DE60017406T2

DE60017406T2 - Verfahren zur herstellung von in lipid verkapselten therapeutischen wirkstoffen

Info

Publication number: DE60017406T2
Application number: DE60017406T
Authority: DE
Inventors: Norbert Maurer; F. Kim WONG; R. Pieter CULLIS
Original assignee: Inex Pharmaceuticals Corp
Current assignee: Inex Pharmaceuticals Corp
Priority date: 1999-07-15
Filing date: 2000-07-14
Publication date: 2005-09-29
Anticipated expiration: 2020-07-15
Also published as: BR0012624A; EP1194122A1; EP1196145A1; CA2378430A1; CN1228041C; AU6256100A; ATE286719T1; AU771706B2; WO2001005373A9; JP5388395B2; JP2011225618A; CA2378438C; DE60017406D1; WO2001005374A1; BR0012624B1; CN1361681A; IL147089A0; AU769357B2; ES2235916T3; CA2378438A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf eine neuartige Methode zur Herstellung von Partikeln aus in Lipid verkapselten therapeutischen Wirkstoffen; und insbesondere in Lipid verkapselten Nukleinsäurepartikeln, die bei der Antisense-Therapie oder bei der Gentherapie nützlich sein können.
Hintergrund der Erfindung
Die Idee, Lipidpartikel als Träger für therapeutische Wirkstoffe zu benutzen, wurde von zahlreichen Menschen in Erwägung gezogen. Ansätze haben sich auf die Komplexbildung therapeutischer Wirkstoffe an die Aussenseite der Lipidpartikel oder auf tatsächliches Einschliessen der therapeutischen Wirkstoffe verlassen, obwohl die Fähigkeit, Ansätze zu einem der beiden Arten zu machen, sowohl von einer Übereinstimmung der Eigenschaften der Lipide und der therapeutischen Wirkstoffe, als auch von den verwendeten Methoden zur Herstellung des Partikels abhängt. In dem Fall der Partikel mit eingeschlossenen therapeutischen Wirkstoffen könnte das Verfahren des Einschliessens passiv sein, d.h., die Lipidteilchen versammeln sich in der Gegenwart des therapeutischen Wirkstoffes, von denen einige dann eingeschlossen werden; oder aktiv, d.h., der therapeutische Wirkstoff wird als Folge eines induzierten Gradienten irgendeiner Art in das Innere eines Lipidpartikels gezogen oder gepresst. Ungeachtet der zahlreichen Bemühungen, Lipidpartikel als Träger zu verwenden, bestehen weiterhin Probleme, welche die tatsächlichen Anwendungen von in Lipid verkapselten therapeutischen Wirkstoffen beschränken können. Diese schliessen niedrige Ebenen der Aufnahme therapeutischer Wirkstoffe auf einer Arzneimittel/Lipidbasis, geringe Wirksamkeit der Aufnahme des therapeutischen Wirkstoffes und Mangel an einem geeigneten Verfahren für die Erzeugung der in Lipid verkapselten therapeutischen Wirkstoffpartikel in grösserem Massstab ein.
Die Erzeugung von vollständig in Lipid verkapselten therapeutischen Wirkstoffpartikeln in grossem Massstab wurde nicht dort erzielt, wo es eine bedeutsame elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem Lipid und dem therapeutischen Wirkstoff gibt. Ein grundlegendes Problem ist die Aggregation. Aggregation erfolgt normalerweise, wenn ein geladenes Lipid mit einem entgegengesetzt geladenen therapeutischen Wirkstoff vermischt wird, was eine Lösung ergibt, welche eine milchige, flockenartige Masse enthält, die für eine weitere Verarbeitung, geschweige denn für eine therapeutische Verwendung unbrauchbar ist. Das Problem der Aggregation hat die Entwicklung von therapeutischen Zusammensetzungen, die von grossem Nutzen sein könnten, verhindert.
Erfolgreich wurden Laborversuchsansätze erzielt, bei welchen ein geladenes Lipid und ein entgegengesetzt geladener therapeutischer Wirkstoff verwendet wurden, wobei kationische Lipide und anionischen Nukleinsäuren in einem passivem Verkapselungsverfahren verwendet wurden, welches in dem US-Patent Nr. 5,705,385 für Bally et al. (PCT-Anmeldung Nr. WO 96/40964; siehe auch die US-Patentanmeldungen S.N. 08/484,282; 08/485,458; 08/660,025; und 09/140,476) und der PCT-Patentanmeldung Nr. WO 98/51278 für Semple et al. beschrieben wurde (siehe auch die US-Patentanmeldung S.N. 08/856,374). Siehe auch Wheeler et al. (1999) Stabilized plasmid-lipid particles: Construction and characterization. Gen. Ther. 6:271–281. Diese Techniken verwenden ein eine Aggregation verhinderndes Lipid, wie zum Beispiel PEG-Lipid oder ATTA-Lipid (offenbart in der gleichzeitig anhängigen US Patentanmeldung 08/996,783), welches komplexe Aggregationsbildung wirksam verhindert. Die entstehenden, vollständig in Lipid verkapselten therapeutischen Wirkstoffpartikel weisen ausgezeichnete pharmazeutische Eigenschaften auf, wie zum Beispiel die geregelte Grösse (im Bereich von 30–250 nm), vollkommene Verkapselung (wie durch beispielsweise Nukleaseresistenz gemessen) und Stabilität im Serum.
Die US-A-5785992 offenbart Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen, welche für die Einführung von polyanionischem Material in Zellen nützlich sind, wobei die Zusammensetzungen kationische Verbindungen und neutrale Lipide umfassen.
Die WO98/51278 beschreibt ein Laborversuchsverfahren zur Herstellung der in Lipid verkapselten therapeutischen Wirkstoffpartikel unter Verwendung von passivem Einschliessen. Dieses bekannte Verfahren verwendet die zwei grundlegenden Schritte der Lipid-Hydratation und Grössensortierung von Liposomen. Bei dem Schritt der Lipid-Hydratation wird eine kationische Lipidlösung (95% EtOH-Verdünnungsmittel) tropfenweise in einen bewegten Behälter, welcher einen therapeutischen Polynukleotidwirkstoff in Citratpuffer (pH-Wert 3.8) enthält, bis zu einer endgültigen Zusammensetzung von 40% EtOH, 9.9 mg/ml Lipid und 2.0 mg/ml Polynukleotid zugegeben. Die sich aus diesem Hydratationsschritt ergebenden Lipidpartikel weisen typischerweise einen Durchmesser von 400 nm und mehr auf, was für eine allgemeine Verwendung als ein Therapeutikum zu gross ist. Aus diesem Grund sind umfangreiche Nachbearbeitungsverfahren, wie zum Beispiel Hoch-Temperatur-Extrusion (bei 65°C) und wahlweises Gefrier-Tauen (von flüssigem Stickstoff zu einem Wasserbad mit 65°C) erforderlich, um von der Grösse her geeignete Lipidpartikel zu erzielen. Der Wirkungsgrad von Verkapselung unter Verwendung dieses Verfahrens ist ziemlich hoch (60 – 95%) im Hinblick auf ein gewonnenes endgültiges Arzneimittel-Lipid-Verhältnis, jedoch ist die absolute Wirksamkeit der Aufnahme eines Starter-Nukleotids in die endgültige Partikelformulierung weniger gut (25 – 45%).
Kommerzielles, grossangelegtes Herstellen dieser Partikel ist unter Verwendung traditioneller Verfahren, welche im Bereich der Liposome angewendet werden, nicht effizient zu erreichen. Diese Probleme bestehen ungeachtet der grossen Menge an Arten der Herstellung von Liposom/Arzneimittelformulierungen, welche seit der ersten Beschreibung eines Liposompräparates durch Bangham, AD. et al. (1956) „The action of steroids and streptolysin S on the permeability of phospholipid structures to cations", J. Mol. Biol. 13, 138–147. aufgetaucht sind.
Bekannte grossangelegte Herstellungstechniken für Lipidpartikel können allgemein in die folgenden Kategorien eingeordnet werden: 1) Lipidfilm-Hydratation (d.h. passives Einschliessen); 2) entgegengesetzte Phasenverdampfung; 3) Hochdruck-Extrusion; 4) und Verdünnungsmittel-Injektion (Verdünnung) (siehe beispielsweise das US-Patent Nr. 4752425 und 4737323 von Martin et al.). Besondere Instrumente für die Lipidpartikel-Herstellung, welche im Stand der Technik offenbart sind, beinhalten: die US-Patente Nr. 5270053 und 5466468 von Schneider et al.; Isele, U. et al. (1994) Large-Scale Production of Liposomes Containing Monomeric Zinc Phthalocyanine by Controlled Dilution of Organic Solvents, J. Pharma. Sci. vol 83(11) 1608–1616; Kriftner, RW. (1992) Liposome Production: The Ethanol Injection Technique, in Bruan-Falco et al., eds, Liposome Derivatives, Berlin, Springer-Verlag, 1992, pp. 91–100; Kremer at al. (1977) Vesicles of Variable Diameter Prepared by a Modified Injection Method. Biochemistry 16(17): 3932-3935; Batzri, S. and Korn, ED: (1973) Single Bilayer Liposomes Prepared Without Sonication, Bioch. Biophys. Acta 298: 1015–1019.
Keines der oben erwähnten Verfahren oder Instrumente ist geeignet, um an Formulierungen eines geladenen Lipids und von entgegengesetzt geladenen therapeutischen Wirkstoffen mit den ausgezeichneten pharmazeutischen Eigenschaften von Bally et al., siehe oben, und Semple et al., siehe oben, heranzureichen. Die Herstellungstechniken, welche bei Bally et al., siehe oben, und Semple et al., siehe oben, dargelegt wurden, sind nur für 1 bis 100 ml-Präparate entwickelt worden und sind schwerfällig und führen zu unhaltbaren Leistungsschwächen bei grossangelegten Herstellungen (d.h. in dem Bereich von 20 bis 200 Litern).
Die vorliegende Erfindung sieht zum ersten Mal Verfahren für die grossangelegte Herstellung von vollständig in Lipid verkapselten therapeutischen Wirkstoffpartikeln vor, wobei das Lipid und der therapeutische Wirkstoff entgegengesetzt geladen sind. Diese Partikel sind als therapeutische Zusammensetzungen und zum Experimentieren und anderweitig nützlich. Es ist ein Ziel dieser Erfindung, solche Verfahren bereit zu stellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäss der vorliegenden Erfindung werden vollständig in Lipid verkapselte therapeutische Wirkstoffpartikel eines geladenen therapeutischen Wirkstoffes durch Kombinieren einer Lipidzusammensetzung hergestellt, welche vorgebildete Lipidbläschen, einen geladenen therapeutischen Wirkstoff und einen destabilisierenden Wirkstoff umfasst, um eine Mischung aus vorgebildeten Bläschen und therapeutischem Wirkstoff in einer destabilisierenden Lösung zu bilden. Die destabilisierende Lösung ist zur Destabilisierung der Membran der vorgebildeten Lipidbläschen wirksam, ohne die Bläschen zu zerstören. Die sich ergebende Mischung wird für eine Zeitspanne, welche ausreichend ist, um das Verkapseln des therapeutischen Wirkstoffes innerhalb der vorgebildeten Lipidbläschen zu ermöglichen, inkubiert. Der destabilisierende Wirkstoff wird dann entfernt, um vollständig in Lipid verkapselte therapeutische Wirkstoffpartikel zu erhalten. Die vorgebildeten Lipidbläschen umfassen ein geladenes Lipid, welches eine Ladung aufweist, die das Gegenteil zu der Ladung des geladenen therapeutischen Wirkstoffes ist, und ein modifiziertes Lipid, welches einen sterischen Sperranteil zur Kontrolle von Aggregation aufweist. Das modifizierte Lipid ist in den vorgebildeten Lipidbläschen in einer Menge vorhanden, welche wirksam ist, um die Aggregation der vorgebildeten Bläschen zu verzögern, jedoch nicht zu verhindern. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung, welches wirksam ist, um eine effiziente Formation von Lipidpartikeln in grossem Umfang (beispielsweise 20 bis 200 Liter) zu erhalten, wird eine therapeutische Wirkstofflösung, welche Nukleinsäuren (beispielsweise Antisense-Oligodeoxynukleotide) umfasst, mit vorgebildeten Lipidbläschen in einer 25 – 40%igen Lösung aus wässrigem Ethanol kombiniert. Das Inkubieren dieser Mischung für eine Zeitspanne von ungefähr einer Stunde ist ausreichend, um die spontane Erzeugung von vollständig in Lipid verkapselten therapeutischen Wirkstoffpartikeln zur Folge zu haben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein denkbares Model der mechanistischen Schritte des Verfahrens der Erfindung;
2 stellt Verkapselungsleistungen als eine Funktion einer Ethanol-Konzentration für Liposome dar, welche 10 mol% PEG-Cer enthält;
3A stellt die Freigabe von Calcein dar, welches mit selbstvermindernden Konzentrationen in DSPC/Chol/PEG-CerC₁₄/DODAP-Liposomen eingeschlossen wurde, als eine Funktion einer Ethanol-Konzentration (geschlossene Kreise) zusammen mit den Verkapselungsleistungen dar, welche unter Verwendung von Liposomen derselben Lipidzusammensetzung (offene Kreise) erzielt wurden;
3B veranschaulicht den schnellen Austausch von Lipiden während der Formation von in Lipid eingeschlossen Nukleinsäuren unter der Verwendung des Verfahrens der Erfindung;
4 zeigt Einschlussleistungen und Calcein-Leckage-Daten, welche als eine Funktion von Temperatur grafisch dargestellt sind;
5A, B und C zeigen NMR-Spektren mit Lipid verbundenen Oligonukleotiden;
6 zeigt ein Diagramm einer Einschlussleistung, welche als eine Funktion des anfänglichen Oligonukleotid-Lipid-Verhältnisses dargestellt wurde; und
7 zeigt eine Verkapselungsleistung für einige Arten von Antisense-Oligodeoxynukleotide und für Plasmid-DNA (pDNA).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Definitionen
Während die in der Anmeldung verwendeten Begriffe dazu gedacht sind, mit der gewöhnlichen Bedeutung interpretiert zu werden, wie sie von einem Fachmann verstanden wird, werden einige Begriffe ausdrücklich definiert, um jedwede Unklarheit zu vermeiden. Wie in der Beschreibung und den Ansprüchen dieser Anmeldung verwendet, bezieht sich somit der Begriff:

Geladenes Lipid auf eine Lipidart, welche entweder eine kationische Ladung oder eine negative Ladung aufweist oder ein Zwitterion ist, welches nicht rein neutral geladen ist, und welches im wesentlichen einen Bezug zu dem pH-Wert der Lösung, in welcher das Lipid festgestellt wurde, erfordert.
Destabilisation bezieht sich auf eine Änderung der Eigenschaften einer Lipidmembran als ein Ergebnis einer Wechselwirkung mit einem Verdünnungsmittel. Wenn die Membran destabilisiert wird, wird die grundlegende Morphologie der ursprünglichen Lipidmembran bewahrt. Jedoch steigt die Leckagerate der Lösungsprodukte mit geringem Molekulargewicht an und Lipide können quer durch die Membran „flip-floppen" und sich schnell mit anderen Lipidpartikeln austauschen. Die Destabilisierung einer Lipidmembran wurde bei der Erfindung beispielsweise bei Ethanol-Konzentrationen von 25 – 40% beobachtet. Verdünnungsmittel, welche eine Destabilisierung, jedoch keine Zerstörung von Lipidbläschen erzielen, werden hierin als destabilisierende Verdünnungsmittel bezeichnet.
Zerstörung bezieht sich auf eine Änderung der Eigenschaften einer Lipidmembran, sodass die grundlegende Morphologie der ursprünglichen Membran verloren geht. Die Zerstörung einer Lipidmembran wurde beispielsweise bei Ethanol-Konzentrationen von > 60% beobachtet.
