本发明的目的旨在提供虎纹捕鸟蜘蛛毒素提取物——虎纹镇痛肽在制备镇痛药物中的应用,这种镇痛药物既能明显减轻病人疼痛,又没有类似***的毒副作用。
本发明所说的虎纹镇痛肽的化学结构式如式(1)所示,其中A为丙氨酸,C为半胱氨酸,D为天门冬氨酸,E为谷氨酸,F为苯丙氨酸,G为甘氨酸,H为组氨酸,I为异亮氨酸,K为赖氨酸,M为甲基,N为天冬酰胺,P为脯氨酸,Q为谷氨酰胺,R为精氨酸,S为丝氨酸,T为苏氨酸,V为缬氨酸,W为色氨酸,Y为酪氨酸。虎纹镇痛肽可作为单一有效活性组份用于制备镇痛药物。
用于制备镇痛药物的单一有效活性组份的虎纹镇痛肽可由虎纹捕鸟蜘蛛的毒素中提取,其方法如下:
1)毒液的采集:将软管束诱物送入虎纹捕鸟蜘蛛的螯爪下,使螯爪的毒液射出,从螯爪下抽出软管束,再将软管束的毒液抽出,经冰冻干燥后得到毒液的干粉(即为粗毒);
2)粗毒的纯化:将粗毒上样,洗脱,收集含有虎纹镇痛肽的洗脱液,冰冻干燥后再上样,洗脱,将虎纹镇痛肽收集液脱盐后冰冻干燥,即得纯净产品。
众所周知,镇痛药是一种能减轻疾病痛苦的物质,不仅能选择性地减轻或缓解疼痛感觉,而且能使因剧烈疼痛而引起的恐惧、紧张、焦虑不安等不愉快的情绪得到缓解。已有的镇痛药常分为解热镇痛药和麻醉性镇痛药两类,前者以阿司匹林为代表,通过对组织中***素合成过程的抑制作用,减低神经末梢对致痛物质的敏感性,主要用于解除炎症性疼痛和其他钝痛;后者以***为代表,其作用部位主要在丘脑和皮层,作用于中枢神经***中的u型阿片受体,以缓解锐痛、钝痛和内脏绞痛,从而产生镇痛作用,主要用于各种疾病所引起的疼痛和手术后病人的严重疼痛,特别是晚期癌症疼痛。但是目前这种***为代表的麻醉性镇痛药存在毒瘾性强,戒断症状严重,病人必须不断增加剂量才能维持镇痛效果,并且最终导致对这类药物的失效,同时对神经损伤性疼痛无疗效等主要缺点。
由于虎纹镇痛肽是通过与神经突触前膜的N型高阈值钙离子通道的结合抑制突触前神经递质的释放而阻断痛觉神经信号的传导,因此它具有明显的镇痛作用,但没有明显的毒副作用。这已被虎纹镇痛肽的药理、药效实验所证实。
下面实施例将结合附图和动物药理实验对本发明作进一步的详细说明。
以下实施例给出从虎纹捕鸟蜘蛛的毒素中提取虎纹镇痛肽的具体方法。
1)毒液的采集:将3~4根长为4cm、内径为1.5mm的透明塑料软管捆成一束作为诱物,用大镊子从侧面夹住虎纹捕鸟蜘蛛的胸部,蜘蛛便张开螯爪,这时,将软管束诱物送入螯爪下,它即用触肢抱住软管束,将螯爪有力地刺入软管内并射出毒液。由于每只蜘蛛的两个螯爪通常并不同时射毒,而且每次每个螯爪不一定射出全部毒液,因而上述过程需进行多次。射毒后从螯爪下慢慢地抽出软管束,用微量注射器将其中的毒液抽出,经冰冻干燥后即可得到略带黄色的白色干粉,即为粗毒。2)虎纹镇痛肽的分离纯化:将1~3mg上述粗毒溶于200μL双蒸水中,上样到事先用0.1%三氯乙酸平衡好的C18反相色谱柱中(美国Waters公司出口,Delta pak,C4 300A,30×0.46cm),用0%~70%乙腈梯度洗脱,柱温45℃,时间120min,流速0.7~1.0mL/min。洗脱结果共分到约23个紫外吸收峰(220nm)(见图2),其中的A峰即含有虎纹镇痛肽,收集A峰洗脱液,冰冻干燥后溶于双蒸水中,上样到事先用0.02M磷酸钠缓冲液(pH6.6)平衡的WCX-I离子交换高效液相色谱柱中(日本岛津公司,5×0.4cm),用0%~45%1H乙酸钠(pH7.0)溶液梯度洗脱,时间30min,流速0.8mL/min,结果得到两个紫外吸收峰(220nm)(见图3),其中第二个峰即为虎纹镇痛肽。将第二峰收集液用国产YWG-C18柱脱盐后,冰冻干燥即为纯净的产品。用上述方法得到的虎纹镇痛肽用SDS凝胶电泳和等电点聚焦电泳测试皆为一条区带。并经美国Milli Gen公司6600型蛋白质顺序分析仪多次测定,以及***二硫键定位法测定其三维立体结构如图1所示,而其化学结构与式(1)完全相同。
