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TECHNISCHES GEBIET
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein neues, aus Panax ginseng isoliertes
Polysaccharid mit hämatopoetischen,
myeloprotektiven, Antitumor-Immunzellen-erzeugenden und radiosensibilisierenden
Wirkungen. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Herstellung
des Polysaccharids aus Panax ginseng und eine pharmazeutische Zusammensetzung
zum Verstärken
der hämatopoetischen,
myeloprotektiven, Antitumor-Immunzellen-erzeugenden und radiosensibilisierenden
Wirkungen.
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Genauer
gesagt wird das aus Panax ginseng isolierte Polysaccharid der vorliegenden
Erfindung durch ein Herstellungsverfahren erhalten, welches die
folgenden Stufen umfaßt:
i) Erhalten eines Rückstands
unter Verwendung von Methanol, ii) Extrahieren und erhalten der
wasserlöslichen
Fraktion unter Verwendung von destilliertem Wasser, iii) Erhalten
eines Präzipitats
unter Verwendung von 40%-igem Ethanol und iv) Erhalten des Polysaccharids
unter Verwendung einer Dialysemembran, v) Erhalten von 6 Fraktionen
mittels Sephacryl S-500-Gelchromatographie, vi) Reinigen des Polysaccharids
mittels DEAE-Sephadex A-50-Chromatographie, bestehend aus 6 Polysaccharidarten
mit Molekulargewichten von 1.800.000-2.200.000, 1.350.000-1.650.000, 620.000-780.000,
105.000-130.000, 23.000-27.000, 5.000-6.000 Dalton, in Verhältnissen
von 11,4-13,4:3,6-4,2:4,5-5,1:0,7-0,9:40,1-48,1:31,0-37,0, hauptsächlich bestehend
aus α(1→6)-verknüpften D-Glucopyranoseeinheiten
mit Verzweigungen, die zum Teil an der C-3-Position verknüpft sind.
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STAND DER TECHNIK
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Vor
der Ausarbeitung der vorliegenden Erfindung wurde über viele
aus Panax ginseng extrahierte Polysaccharide berichtet. Das Folgende
sind gut bekannte Berichte in diesem Bereich.
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Panaxan,
eines der aus D-Glucose bestehenden Glycane, wurde als aktiver Inhaltsstoff
zum Absenken des Blutzuckerspiegels offenbart [Konno, C. et al.,
Isolation and hypoglycemic activity of Panaxan A.B.C.D. and E glycans
of Panax ginseng roots, Planta Medica 50 S. 434-436, 1984]. Die Polysaccharide, umfassend Galacturonsäure, Glucose,
Arabinose, Mannose und Galactose, wurden als Material mit antikomplementärer Wirkung
offenbart [Gao, Q., Kiyohara, H. et al., Chemical properties and
anti-complementary activities of polysaccharide fractions from roots
and leaves of Panax ginseng, Planta Medica 55 S. 9-12, 1989]. Darüber hinaus wurde
berichtet, daß das
Polysaccharid aus Panax ginseng Antitumor- oder Bakterienresistenzwirkungen
besitzt [offengelegtes
japanisches
Patent Nr. 1986-18722A1 ].
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Die
JP61109732 beschreibt ein
aus einer Ginsengpflanze isoliertes Polysaccharid, welches die Expression
von Tumorabtötungsfaktor
(TKF) durch Makrophagenzellen fördern
kann.
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Dieses
Dokument zeigt auch, daß das
isolierte Polysaccharid zur Behandlung von Krebs in Säugern verwendet
werden kann.
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Die
JP06239759 beschreibt ein
aus einer Ginsengwurzel isoliertes Polysaccharid, welches das Zellwachstum
von Säugern,
Kaninchen und Mäusen
in vivo fördern
kann. Dieses Dokument zeigt auch, daß das isolierte Polysaccharid
zur Behandlung von Hornhaut- oder Hautwunden verwendet werden kann.
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Die
JP02045499 beschreibt eine
aus einer Ginsengpflanze isolierte Polysaccharidverbindung, die Saccharideinheiten,
ausgewählt
unter Arabinose, Xylose, Rhamnose, Fucose, Glucose, Galactose und
Galacturonsäure,
als diese bildende Verbindungen enthält. Das Polysaccharid kann
als die Biophylaxefähigkeit
förderndes
Mittel verwendet werden, welches durch eine geringe Toxizität gekennzeichnet
ist.