Vollständig verkapselt bezieht sich auf Lipidpartikel, in welchen der therapeutische Wirkstoff in dem Lumen eines Lipidbläschens, wie z. B. ein Liposom, enthalten, oder innerhalb einer Doppelschicht eines Lipidpartikels eingebettet ist, sodass kein Teil des therapeutischen Wirkstoffes unmittelbar dem das Lipidpartikel umgebenden Medium zugänglich ist. Lipidpartikel, in welchen der therapeutische Wirkstoff vollständig verkapselt ist, unterscheiden sich von Partikeln, in welchen ein therapeutischer Wirkstoff mit der Aussenseite des Partikels komplexbildend zusammengesetzt ist, oder von Partikeln, in welchen der therapeutische Wirkstoff teilweise in dem Lipid eingebettet und teilweise dem Aussenmedium ausgesetzt ist. Der Grad der Verkapselung kann unter Verwendung von Methoden bestimmt werden, welche einen verfügbaren therapeutischen Wirkstoff abbauen. In dem Fall eines Polynukleotides beinhalten diese Verfahren S1-Nuklease-Aufschluss, Serum-Nuklease und Micrococcal-Nuklease-Analyse. Alternativ dazu kann eine OliGreen^TM-Probe verwendet werden. In einem quantitativen Sinn ist ein „vollständig verkapselter" therapeutischer Wirkstoff ein Wirkstoff, bei dem weniger als 10% des therapeutischen Wirkstoffes und bevorzugt weniger als 5% des therapeutischen Wirkstoffes in einem Lipidpartikel unter Bedingungen abgebaut wird, bei welchen mehr als 90% des therapeutischen Wirkstoffes in der freien Form abgebaut wird. Es sollte weiterhin beachtet werden, dass (ein) zusätzlicher) therapeutischer) Wirkstoffe) mit dem Lipidpartikel durch Komplexierung oder in einer anderen Weise verbunden werden kann/können, welcher) nicht vollständig verkapselt ist/sind, ohne von der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
Hydratation bezieht sich auf ein übliches Verfahren, bei welchem Lipidpartikel, einschliesslich Liposomen, gebildet werden. Bei diesem Verfahren wird die Menge an Wasser in dem Verdünnungsmittel, welches die Lipide umgibt, von einer Konzentration von ungefähr 5% oder weniger (bei dieser Konzentration werden die Lipidmoleküle im wesentlichen einzeln solvatisiert) auf eine Konzentration von 40 – 60% oder höher erhöht (bei welcher sich Lipide spontan zu Membranen, Mizellen oder Partikel formen).
Lipid bezieht sich auf eine Gruppe organischer Verbindungen, welche Ester von Fettsäuren und dadurch gekennzeichnet sind, dass sie in Wasser unlöslich, jedoch in vielen organischen Lösungsmitteln löslich sind. Sie werden üblicherweise in zumindest drei Klassen unterteilt: (1) „einfache Lipide", welche sowohl Fette und Öle, als auch Wachse umfassen; (2) „ Mischlipide", welche Phospholipide und Glycolipide umfassen; und (3) „abgeleitete Lipide", wie beispielsweise Steroide. Eine breite Vielfalt an Lipiden kann bei der Erfindung verwendet werden, einige von ihnen sind weiter unter beschrieben.
Vorgebildetes Bläschen bezieht sich auf die bei dem Verfahren der Erfindung verwendete Starterlipidzusammensetzung, welche Lipidbläschen beinhaltet. Diese Bläschen weisen eine selbstgeschlossene Struktur von im wesentlichen kugelförmiger oder ovaler Form auf, welche aus einer oder mehreren Lipidschichten gebildet wird, und welche ein Innenlumen aufweisen, welches einen Teil des Verdünnungsmittels enthält. Die Bläschen können einlamellare, oligolamellare oder multilamellare Strukturen aufweisen.

Die hierin offenbarte Erfindung bezieht sich auf ein neuartiges Verfahren zum Herstellen von in Lipid verkapselten therapeutischen Wirkstoffpartikeln, welches insbesondere bei der grossangelegten Herstellung solcher Partikeln anwendbar ist, wenn das Lipid und der therapeutische Wirkstoff entgegengesetzt geladen sind, wie das beispielsweise bei Formulierungen eines kationischen Lipids und anionischer Polynukleotide festgestellt wurde. Diese Erfindung verlässt sich auf die überraschende und unerwartete Beobachtung, dass das Kombinieren vorgebildeter Lipidbläschen mit einer Lösung eines therapeutischen Wirkstoffes spontan zu der Bildung von Partikeln eines vollständig in Lipid verkapselten therapeutischen Wirkstoffes einer therapeutisch nützlichen Grösse führen kann. Somit werden vollständig in Lipid verkapselte therapeutische Wirkstoffpartikel gemäss der Erfindung durch ein Verfahren gebildet, welches den Schritt des Kombinierens einer Lipidzusammensetzung, welche vorgebildete Lipidbläschen umfasst, und einer Lösung des therapeutischen Wirkstoffes und das Inkubieren der sich ergebenden Mischung für eine Zeitspanne umfasst, um die Verkapselung des therapeutischen Wirkstoffes in den Lipidbläschen zu erreichen. Die Lipidzusammensetzung umfasst des weiteren ein Verdünnungsmittelsystem, welches wirksam ist, um die Membran der Lipidbläschen zu destabilisieren, ohne die Bläschen zu zerstören.
Das Verfahren der Erfindung weist einige wichtige Eigenschaften auf, welche es von erheblichem Nutzen auf dem Fachgebiet sein lassen. Zunächst ist es ein grossangelegtes Verfahren, welches verwendet werden kann, um erhebliche Mengen (z. B. >100g) des verkapselten therapeutischen Wirkstoffes in einer einzigen Ladung herzustellen. Zweitens wird die Grösse der vorgebildeten Lipidbläschen im wesentlichen beibehalten, sodass eine Weiterverarbeitung der Lipidpartikel nach Einführung des therapeutischen Wirkstoffes, um Partikel von therapeutisch nützlicher Grösse zu erhalten, nicht notwendig ist. Drittens ist die Wirksamkeit einer Verkapselung hoch. Viertens ist die Menge an therapeutischem Wirkstoff, welcher in die Partikel geladen wird, hoch.
Die Lipidpartikel, welche bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden aus einer Kombination von mehreren Lipidarten gebildet, einschliesslich zumindest (1) eines geladenen Lipids, welches eine Gesamtladung aufweist, die das Gegenteil der Ladung des therapeutischen Wirkstoffes ist; und (2) eines veränderten Lipids, welches eine Änderung, wie beispielsweise einen Polyethylen-Glykol-Substituenten enthält, welcher wirksam ist, um Aggregation zu begrenzen. Darüber hinaus kann die Formulierung ein neutrales Lipid oder Sterin enthalten. Beim Formulieren der Lipidpartikel unter Verwendung all der o. g. Bestandteile werden die folgenden Mengen eines jeden Lipidbestandteiles in geeigneter Weise verwendet: 10 bis 40 mol% geladenes Lipid; 25 bis 45 mol% neutrales Lipid, 35 bis 55 mol% Sterin; und 0.5 bis 15 mol% verändertes Lipid. Spezifische Lipidbestandteile können aus den folgenden, nicht begrenzten Beispielen ausgewählt werden.
Geladene Lipide
Eine breite Vielfalt an geladenen Lipiden und entgegengesetzt geladenen therapeutischen Wirkstoffen kann bei der Erfindung verwendet werden. Beispiele solcher Verbindungen sind dem Fachmann verfügbar und bekannt. Die folgenden Listen sind dazu gedacht, veranschaulichende, nicht begrenzende Beispiele zu bieten.
Kationisch geladene Lipide bei einem physiologischen pH-Wert umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf N,N-Dioleyl-N,N,-Dimethylammoniumchlorid ("DODAC"); N-(2,3-Dioleyloxy)Propyl)-N,N,N-Trimethylammoniumchlorid ("DOTMA"); N,N-Distearyl-N,N-Dimethylammoniumbromid ("DDAB"); N-(2,3-Dioleyloxy)Propyl)-N,N,N-Trimethylammoniumchlorid ("DOTAP"); 3β-(N-(N',N'-Dimethylaminoethan)-Carbamoyl)Cholesterin ("DC-Chol") und N-(1,2-Dimyristyloxyprop-3-yl)-N,N-Dimethyl-N-Hydroxyethylammoniumbromid ("DMRIE"). Zusätzlich dazu sind eine Anzahl von kommerziellen Präparaten von kationischen Lipiden verfügbar, welche bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Diese beinhalten beispielsweise Lipofectin^TM (kommerziell erhältliche kationische Liposome von GIBCO/BRL, Grand Island, New York, USA, welche DOTMA und 1,2-Dioleoyl-sn-3-Phosphoethanolamin ("DOPE") umfassen); Lipofectamine^TM (kommerziell erhältliche kationische Liposome von GIBCO/BRL, welche N-(1-(2,3-Dioleyloxy)Propyl)-N-(2-(Spermincarboxamido)Ethyl)-N,N-Dimethylammoniumtrifluorazetat ("DOSPA") und DOPE umfassen); und Transfectam^TM (kommerziell erhältliche kationische Lipide von der Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA, welche Dioktadecylamidoglycyl-Carboxyspermin ("DOGS") in Ethanol umfassen).
Einige kationisch geladene Lipide sind titrierbar, d.h. sie weisen einen pKa bei oder nahe eines physiologischen pH-Wertes auf, mit der bedeutsamen Folge für diese Erfindung, dass sie unter milden Säurebedingungen stark kationisch und schwach (oder nicht) kationisch bei einem physiologischem pH-Wert sind. Solche kationisch geladenen Lipide enthalten, sind jedoch nicht begrenzt auf N-(2,3-Dioleyloxy)Propyl)-N,N-Dimethylammoniumchlorid ("DODMA") und 1,2-Dioleoyl-3-Dimethylammonium-Propan ("DODAP").
Anionisch geladene Lipide bei einem physiologischen pH-Wert enthalten, sind jedoch nicht begrenzt auf Phosphatidyl-Inosit, Phosphatidyl-Serin, Phosphatidyl-Glycerin, Phosphatidsäure, Diphosphatidyl-Glycerin, Poly(Ethylen-Glykol) Phosphatidyl-Ethanolamin, Dimyristoylphosphatidyl-Glycerin, Dioleoylphosphatidyl-Glycerin, Dilauryloylphosphatidyl-Glycerin, Dipalmitoylphosphatidyl-Glycerin, Distearyloylphosphatidyl-Glycerin, Dimyristoyl-Phosphat-Säure, Dipalmitoyl-Phosphat-Säure, Dimyristoyl-Phosphatidyl-Serin, Dipalmitoyl-Phosphatidyl-Serin, Brain-Phosphatidyl-Serin und dergleichen.
Einige anionisch geladene Lipide können titrierbar sein, d.h. sie würden einen pKa bei oder nahe einem physiologischen pH-Wert aufweisen, mit der bedeutsamen Folge für diese Erfindung, dass sie bei milden basischen Bedingungen stark anionisch und bei einem physiologischen pH-Wert schwach (oder nicht) anionisch sind. Solche anionisch geladenen Lipide können durch einen Fachmann, basierend auf den hierin offenbarten Prinzipien, identifiziert werden.
Neutrale Lipide und Sterine
Der Begriff „neutrales Lipid" bezieht sich auf jedwede Anzahl von Lipidarten, welche entweder in einer ungeladenen oder neutralen, zwitterionischen Form eines physiologischen pH-Wertes vorkommen. Solche Lipide umfassen beispielsweise Diacylphosphatidylcholin, Diacylphosphatidylethanolamin, Ceramide, Sphingomyelin, Kephalin, Cholesterin, Cerebroside und Diacylglycerine.
Veränderte Lipide
Gewisse bevorzugte Formulierungen, welche bei der Erfindung verwendet werden, umfassen Aggregation verhindernde Lipide, wie beispielsweise PEG-Lipide oder Polyamid-Oligomer-Lipide (wie beispielsweise ATTA-Lipid), und andere sterische Sperr- oder „verdeckte" Lipide. Solche Lipide sind in den US-Patenten Nr. 4320121 von Sears, 5,820,873 von Choi et al., 5,885,613 von Holland et at., der WO 98/51278 (Erfinder Semple et al.) und der US-Patentanmeldung Serien-Nr. 09/218988 beschrieben, welche sich auf Polyamid-Oligomere beziehen und alle unter Bezugnahme hierin enthalten sind. Diese Lipide verhindern eine Ausfällung und Aggregation von Formulierungen, welche entgegengesetzt geladene Lipide und therapeutische Wirkstoffe enthalten. Diese Lipide können auch verwendet werden, um die Zirkulationslebenszeit in vivo zu verbessern (siehe Klibanov et al. (1990) FEBS Letters, 268 (1): 2358–237), oder sie können ausgewählt werden, um rasch aus der Formulierung in vivo zu wechseln (siehe US-Patent Nr. 5885613). Besonders nützliche austauschbare Lipide sind PEG-Ceramide, welche kürzere Acylketten (d.h. C14 oder C18, auf welche als PEG-CerC14 und PEG-CerC18 Bezug genommen wird) oder PEG-PE aufweisen, das eine C14-Acylkette aufweist.
Einige Lipidpartikel-Formulierungen können Zielgruppen verwenden, welche dazu bestimmt sind, eine Anordnung von Liposomen an bestimmten Zielzellen oder Zielgeweben zu fördern. Zielgruppen können mit der äusseren Doppelschicht des Lipidpartikels während oder nach einer Formulierung verbunden werden. Diese Verfahren sind im Stand der Technik gut bekannt. Darüber hinaus können einige Lipidpartikel-Formulierungen fusogen wirkende Polymere, wie beispielsweise PEAA, Hämaglutinin, andere Lipopeptide (siehe US-Patentanmeldungen SN 08/835,281 und 60/083,294, welche alle unter Bezugnahme hierin enthalten sind) und andere Eigenschaften verwenden, welche für in vivo und/oder intrazelluläre Zufuhr nützlich sind.
Die vorgebildeten Lipidbläschen können in einer Lösung aus Ethanol oder anderen organischen Verdünnungsmitteln unter Verwendung eines einfachen Lipid-Hydratation-Schrittes hergestellt werden. Der Prozentsatz an Ethanol oder einem anderen organischen Verdünnungsmittel muss so ausgewählt werden, dass die Lipidpartikel sich nicht abbauen oder wieder in das Verdünnungsmittel auflösen (im Wesentlichen bei >60% Ethanol), jedoch Bedingungen liefern, welche den spontanen Verkapselungsprozess der Erfindung ermöglichen (ungefähr 5 – 50% Ethanol, bevorzugterweise jedoch 20 – 40% Ethanol). Alternativ dazu können zusätzliche Bestandteile, wie beispielsweise chemische Reinigungsmittel in der Lipidbläschenlösung enthalten sein, welche zu der Destabilisierung der Membran beitragen. Für diese Patentschrift bedeutet „organisches Verdünnungsmittel" entweder ein vollständig organisches Verdünnungsmittel (d.h. 100% Ethanol) oder ein teilweise organisches Verdünnungsmittel (wie beispielsweise Ethanol in Wasser, d.h. 20% Ethanol, 40% Ethanol, usw.). Eine breite Vielfalt an wassermischbaren organischen Verdünnungsmitteln kann verwendet werden, einschliesslich Ethanol oder andere Alkohole, Acetronitril, Dimethylformamid, DMSO, Aceton, andere Ketone und dergleichen. Verdünnungsmittel mit grösserer oder geringerer Polarität können in einigen Fällen nützlich sein. Detergens-Lösungen umfassen β-D-Glucopyranose, Tween 20 und solche der in der WO 96/40964 und der US-Patentanmeldung SN 09/169573 genannten, welche beide hierin unter Bezugnahme eingeschlossen sind, und jedwede anderen chemischen Detergens oder sterischen Sperrbestandteil, welcher dieselben Löslichkeitseigenschaften bieten kann und/oder Partikelaggregation während einem Mischen von entgegengesetzt geladenem Lipid und therapeutischem Wirkstoff verhindern kann. Bevorzugt sind alle organischen Verdünnungsmittel oder Detergens-Lösungen pharmazeutisch in Spuren oder mehr annehmbar, damit das Formulierungsverfahren eine beharrliche Verabreichung nicht hindert.
Anionische therapeutische Wirkstoffe umfassen alle therapeutischen Wirkstoffe mit einer rein negativen Ladung oder weisen eine negativ geladene Gruppe auf, welche in der Lage ist, mit einem kationischen Lipid zusammenzuwirken, ohne durch andere kationisch geladene Gruppen des therapeutischen Wirkstoffes blockiert zu werden. Solche therapeutischen Wirkstoffe umfassen alle bekannten oder potenziell therapeutischen Wirkstoffe, einschliesslich aller Arzneimittel und Verbindungen, wie beispielsweise, jedoch nicht ausschliesslich, Oligonukleotide, Nukleinsäuren, veränderte Nukleinsäuren (einschliesslich Protein-Nukleinsäuren und dergleichen) Proteine und Peptide mit negativen Ladungsgruppen, herkömmliche Arzneimittel, wie beispielsweise Pflanzenalkaloide und Analoge, welche negative Ladungsgruppen aufweisen, und dergleichen. Therapeutische Wirkstoffe, welche nicht von Natur aus anionisch sind, können mit anionischen Gruppen abgeleitet werden, um ihre Verwendung bei der Erfindung zu vereinfachen. Beispielsweise kann Paclitaxel mit einer Polyglutaminsäuregruppe, welche mit dem 2'-Karbon verbunden ist, abgeleitet werden.