上述化学结构除得到氨基酸组成分析、羧肽酶Y降解分析实验的验证外,还在质谱仪上作了质谱分析,质谱仪测出其准确分子量为3749.3±1,与按顺序分析结果计算得出的分子量3750完全吻合,并确证6个半胱氨酸残基是以三对二硫键的形式存在。
为了更好地理解和更充分地公开本发明,下面将通过大鼠硬膜外用药途径,采用光热辐射刺激法的镇痛实验,以及通过家兔硬膜外用药途径,采用光热辐射刺激法和针刺法的镇痛实验及其结果来说明虎纹镇痛肽的镇痛作用。
实验1:虎纹镇痛肽硬膜外注射对大鼠的镇痛作用。
1)实验用主要原料及仪器:所用的虎纹镇痛肽从虎纹捕鸟蜘蛛粗毒中分离纯化而得,同时通过HPLC和MAIDITOF质谱仪鉴定其纯度为98%以上;PE-10型聚乙烯管为美国Befon-Dickson公司生产;实验大鼠由湖南医科大学动物房提供,200~300g重;光热辐射刺激器采用国产品。
2)给药途径:硬膜外注射是目前对手术后病人与晚期癌症病人进行镇痛的常用给药方式,该方式有药效作用集中持久,毒副作用小等优点。
具体操作如下:将大鼠用乌拉坦麻醉后,剪开大鼠颈部皮肤,挑开寰枕膜,暴露小脑延髓池,将一充满生理盐水的PE-10聚氯乙烯管自挑开处***硬膜外腔(***深度为7.5cm),约达膜膨大处,插管方法与Yaksh等人报道的相一致。实验结束后,注入10μL滂胺天兰染料,解剖后确证插管在硬膜外的确切位置。
3)实验方法与结果:将大鼠垂直放入圆柱型容器内,将其尾部从容器底部伸出、下垂,将光热辐射刺激器的光聚集在其尾部,开启电源的同时按动马表计时器,记录下从光照开始至甩尾的时间。
用光热辐射刺激器选出基础痛域在4s内的大鼠16只,雌雄不分;均分为对照组(注射50μL的磷酸缓冲液PBS)和用药组(注射50μL的虎纹镇痛肽)。镇痛作用以痛阈提高率来表示,按以下公式计算:
将每次实验的痛阈提高率作成时效曲线,结果如图4所示。结果表明,按每公斤体重100μg量注射虎纹镇痛肽,用药后30min镇痛效果最强,镇痛作用可持续近60min。实验动物用药后,除个别表现出后肢共济失调外,大多数实验动物无明显毒副作用症状,所有动物均在3~5h内恢复正常,且无明显后遗症状。
实验2:虎纹镇痛肽硬膜外注射对家兔的镇痛作用。
1)实验主要原料和仪器:所用的虎纹镇痛肽从虎纹捕鸟蜘蛛粗毒中分离纯化而得,同时通过HPLC和MAIDITOF质谱仪鉴定其纯度为98%以上;PE-10型聚乙烯管为美国Be-fon-Dickson公司生产;实验家兔由湖南医科大学动物房提供;光热辐射刺激器采用国产品;长钢针的长度各为3,4,5mm。
2)给药途径:硬膜外注射。
3)实验方法及结果:将8只家兔用辐射刺激法测定其基础痛阈后,分为2组,不论雌雄每组4只,然后按实验1所述的程序分别进行实验,穿刺成功后,第1组按30μg/kg量注射虎纹镇痛肽(体积1mL),第2组注射1mL生理盐水作为对照,记录光照摄后至后肢出现收缩反应的时间,按式(2)计算痛阈提高率,结果如图5所示。它表明:注射虎纹镇痛肽的家兔的痛阈提高百分率在用药后逐渐上升,50min达到最高值,痛阈提高百分率达83%,镇痛作用时间持续近4h,所有实验动物未表现出明显毒副作用并全部未有后遗症状;而生理盐水未表现出任何镇痛作用。