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Die
JP02045499 beschreibt ein
aus einer Ginsengwurzel isoliertes Polysaccharid, welches Saccharide,
ausgewählt
unter Arabinose, Rhamnose, Mannose, Galactose, Glucose, Glucuronsäure, Galacturonsäure und
anderen, enthält.
Das Polysaccharid kann als sthenisches Mittel mit Biophylaxeeigenschaften
verwendet werden.
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Alle
oben beschriebenen Polysaccharide wurden aus Panax ginseng extrahiert.
Die Komponenten solcher Polysaccharide unterscheiden sich von denen
der vorliegenden Erfindung. Des weiteren wurden aus Panax ginseng
extrahierte Polysaccharide noch nie als Material zum Verstärken der
hämatopoetischen,
myeloprotektiven, Antitumor-Immunzellen-erzeugenden und radiosensibilisierenden
Wirkungen offenbart.
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Ansonsten
gehören
die wirksamen Materialien aus Panax ginseng zu den Saponinderivaten,
die eine andere molekulare Struktur aufweisen als das Polysaccharid
der vorliegenden Erfindung.
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Von β-Glucan,
das aus der Zellwand von Hefe abgetrennt wurde, ist bekannt, daß es eine
hämatopoetische
Wirkung besitzt, es hat jedoch eine andere molekulare Struktur als
das Polysaccharid der vorliegenden Erfindung. Des weiteren wurde
ein Pulver aus OK-432, hergestellt durch Hitzebehandlung der Zellinie
Streptococcus pyrogenes Su, zusammen mit Lentinan, extrahiert aus
Lentinus edodes, als biologische Antwortmodifizierer (BRM) offenbart,
sie haben jedoch auch eine β-Glucan-Struktur.
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Die
vorliegende Erfindung wurde durch Reinigung und Isolierung eines
Polysaccharids, welches das Wachstum hämatopoetischer Zellen fördert, myeloprotektive
Wirkung, Antitumor-Immunzellen-erzeugende und
radiosensibilisierende Wirkung zeigt, aus den Wurzeln von Panax
ginseng ausgearbeitet.
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OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Das
Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Polysaccharidzusammensetzung
mit hämatopoetischen,
myeloprotektiven, Antitumor-Immunzellen-erzeugenden und radiosensibi lisierenden
Wirkungen bereitzustellen, die aus den Wurzeln von Panax ginseng
gereinigt wird, hergestellt durch die Stufen, in denen man:
- i) einen Rückstand
erhält,
indem man 1 Gewichtsteil Ginsengwurzel mit 2-4 Gewichtsteilen Methanol
extrahiert,
- ii) eine wasserlösliche
Fraktion aus dem Rückstand
von Stufe i) extrahiert und erhält,
wobei man 3-5 Gewichtsteile destilliertes Wasser verwendet,
- iii) die in Stufe ii) erhaltene wasserlösliche Fraktion gefriertrocknet,
- iv) nach Erhalten der unlöslichen
Fraktion mit 40%-igem Ethanol aus der Stufe des Gefriertrocknens
der Fraktion in Stufe iii) unter Verwendung einer Dialysemembran
eine innere Fraktion erhält,
- v) sechs Fraktionen durch Sephacryl-S-500-Gelchromatographie
erhält
und
- vi) das Polysaccharid mittels DEAE-Sephadex-A-50-Chromatographie
reinigt.
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Ein
weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Polysaccharid
bereitzustellen, welches aus sechs Polysaccharidarten besteht, die
jeweils Molekulargewichte von 1.800.000-2.200.000, 1.350.000-1.650.000,
620.000-780.000, 105.000-130.000, 23.000-27.000 und 5.000-6.000
Dalton in Gewichtsverhältnissen
von 11,4-13,4:3,6-4,2:4,5-5,1:0,7-0,9:40,1-48,1:31,0-37,0 haben, bestehend aus α(1→6)-verknüpften D-Glucopyranoseeinheiten
mit teilweise α(1→3)-verknüpften Verzweigungen.
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Ein
Polysaccharid umfaßt
auch eine Menge von mehr als 98,5% an Kohlehydraten und eine Menge von
weniger als 1,0% an Protein nach quantitativer Bestimmung.
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Das
weitere Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine das
Polysaccharid umfassende pharmazeutische Zusammensetzung zum Verstärken der
hämatopoetischen,
myeloprotektiven, Antitumor-Immunzellen-erzeugenden und radiosensibilisierenden
Wirkungen bereitzustellen.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
den Isolationsvorgang zum Erhalten des Polysaccharids der vorliegenden
Erfindung aus Panax ginseng.