Kationische therapeutische Wirkstoffe beinhalten jedweden therapeutischen Wirkstoff mit einer rein positiven Ladung oder weisen eine positiv geladene Gruppe auf, welche in der Lage ist, mit einem negativen Lipid in Wechselwirkung zu interagieren, ohne durch andere negative Ladungsgruppen des therapeutischen Wirkstoffes blockiert zu werden. Solche therapeutischen Wirkstoffe umfassen jeden bekannten oder potentiell therapeutischen Wirkstoff, einschliesslich aller Arzneimittel und Verbindungen, wie beispielsweise, jedoch nicht ausschliesslich, modifizierte Nukleinsäuren, welche mit kationischen Ladungen in Verbindung stehen, Proteine und Peptide mit positiven Ladungsgruppen, herkömmliche Arzneimittel, wie beispielsweise Pflanzenalkaloide und Analoge, welche positive Ladungsgruppen aufweisen, und dergleichen. Therapeutische Wirkstoffe, welche nicht von Natur aus kationisch sind, können mit kationischen Gruppen abgeleitet werden, um ihre Verwendung bei der Erfindung zu vereinfachen.
Typischerweise werden geladene therapeutische Wirkstoffe anfänglich in einer gepufferten, wässrigen Lösung bereitgestellt, welche im wesentlichen eine Menge an Ethanol oder einem anderen organischen Verdünnungsmittel enthält.
Eine salzige Konzentration kann das Aufbauverfahren (siehe US-Patentanmeldung SN 09/169573, welche unter Bezugnahme hierin eingezogen ist), welches bei der Erfindung verwendet wird, stark beeinflussen, sodass die gepufferten Salze, welche verwendet werden, vorsichtig ausgewählt werden müssen. Des weiteren müssen alle Puffer pharmazeutisch zulässig sein, da Spuren in der endgültigen Formulierung zurückbleiben können. Ein geeigneter Puffer ist 300 mM Citrat-Puffer für Phosphorothioat-Oligodeoxynukleotide. Für auf Phosphodiester basierende Oligodeoxynukleotide und Plasmid-DNA, welche geringere Bindungsneigungen aufweisen, ist ein Puffer von geringer ionischer Stärke geeignet. Beispielsweise betragen typische Citrat-Konzentrationen zwischen 25 und 150 mM, mit maximalem Einschluss bei ungefähr 50 mM. Die Menge an Ethanol oder einem anderen organischen Verdünnungsmittel, welches enthalten sein kann, wird durch die Löslichkeit des therapeutischen Wirkstoffes in der wässrigen organischen Mischung gesteuert und auch durch die gewünschten Eigenschaften der endgültigen Mischung des therapeutischen Wirkstoffes und der vorgebildeten Lipidbläschen.
Die Auswahl von Lipiden, eines destabilisierenden Verdünnungsmittels und therapeutischer Wirkstoffe wird ausgeführt, um vollständig in Lipid verkapselte Zusammensetzungen vorsehen zu können. Somit sollten die Lipidbestandteile, falls der therapeutische Wirkstoff ein polyanionisches Oligonukleotid ist, ausgewählt werden, um Lipide zu enthalten, welche unter den Bedingungen in dem stabilisierenden Verdünnungsmittel kationisch sind. Umgekehrt dazu sollten die Lipidbestandteile, falls der therapeutische Wirkstoff kationisch ist, ausgewählt werden, um Lipide zu enthalten, welche unter den Bedingungen in dem destabilisierenden Verdünnungsmittel anionisch sind. Dies bedeutet nicht, dass alle Lipide, welche in der Lipidlösung enthalten sind, geladen sein müssen, noch schliesst es die Aufnahme einiger Menge an ähnlich geladenen Lipiden oder zwitterionischen Lipiden aus. Es bedeutet lediglich, dass die Lipidlösung Lipide enthalten sollten, welche eine Gesamtladung aufweisen, die entgegengesetzt zu der Gesamtladung des therapeutischen Wirkstoffes ist.
Das Verfahren der Erfindung wendet relativ verdünnte Lösungen von Lipidpartikeln und therapeutischem Wirkstoff an. Im wesentlichen wird die therapeutische Wirkstofflösung eine Konzentration von 1 bis 1000 mg/ml aufweisen, bevorzugt 10 – 50 mg/ml des therapeutischen Wirkstoffes, um eine endgültige Konzentration (nach dem Mischen mit den vorgeformten Lipidbläschen) in der Grössenordnung von 0.2 – 10 mg/ml, bevorzugt ungefähr 1 – 2 mg/ml zu erzielen. Vorgeformte Lipidbläschen werden mit der therapeutischen Wirkstofflösung vermischt, sodass die sich ergebende Lipid-Konzentration (nach dem Mischen mit der therapeutischen Wirkstofflösung) ungefähr 1.5 – 30 mg/ml (ungefähr 2 – 40 mM), bevorzugt 10 mg/ml beträgt. Eine bevorzugte Zusammensetzung für vorgebildete Bläschen zur Verwendung mit polynukleotidem therapeutischem Wirkstoff wird bei dem Standard-Lipid-Verhältnis (PEG-cerC14:DODAP:DSPC:Chol (molare Verhältnisse von 5:25:25:45) hergestellt. Diese Lösung, in 100% Ethanol, wird durch Mischen mit einem wässrigen Puffer, beispielsweise 300 mM Citrat mit einem pH-Wert 4.0 zu 5 – 50% Ethanol, bevorzugt 40% Ethanol, verdünnt.
Eine Verkapselung ergibt sich nach einem Zusammenrühren der Lipidlösung und der Oligonukleotid-Lösung, bis sie gut gemischt sind, und dem anschliessenden Inkubieren ohne Rühren oder nur sanftem Rühren für eine Dauer von ungefähr 1 bis 2 Stunden. Die sich ergebende Lösung wird dann dialysiert, um Ethanol oder andere Materialien, welche die Lipidpartikelmembran destabilisieren, zu entfernen. PH-Anpassungen können angewendet werden, um Oberflächenladungen zu neutralisieren (in dem Fall, dass das geladene Lipid titrierbar ist), um den therapeutischen Wirkstoff freizusetzen, welcher mit der Aussenseite des Partikels komplexiert sein kann.
Am Ende der Inkubation führt das Verfahren der Erfindung zu spontan gebildeten, vollständig verkapselten therapeutischen Wirkstoffpartikeln, welche eine Grösse aufweisen, die für therapeutische Verwendung annehmbar ist, und welche, basierend auf der Startseite der vorgebildeten Lipidbläschen, vorausberechnet werden können. Somit ist im wesentlichen ein Kalibrierungsschritt des im Stand der Technik bekannten Typs nach dem Zusatz des therapeutischen Wirkstoffes nicht notwendig. Dies ist vorteilhaft, da keine Notwendigkeit für eine Anwendung von mechanischer Belastung auf die Lipidbläschen nach Aufnahme des therapeutischen Wirkstoffes und somit kein Risiko eines Verlustes oder einer Beschädigung des therapeutischen Wirkstoffes besteht. Sollte ein weiteres Kalibrieren der Produktpartikel gewünscht sein, kann jedoch ein optionaler Schritt zum Kalibrieren der endstehenden Lipidpartikel angewendet werden. Des weiteren kann ein Kalibrierungsschritt als Teil der Herstellung der vorgeformten Bläschen vor der Aufnahme des therapeutischen Wirkstoffes angewendet werden, um Starterbläschen der gewünschten Grösse zu erhalten.
Es gibt mehrere Verfahren für die Kalibrierung von Lipidpartikeln und jedes dieser Verfahren kann im wesentlichen angewendet werden, wenn eine Kalibrierung als Teil der Erfindung angewendet wird. Das Extrusionsverfahren ist ein bevorzugtes Verfahren zum Kalibrieren eines Liposoms, siehe Hope, MJ et al. Reduction of Liposome Size and Preparation of Unilamellar Vesicles by Extrusion Techniques. In: Liposome Technology (G. Gregoriadis, Ed.) Vol. 1. p 123 (1993). Das Verfahren besteht aus einem Extrudieren von Liposomen durch eine kleinporige Polykarbonat-Membran oder eine asymmetrische Keramikmembran, um Liposomgrössen auf eine relativ klare Grössenverteilung zu reduzieren. Typischerweise durchläuft die Suspension die Membran ein oder mehrere Male zyklisch, bis die gewünschte Liposom-Grössenverteilung erreicht ist. Die Liposome können durch nacheinanderfolgende kleinere Porenmembranen extrudiert werden, um eine allmähliche Reduktion der Liposomengrösse zu erreichen.
Eine Vielfalt von alternativen, im Stand der Technik bekannten Verfahren sind zur Reduktion der Grösse einer Liposomenpopulation („kalibrierende Liposome") verfügbar. Ein Kalibrierungsverfahren ist in dem US-Patent Nr. 4,737,323, welches hierin unter Bezugnahme eingeschlossen ist, beschrieben. Das Schallbehandeln einer Liposomsuspension entweder durch Bad -oder Proben-Schallbehandlung bewirkt eine fortschreitende Grössenreduktion nach unten bis zu kleinen einlamellaren Bläschen von weniger als ungefähr 0.05 Mikron im Durchmesser. Eine Homogenisierung ist ein anderes Verfahren; es beruht auf Scherenergie, um grosse Liposome in kleinere aufzusplitten. Bei einem typischen Homogenisierungsverfahren werden multilamellare Bläschen durch einen Standard-Emulsionshomogenisierer im Kreislauf zurückgeführt, bis definierte Liposomgrössen, typischerweise zwischen ungefähr 0.1 und 0.5 Mikrons, beobachtet werden. Die Grösse der liposomalen Bläschen kann durch quasi-elektrische Lichtstreuung (QELS) bestimmt werden, wie bei Bloomfield, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 10:421–450 (1981), beschrieben, welches unter Bezugnahme hierin eingeschlossen ist. Ein durchschnittlicher Liposomdurchmesser kann durch Schallbehandlung von gebildeten Liposomen reduziert werden. Periodische Zyklen von Schallbehandlung können mit QUELS-Bestimmung abgewechselt werden, um eine wirksame Liposomsynthese zu leiten.
Bevorzugte Grössen für Liposome, welche durch die verschiedenen Liposom-Kalibrierungsverfahren hergestellt werden, hängen zum Teil von der Anwendung, für welche die Liposome hergestellt werden, ab, befinden sich jedoch im wesentlichen in dem Bereich von 25 – 250 nm. Bestimmte Beispiele geeigneter Grössen sind in den unten angeführten Beispielen aufgeführt.
Beim Studieren der Lipidpartikel, welche gemäss der Erfindung hergestellt wurden, wurde überraschend festgestellt, dass zahlreiche leere, unilamellare Bläschen (LUV) in multilamellare Bläschen mit eingeschlossenem therapeutischen Wirkstoff umgewandelt wurden. Während es nicht beabsichtigt ist, durch irgendwelche besonderen Mechanismen gebunden zu werden, wird geglaubt, dass das auftretende Verfahren wie in 1 aufgezeigt ist, bei welchem ein kationisch geladenes Lipid und ein anionischer therapeutischer Wirkstoff vorausgesetzt werden. Das Verfahren beginnt mit einem einlamellaren Bläschen 10, welches, als Ergebnis des Einschlusses von kationischen Lipiden, positive Oberflächenladungen an den Innen- und Aussenoberflächen der doppelschichtigen Wand aufweist. Ein Zusatz eines anionischen therapeutischen Wirkstoffes, beispielsweise Antisense-Oligodeoxynukleotide 11, führt zu der Bildung eines Zwischenkomplexes 12, in welchem die therapeutischen Wirkstoffmoleküle 11 durch einen ionischen/elektrostatischen Mechanismus an die entgegengesetzt geladenen Lipide an der Oberfläche des LUV gebunden werden.
Der nächste Schritt bei dem Verfahren scheint ein Aggregationsschritt zu sein, bei welchem Aggregate 13 der LUV/therapeutischen Wirkstoffkomplexe gebildet werden. Dieser Aggregationsschritt ist sowohl sehr komplex und offensichtlich abhängig von der Menge an destabilisierendem Wirkstoff (beispielsweise Ethanol) und der Menge an modifiziertem Lipid in den vorgebildeten Bläschen, als auch durch den geladenen therapeutischen Wirkstoff vermittelt. Einiges begrenztes Wissen wird im Stand der Technik über diese Verfahren bereit gestellt, jedoch sagen sie das Phänomen, welches die Basis der vorliegenden Erfindung ist, weder voraus, noch erklären sie es. Es ist bekannt, dass kationische Liposom-/DNA-Komplexe eine grosse Vielfalt an unterschiedlichen Strukturen, einschliesslich Anhäufungen von aggregierten Liposomen mit flachen, doppelten zweischichtigen Diaphragmen in den Kontaktbereichen, mit DNA umhüllte Liposome und (aggregierte) multilamellare Strukturen besitzen, bei denen DNA zwischen Lipid-Doppelschichten eingelegt ist (Gustafsson et al., 1995; Lasic, 1997; Lasic et al., 1997; Huebner et al., 1999; Xu et al., 1999). Die letzteren Strukturen können flache Stapel von Doppelschichten oder Liposomen sein, welche häufig offene Doppelschicht-Segmente an ihrer äusseren Oberfläche besitzen. Ähnliche Strukturen wurden nach einer Bindung von Ca²⁺ an negativ geladene Liposome beobachtet (Papahadjopoulos, 1975; Miller und Dahl, 1982; Rand et al., 1985; Kachar et al., 1986). Die in diesen Systemen auftretenden strukturellen Umwandlungen werden den Adhäsion vermittelten Verfahren, wie beispielsweise Doppelschicht-Bruch und -Verbindung zugeordnet (Rand et al., 1985; Kachar et al., 1986; Huebner et al., 1999). Zuerst wird ein Liposomenaggregat durch DNA oder Ca²⁺ querverbunden. Schnelles Aufteilen des Kontaktbereiches deformiert die Liposome, da sie sich flach gegeneinander drücken. Dies setzt die Doppelschicht unter erhöhte Spannung. Falls die Spannung (Adhäsionsenergie) hoch genug ist, kann der auf die Lipidmembran ausgeübte Druck entweder durch Verbinden (Anstieg des Bereich/Volumen-Verhältnisses) und/oder Bruch (Volumenverlust) abgebaut werden. Die meisten Doppelschichten brechen, wenn der Bereich um ungefähr 3% zunimmt (Evans und Parsegian, 1983). Nach einem Bruch einer Doppelschicht kollabieren Bläschen und pressen sich flach gegeneinander, um multilamellare Stapel zu bilden. Membran destabilisierende Wirkstoffe, wie beispielsweise Ethanol, können die strukturellen Neuordnungen abstimmen, welche nach einer Wechselwirkung von kationischen Liposomen mit DNA oder Oligonukleotiden auftreten.
Bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung deutet die Bildung von multilamellaren Liposomen aus einlamellaren Bläschen in der Gegenwart von Ethanol auch auf ein Adhäsion vermittelndes Verfahren für ihre Bildung hin. Jedoch unterscheidet sich das Verfahren in mancher Hinsicht von den Komplexen mit ihren begrenzten Membranen, da das Produkt in diesem Fall konzentrische Doppelschicht-Hüllen aufweist. Während Ethanol oder ein vergleichbarer destabilisierender Wirkstoff für die letzteren zu bildenden Strukturen erforderlich ist, ist nicht klar, wie er diese strukturellen Neuordnungen beeinflusst. Diese Neuordnungen korrelieren mit dem Verlust der Membrandurchlässigkeitssperre für kleinere Moleküle und schnelleren Lipidaustausch und auch einem Lipid-Flip-Flop (welcher mit einer Alkoholkonzentration korreliert). Darüber hinaus kann der Austausch des modifizierten Lipids aus dem LUV ein bedeutsamer Faktor bei einer Neugestaltung der Lipidbläschen sein. Auf jeden Fall ordnen sich die Aggregate 13 durch irgendeinen Mechanismus neu, um multilamellare Bläschen 14 zu bilden, bei denen der therapeutische Wirkstoff zwischen die Lamellen und an der Innenseite des Bläschens eingeschlossen ist. Diese Neuordnung ist nicht nur von der Natur der gebildeten Aggregate abhängig, sondern auch von der Temperatur, bei welcher die Aggregate inkubiert werden. Ein wenig des therapeutischen Wirkstoffes kann auch mit Ladungen an der Aussenseite des multilamellare Bläschens verbunden bleiben, und dies kann durch Ladungsneutralisation (beispielsweise mit einer Säure oder einer Base in dem Fall eines titrierbaren geladenen Lipids) oder durch Ionenaustausch entfernt werden.
