムで分画した:
(1)ペプチド画分を、カチオン交換樹脂に負荷し、溶媒pH3.0の1%酢酸及び1Mの酢酸アンモニウムでpH勾配を付けた。ASICalginを含む画分を、60%酢酸アンモニウムから出発して流出させた。
(2)このペプチド画分を、C18逆相カラムに負荷し、内容物を、溶媒水−0.1%TFAとアセトニトル−0.1%TFAの間で疎水性勾配で溶出させた。ASICalgin−1及びASICalgin−2ペプチドは、それぞれアセトニトリルの26%及び27%で純粋に溶出された。
アミノ酸分析
ASICalgin−1及びASICalgin−2は2つの塩基性イソペプチドであり、57アミノ酸を持ち、8個のシステインを持っておち4個のジスルフィド架橋を形成しており(図1A、それぞれ配列番号2及び3)、21個のアミノ酸(図1B、配列番号6参照)のシグナル配列が先行している。これらはお互いに、配列番号1、2又は3の4番目のアミノ酸の点でのみ相違する(配列番号6の25番目の位置)
クローン化によるアミノ酸配列決定
ASICalgin−1の全アミノ酸配列(図1B)は、粗毒内に痕跡量存在するメッセージRNA(mRNA)から、PCRによりcDNAをクローニングすることで決定された。蛇ブラックマンバ毒(Sigma)の毒25mgを、溶解緩衝液(500mMのLiCl、10mMのEDTA、1%(重量/容積)のLiDS及びpH7.5の100mMのトリス−HCl緩衝液中の5mMのジチオスレイトール)に懸濁させた。メッセンジャーRNAを、dT25オリゴヌクレオチドでグラフト化磁気ビーズ(Dynal、 UK)の手段で補足した。このオリゴヌクレオチドを、PrimeScriptTM 逆転写酵素(TaKaRa Bio Inc.、 Japan)を用いて、mRNAからcDNAへの逆転写を実施するためのプライマーとして直接使用した。得られた固相cDNAライブラリーを、直接N末端配列決定に寄る前記毒の部分タンパク質配列から定められた、センス(TGITTYCARCAYGGIAARGT、配列番号7)及びアンチセンス(YTTIARRTTICGRAAIGGCAT、配列番号8)オリゴヌクレオチドを用いて、縮重PCRの実施に使用された。前記ポリメラーゼによるエラーを除外するために、3つの独立したPCRを実施し、望ましいサイズ(89塩基対)を持つ断片を生成し、続いてこれらをpGEMTeasyベクター(Promega)にサブクローニングして配列決定された。これらの配列により、付加EcoRI制限サイトを持たせた特定のセンスオリゴヌクレオチド(ACAC(GAATTC)GCTATCATAACACTGGCATG、配列番号9)を合成し、同様に付加EcoRIサイトを持たせた特定のポリ−dT30アンチセンスオリゴヌクレオチド(ACAC(GAATTC)dT30、配列番号10)を合成した。これらの2つのオリゴヌクレオチドは、PCRによって、同定目的で全3’コード及び3’非コード末端を増幅することができた。3つの独立した約400塩基対のPCR生成バンドが生成され、これらをEcoRI制限サイトでpGEMTeasyベクターにサブクローニングすることで、ポリメラーゼにより生成されるエラーを除外して配列を決定することができた。
前記配列は、自動配列決定装置(LC491、 Applied Biosystems、 USA)で、前記制限されアルキル化されたペプチドのアミノ酸Asp40までを直接N−末端配列方法で確認した。
前記配列を確認するために、ペプチドを次の酵素処理に付した:
(a)C18逆相HPLCカラム上の消化ペプチドの分離と伴う、V8プロテアーゼ。D15及びE43での開裂及び2つのペプチドの分子量1786.9Da(ペプチド1から15)(完全に再配列化)、及び3194.5Da(ペプチド16から43)(部分配列)のHPLCにおける分離は、N末端配列を確認することを可能にする。
(b)質量スペクトル測定による直接分析を伴う、トリプシン消化。トリプシン消化は、N末端配列をも確認し、かつASICalginのペプチド配列の他の部分をも確認する。MS/MS分析により検出及び配列化されたトリプシンペプチドは、以下表1に与えられている。
全ての場合に、質量スペクトル分析は、MALDI−TOF−TOFスペクトル装置(Applied Biosystems、 USA)で実施された。