进行上述实验的同时,对注射虎纹镇痛肽与生理盐水的家兔在用药后的不同时间用长度各为3,4,5mm长钢针外刺家兔的四肢下部,观察其收缩反应。用药组20min后开始对3mm针刺反应迟钝,40min后开始对5mm针刺反应迟钝,而对照组所有时间对3mm针刺反应敏感,结果见表1。
表1:家兔硬膜外注射虎纹镇痛肽用针刺法测定其镇痛作用(min)时间 10 20 30 60 90 120 150 180 210 240 270用药组 - + ++ +++ +++ +++ +++ ++ + + -对照组 - - - - - - - - - - -
-:对3mm针刺反应敏感;+:对3mm针刺反应迟钝;++:对4mm针刺反应迟钝;+++:对5mm针刺反应迟钝
综上所述,家兔在硬膜外注射虎纹镇痛肽后用光热辐射刺激法和针刺法测定时均表现出明显的镇痛作用,同时未表现出明显的毒副作用。
从以上两个实验结果分析,可以发现以虎纹镇痛肽为单一有效活性组分的镇痛药具有明显的镇痛作用,又没有明显的毒副作用。
另外,为了确认本发明中的虎纹镇痛肽的镇痛机制是否不同于麻醉性中枢神经***镇痛药的镇痛机制,进行了如下3个镇痛作用机理实验:
1)虎纹镇痛肽对豚鼠回肠的作用机制:
虎纹镇痛肽(5×10-6g/mL)对电刺激豚鼠回肠引起的一过性收缩有非常明显的抑制作用,虎纹镇痛肽的抑制作用发生后,乙酰胆碱(ACh)诱发回肠的收缩幅度与使用虎纹镇痛肽前无明显差异。在使用酚妥拉明后,虎纹镇痛肽仍能引起豚鼠回肠的一过性收缩抑制。虎纹镇痛肽对豚鼠回肠的抑制作用主要是抑制ACh释放或影响ACh释放之前的过程。虎纹镇痛钛对乙酰胆碱诱发收缩的作用如图6所示,其刺激条件为方波刺激,强度25V,0.05ms,0.05次/s,温度32℃。由于电刺激引起的豚鼠回肠收缩在关电后消失(A处),这时加入乙酰胆碱6μg/L(B处),即使不开启电刺激,豚鼠回肠也出现持续收缩,清洗后(C处)收缩消失,开电刺激(D处),豚鼠回肠又出现收缩。加虎纹镇痛肽5mg/L(E处)电刺激引起的收缩逐渐被抑制,完全抑制后,停止电刺激(F处),浴槽中加入ACh 6μg/L(G处),豚鼠回肠收缩又出现,其诱发幅度与施加虎纹镇痛肽前或虎纹镇痛肽抑制作用发生后通过台氏液灌流完全恢复时对同样浓度ACh的反应没有明显差异,说明虎纹镇痛肽对豚鼠回肠的抑制作用是抑制乙酰胆碱的释放,但并未影响突触后膜的敏感性。
2)虎纹镇痛肽对蟾蜍心脏活动的影响:
电刺激交感迷走神经引起蟾蜍在体心脏膊动减慢或停止的作用可以被虎纹镇痛肽取消,此时乙酰胆碱对心脏的抑制效应仍然明显;阿托品化的离体蟾蜍心脏,电刺激其交感迷走神经引起搏动加强,但此作用可被虎纹镇痛肽取消,此时肾上腺素对心脏的兴奋效应仍然明显。结果表明,虎纹镇痛肽影响交感神经释放肾上腺素和迷走神经释放乙酰胆碱。虎纹镇痛肽对蟾蜍走交感肾上腺素作用的影响如图7所示,其电刺激强度25V,波宽0.25ms,频率10次/s,持续时间5s,心脏先用阿托品6.7×10-5g/mL处理。先将心房阿托品化(6.7×10-5g/mL)。在神经干施加刺激后,心房的收缩节律变强变快。在心房加入虎纹镇痛肽10μL(1×10-3g/mL),其浓度为3.3×10-5g/mL,电刺激引起的心房收缩加强效应逐步被取消,取消时间为2.67±0.27min(n=3,含斯氏蛙心插管),如图7所示。此时在心房加入Adr,终浓度为6.7×10-5g/mL,可见心房收缩加强。虎纹镇痛肽的作用发生后通过任氏液灌洗,电刺激神经的兴奋效应又可以完全恢复,恢复时间约为6min。在图7中,A,B表示电刺激能使蟾蜍心脏活动加强,在时间C处加入虎纹镇痛肽3.3×10-5g/mL后,在D(2.75min后)和E(6min后)时刻再施加电刺激不再使心脏活动加强,说明电刺激使突触前膜释放肾上腺素引起心博加强的作用被虎纹镇痛肽抑制,但这时在F时刻(8.5min后)加入肾上腺素(5×10-5g/mL)仍使心博加强,说明虎纹镇痛肽是抑制突触前释放肾上腺素而不是影响突触后膜对肾上腺素的敏感性。另外,G,H处是用任氏液清洗12,14.5min后的电刺激。