Einige Merkmale der Lipidbläschen und des destabilisierenden Verdünnungsmittels wurden experimentell als von Wichtigkeit für die Eigenschaften des endgültigen Produktes angesehen und die Auswahl dieser Eigenschaften kann verwendet werden, um die Eigenschaften der multilamellaren Bläschenprodukte zu steuern. Diese Eigenschaften umfassen:

(1) den Einschluss eines geladenen Lipids in die vorgebildeten Lipidbläschen mit einer entgegengesetzten Ladung wie der therapeutische Wirkstoff;
(2) den Einschluss eines modifizierten Lipids in einer Menge, welche ausreichend ist, um Aggregation zu hemmen, jedoch nicht ausreichend ist, um Aggregation zu verhindern. In dem Fall von PEG-CerC₁₄ wurde festgestellt, dass diese Menge in dem Grössenbereich von 2.5 bis 10% liegt;
(3) den Einschluss in dem destabilisierenden Verdünnungsmittel eines destabilisierenden Wirkstoffes (wie beispielsweise Ethanol oder Detergens) in einer Menge, welche destabilisiert, jedoch die vorgeformten Lipidbläschen nicht zerstört; und
(4) die Durchführung der Zusammensetzung der vollständig in Lipid verkapselten therapeutischen Wirkstoffpartikel bei einer Temperatur, bei welcher die Aggregation und der Einschlussschritt nicht entkoppelt werden. Im wesentlichen erfordert dies einen Betrieb in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur (~20°C) oder darüber, abhängig von der Konzentration des destabilisierenden Wirkstoffes und der Lipidzusammensetzung.

Das Verfahren der Erfindung kann unter Verwendung einer herkömmlichen Mischvorrichtung ausgeübt werden. Für eine gross angelegte Herstellung jedoch, kann es wünschenswert sein, eine speziell angepasste Vorrichtung zu verwenden, welche in einer gleichzeitig angemeldeten PCT-Anmeldung mit dem Titel „Methods and Apparatus for Preparation of Lipid Vesicles", Serial No. ist noch nicht vergeben, angemeldet am 14. Juli 2000 (Anwaltsverzeichnis Nr. 80472–6), beschrieben ist.
Das Verfahren der Erfindung wird nun mit Bezug auf die folgenden, nicht beschränkenden Beispiele weiter beschrieben.
Beispiele
Materialien, welche bei den folgenden Beispielen verwendet wurden, werden wie folgt bereit gestellt:
Die Phosphorothioat-Antisense-Oligodeoxynukleotide und Plasmid-DNA, welche bei dieser Studie verwendet werden, wurden durch Inex Pharmaceuticals (Burnaby, BC, Kanada) bereit gestellt. Die mRNA-Ziele und – Sequenzen der Oligonukleotide lauten wie folgt:
Menschliches c-Myc, 5'TAACGTTGAGGGGCAT-3' (Seq ID Nr. 1);
Menschliches ICAM-1, 5'-GCCCAAGCTGGCATCCGTCA-3' (SEQ ID Nr. 2); und mit FITC gekennzeichnetes, menschliches EGFR, 5'CCGTGGTCATGCTCC-3' (SEQ ID Nr. 3).
1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (DSPC) wurde von Northern Lipids (Vancouver, BC, Kanada) und sowohl 1,2-Dioleoyl-3-Dimethylammoniumpropan (DODAP), 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoserin- N-(7-Nitro-2-1,3-Benzoxadiazol-4-yl) (NBD-PS), 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phospoethanolamin (DOPE), 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin-N-(Lissamin-Rhodamin-B-Sulfonyl) (LRh-PE), als auch 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamin-N-(7-Nitro-2-1,3-Benzoxadiazol-4-yl) (NBD-PE) von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL) erworben. 1-Hexadecanoyl-2-(1-Pyrendecanoyl)-sn-Glycero-3-Phosphocholin (Py-HPC) und das Oligonukleotid bindende Färbemittel OliGreen wurden von Molekular Probes (Eugene, OR) bezogen. Sowohl 1-O-(2'-(ω-Methoxypolyethylen-Glycol)Succinoyl)-2-N-Myristoylsphingosin (PEG-CerC₁₄), radioaktiv gekennzeichnetes [³H]-PEG-CerC₁₄, als auch 1-O-(2'-(ω-Methoxypolyethylen-Glycol)Succionoyl)-2-N-Dodecanoylsphingosin (PEG-CerC₂₀) wurden durch INEX Pharmaceuticals (Burnaby, BC, Kanada) bereitgestellt. Cholesterin (chol), n-Octyl β-D-Glucopyranosid (OGP), Triton X-100, Calcein, Dichlordimethylsilan, Natrium-Hydrosulfit (Dithionit), 2-p-Toluidinylnaphthalen-6-Sulfonat (TNS) und Polyanetholsulfonsäure (PASA) wurden von Sigma (Oakville, ON, Kanada) bereitgestellt. Alle Materialien für die Transmissions-Elektronenmikroskopie, einschliesslich Osmium-Tetroxid, Bleizitrat, Maleinsäure, Natrium-Kakodylat und das einbettende Harz Embed 812 wurden von Elektron Microscopy Sciences (Fort Washington, PA) und Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (L.M.P.) von Life Technologies (Burlington, Ontario) bezogen. Cholesterin (CHOL) wurde von der Sigma Chemcial Company (St. Louis, Missouri, USA) bereit gestellt. PEG-Ceramide wurden durch Dr. Zhao Wang bei Inex Pharmaceuticals Corp. unter Verwendung von in der PCT WO 96/40964, welche unter Bezugnahme hierin enthalten ist, beschriebenen Produkten synthetisiert. [³H] oder [¹⁴C]-CHE wurden von NEN (Boston, Massachusetts, USA) gekauft. Alle Lipide waren >99% rein. Ethanol (95%), Methanol, Chloroform, Zitronensäure, HEPES und NaCl wurden von kommerziellen Anbietern gekauft.
Analytische Verfahren:
Proben, welche verwendet wurden, um zu bestimmen, ob ein in Lipid therapeutischer Wirkstoff „verkapselt" ist, wie beispielsweise „vollständig verkapselt", sind in der WO 98/51278 dargelegt und hierin unter Bezugnahme eingeschlossen. Solche Verfahren umfassen S1-Nuklease-Aufschluss, Serum-Nuklease und Micrococcal-Nuklease-Analyse.
Die OliGreen-Probe wurde verwendet, um die Menge von in die Bläschen geladenem Oligonukleotid zu bestimmen. Eine ein fluoreszierendes Färbemittel bindende Probe zur Bestimmung einzelner festsitzender Oligonukleotide in wässrigen Lösungen wurde unter Verwendung eines Biolumin^TM 960 fluoreszenten Plattenlesers (Molecular Dynamics, Sunnyvale, Kalifornien, USA) eingesetzt. Kurz, Teilproben eines verkapselten Oligonukleotids wurden in HEPES gepuffertem Salin (HBS; 20 mM HEPES, 145 mM NaCl, pH-Wert 7.5) verdünnt. Eine 10 μL – Teilprobe der verdünnten Probe wurde zu 100 μL einer 1:200-Verdünnung eines Oligreen^TM – Reagens hinzugefügt, beide mit und ohne 0.1 % Triton X-100-Detergens. Eine Oligo-Standardkurve wurde mit und ohne 0.1 % Triton X-100 zur Mengenbestimmung von verkapseltem Oligo erstellt. Die Fluoreszenz des Oligreen^TM-Antisense-Komplexes wurde unter Verwendung von Anregungs- und Emissionswellenlängen von 485 nm bzw. 520 nm gemessen. Mit einer Oberfläche verbundenes Antisense wurde durch Vergleichen der Fluoreszenz-Messungen in der Abwesenheit und der Gegenwart von Detergens bestimmt.
Dynamische Lichtstreuung.
Grössen wurden durch dynamische Lichtstreuung unter Verwendung eines NICOMP 370-Partikelsichters (Nicomp Particel Sizing Inc., Santa Barbara, Kalifornien) bestimmt. Bei der gesamten Anmeldung werden nach Anzahl durchschnittlich verteilte Grössen vorgelegt, welche durch einen Summenwert, der aus den experimentellen Korrelationsfunktionen angepasst wurde, erzielt wurden. Die Polydispersität wird als die halbe Breite bei halber Höhe einer monomodalen Gauss'schen Grössenverteilung ausgedrückt. Die Viskosität des Ethanol/Citrat-Puffers wurde unter Verwendung eines Viskosemeters nach Ubelohde (Cannon 50) bestimmt. Die Viskosität von Ethanol/300 mM Citrat-Puffer (40/60 (v/v)) bei 23°C, welche bezüglich Wasser bei derselben Temperatur gemessen wurde, betrug 2.674 mPa*s. Das Zetapotential wurde durch elektrophoretische Lichtstreuung unter Verwendung eines Coulter-Streulichtinstrumentes (DELSA, Coulter Electronics Inc., FL) bestimmt.
Lipid-Flip-Flop.
Lipid-Flip-Flop wurde durch chemische Reduktion des fluoreszierenden Lipids, NBD-PS, zu einer nicht fluoreszierenden Verbindung mit Sodium-Dithionit (McIntyre und Sleight, 1991; Lentz et al., 1997) bestimmt. Liposome wurden bei 20 mM Lipid durch Extrusion in der Anwesenheit von 1 mol% NBD-PS hergestellt. Nur NBD-PS, welches in der äusseren Monoschicht angeordnet ist, ist für den reduzierenden Wirkstoff Dithionit zugänglich, welcher dem äusseren Medium zugegeben wurde. Seiner Umverteilung von der inneren in die äussere Monoschicht kann nach Reduktion von NBD-PS in dem äusseren Membranblättchen gefolgt werden. Eine 1 M Natrium-Dithionit-Lösung wurde in 1 M TRIS frisch hergestellt. NBD-PS in der äusseren Monoschicht wurde durch einen Zusatz eines 100-fachen molaren Übermasses an Sodium-Dithionit bezüglich NBD und einer Inkubation für 10 Minuten reduziert. Die Vollendung der Reaktion wurde durch Messen der Dithionit-Fluoreszenz bei 520 mM vor und nach Reduktion, welche bei 465 nm spannend war, überprüft. Überschüssiges Dithionit wurde anschliessend durch Grössenausschlusschromatographie an einer Sephadex-G50-Säule entfernt. Die Liposome wurden in Gegenwart von 40% Ethanol inkubiert und Teilproben, welche einer endgültigen Lipid-Konzentration von 150 μM entsprechen, zum Messen bei unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen.
Leckage-Experimente.
Ethanol induzierte Permeabilization von LUVs wurde bei unterschiedlichen Temperaturen und als eine Funktion der Grösse (MW) der eingeschlossenen gelösten Substanz gemessen. Calcein wurde als ein gering molekulargewichtiger Markierer für Leckage und FITC-Dextran (MW 19500) als ein hoch molekulargewichtiger Markierer verwendet. Einer Leckage von Calcein, welches mit selbstvermindernden Konzentrationen eingeschlossen wurde, wurde durch Überwachung der Zunahme der Calcein-Fluoreszenz gefolgt. LUVs wurden durch Hydratation eines Lipidfilms mit einer wässrigen Lösung, welche 75 mM Calcein und 5 mM HEPES enthält, erstellt, welche durch Hinzufügen von Natrium-Hydroxid, gefolgt durch 5 Gefrier-/Tau-Zyklen und eine Extrusion durch zwei gestapelte 100 mM-Filter (10 Durchläufe) auf einen pH-Wert von 7.5 eingestellt wurde. In dem Fall von DSPC/chol/PEG-CerC₁₄/DODAP wurde eine Extrusion bei 60°C durchgeführt. Uneingeschlossenes Calcein wurde durch Anionenaustauschchromatographie an einer DEAE-Sepharose-CL6B-Säule gegen einen isoosmotischen HBS-Puffer ausgetauscht. Die Liposomen-Vorratslösung wurde auf eine Lipid-Konzentration von 3 μM in HBS verdünnt, welche unterschiedliche Mengen an Ethanol enthält, welches bei 25, 40 oder 60°C vorher ins Gleichgewicht gebracht wurde. Die Fluoreszenz bei 520 nm wurde mit einem Perkin-Elmer-LS50Fluorimeter (Perkin Elmer) nach 5 Minuten Inkubation bei der entsprechenden Temperatur gemessen (Anregungswellenlänge 488 nm, langer Durchlauf-Filter bei 430 nm). Der Wert für 100% Leckage (maximaler Anstieg) wurde durch Hinzufügen einer 10%igen Triton X-100-Lösung auf eine endgültige Konzentration von 0.05% erzielt. Calcein-Leckage wurde entsprechend %Leckage = (F_S–F_b)/(F_Tx–F_b)*100 errechnet, wobei F_S die Fluoreszenz der Probe, F_b der Hintergrund entsprechend den Calcein enthaltenden Liposomen in der Abwesenheit von Ethanol und F_Tx der Triton X-100-Wert ist.
FITC-Dextran (MW 19500) wurde in DSPC/Chol/PEG-CerC₁₄/DODAP-Liposomen eingeschlossen, welche 0.5 mol% LRh-PE bei einer endgültigen Konzentration von 45 mg/ml enthielten. Ein Einschluss wurde durch Hinzufügen der Lipide, welche in Ethanol zu der FITC-Dextran-Lösung in HBS gelöst wurden, durchgeführt, gefolgt durch Extrusion (2 gestapelte 100 nm-Filter, 2 Durchläufe) und einem anschliessenden Entfernen von Ethanol durch Dialyse. Uneingeschlossenes FITC-Dextran wurde durch Grössenausschlusschromatographie an einer Sepharose-CL4B-Säule (1.5×15 cm) entfernt. Der Verlust von FITC-Dextran aus Liposomen, welche 40% Ethanol ausgesetzt waren, wurde nach Entfernen von freigesetztem FITC-Dextran durch Grössenausschlusschromatographie an einer Sepharose-CL4B-Säule (1.5×15 cm) bestimmt. Das FITC/LRh-PE-Verhältnis wurde vor und nach einem Hinzufügen von Ethanol gemessen. FITC- und LRh-PE-Fluoreszenz wurde bei 515 nm und 590 nm mit der Anregungswellenlänge bei 485 nm bzw. 560 nm gemessen.
Lipid-Mischen.
Ethanol induziertem Lipid-Mischen/-Austausch folgte der Verlust von Resonanzenergieübertragung, welche zwischen einem Donator, NBD-PE, und einen Empfänger, LRh-PE, auftritt, welche sich, nach Verdünnung der Proben in eine ungekennzeichnete Zielmembran (Struck et al., 1981) in naher Umgebung befinden. LUVs enthielten 0.75 mol% sowohl von NBD-PE, als auch von LRh-PE. Gekennzeichnete und ungekennzeichnete Liposome wurden in HBS mit einem pH-Wert von 7.5 durch Extrusion bei Lipid-Konzentrationen von 20 mM hergestellt. Ethanol wurde zu gekennzeichneten und ungekennzeichneten Liposomen bis zu einer endgültigen Konzentration von 40% (v/v) hinzugegeben. Anschliessend wurden die ethanolischen Dispergierungen von gekennzeichneten und ungekennzeichneten Liposomen bei einem molaren Lipid-Verhältnis von 1:5 gemischt und bei den geeigneten Temperaturen inkubiert. Teilproben wurden zu gegebenen Zeitpunkten entnommen und zu 2 ml HBS hinzugefügt, um eine endgültige Lipid-Konzentration von 150 μM zu ergeben. Emissionsspektren von NBD und LRh wurden in dem Bereich von 505 bis 650 nm mit der Anregungswellenlänge bei 465 nm (430 nm Emissions-Langdurchlauffilter) gemessen. Nach Hintergrundabzug (ungekennzeichnete Liposome bei 150 μM Lipid) wurde der Verlust von Resonanzenergieübertragung als die Zunahme des NBD/LRh-Verhältnisses ausgedrückt.
Pyren-HPC-Probe.