ASICalgin−1及びASICalgin−2は、データベースにはなく、知られたペプチド又は毒との完全な配列一致はなかった。
マウス(C57B16J、7−から11週齢オス)の痛み挙動が、Hylden及びWilcox [1980][35]の手順に従い、脊椎のL5とL6の間に、前記ペプチドを髄膜注射(IT)した後、評価された。34μMのASICalgin−1(0.34nmol)又は2μMのASICalgin−2(0.2nmol)の効果を、3.1mMのモルヒネ(31nmol)又は10μlの生理的食塩水(145mMのNaC、5mMのKCl、2mMのCaCl2、10mMのHEPES、pH7.4、0.05%ウシ血清アルブミン)のIT注射の効果と比較した。実験のいくつかの系列で、ナキソロン、アヘンレセプター阻害剤(特にμタイプ)を、50μlの0.9%のNaCl中で2mg/kgを、前記ASICalginペプチドのIT注射の10分前に、皮下に注射した。
ASICalgin−1及びASICalgin−2ペプチドの髄膜注射は、マウスの、運動障害の挙動、平衡障害、無関心、麻痺又は痙攣タイプに何ら変化を誘導せず、いかなる死亡をも引き起こさない。
ホルマリン(0.9%NaCl溶液中、2%で15μl)をマウスの後足のアーチ部分へ皮下注射して、2つの相の痛みを誘導した:相Iは化学的痛みが10分間の急性痛み、相IIは炎症性痛みで15から45分間(図2A)である。
熱痛みが、マウスを用いて、46℃(反射運動、動物はブレースされている)の水中に浸漬させた尾を引っ張る時間を、30秒の時間に限定して、研究した。
マウスの後ろ脚のアーチ内に2%のカラギーナンを皮下注射は、炎症性及び過敏痛感を誘導し、これは、46℃の水中に浸漬された後ろ脚を引き込む時間(統合自発運動、動物はブレースされている)が、30秒限定で、カラギーナンの注射後2時間、測定される(図2E、#)。
ASICalgin−1ぺの運動活動への効果は、ローターロッド試験の手段で評価された。マウスを1分間で4回転(rpm)する軸回転体上に置き、5rpmから40rpmまで一定に加速して実施する。落下するまでの時間を、最大300秒限定で測定する。
ASICalgin−1の脳室内(ICV)注射は、定位置座標(皮質表面下−2.4mm、前後軸で−0.5mm、前頂に対して中外軸で+1.6mm)を用いて、前記第3脳室内にイソフラン(1.5%)で麻酔されたマウス(57B16J、7−から11週齢オス)に実施された。34μMのASICalgin−1(0.34nmol)を含む溶液の5μlのICV注射の効果が、5μlの生理的食塩水(145mMのNaCl、5mMのKCl、2mMのCaCl2、10mMのHEPES、pH7.4、0.05%ウシ血清アルブミン)の効果と比較された。アヘンレセプター(特にμタイプ)の阻害剤であるナキソロンが、ASICalgin−1のICV注射の10分前に、0.9%のNaClの50μl中の2mg/kgで皮下注射された。
ASICalgin−1のICV注射は、マウスの、運動問題、平衡問題、無関心、麻痺又は痙攣タイプに変化を誘導せず、3日後でさえ死亡もない。
熱的痛みが、マウスを用いて、46℃の水に浸漬された尾を引き上げる(反射運動、動物はブレースされている)時間を、限度を30秒として測定することで研究された。
ASICalgin−1ペプチドの皮下(SC)注射の効果が、カラギーナン誘導炎症性痛覚過敏について試験された。
ASICalgin−1(π−Dp1)及びASICalgin−2(π−Dp2)ペプチドは、COS細胞で異種的に発現され「全細胞」構成でパッチクランプ技術を用いて記録されるASICチャンネルにより精製される伝達を阻害する(「適用電位」モード)。
ASICalgin−1及びASICalgin−2ペプチドは、大人ラット脊髄神経節から(図6A)、マウス胚背側脊髄から(図6B)、及び新生マウス(2日)海馬から(図6C)から単離された主培地でのニューロンでの「全細胞」構成(「適用電位」モード)でのパッチクランプ技術を用いて記録されたASIC伝達を阻害する。
培地での脊髄ニューロンへのASICalgin−1及びASICalgin−2ペプチドの適用は、基底伝達レベルになんの変更も誘導しないし、「全細胞」構成でのパッチクランプ技術を用いて記録される静止電位にも変化を誘導しない(図7A)。