3)虎纹镇痛肽对钙离子通道作用的初步分析(见图8):
根据对极化的敏感性,钙通道可以分为两大类:低阈值激活钙通道(Low Voltage Acti-valed)和高阈值激活钙通道(High Voltage Activated)。其中,低阈值的钙通道通常被称为T型钙通道,而高阈值钙通道则可分为N型(对芋螺毒素Conotoin敏感)、L型(对二二氢吡啶Dihydropyridine敏感)和R型(Residue,残余钙通道),另外还包括P/Q型(它不同于T,L,N型,一般认为只存在于中枢神经中)。
在NG108-15细胞(小鼠神经细胞瘤×大鼠神经胶质细胞杂交细胞)上,正常细胞全细胞钳制(Whole-cell patch)能记录到的钙电流很小,而且仅有T型钙通道。经过3-异丁基-甲基黄嘌呤3-isobutyi-methylxanthine(50μM)分化4~5d能使NGl08-15细胞发生神经性质的生长和增殖,不仅原有的T型钙通道表达得到增加,而且分化出新的高阈值的钙通道类型(N,L,Q型),从而得以记录到nA级水平的钙电流。
实验表明,在1nM的浓度下,虎纹镇痛肽对高阈值钙离子通道的阻断幅度为38%~52%,与此同时我们用I125标记的虎纹镇痛肽与NGl08-15分化细胞进行实验,表明I125标记的虎纹镇痛肽与该种具有钙离子通道的细胞能发生特异性结合。
以下给出虎纹镇痛肽用于几种镇痛药物的实施例。
实施例1:虎纹镇痛肽用于注射用镇痛药物。
将虎纹镇痛肽原料精制成无菌生理盐水溶液,再进行无菌灌装,经冷冻干燥,在无菌条件下严封制成注射用冷冻干燥镇痛制品。使用时,每支(含虎纹镇痛肽4mg)加2mL灭菌注射用水溶解,供椎管内给药、静脉或肌肉注射用。主要用于:
1)癌症及晚期爱滋病病人。通过椎管内或静脉等途径给药,由于虎纹镇痛肽的镇痛效果比***好,无成瘾性,因此可使上述病人摆脱疼痛的严重折磨。
2)严重慢性疼痛患者。由于脊柱、骨关节、肌肉、血管、神经等病变所致的严重慢性疼痛患者需长期使用镇痛药。但是若使用非甾体类抗炎镇痛药,则副作用大,疗效差;若使用麻醉性镇痛药,则有成瘾性。由于虎纹镇痛肽的镇痛效果比麻醉性镇痛药好,又不成瘾,副作用小,因此它是慢性疼痛患者首选的镇痛药剂。
3)术中、术后病人及分娩者。由于虎纹镇痛肽能阻滞神经细胞的疼痛传递,不成瘾,效果好,无副作用,因此,可广泛用于解除病人术中和术后的疼痛,以及无痛分娩中。
实施例2:虎纹镇痛肽用于脂质体口服镇痛药物。脂质体是一种类似微型胶囊的新剂型,它作用一种药物载体,将虎纹镇痛肽的精制粉包封于类脂质双分子层形成的薄膜中间而制成超微型球状体。此剂型镇痛药物可口服给药。主要用于:
1)风湿性和类风湿关节炎患者。这些患者一般需终身服用止痛药,上述剂型镇痛药物对风湿性和类风湿关节炎具有良好的止痛效果,且不成瘾,副作用小。
2)慢性头痛患者。尤其是治疗偏头痛、神经性头痛。
3)其他如颈肩痛、腰腿痛、糖尿病引起的肢端疼痛等。
实施例3:虎纹镇痛肽用于滴牙镇痛药物。将虎纹镇痛肽的精制粉于溶媒中稀释,制成滴牙镇痛剂,用于牙髓炎等疾病所致的牙痛患者,具有无刺激性,副作用小,止痛效果好等优点。所说的溶媒如无菌蒸馏水等。