Pyren-HPC bildet bei hohen Konzentrationen Dimer in erregtem Zustand, welche bei einer unterschiedlichen Wellenlänge als die Monomere fluoreszieren. Excimer-Bildung ist ein diffusionsgesteuertes Verfahren und erfordert zwei Moleküle, die zusammenkommen, um einen Dimer zu bilden. Sowohl Lipidmischen (Zielmembran), als auch ein Abfall der lateralen Mobilität von Pyren-HPC in der Membran kann zu einem Abfall von Pyren-Excimer-Fluoreszenz führen (Hoekstra, 1990; Duportail und Lianose, 1996). Laterale Phasenentmischung führt für gewöhnlich zu einer Zunahme con Pyren-Excimer-Fluoreszenz (Duportail und Lianos, 1996). Das Grundprinzip dieses Experimentes war es, die Auswirkung einer Oligonukleotid-Bindung auf die liposomale Membran zu beobachten. Die Pyren-HPC-Fluoreszenz eines Liposome einschliessenden Oligonukleotids wurde mit leeren Kontrollliposomen vor und nach Verminderung des transmembranen pH-Gradienten verglichen. Eine Zunahme des inneren pH-Wertes auf 7.5 führte zu der Freigabe von membrangebundenen Oligonukleotiden. Liposome, welche Pyren-HPC bei einer Konzentration von 7 mol% enthalten, wurden durch Hinzufügen von Lipiden, welche in Ethanol zu einem Citrat-Puffer mit einem pH-Wert von 4 gelöst wurden, hergestellt. Eine Teilprobe wurde entnommen und ein Oligonukleotid, wie oben beschrieben, eingeschlossen. Die verbleibenden anfänglichen Liposome wurden in derselben Art und Weise mit all den folgenden Schritten (siehe unter Einschluss) behandelt. Der pH-Gradient wurde mit Ammonium-Acetat, welches auf einen pH-Wert von 7.5 eingestellt wurde, abgeleitet. Liposome wurden in dem entsprechenden Puffer, HBS mit einem pH-Wert von 7.5 oder 150 mM Ammonium-Acetat mit einem pH-Wert von 7.5, auf eine endgültige Lipid-Konzentration von 2 μM gelöst. Pyren-HPC-Emmissions-Spektren wurden in dem Wellenlängenbereich von 365 – 550 nm mit Anregung bei 345 nm und einen Emissionssperrfilter bei 350 nm aufgenommen. Das Intensitätsverhältnis von Monomerfluoreszenz bei 397 nm zu Dimerfluoreszenz bei 478 nm wurde sowohl für die anfänglichen Liposome, als auch für die ein Oligonukleotid enthaltenden Liposome vor und nach Verringerung des pH-Gradienten dargestellt.
³¹P-NMR-Spektroscopy.
³¹P NMR Spektren werden mit einem Bruker-MSL200-Spektrometer, welches bei 81 MHz betrieben wird, erzielt. Freie Induktionsabfälle (FIDs), welche 800 oder 2400 Abtastungsresultaten entsprechen, wurden unter Verwendung eines 2.8 μs 50° Impulses mit einer dreisekündigen Zwischenimpulsverzögerung und einer spektralen Breite von 20000 Hz auf einer 2.0 ml-Probe in einer 10 mm-Probe gesammelt. Es wurde keine Protonenkopplung verwendet. Eine exponentielle Multiplikation, welche 25 Hz Linienverbreiterung entspricht, wurde vor einer Fourier-Transformation auf die FIDs angewendet. Die chemische Veränderung wurde auf äusserliche 85%ige Phosphorsäure (H₃PO₄) bezogen. Die Spinnengitter-Entspannungszeiten (T₁) der freien und verkapselten Oligonukleotide bei einem pH-Wert von 7.5 sind im wesentlichen dieselben bei T₁ ^free = 1.7 sec und T1^enc= 2.1 sec. Die T₁-Werte wurden durch eine Inversion gewinnende Pulssequenz gemessen. Die Zwischenimpulsverzögerung von 3 Sekunden für 50°-Impulse ermöglichen die vollständige Entspannung aller Antisense-Resonanzen.
Ultrazentrifugieren.
Liposome mit und ohne eingeschlossenen Oligonukleotiden werden durch Ultrazentrifugieren an einem Zuckerstufengradienten, bestehend aus 1 %, 2.5%, 10% und 15% (w/v) Saccharose in HBS mit einem pH-Wert von 7.5 mit einem Stufenvolumen von 3.5, 3.5, 2.5 bzw. 1.5 ml, fraktioniert. Proben wurden für 2 Stunden bei 36000 rpm (RCF_Rmax 221000xg) unter Verwendung einer Beckmann L8-70-Ultrazentrifuge in Kombination mit einem SW41Ti-Rotor zentrifugiert. Der Gradient wurde entweder von der Spitze her fraktioniert oder es wurden mit einer Spritze nach Durchstechen des Rohres mit einer Nadel individuelle Banden entfernt.
Kryo-Transmissions-Elektronenmikroskopie (Kryo-TEM).
Ein Tropfen einer Probe wurde auf einen Träger eines Standard-Elektronenmikroskops mit einem perforierten Karbonfilm aufgetragen. Überschüssige Flüssigkeit wurde durch Löschen mit Filterpapier entfernt, wobei eine dünne Wasserschicht, welche die Löcher des Karbonfilmes bedeckt, zurückblieb. Der Träger wurde in flüssigem Ethan schnell gefroren, wodurch Bläschen in einem dünnen Film aus amorphem Eis eingebettet wurden. Bilder der Bläschen in Eis wurden unter Tieftemperaturbedingungen bei einer Vergrösserung von 66000 und einer Defokusierung von –1.5 Mikron unter Verwendung eines Gashahns-Kryohalters in einem Philipps-CM200-FEG-Elektronenmikroskop erzielt.
Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie.
Proben wurden in der Gegenwart von 25% Glyzerin durch Eintauchen in flüssiges Freon 22, welches durch flüssiges N₂ gekühlt wird, kryofixiert. Die gebrochene Oberfläche wird in eine Richtung mit Platin (45°) beschattet und mit Karbon (90°) bedeckt, wobei ein Balzers-Gefrier-Ätzungs-System BAF 400D (Balzers, Liechtenstein) verwendet wird. Nachbildungen wurden unter Verwendung eines JEOL-Model JEM-1200-EX-Elektronenmikroskop (Soquelec, Montreal, QC, Kanada) analysiert.
Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM).
Bläschen wurden durch den Zusatz von 1 Volumen 2%igem Osmium-Tetroxid auf 0.5 Volumen an Bläschen in HBS, gefolgt durch Zentrifugierung bei 17000 × g und 4°C für 45 Minuten, fixiert. Das sich ergebende Pellet wurde mit einem gleichen Volumen 3%iger Agarose/PBS vermischt, auf einen Mikroskopschlitten pipettiert und auf 4°C abgekühlt. Die fest gewordene Agarose, welche die Bläschen enthält, wurde in 1 mm Stücke geschnitten und in ein Glasrohr zur weiteren Verarbeitung überführt. Die Blöcke wurden für 3 × 5 Minuten mit 0.05 M Malceinsäure mit einem pH-Wert von 5.2 gewaschen, bevor sie für 1 Stunde in 2% Uranyl-Acetat gefärbt werden. Die Gewebestücke werden durch eine abgestufte Reihe von Alkoholen (50 – 100%) dehydriert, mit zunehmenden Verhältnissen von Epoxydharz (EMbed 812):Propylen-Oxid infiltriert und in 100% EMbed 812 bei 60°C für 24 Stunden eingeschlossen. Ultradünne Teile werden mit 2% Blei-Citrat verdünnt und unter Verwendung eines Zeiss-EM-10C-Transmissions-Elektronenmikroskops (Oberkochen, Deutschland) untersucht.
Phasenkontrast- und Fluoreszenz-Mikroskopie.
Phasenkontrast- und Fluoreszenz-Mikroskopie werden an einem Zeiss-Axiovert-100-Mikroskop unter Verwendung eines Plan-Apochromat 63x/1.4NA-Ölkapselungsobjektives in Verbindung mit einer 1.6x-Optovarlinse und einem XF100-Filtersatz von Omega Optical (Brattleboro, Vermont) mit den folgenden optischen Angaben durchgeführt: Anregung 475 ± 20/Dichromatisch 500/Emission 535 ± 22.5. Bilder werden auf einem Kodak-Ektachrome-P1600-Farbumkehrfilm bei 1600 ISO mit einer Zeiss-MC80DX-Mikroskopkamara aufgenommen. Schlitten und Abdeckgläser werden mit Dichlordimethylsilan siliziert, um die ansonsten negativ geladene Glasoberfläche zu neutralisieren.
Beispiel 1
Leere vorgebildete Bläschen wurden aus einer Lipidmischung, welche PEG-CerC14, DODAP, DPSC und CHOL in einem molaren Verhältnis von 5:25:25:45 enthalten, hergestellt. Die vier Lipide wurden in 100% Ethanol auf eine Gesamt-Lipid-Konzentration von 25 mg/ml (33 mM) gelöst. Das ethanolische Lipid wurde dann durch eine Injektionsöffnung mit einem Öffnungsdurchmesser von 0.25 mm in einen Behälter mit 300 mM Citrat-Puffer bei einem pH-Wert von 4.0 eingeführt. Der Behälter und alle Lösungen besassen Raumtemperatur. Das Gesamtvolumen eines ethanolischen Lipids betrug 6 Liter und die Fliessrate für Lipideinführung betrug 200 bis 300 ml pro Minute. Das Gesamtvolumen eines Citrat-Puffers betrug 9 Liter. Die sich ergebende 15 Liter-Mischung wies eine Ethanol-Konzentration von 40% und 180 mM Citrat auf. Bläschen mit einem mittleren Durchmesser von 170 ± 20 nm wurden erzeugt. Die leeren vorgeformten Bläschen wurden auf einen mittleren Durchmesser von 90 – 120 nm vergrössert, in dem sie 1 – 3 Durchläufe durch den Extrusionskreislauf (65°C) bei geringem Druck (100 p.s.i., reduziert von den klassischen 500 – 1000 p.s.i.) unter Verwendung von zwei gestapelten 80 nm-Membranen durchliefen. Die leeren vorgebildeten Bläschen wurden dann in einem Behälter 20 vereinigt und bei 40°C bis zu einer Zugabe einer therapeutischen Wirkstofflösung beibehalten.
Beispiel 2
Vorgebildete Bläschen nach Beispiel 1 werden verwendet, um vollständig in Lipid verkapselte therapeutische Wirkstoffpartikel unter Verwendung von Oligonukleotid INX-6295 (Seq. ID Nr. 1) als den therapeutischen Wirkstoff herzustellen. Oligonukleotid INX-6295 in destilliertem Wasser wurde durch den Zusatz von 100% Ethanol verdünnt, um verschiedene Lösungen von 10, 20, 30, 40 oder 50 mg/ml Oligonukleotid in 40% Ethanol zu bilden. Das ethanolische Oligonukleotid wurde den vorgebildeten Bläschen in einem Behälter 20 bei 40°C unter Rühren hinzugefügt. Die Menge und das Volumen an ethanolischem Oligonukleotid wurde errechnet, um ein endgültiges Arzneimittel:Lipid-Verhältnis von 0.1 bis 0.25 nach Gewicht zu ergeben. Die Mischung wurde dann bei 40°C durch leichtes und periodisches Rühren für eine Stunde inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Lösung durch Diafiltration, um verbundene Oligonukleotide frei zu strippen oder zu entfernen, weiter behandelt, Ethanol entfernt und das Puffersystem mit Phosphat gepuffertem Salin (PBS) mit einem pH-Wert von 7.4 ausgetauscht. Konzentration, sterile Filtrierung und Verpacken vollenden die Herstellung eines kommerziellen Produktes.
Beispiel 3
Das Verfahren von Beispiel 2 wurde mit Veränderungen verschiedener Parameter wiederholt, um zu bestimmen, welcher bei der Herstellung von vollständig in Lipid verkapselten therapeutischen Wirkstoffpartikeln gemäss der Erfindung kritisch sein könnte. Bei diesen Versuchen wurden die gesamte Oligonukleotid-Gewinnung (Ausbeute), die gesamte Lipid-Gewinnung (Ausbeute) und die Verkapselungsfähigkeit als Hinweise der Qualität des Produktes und des Verfahrens betrachtet. Die gesamte Oligonukleotid-Gewinnung wurde unter Verwendung folgender Formel errechnet:
Die Verkapselungs-Fähigkeit (E.E.) wurde unter Verwendung der Formel errechnet:
Der Prozentsatz an Oligo, welches verkapselt ist (d.h., integriert in Doppelschichten oder eingeschlossen in dem Inneren des Lipidpartikels), wurde mit der oben beschriebenen OliGreen-Pobe bestimmt.
Um die Bedeutung des anfänglichen Arzneimittel-Lipid-Verhältnisses zu beurteilen, wurde der Versuch mit zwei unterschiedlichen Start-Verhältnissen geführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Es wurde keine Änderung bei der Grösse der Bläschen bei dem Verfahren des Ladens des Oligonukleotids beobachtet.
Tabelle 1
Um die Bedeutung der Inkubationstemperatur zu beurteilen, wurde der Versuch bei Raumtemperatur und bei zwei erhöhten Temperaturen für eine Stunde geführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Wie dargestellt, beginnt die höhere Temperatur von 60°C die Wirksamkeit des Verfahrens zu beeinträchtigen und zu einem Anstieg der Partikelgrösse zu führen. Somit werden die unteren Temperaturen bevorzugt.
Tabelle 2
Um die Bedeutung der Inkubationszeit zu beurteilen, wurde der Versuch bei drei Inkubationszeiten und einer Inkubationstemperatur von 40°C geführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Wie dargestellt, verbessert sich die Ausbeute zwischen 0.5 Stunden und einer Stunde, jedoch führt eine Erhöhung der Inkubationszeit über ein Stunde hinaus zu keiner bedeutenden Verbesserung. Somit wird das wirksamste Verfahren bei der verwendeten Vorrichtung eine Inkubationszeit von ungefähr einer Stunde anwenden.
Tabelle 3
Um die Bedeutung der Pufferkonzentration in der Oligonukleotid-Lösung zu beurteilen, wurde der Versuch bei vier unterschiedlichen Konzentrationen von Citrat-Puffer und eines anfänglichen Arzneimittel/Lipid-Verhältnisses von 0.1 geführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
Tabelle 4
Um die Bedeutung der anfänglichen Ethanol-Konzentration während des Mischungsschrittes zu beurteilen, wurde der Versuch mit drei unterschiedlichen anfänglichen Ethanol-Konzentrationen bei jedem von zwei anfänglichen Arzneimittel/Lipid-Verhältnissen geführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Dies erscheint eine optimale Ethanol-Konzentration zu sein, welche für jedes Start-Oligo/Lipid-Verhältnis unterschiedlich ist. Bei einem zusätzlichen Versuch, welcher nicht in der Tabelle angezeigt ist, wurde eine anfängliche Ethanol-Konzentration von 50% bei einem Oligo/Lipid-Verhältnis von 0.1 verwendet. Bei diesem Versuch wurde auf bedeutende Probleme unbekannter Ursache gestossen und es wurde kein Produktgewinn erzielt.
Tabelle 5
Um die Bedeutung der anfänglichen Oligonukleotid-Konzentration (und damit des Volumens der therapeutischen Wirkstoff-Lösung, um dasselbe anfängliche Arzneimittel-Lipid-Verhältnis zu erhalten) zu beurteilen, werden Vorratslösungen bei vier unterschiedlichen Konzentrationen eines Oligonukleotids verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 zusammengefasst. Wie dargestellt, scheint dieser Parameter für die Ergebnisse, welche unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung erzielt wurden, nicht kritisch zu sein.
Tabelle 6
Beispiel 4
Um die Anwendbarkeit der Erfindung auf grössere therapeutische Wirkstoffe zu zeigen, wurde Plasmid pINEX L1018, ein 5.5 kb-Plasmid, welches das Luziferase-Gen, welches mit einem CMV-Förderer verbunden ist, verschlüsselt und auch SV40-Verstärkerelemente und ein AmpL-Gen beinhaltet, in die vorgebildeten Lipidbläschen geladen.