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36. Deval et al.、 J. Neurosci.、 31(16): 6059−6066、 2011
Claims (16)
- ペプチドであり、前記ペプチドは、アミノ酸配列LKCX4QHGKVVTCHRDMKFCYHNTGMPFRNLKLILQGCSSSCSETENNKCCSTDRCNK (配列番号1)を持ち、X4は、Y又はFを表す、アミノ酸配列を含む、ペプチド。
- 前記ペプチドは少なくとも1つのASICチャンネルのブロッカーである、請求項1に記載のペプチド。
- 前記ペプチドが、ASIC1a及びASIC1bサブユニットからなる群から選択される少なくとも1つのサブユニットを含む少なくとも1つのASICチャンネルのブロッカーである、請求項2に記載のペプチド。
- 前記ペプチドが、ホモメリックASIC1aチャンネル、ホモメリックASIC1bチャンネル、ヘテロメリックASIC1a+ASIC1bチャンネル及び/又はヘテロメリックASIC1a+ASIC2aチャンネルのブロッカーである、請求項3に記載のペプチド。
- 請求項1乃至4のいずれか一項に記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
- ヌクレオチド配列:atgaaaactctgctgctgaccttgctggtggtgacaatcgtgtgcctagacttaggatactccctgaaatgt73txx75caacatggtaaagttgtgacttgtcatcgagatatgaagttttgctatcataacactggcatgccttttcgaaatctcaagctcatcctacagggatgttcttcttcgtgcagtgaaacagaaaacaataagtgttgctcaacagacagatgcaacaaatag(配列番号4);又は
ctgaaatgt10txx12caacatggtaaagttgtgacttgtcatcgagatatgaagttttgctatcataacactggcatgccttttcgaaatctcaagctcatcctacagggatgttcttcttcgtgcagtgaaacagaaaacaataagtgttgctcaacagacagatgcaacaaatag(配列番号22);を含み、配列中73txx75及び10txx12が、tac、tat、ttt又はttcを表す、請求項5に記載のポリヌクレオチド。 - 請求項5又は6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項7に記載のベクターであり、前記ベクターが発現ベクターである、ベクター。
- 請求項7又は8のいずれか一項に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1乃至4のいずれか一項に記載の1以上のペプチドを含む医薬組成物。
- 医薬として使用されるための、請求項1乃至4のいずれか一項に記載のペプチド。
- 前記医薬が鎮痛剤である、請求項11に記載の使用されるためのペプチド。
- 前記鎮痛剤が、ASICチャンネルの活性化を含む痛みのもしくは病態の予防もしくは治療のためである、請求項12に記載の使用されるためのペプチド。
- 前記ASICチャンネル活性化を含む痛みもしくは病態が、炎症性、神経障害、癌関連、術後関連、筋骨格、及び内蔵痛み、炎症、癌、線維筋痛症及び過敏性腸症候群からなる群から選択される、請求項13に記載の使用されるためのペプチド。
- 前記医薬が、うつ病、不安症、脳卒中、癲癇、中枢炎症及び神経変性疾患からなる群から選択される中枢神経疾患の予防及び治療のために使用される、請求項11に記載の使用されるためのペプチド。
- 前記医薬が、中枢内に、皮下、経皮的に、全身、経口又は呼吸経路を介して、投与される、請求項11乃至15のいずれか一項に記載の使用されるためのペプチド。
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