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2 zeigt
die teilweise Struktur des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung
aus Panax ginseng.
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3 zeigt
den Isolationsvorgang der sechs Arten von Polysaccharid der vorliegenden
Erfindung mittels Sephacryl S-500-Gelchromatographie.
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4 zeigt
das TLC-Muster des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung nach
Säurehydrolyse.
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5 zeigt
das IR-Spektrum des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung.
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6 zeigt
das 1H-NMR-Spektrum des Polysaccharids der
vorliegenden Erfindung.
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7 zeigt
das 13C-NMR-Spektrum des Polysaccharids
der vorliegenden Erfindung.
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8 zeigt
das DQF-COSY-Spektrum des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung.
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9 zeigt
das HMBC-Spektrum des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung.
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10 zeigt
die Schutzwirkung des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung
auf Myeloidzellen nach Bestrahlung mit 60Co-γ-Strahlen.
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11 zeigt
die Anti-Tumor-Wirkung des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung
in vivo.
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12 zeigt
die verstärkende
Wirkung des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung auf die Zytokin-mRNA-Expression.
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13 zeigt
die Wirkung der Erzeugung von Stickstoffoxid in einer Krebszellinie
durch das Polysaccharid der vorliegenden Erfindung.
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14 zeigt
die radiosensibilisierende Wirkung des Polysaccharids der vorliegenden
Erfindung in einer Krebszellinie.
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15 zeigt
die verstärkende
Wirkung des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung auf die radiotherapeutische
Effizienz.
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BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
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Das
Isolationsverfahren der vorliegenden Erfindung ist in 1 veranschaulicht.
Es folgt eine detaillierte Beschreibung des Extraktionsprozesses.
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1
Gew.-Teil Panax ginseng wurde mit 3 Gew.-Teilen Methanol extrahiert.
Nach der Extraktion wurde ein Rückstand
erhalten und im Dunkeln getrocknet. Dann wurde durch dreimalige
Extraktion des Rückstands unter
Verwendung von 4 Gew.-Teilen destilliertem Wasser bei 4°C für 24 Stunden
und Gefriertrocknen eine wasserlösliche
Fraktion erhalten. Die erhaltene wasserlösliche Fraktion wird in einer
geringen Menge an destilliertem Wasser gelöst und dann mit 40%-igem Ethanol
präzipitiert,
wodurch eine unlösliche
Fraktion erhalten wird. Dann wurde die Polysaccharidfraktion durch
Dialyse gegen destilliertes Wasser unter Verwendung einer Zellulosemembran
erhalten und gefriergetrocknet. Schließlich wurden die sechs Polysaccharidfraktionen
mittels Sephacryl S-500-Gelchromatographie erhalten und mittels
DEAE-Sephadex A-50-Chromatographie gereinigt (1-3).
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1) Bestimmung des Kohlehydratgehalts des
Polysaccharids der vorliegenden Erfindung
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Der
gesamte Kohlehydratgehalt des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung
wurde durch das Phenol-Schwefelsäure-Verfahren
mit D-Glucose als Standard bestimmt. Das Polysaccharid wurde in
einer Konzentration von 0,1 mg/ml in destilliertem Wasser gelöst. Dann
wurden 30 μl
einer 5%-igen Phenollösung
und 0,2 ml Schwefelsäurereagens
unter Schütteln
zu 20 μl
Polysaccharidlösung
zugegeben und bei 60°C
für 20 Minuten
umgesetzt. Die Absorption wurde bei 490 nm gemessen, und der Kohlehydratgehalt
des Polysaccharids beträgt
98,5% im Vergleich zum Glucosestandard.
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2) Bestimmung des Proteingehalts des Polysaccharids
der vorliegenden Erfindung
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Der
Gesamtproteingehalt des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung
wurde mit dem Bradford-Verfahren unter Verwendung eines Protein
Assay Kits, Bio-Rad, Co. gemäß den Anlei tungen
des Herstellers bestimmt. Der Proteingehalt des Polysaccharids betrug
weniger als 1,0% im Vergleich zum Standard Rinderserumalbumin.