Vorgebildete Lipidbläschen wurden durch langsames Hinzufügen von 10 mg Lipiden (DSPC/Chol/DODAP/PEG-CerC14 in einem 20/45/25/10 mol%-Verhältnis), welche in 100% Ethanol zu 25 mM Citrat-Puffer (25 mM Zitronensäure, 255 mM Saccharose, mit Natrium-Hydroxid auf einen pH-Wert von 4 eingestellt) gelöst wurden, hergestellt. Beide Lösungen wurden vor dem Mischen auf 40°C vorgewärmt. Die endgültige Ethanol-Konzentration betrug 40% (v/v). Die ethanolische Verteilung von Lipidbläschen wurde zweimal durch zwei gestapelte 100 nm Polykarbonat-Filter bei Raumtemperatur extrudiert. 0.25 mg Plasmid-DNA in 40% Ethanol wurde den Lipidbläschen bei Raumtemperatur hinzugefügt, gefolgt von einer Stunde Inkubation der Probe bei 40°C. Das anfängliche Plasmid/Lipid-Verhältnis betrug 0.025. Anschliessend wurde die Probe gegen 2 L von 25 mM Salin mit einem pH-Wert von 7.5 (20 mM HEPES, 150 mM NaCl) für insgesamt 18 bis 20 Stunden dialysiert.
Die Einschlusswirkung wurde nach einem Entfernen von verbleibender, äusserer Plasmid-DNA durch Anionenaustauschchromatographie an einer DEAE-Sepharose-CL6B-Säule bestimmt. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des DNA-Bindungs-System-PicoGreen-Lipids durch eine anorganische Phosphat-Probe gemäss Fiske und Subbarrow nach Trennung von dem Plasmid durch eine Bligh-Dyer-Extraktion quantifiziert. Ausserdem wurde die endgültige Lipid-Konzentration durch Einschluss von 0.25 mol% des fluoreszierend gekennzeichneten Lipids Lissamin-Rhodamin-PE in die Lipidbläschen bestimmt.
Das endgültige Plasmid-Lipid-Verhältnisses betrug 0.022, was einem Einschluss von 88% entspricht. Die sich ergebenden, in Lipid verkapselten therapeutischen Wirkstoffpartikel wiesen eine durchschnittliche Grösse von 100 nm und eine sehr geringe Grössen-Verteilung auf.
Beispiel 5
Liposomen-Herstellung:
Grosse einlamellare Liposome in Ethanol/Puffer-Lösungen wurden entweder durch Hinzufügen von Ethanol zu extrudierten Liposomen oder durch Hinzufügen von Lipiden, welche in Ethanol zu einer wässrigen Puffer-Lösung gelöst wurden, und anschliessende Extrusion hergestellt. Beide Verfahren führen zu denselben Einschlussergebnissen und werden im folgenden detaillierter beschrieben:

1. Nach einer Dehydrierung eines Lipidfilms in einem Citrat-Puffer mit einem pH-Wert von 4 und fünf Gefrier/Tau-Zyklen wurden LUVs mittels Extrusion durch zwei gestapelte 100 nm Filter (10 Durchläufe) erzeugt. In dem Fall von DODAP/DSPC/Chol/PEG-CerC14-Liposomen wurde die Extrusion bei 60°C durchgeführt. Anschliessend wurde Ethanol unter schnellem Rühren langsam hinzugegeben. Typische Liposomgrössen, welche nach einem Entfernen von Ethanol durch dynamisches Lichtstreuen bestimmt wurden, betrugen 90 ± 20 nm für das DODAP/DSPC/Chol/PEG-CerC₁₄-System. Langsames Hinzufügen von Ethanol und schnelles Rühren sind wichtig, da Liposome instabil werden und sich zu grossen Lipidstrukturen verbinden, sobald die Ethanol-Konzentration eine gewisse obere Grenze übersteigt. Das letztere hängt von der Lipid-Zusammensetzung ab. Beispielsweise wird eine anfänglich lichtdurchlässige DSPC/Chol/PEG-CerC₁₄/DODAP-Liposom-Verteilung milchig weiss, wenn die Ethanol-Konzentration 50% (v/v) übersteigt.
2. LUVs werden durch langsames Hinzufügen der Lipide hergestellt, welche in Ethanol (0.4 ml) zu Citrat-Puffer bei einem pH-Wert von 4 (0.6 ml) gelöst wurden, gefolgt von einer Extrusion durch zwei gestapelte 100 nm Filter (zwei Durchläufe) bei RT. Dynamische Lichtstreuungs-Messungen, welche in Ethanol und nach Entfernen von Ethanol durch Dialyse durchgeführt wurden, zeigen keine bedeutenden Grössenunterschiede, welche typischerweise 75 ± 18 nm betragen. Der Extrusionsschritt kann ausgelassen werden, wenn Ethanol sehr langsam unter kräftigem Rühren hinzugefügt wird, um örtlich hohe Ethanol-Konzentrationen zu vermeiden.

Einschlussverfahren:
Eine Oligonukleotid-Lösung wurde langsam unter Verwirbelung der ethanolischen Liposom-Verteilung hinzugegeben, welche anschliessend bei der geeigneten Temperatur für eine Stunde inkubiert, für zwei Stunden gegen Citrat-Puffer dialysiert wurde, um das meiste Ethanol zu entfernen, und zweimal gegen HBS (20 mM HEPES/145 mM NaCl, pH-Wert 7.5). Bei einem pH-Wert von 7.5 wird DODAP ladungsneutral und an der äusseren Membranoberfläche gebundene Oligonukleotide werden aus ihrer Verbindung mit dem kationischen Lipid gelöst. Unverkapselte Oligonukleotide werden anschliessend durch Anionenaustauschchromatographie an DEAE-Sepharose-CL-6B-Säulen entfernt, welche in HBS mit einem pH-Wert von 7.5 ins Gleichgewicht gebracht wurden. Wenn ein Octylglucosid anstelle von Ethanol verwendet wurde, wurde das Detergens zu Liposomen (1:1 v/v) zu endgültigen Konzentrationen in Bereichen von 30 – 40 mM hinzugefügt. All die anschliessenden Schritte wurden wie oben beschrieben durchgeführt, ausgenommen der anfängliche Dialyseschritt gegen Citrat-Puffer mit einem pH-Wert von 4, welcher auf fünf Stunden ausgedehnt wurde. Bei den folgenden Beispielen wurden, falls nichts anderes gesagt wird, DSPC/Chol/PEG-CerC₁₄/DODAP-Liposome (20:45:10:25 mol%), c-Myc (Seq. ID Nr. 1), 40% (v/v) Ethanol, 300 mM Citrat-Puffer und eine Inkubation bei 40°C angewendet.
Bestimmung von Einschlusswirkungsgraden:
Einschlusswirkungsgrade wurden snach einem Entfernen von äusseren Oligonukleotiden durch Anionenaustauschchromatographie bestimmt. Oligonukleotid-Konzentrationen wurden durch UV-Spektroskopie an einem Shimadzu-UV160U-Spektrophotometer bestimmt. Das Absorptionsvermögen bei 260 nm wurde nach einem Löslichmachen der Proben in Chloroform/Methanol bei einem Volumenverhältnis von 1:2.1:1 Chloroform/Methanol/wässriger Phase (Proben/HBS) gemessen. Falls die Lösung nach dem Mischen nicht vollständig klar war, wurden zusätzliche 50 – 100 μm an Methanol hinzugegeben. Andernfalls wurde die Absorbierung nach Auflösung der Proben in 100 mM Octylglucosid abgelesen. Die Antisense-Konzentrationen wurden gemäss: c[μg/μl] = A₂₆₀ * 1 OD₂₆₀-Einheit[μg/ml] * Verdünnungsfaktor[ml/μl] errechnet, wobei der Verdünnungsfaktor durch das Gesamtprobenvolumen [ml], geteilt durch das Probenvolumen [μl] gegeben ist. OD₂₆₀-Einheiten wurden aus paarweisen Extinktions-Koeffizienten für individuelle Deoxynukleotide errechnet, welche nächste Nachbar-Interaktionen berücksichtigen. 1 OD entspricht 30.97 μg/ml c-Myc (Seq. ID Nr. 1), 33.37 μg/ml h-ICAM-1 (Seq. ID Nr. 2) und 34 μg/ml EGFR (Seq. ID Nr. 3). Lipid-Konzentrationen wurden durch die anorganische Phosphor-Probe nach Trennung der Lipide von den Oligonukleotiden durch eine Bligh-und-Dyer-Extraktion (Bligh und Dyer, 1959) bestimmt. Kurz, zu 250 μl wässriger Phase (Probe/HBS) wurden 525 μl Methanol und 250 μl Chloroform hinzugefügt, um ein durchsichtige, einzelne Phase (wässrige Phase/Methanol/Chloroform 1:2.1:1 vol) zu bilden. Falls die Lösung nicht durchsichtig war, wurde ein gleiches Volumen an Chloroform hinzugegeben. Die Proben wurden gemischt und für 5 – 10 Minuten bei 3000 rpm zentrifugiert. Dies führte zu einem durchsichtigen Zwei-Phasen-System. Die Chloroform-Phase wurde auf phospholipiden Inhalt gemäss dem Verfahren von Fiske und Subbarrow (1925) überprüft. Falls nichts anderweitiges gesagt ist, werden Einschlusswirkungsgrade als Oligonukleotid-Lipid-Gewichtsverhältnisse (w/w) ausgedrückt.
Beispiel 6
Den Verfahren von Beispiel 5 folgend, werden den 100 nm DSPC/Chol/DODAP-Liposomen (nicht modifiziertes Lipidbestandteil), welche durch Extrusion hergestellt wurden, steigende Mengen an Ethanol hinzugefügt. Alle Proben wurden sofort nach Zugabe eines Oligonukleotids milchig weiss, was eine Oligonukleotid induzierte Aggregation anzeigte. Der Inkubation mit Antisense-Oligonukleotiden bei einem molaren ODN/Lipid-Verhältnis von 0.035 bei einem pH-Wert von 4 folgend, wurden Ethanol und uneingeschlossene Oligonukleotide entfernt. Tabelle 7 listet Verkapselungswirkungsgrade, wie sie durch dynamische Lichtstreuung bestimmt wurden, zusammen mit den endgültigen Grössen der sich ergebenden multilamellaren Bläschen auf. Zunehmend mehr Antisense-Oligonukleotide werden eingeschlossen, da die Ethanol-Konzentration ansteigt. Der begleitende Anstieg der Grösse und der Polydispersität reflektiert eine fortlaufende Neuorganisation der LUVs in grössere Lipid-Strukturen, welche vorwiegend grosse, multilamellare Liposome zu sein scheinen. Es sollte beachtet werden, dass aufgrund der Grösse dieser Systeme einige der Lipide an der Anionenaustauschsäule verloren gehen, welche verwendet wurde, um äussere, uneingeschlossene Oligonukleotide zu entfernen. Die herausgelöste Fraktion entspricht ungefähr 50 – 60% des gesamten Lipids. Bei Ethanol-Konzentrationen von 40% und höher werden die anfänglichen Liposome instabil und verschmelzen, um eine milchig weisse Verteilung zu formen.
Tabelle 7
Diese Ergebnisse zeigen, dass Ethanol die Lipidmembranen für strukturelle Neuordnungen anfällig macht, was zu einem Einschluss des Oligonukleotids zwischen den konzentrischen Lamellen der multilamellaren Liposome führt. Jedoch kann die Grösse der sich ergebenen Liposome nicht leicht kontrolliert werden.
Beispiel 7
Liposome werden hergestellt, wobei sie 2.5 bis 10 mol% eines modifizierten Lipids (PEG-Cer) enthielten, und unter Verwendung der Protokolle der Beispiele 5 und 6 getestet. In jedem Fall fand der Abfall der PEG-Cer-Konzentration bei einem Anstieg der DSPC-Niveaus statt. Es wurde festgestellt, dass die Aufnahme des modifizierten Lipids in die Liposome eine Regulierung der endgültigen Grösse der Antisense enthaltenden Liposome ermöglicht. Die Liposome waren bei höheren Ethanol-Konzentrationen stabiler in der Gegenwart von PEG-Cer als in seiner Abwesenheit. Die Verteilungen blieben optisch durchsichtig in 40% Ethanol, obwohl eine leichte Zunahme der Trübe für die Probe bemerkt wurde, welche 2.5 mol% PEG-Cer enthielt. Die gesteigerte Stabilität spiegelt sich auch in den höheren Mengen Ethanol wieder, welche für einen sich zu ereignenden Einschluss (Tabelle 8, 2) erforderlich sind. 2 stellt Verkapselungswirkungsgrade als eine Funktion einer Ethanol-Konzentration für Liposome dar, welche 10 mol% PEG-Cer enthalten. Ein maximaler Einschluss wurde bei 40% Ethanol erreicht und Ethanol-Konzentrationen über 25% (v/v) (> 4.3 M) waren für einen sich zu ereignenden Einschluss erforderlich. In der Abwesenheit von Ethanol wurde kein Einschluss festgestellt. Tabelle 8 listet Einschlusswirkungsgrade und Grössen auf, welche durch dynamische Lichtstreuung als eine Funktion des PEG-Cer-Inhaltes (2.5-10 mol%) bei den Minimum- und Maximum-Ethanol-Konzentrationen bestimmt wurden, welche aus 2 bestimmt wurden. Die Grössen der anfänglich ausgestossenen Liposome sind in Klammern gegeben. Die Menge an Ethanol, welche für einen sich zu ereignenden Einschluss erforderlich sind, hängen von dem PEG-Cer-Inhalt der Liposome ab. Liposome, welche 2.5 mol% PEG-Cer enthielten, schlossen ungefähr 15% der Oligonukleotide bei 25% Ethanol und 45% in der Gegenwart von 40% Ethanol ein. Im Gegensatz dazu wurde ein Einschluss bei 10 mol% PEG-Cer in der Gegenwart von 25% Ethanol (≤5%) nahezu aufgehoben und betrug 60% bei 40% Ethanol. In allen Fällen betrug das anfängliche Oligonukleotid-Lipid-Verhältnis 0.037 (mol/mol). Einschlusslevel stiegen von 45% auf beinahe 60% bei 40% Ethanol an, wenn der PEG-Cer-Inhalt von 2.5 auf 10 mol% erhöht wurde. Liposomengrösse und – Polydispersität fielen von 131 ± 40 nm auf 100 ± 26 nm ab.
Tabelle 8
Beispiel 8
Die störende Auswirkung von Ethanol auf Lipidmembranen wurde hauptsächlich bei geringen Ethanol-Konzentrationen (<15% v/v) in Bezug auf Veränderungen der Lipid-Hydratation, der Akyl-Ketten-Reihenfolge, der Membrandurchlässigkeit für kleine Ionen und der Induktion von Kettenverzahnung in DPPC-Systemen studiert (Slater und Huang, 1988; Barchfeld und Deamer, 1988; Schwichtenhovel et al. 1992; Slater et al., 1993; Barry und Gawrisch, 1994; Vierl et al., 1994; Lobbecke und Cevc, 1995; Komatsu und Okada, 1996; Holte und Gawrisch, 1997). Es war logisch, zu fragen, ob Liposome bei den hohen Ethanol-Konzentrationen, welche für einen Einschluss erforderlich sind, noch immer unbeschädigt sind. 3A stellt die Freigabe von Calcein, welches mit selbstvermindernden Konzentrationen bei DSPC/Chol/PEG-CerC₁₄/DODAP-Liposomen eingeschlossen wurde, als eine Funktion der Ethanol-Konzentration (geschlossene Kreise) zusammen mit den Verkapselungswirkungsgrades dar, welche unter Verwendung von Liposomen derselben Lipid-Zusammensetzung (offene Kreise) erhalten wurden. Sowohl die Verkapselungs-, als auch die Leckage-Versuche werden bei 40°C durchgeführt. Eine Leckage von Calcein, einem kleinen Molekül mit einem MW von 623, beginnt bei ≥30% Ethanol und erreicht ein Maximum um 40% Ethanol. Der Oligonukleotid-Einschluss zeigt eine ähnliche Ethanol-Abhängigkeit, welche zeigt, dass der Einschluss mit der Destabilisierung der Durchlässigkeitssperre der liposomalen Membran sehr korreliert ist. Im Vergleich zu Calcein betrug die Freigabe von FITC-Dextran (MW 19500) weniger als 10% in 40% Ethanol. Dies zeigt, dass der Verlust der Durchlässigkeitssperre MW-abhängig ist, wie das auch für Detergens, wie beispielsweise Octylglucosid, angezeigt wurde (Almog et al., 1990). Die Liposome behielten ihre Morphologie in der Gegenwart von 40% Ethanol bei. Phasen-Kontrast-Mikroskopie von Riesen-Liposomen in 40% Ethanol enthüllten auch unbeschädigte liposomale Strukturen.
Lipide sind auch in der Lage, schnell zwischen Liposomen und zwischen den inneren und äusseren Monoschichten der Lipid-Doppelschichten zu wechseln, welche die Liposome umfassen. Wie in 3B gezeigt, wurde das Mischen eines Lipids, wie durch die NBD-PE/LRh-PE FRET-Probe festgestellt, unmittelbar in 40% Ethanol wirksam. Es wurde kein Anstieg der Bläschengrösse beobachtet, welcher anzeigt, dass das Mischen eines Lipids von schnellem Lipid-Wechsel zwischen Liposomen eher als von Liposom-Verschmelzung herrührt. Die in 3B gezeigten Ergebnisse zeigen auch, dass Lipide in der Lage sind, schnell von einer Seite der liposomalen Lipid-Doppelschicht auf die andere zu wandern (flip-flop), wie durch den Verlust an Fluoreszenz von NBD-PS, welches in der äusseren Lipid-Monoschicht nach einer chemischen Reduktion mit Natrium-Dithionit angeordnet ist, gezeigt.
Beispiel 9
Die Zunahme der Trübung nach Verkapselung zeigt, dass einem Einschluss ein anfänglicher Aggregationsschritt (Bildung von Mikroaggregaten) vorausgegangen ist. Der Aggregationsschritt und der Einschluss können bei geringen Temperaturen entkoppelt werden. Proben werden bei oder kurz nach Zugabe eines Oligonukleotids trüb und die Trübung nimmt mit der Zeit zu. In der Abwesenheit von Ethanol gibt es nur eine leichte Zunahme der folgenden Trübung, deren Lichtdurchlässigkeit konstant bleibt. Im Vergleich zu Proben, welche bei 40°C hergestellt wurden, werden Proben, welche bei 4°C inkubiert wurden, wieder durchsichtig, wenn Ethanol entfernt wird und Liposome kein Oligonukleotid einschliessen. Einschlusswirkungsgrade werden als eine Funktion von Temperatur in 4 zusammen mit Calcein-Leckage-Daten dargestellt. Leckagedaten werden als die Ethanol-Konzentrationen vorgestellt, welche erforderlich sind, um 50%ige Calcein-Freigabe zu veranlassen. Es gibt wiederum eine qualitative Beziehung zwischen der Destabilisierung der liposomalen Membran und dem Einschlusswirkungsgrad.
Beispiel 10
³¹P-NMR kann verwendet werden, um Oligonukleotid-Einschluss zu untersuchen. Die 5A und 5B zeigen ³¹P-NMR-Spektren von c-Myc in Lösung (5A) und eingeschlossen in DODAP/DSPC/Chol/PEG-CerC₁₄-Liposomen (5B). Zunächst zeigen die Liposome einen transmembranen pH-Gradienten dort, wo der innere pH-Wert 4 und der äussere pH-Wert 7.5 beträgt. Unter diesen Bedingungen werden die eingeschlossenen Oligonukleotide fest mit der positiv geladenen, liposomalen Membran verbunden. Diese Immobilisierung führt zu dem Verschwinden (Verbreiterung) des NMR-Signals (5B). Nach Umwandlung des pH-Gradienten durch Zugabe von Ammonium-Acetat und Einstellung des äusseren pH-Wertes auf 7.5, wird das DODAP deprotoniert und die Oligonukleotide aus der liposomalen Membran dissoziiert. Dies wird durch die Wiederherstellung des NMR-Signales in 5C demonstriert. Jedoch ist die Wiedergewinnung unvollständig und beträgt ungefähr 50% des anfänglichen Signals. Die Signalschwächung liegt nicht an der NMR-Resonanzsättigung. Es kann auf zwei Möglichkeiten zurückzuführen sein: Entweder übersteigt die Menge an verkapseltem Antisense seine Löslichkeit, so dass ein Teil von ihm ausfällt, oder die Mobilität der Antisense-Moleküle ist räumlich eingeschränkt, z. B. durch Immobilisierung zwischen zwei nah gegenüberliegenden Doppelschichten (siehe 3A). Um zu bestätigen, dass die Oligonukleotide verkapselt wurden und in dem wässrigen Inneren der Chromosome lokalisiert sind, wurde der äusseren Lösung 5 mM MnSO₄ hinzugefügt (5D). Mn²⁺ ist ein Membran undurchlässiger, paramagnetischer, linienverbreiternder Wirkstoff und dämpft die Signale aller zugänglichen Phosphatgruppen, sowohl Phosphorlipide, als auch Oligonukleotide. Jedoch blieb das Oligonukleotid-Signal unbeeinflusst und verschwand nur nach einem Löslichmachen der Liposome mit OGP (5E). Das gesamte Oligonukleotid-Signal wird wiedergewonnen, wenn die anfänglichen Liposome (5B) mit OGP in der Abwesenheit von Mn²⁺ (5F) gelöst werden. Diese Daten zeigen deutlich, dass das Oligonukleotid in den Liposomen eingeschlossen ist und nicht einfach nur mit der äusseren Membran verbunden ist. Es sollte auch beachtet werden, dass eingeschlossene Oligonukleotide dem Oligonukleotid bindenden Farbstoff OliGreen nicht zugänglich waren.
Die NMR-Studien beschreiben die Wechselwirkung zwischen Oligonukleotiden und Liposomen aus der Perspektive der Oligonukleotide. Veränderungen der Lipid-Dynamiken und des Membranaufbaus können mit Pyren gekennzeichneten Lipiden (Duportail und Lianos, 1996) untersucht werden. Pyren gekennzeichnete Lipide bilden Dimer in erregtem Zustand bei hohen Konzentrationen, welche bei einer unterschiedlichen Wellenlänge als die Monomere fluoreszieren. Excimer-Bildung ist ein diffusionsgesteuertes Verfahren und erfordert das Zusammenkommen von zwei Molekülen, um einen Dimer zu formen. Das Binden der Oligonukleotide führt zu einer dramatischen Abnahme der lateralen Mobilität aller Lipidarten bezüglich Steuerungsliposomen, welche keine Oligonukleotide enthalten. Die Membran wird seitlich zusammengepresst. Dies folgt aus dem beobachteten Abfall von Excimer-Fluoreszenz von Pyren-HPC. Die Erschöpfung des transmembranen pH-Gradienten führt zu einem Anstieg der Excimer-Fluoreszenz und der Wiederherstellung von Lipid-Mobilität.
Beispiel 11
Sowohl die Grösse der Antisense einschliessenden Liposome, als auch der Einschlusswirkungsgrad hängen von dem anfänglichen Antisense-Lipid-Verhältnis ab. 6 zeigt, dass Oligonukleotide bei hohen Antisense-Lipid-Verhältnissen wirksam eingeschlossen werden können. Der Einschlusswirkungsgrad wird als eine Funktion des anfänglichen Oligonukleotid-Lipid-Verhältnisses dargestellt. Das Verbindungslevel bei maximalem Einschluss beträgt 0.16 mg Oligonukleotid pro mg Lipid (0.024 mol/mol). Dies entspricht ungefähr 2250 Oligonukleotid-Molekülen pro 100 nm Liposomen und zeigt die hohe Wirksamkeit dieses Einschlussverfahrens. Einschlusswirkungsgrade sind ungefähr drei Grössenordnungen höher, als durch aktive Verkapselung erreicht.
Nach einer Zunahme des Oligonukleotid-Lipid-Verhältnisses nehmen sowohl die Grösse, als auch die Polydispersität der Proben leicht von 70 ± 10 nm für Liposome allein bis zu 110 ± 30 für ein anfängliches ODN-Lipid-Gewichtverhältnis von 0.2 zu. Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie zeigte eine Zunahme der Anzahl grösserer Liposome mit ansteigenden anfänglichen Oligonuklotid-Lipid-Verhältnissen. Als eine Nebenbemerkung sollte beachtet werden, dass die anfängliche, lichtdurchlässige Liposom-Verteilung zunehmend trüb wird, da das Antisense-Lipid-Verhältnis zunimmt.
Beispiel 12
Es würde erwartet werden, dass die PEG-Schicht eine Bildung der sich nah gegenüberliegenden Membranen, welche für die multilamellaren Strukturen durch ein TEM beobachtet wurden, verhindern würde. Das Schicksal von PEG-Cer wurde deshalb unter Verwendung von radioaktiv gekennzeichnetem PEG-CerC₁₄ untersucht. Antisense-Oligonukleotide wurden in Liposomen verkapselt, welche Spuren von [³H]-PEG-CerC₁₄ zusätzlich zu 10 mol% ungekennzeichneten PEG-CerC₁₄ und [¹⁴C]-Cholesterol-Hexadecylester (CHE) als ein Cholesterin-Markierer bei einem [³H]/[¹⁴C]-Verhältnis von 5.9 enthielten. Dieses Verhältnis stellt ein offensichtliches PEG-Cer/chol-Verhältnis dar und wird anstelle des molaren PEG-Cer/chol-Verhältnisses verwendet. Das anfängliche Antisense-Lipid-Gewichtsverhältnis betrug 0.29. Ein Einschluss führte zu einem endgültigen Antisense-Lipid-Verhältnis von 0.16. Freie PEG-Cer- und PEG-Mizellen wurden durch Ultrazentrifugieren unter Verwendung eines Saccharose-Stufengradienten (1%, 2.5%, 10%, 15% (w/v) Saccharose in HBS) getrennt. Leere Liposome verbanden sich an der Übergangsstelle zwischen 2.5% und 10% Saccharose mit einem ofensichtlichen PEG-Cer/chol-Verhältnis von 5.5. Diese Verbindung machte ungefähr 80% des gesamten Lipids aus. Die Antisense enthaltenden Liposome zeigen ein schwaches Band an derselben Stelle, welches weniger als 9% des gesamten Lipids entspricht. Jedoch wandert das meiste des liposomalen Antisenses zu der 15%-Saccharose-Schicht oder -Pellets am Boden hinunter. Eine vollständige Analyse der Liposome enthaltenden Fraktionen des Gradienten wird in Tabelle 9 dargestellt. Die Ergebnisse sind repräsentativ für Proben, welche bei hohen Oligonukleotid-Lipid-Verhältnissen hergestellt wurden. Es kann gesehen werden, dass die relativen PEG-Cer/chol-Verhältnisse in Richtung des Grundes des Gradienten stufenweise abnehmen. Mehr als 50% des PEG-Cer ist von dem am Boden befindlichen Fraktion bezogen auf die anfänglichen Liposome verloren (offensichtliches PEG-Cer/chol-Verhältnis von 5.5). Das DSPC/Chol-Verhältnis verändert sich nicht. 27% des PEG-Cer kann in den oberen Fraktionen zusammen mit 6.6% Cholesterin festgestellt werden. Ungefähr dieselbe Menge von nicht mit einem Liposom verbundenem PEG-Cer wurde für die leeren Steuerungsliposome festgestellt.
Weitere Analysen der Fraktionen des oben genannten Gradienten zeigen, dass die Antisense enthaltenden Liposome grosse Unterschiede bei ihrem Antisense-Inhalt und ihrer Grösse zeigen (Tabelle 9). Die Oligonukleotid-Lipid-Verhältnisse als auch die durchschnittliche Grösse nehmen von oben nach unten zu. Drei Hauptpopulationen können als eindeutige Banden identifiziert werden (Tabelle 10). Ihre relativen Proportionen hingen von dem anfänglichen Oligonukleotid-Lipid-Verhältnis ab (Tabelle 10). Erstens, Liposome, welche Antisense bei einem geringen ODN/Lipid-Verhältnis (0.03–0.05) einschliessen. Zweitens, Liposome mit einem ODN/Lipid-Verhältnis von 0.14 – 0.15 und schliesslich Liposome mit sehr hohen ODN/Lipid-Verhältnissen (0.29 mg/mg). Der letztere Bestand nimmt zugunsten der ersten beiden mit abnehmendem anfänglichen ODN/I-Verhältnis ab. Es ist optisch trüb, wo hingegen die anderen beiden lichtdurchlässig sind. Es wurde versucht, die beobachteten Unterschiede beim Einschluss und der Grösse mit der morphologischen Heterogenität in Beziehung zueinander zu setzen, welche durch das Kryo-TEM gesehen wurden. Antisense wurde bei einem hohen anfänglichen Oligonukleotid-Lipid-Verhältnis (0.28 mg/mg) eingeschlossen und die beiden Hauptfraktionen, welche den Fraktionen 15 und 17 in Tabelle 10 entsprechen, wurden durch das Kryo-TEM nach Entfernen von Saccharose durch Dialyse betrachtet. Die obere Fraktion besteht ausschliesslich aus bilamellaren Liposomen, von denen manche Ausbuchtungen zeigen, wohingegen die Bodenfraktion eine Mischung aus bi- und multilamellaren Liposomen enthielt.
Tabelle 9
Tabelle 10
Beispiel 13
Das Hinzufügen von Oligonukleotiden zu kationischen Liposomen in der Gegenwart von Ethanol kann Domänenbildung zur Folge haben. Der Bildung der erkannten multilamellaren Liposome muss durch Liposom-Adhäsion vorausgegangen werden. Jedoch verhindern 10 mol% PEG-Cer Adhäsion in der Abwesenheit von Ethanol vollständig. In der Gegenwart von Ethanol könnten zwei Auswirkungen zu einer Liposom-Adhäsion beitragen: Erstens die Zunahme der Menge an nicht in einer Membran eingeschlossenem PEG-Cer durch schnellen Lipidaustausch und zweitens die Bildung von kleinen Domänen, welche in PEG-Cer verdünnt und in Antisense-Oligonukleotiden angereichert sind. Die letztere Möglichkeit wurde untersucht. Die Auswirkung einer Oligonukleotid-Bindung wurde durch Phasen-Kontrast- und Fluoreszenz-Mikroskopie unter Verwendung von Riesen-DSPC/Chol/DODAP/PEG-CerC₁₄-Liposomen in Verbindung mit FITC gekennzeichneten Oligonukleotiden sichtbar gemacht. Die meisten der beobachteten Liposome waren multilamellar und stellten eine innere Struktur dar. In der Abwesenheit von Ethanol verfielen die Riesen-Liposome nach Zugabe von Antisense in unregelmässig geformte Aggregate und kleine Liposome. Die grüne FITC-Fluoreszenz deckte die Lage der Oligonukleotide auf. Ein vollständig unterschiedliches Bild wird in der Gegenwart von 40% Ethanol dargestellt. Die anfänglich runden Liposome nehmen 5–10 Minuten nach Zugabe eines Oligonukleotide eine birnenförmige Form an, wobei sich die Oligonukleotide in einem Halbkreis an einer Seite dieser Strukturen befinden. Die inneren Membranen sind aus diesem Hufeisen ausgedrückt, welches, insbesondere nach Erhöhung der Temperatur, abnimmt und in eine kompakte, leicht unregelmässige Struktur kollabiert, welche in Fluoreszenz vollständig grün erscheint. Die Ausscheidung der Oligonukleotide zeigt, dass Ethanol in der Lage ist, Domänenbildung anzuregen.
Beispiel 14
Das Verkapselungsverfahren der Erfindung hängt weder von einem bestimmten Oligonukleotid oder eine Lipid-Zusammensetzung ab, noch ist sie auf die verwendeten, hohen Citrat-Konzentrationen beschränkt. Verkapselung ist in 50 mM Citrat-Puffer am wirksamsten und nimmt bei höheren, als auch bei geringeren Citrat-Konzentrationen ab. Die Grösse und Polydispersität nehmen bei Citrat-Konzentrationen unter 25 mM beträchtlich zu. 7 zeigt, dass sowohl andere Oligonukleotide als c-Myc (Seq, ID Nr. 1), als auch Plasmid-DNA wirksam in DSPC/Chol/DODAP/PEG-CerC₁₄-Liposomen eingeschlossen werden können. Das anfängliche Oligonukleotid-Lipid-Gewichtsverhältnis betrug 0.1 mg/mg, und 300 mM Citrat-Puffer wurden für einen Oligonukleotid-Einschluss verwendet. Der pDNA-Einschluss wurde in 50 mM Citrat-Puffer bei einem pDNA-Lipid-Gewichtsverhältnis von 0.03 durchgeführt. Ungleiche auf Phosphorothioat-Antisense-Oligonucleotide-Phosphodiester basierende Moleküle können bei Puffern mit hoher ionischer Stärke, wie beispielsweise 300 mM Citrat-Puffer, nicht verkapselt werden. Dies spiegelt wahrscheinlich Unterschiede der Bindungs-Neigungen (Semple et al., 2000) wieder. Im Vergleich zu der wirksamen Verkapselung grosser Moleküle könnten weniger als 10% ATP in DSPC/Chol/DODAP/PEG-CerC₁₄-Liposomen bei einem anfänglichen ATP-Lipid-Verhältnis von 0.2 mg/mg eingeschlossen werden. Der ATP-Einschluss wurde in 50 mM Citrat-Puffer durchgeführt. Tabelle 5 stellt dar, dass das Einschlussverfahren auf andere Lipid-Zusammensetzungen, einschliesslich DOPE-Systeme, erweitert werden kann. Vorläufige Ergebnisse mit negativ geladenen Liposomen und positiv geladenen Polyelektrolyten, welche Polylysine enthalten, zeigen, dass ein Einschluss ein wesentliches Merkmal der Wechselwirkung von Polyelektrolyten mit entgegensetzt geladenen Liposomen in Ethanol ist.
Beispiel 15
Octylglucosid (OGP) wurde anstelle von Ethanol verwendet. Das Detergens wurde zu Liposomen (1:1 v/v) zu endgültigen Konzentrationen im Bereich von 30 – 40 mM hinzugeben. All die folgenden Schritte wurde, wie im Beispiel 5 beschrieben, durchgeführt, ausgenommen des anfänglichen Dialyse-Schrittes gegen Citrat-Puffer mit einem pH-Wert von 4, welcher auf 5 Stunden ausgedehnt wurde. Das Oligonukleotid wurde gezeigt, um vor dem von aussen hinzugegebene OliGreen, ein fluoreszierendes, Oligo bindendes Färbemittel, geschützt zu werden. Das anfängliche Oligonukleotid-Lipid-Verhältnis betrug 0.23 (mg/mg). Grössen repräsentieren der Anzahl nach entsprechend durchschnittliche Grössen. DSPC/Chol/DODAP/PEG-CerC₁₄ (20/45/25/10 mol%). Die beobachteten Level der Verkapselung und der endgültigen Partikelgrösse sind in Tabelle 11 zusammengefasst.
Tabelle 11
Referenzen:

Albersdorfer, A., T., Feder, and E., Sackmann. 1997. Adhesion-induced domain formation by interplay of long-range repulsion and short-range attraction force: a model membrane study. Biophys. J. 73, 245–57.
Almog, S., B. J., Litman, W., Wimley, J., Cohen, E. J., Wachtel, Y., Barenholz, A., Ben-Shaul, D., Lichtenberg. 1990. States of aggregation and phase transformations in mixtures of phosphatidylcholine and octyl glucoside. Biochemistry 29, 4582–4592.
Angelova, M. I., N., Hristova, and I., Tsoneva. 1999: DNA-induced endocytosis upon local microinjection to giant unilamellar cationic vesicles. Eur. Biophys. J. 28, 142–50.
Bailey, A. L., and P. R., Cullis. 1994. Modulation of membrane fusion by asymmetric transbilayer distributions of amino lipids. Biochemistry 33, 12573-80.
Barchfeld, G. L., and D. W., Deamer. 1988. Alcohol effects on lipid bilayer permeability to protons and potassium relation to action of general anesthetics. Biochim. Biophys. Acta 944, 40–48.
Barry, J. A., and K., Gawrisch. 1995. Direct NMR evidence for ethanol binding to the lipid-water interface of phospholipid bilayers. Biochemistry 33, 8082–88.
Bligh, E. G., and W. J., Dyer. 1959. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911–17.
Bozzola, J. J., and L. D., Russell. 1999. Electron Microscopy. Chapter 19 – Interpretation of micrographs. Jones and Bartlett Publishers, Toronto.
Chonn, A., and P. R., Cullis. 1998. Recent advances in liposome technologies and their applications for systemic gene delivery. Adv. Drug Del. Rev. 30, 73-83.
Duportail, G., and Lianos, P. (1996) Fluorescence probing of vesicles using pyrene and pyrene derivatives. In Vesicles (M. Rosoff, ed.). p. 295–366. Marcel Dekker Inc., N.Y.
Evans, E. A., and V. A., Parsegian. 1983. Energetics of membrane deformation and adhesion in cell and vesicle aggregation. Ann. N.Y Acad. Sci. 416, 13–33.
Felgner, P. L., T. R., Gadek, M., Holm, R., Roman, N. S., Chan, M., Wenz, J. P., Northrop, G. M., Ringold, and H. Danielson. 1987. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA transfection procedure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413–17.
Felgner, P. L. 1997. Nonviral strategies for gene therapy. Scientific American 276, 102–106.
Fiske, C. H., and Y., Subbarow. 1925. J. Biol. Chem. 66:325–329.
Gao, X., and L., Huang. 1995. Cationic liposome-mediated gene transfer. Gene Therapy 2, 710–722.
Gennis, R. B. 1989. Biomembranes: Molecular Structure and Function. Springer Verlag, N.Y.
Gustafsson, J., G., Arvidson, G., Karlsson, and M., Almgren. 1995. Complexes between cationic liposomes and DNA visualized by cryo-TEM. Biochim. Biophys. Acta 1235, 305–12.
Hirschbein, B. L., and K. L., Fearon. 1997. P-31 NMR spectroscopy in oligonucleotide research and development – commentary. Antisense & Nucleic Acid Drug Development 7, 55–61.
Noekstra, D. 1990. Fluorescence assays to monitor membrane fusion: potential application in biliary lipid secretion and vesicle interactions. Hepatology 12, 61S-66S.
Holte, L. L., and K., Gawrisch. 1997. Detecting ethanol distribution in phospholipid multilayers with MAS-NOESY Spectra. Biochemistry 36, 4669–74.
Huebner, S., B. J., Battersby, R., Grimm, and G., Cevc. 1999. Lipid-DNA complex formation: reorganization and fusion of lipid bilayers in the presence of DNA as observed by cryo-electron microscopy. Biophys. J. 76, 3158–3166.
Hyatt, M.A. 1981. Principles and Techniques of Electron Microscopy. Edward Arnold Publishers, London, UK.
Kachar, B., N., Fuller, and R. P., Rand. 1986. Morphological responses to calcium-induced interactions of phosphatidylserine-containing vesicles. Biophys. J. 50, 779–88.
Komatsu, N., and Okada. 1996. Ethanol-enhanced permeation of phosphaditylcholine/phosphatidylethanolamine mixed liposomal membranes due to ethanol-induced lateral phase separation. Biochim. Biophys. Acta 1283, 73–79.
Lasic, D. D. 1997a. Liposomes in Gene Delivery. Chapter 7, CRC Press, Boca Raton.
Lasic, D. D., H., Strey, M. C. A., Stuart, R., Podgornik, and P. M., Frederik. 1997b. The structure -of DNA-liposome complexes. J. Am. Chem. Soc. 119, 832-3.3.
Leckband., D. E., C. A., Helm, and J., Israelachvili. 1993. Role of calcium in adhesion and fusion of bilayers. Biochemistry 32, 1127–1140.
Lentz, B. R., W., Talbot, J., Lee, and L.-X., Zheng. 1997. Transbilayer lipid redistribution accompanies poly(ethylene glycol) treatment of model membranes but is not induced by fusion. Biochemistry 36, 2076–2083.
Lobbecke, L., and G., Cevc. 1995; Effects of short-chain alcohols on the phase behavior and interdigitation of phosphatidylcholine bilayer membranes. Biochim. Biophys. Acta 1237, 59–69.
Lipowsky, R. 1991. The conformation of membranes. Nature 349, 475–81.
Macdonald, P. M., K. J., Crowell, C. M., Franzin, P., Mitrakos, and D. J., Semchyschyn. 1998. Polyelectrolyte-induced domains in lipid bilayer membranes: the deuterium NMR perspective. Biochem. Cell Biol. 76, 452–464.
Maurer, N., A., Mori, L., Palmer, M. A., Monck, K. W. C., Mok, B., Mui, Q. F., Akhong, and P. R., Cullis. 1999. Lipid-based systems for the intracellular delivery of genetic drugs. Mol. Membr. Biol. 16, 129–140.
Mclntyre, J. C., and R. G., Sleight. 1991. Fluorescence assay for phospholipid membrane asymmetry. Biochemistry 30:11819–27.
May, S., D., Harris, and A. Ben-Shaul. 2000. The phase behavior of cationic lipid-DNA complexes. Biophys. J. 78, 1681–97.
Meyer, O., D. Kirpotin, K., Hong, B., Sternberg, J. W., Park, M. C., Woodle, and D., Papahadjopoulos. 1998. Cationic liposomes coated with polyethylene glycol as carriers for oligonucleotides. J. Biol. Chem. 273, 15621–7.
Miller, D. C., and G. P. Dahl. 1982. Early events in calcium-induced liposome fusion. Biochim. Biophys. Acta. 689, 165–9.
Mitrakos, P., and P. M., Macdonald. 1996. DNA-induced lateral segregation of cationic amphiphiles in lipid bilayer membranes as detected via ²H NMR. Biochemistry 35, 16714–22.
Needham, D., and E., Evans. 1988. Structure and mechanical properties of giant lipid (DMPC) vesicle bilayers from 20°C below to 10°C above the liquid crystal-crystalline phase transition at 24°C. Biochemistry 27, 8261–69.
Ollivon, M., O., Eidelman, R., Blumenthal, and A., Walter. 1988. Micell-vesicle transition of egg phosphatidylcholine and octyl glucoside. Biochemistry 27, 1695–1703.
Papahadlopoulos, D., W. J., Vail, K., Jacobson, and G., Poste. 1975. Cochleate lipid cylinders: formation by fusion of unilamellar lipid vesicles. Biochim. Biophys. Acta. 394, 483–91.
Radler, J. O., I., Koltover, A., Jamieson, T., Salditt, and C. R., Safinya. 1998. Structure and interfacial aspects of self-assembled cationic lipid-DNA gene carrier complexes. Langmuir 14, 4272–83.
Rand, R. P., B., Kachar, and T. S., Reese. 1985. Dynamic morphology of calcium-induced interactions between phosphatidylserine vesicles. Biophys. J. 47, 483–9.
Sackmann, E. 1994. Membrane bending energy concept of vesicle- and cellshapes and shape transitions. FEBS Let. 346, 3–16.
Safinya, C. R., E. B., Sirota, D., Roux, and G. S., Smith. 1989. Universality in interacting membranes: The effect of cosurfactants on the interfacial rigidity. Phys. Rev. Lett. 62, 1134–37.
Semple, S. C., S. K., Klimuk, T. O., Harasym, N., Dos Santos, S. M., Ansell, K. F., Wong, N., Maurer, H., Stark, P. R., Cullis, M. J., Hope, and P., Scherrer. 2000. Efficient encapsulation of antisense oligonucleotides in lipid vesicles using ionizable aminolipids: formation of novel small multilamellar vesicle structures.
Siegel, D. P., W.-J., Green, and Y., Talmon. 1994. The mechanism of lamellarto-inverted hexagonal phase transitions: a study using temperature-jump cryotransmission electron microscopy. Biophys. J. 66, 402–14.
Siegel, D. P., and R. M., Epand. 1997. The mechanism of lamellar-to-inverted hexagonal phase transitions in phosphatidylethanolamine: implications for membrane fusion mechanisms. Biophys. J. 73, 3089–3111.
Slater, S. J., C., Ho, F. J., Taddeo, M. B., Kelly, and C. D., Stubbs. Contribution of hydrogen bonding to lipid-lipid interactions in membranes and the role of lipid order: effects of cholesterol, increased phospholipid unsaturation, and ethanol. Biochemistry 32, 3714–3721.
Slater, J. L., and Huang, C.-H. 1988. Interdigitated bilayer membranes. Prog. Lipid Res. 27, 325–359.
Struck, D. K., D., Hoekstra, and R. E., Pagano. 1981. Use of resonance energy transfer to monitor membrane fusion. Biochemisry 20, 4093–4099.
Tocanne, J. F. and J., Teissie. 1990. Ionization of phospholipids and phospholipid-supported interfacial lateral diffusion of protons in membrane model systems. Biochim. Biophys. Acta 1031:111–142.
Wheeler, J. J., L., Palmer, M., Ossanlou, I., MacLachlan, R. W., Graham, M. J., Hope, P., Scherrer, and P. R., Cullis. 1999. Stabilized plasmid-lipid particles: construction and characterization. Gene Therapy 6, 271–281.
Vierl, U., L., Lobbecke, N., Nagel, and G., Cevc. 1994. Solute effects on the colloidal and phase behavior of lipid bilayer membranes: ethanoldipalmitoylphosphatidylcholine mixtures. Biophys. J. 67, 1067–1079.
Xu, Y., S. W., Hui, P., Frederick, and F. C., Szoka. 1999. Physicochemical characterization and purification of cationic liposomes. Biophys. J. 77, 341–53.

Claims

Verfahren zur Herstellung von vollständig in Lipid verkapselten therapeutischen Wirkstoffpartikeln eines geladenen therapeutischen Wirkstoffes, welches die folgenden Schritte umfasst: das Kombinieren einer Lipidzusammensetzung, welche vorgebildete Lipidbläschen, einen geladenen therapeutischen Wirkstoff und einen destabilisierenden Wirkstoff umfasst, um eine Mischung aus vorgebildeten Bläschen und therapeutischem Wirkstoff in einer destabilisierenden Lösung zu bilden, wobei die destabilisierende Lösung zur Destabilisierung der Membran der vorgebildeten Lipidbläschen wirksam ist, ohne die Bläschen zu zerstören, das Inkubieren der Mischung für eine Zeitspanne, welche ausreichend ist, um das Verkapseln des therapeutischen Wirkstoffes innerhalb der vorgebildeten Lipidbläschen zu ermöglichen, und das Entfernen des destabilisierenden Wirkstoffes, wobei die vorgebildeten Lipidbläschen ein geladenes Lipid umfassen, welches eine Ladung aufweist, die das Gegenteil zu der Ladung des geladenen therapeutischen Wirkstoffes ist, und ein modifiziertes Lipid, welches einen sterischen Sperranteil zur Kontrolle einer Aggregation aufweist, und wobei das modifizierte Lipid in den vorgebildeten Lipidbläschen in einer Menge vorhanden ist, welche wirksam ist, um die Aggregation der vorgebildeten Bläschen zu verzögern, jedoch nicht zu verhindern.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das geladene Lipid in den vorgebildeten Lipidbläschen ein kationisches Lipid umfasst und der therapeutische Wirkstoff ein anionischer therapeutischer Wirkstoff ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der therapeutische Wirkstoff ein Polynukleotid ist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei das kationische Lipid ausgesucht wird aus einer Gruppe bestehend aus: Dioleyl-N,N-Dimethylammoniumchlorid („DODAC"); N-(2,3-Dioleyloxy)Propyl)-N,N,N-Trimethylammoniumchlorid („DOTMA"); N,N-Distearyl-N,N-Dimethylammoniumbromid („DDAB"); N-(2,3-Dioleyloxy)Propyl)-N,N,N-Trimethylammoniumchlorid („DOTAP"); 3β-(N-(N',N'-Dimethylaminoethan)-Carbamoyl)Cholesterin („DC-Chol"); N-(1,2-Dimyristyloxyprop-3-yl)-N,N-Dimethyl-N-Hydroxyethylammoniumbromid („DMRIE"); kationische Liposome, welche DOTMA und 1,2-Dioleoyl-sn-3-Phosphoethanolamin („DOPE") umfassen; kationische Liposome, welche N-(1-(2,3-Dioleyloxy)Propyl)-N-(2-(Spermincarboxamido)Ethyl)-N,N-Dimethylammoniumtrifluorazetat („DOSPA") und DOPE umfassen; kationische Lipide, welche Dioktadecylamidoglycylcarboxyspermin („DOGS") in Ethanol umfassen; N-(2,3-Dioleyloxy)Propyl)-N,N-Dimethylammoniumchlorid („DODMA") und 1,2-Dioleoyl-3-Dimethylammonium-Propan („DODAP").
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Lipidzusammensetzung 10 bis 40 mol % des geladenen Lipids, 25 bis 40 mol % eines neutralen Lipids, 35 bis 55 mol % eines Sterols und 2.5 bis 10 mol eines modifizierten Lipids umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der destabilisierende Wirkstoff Ethanol ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei Ethanol in der destabilisierenden Lösung in einer Konzentration von 25 bis 40 % vorhanden ist
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der destabilisierende Wirkstoff ein Detergent ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die destabilisierende Lösung ferner 25 bis 300 mM Citratpuffer beinhaltet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Mischung bei einer Temperatur von ungefähr 40°C inkubiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das modifizierte Lipid PEG-CerC₁₄ ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die vorgebildeten Lipidbläschen folgendes umfassen: ein kationisches Lipid, ein neutrales Lipid, welches aus der Gruppe bestehend aus DOPE und DSPC ausgewählt wurde, das modifizierte Lipid und Cholesterin.