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3) Identifizierung von Zuckerkomponenten
des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung mittels Dünnschichtchromatographie
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20
mg des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung wurden mit 2 ml
1M H2SO4 bei 100°C für 4 Stunden
umgesetzt und mit Bariumhydroxid neutralisiert. Das Polysaccharid
der vorliegenden Erfindung bestand hauptsächlich aus Glucose, ermittelt
durch Dünnschichtchromatographie
unter Verwendung eines gemischten Lösungsmittelsystems aus n-Propanol
und Wasser (85:15, v/v) und detektiert mit Schwefelsäure. 4 zeigt, daß das Polysaccharid
aus Glucose bestand.
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4) Bestimmung der Zuckeranalyse zum Messen
der Komponenten des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung mittels
Gaschromatographie
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20
mg des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung wurden in DMSO
(2 ml) gelöst
und für
5 Minuten bei 60°C
unter N
2-Gas umgesetzt. Methylsulfinylcarbanion
(0,5 ml) wurde zu der Polysaccharidlösung zugegeben und bei 25°C für 1,5 Stunden
umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser dialysiert und
mit Chloroform extrahiert, und die Methylierung wurde wiederholt,
bis kein IR-Absorptionsband für
die Hydroxylgruppe mehr erfaßt
wurde. Das methylierte Polysaccharid wurde zuerst mit 90%-iger Ameisensäure (0,5
ml) für
8 Stunden bei 100°C
und dann mit 2M Trifluoressigsäure
(0,5 ml) für
3 Stunden bei 100°C
hydrolysiert. Nach Reduktion mit Natriumborhydrid wurden die Alditiole
durch Erhitzen mit 0,2 ml Essigsäure-Pyridin
(1:1, v/v) für
2 Stunden bei 100°C
acetyliert. Das Produkt wurde mit GS-MS untersucht, die unter Bedingungen
unter Verwendung einer HP-5-Kapillarsäule bei 280°C durchgeführt wurde. Die Temperaturbedingungen
des Injektors betrugen 280°C,
und die Temperatur des Flammenionisationsdetektors betrug 300°C. Auf Basis
dieser Ergebnisse besteht das Polysaccharid aus α(1→6)-verknüpften D-Glucopyranoseeinheiten
mit teilweise in der 3-Position verknüpften Verzweigungen in einem
Verhältnis
von 10:1 (Tabelle 1). Tabelle 1. Bestimmung von Komponenten
des Polysaccharids mittels GC-MS
Derivate | Retentionszeit
(Min.) | Fläche (%) | Hauptfragmente
(m/z) |
1,5-Ac-2,3,4,6-Me-D-Glucitol | 8,31 | 7,7 | 43,
45, 71, 88, 101, 115, 129, 145, 161, 205 |
1,5,6-Ac-2,3,4-Me-D-Glucitol | 9,33 | 76,9 | 43,
71, 88, 101, 115, 129, 143, 161, 186 |
1,3,5-Ac-2,4,6-Me-D-Glucitol | 9,44 | 7,8 | 43,
87, 101, 127, 143, 186 |
1,3,5,6-Ac-2,4-Me-D-Glucitol | 10,74 | 7,6 | 43,
71, 88, 101, 115, 129, 143, 161, 186 |
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5) Bestimmung des Molekulargewichts des
Polysaccharids der vorliegenden Erfindung
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Gelpermeationschromatographie
des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung wurde mit einem Hewlett-Packard
HP-600S durchgeführt.
Die mobile Phase war 0,1 M Natriumcarbonatlösung mit einer Flußrate von
1,5 ml/Min., und die Zucker wurden mit einem Brechungsindexdetektor überwacht.
Das Molekulargewicht wurde durch Vergleichen der Elutionszeit und
der Fläche
mit Standard-Polysacchariden, wie Dextran T2000 (MW 2.000.000 Dalton),
T500 (MW 500.000 Dalton), T70 (MW 70.000 Dalton, T40 (MW 40.000
Dalton) und T10 (MW 10.000 Dalton, erworben von Amersham Pharmacia
Biotech., bestimmt. Tabelle 2 zeigt, daß das Polysaccharid der vorliegenden
Erfindung Molekulargewichte von 1,8-2,2 × 10
6,
1,35-1,65 × 10
6, 6,2-7,8 × 10
5, 1,05-1,3 × 10
5, 2,3-2,7 × 10
4,
5,0-6,0 × 10
3 Dalton in Verhältnissen von 11,4-13,4:3,6-4,2:4,5-5,1:0,7-0,9:40,1-48,1:31,0-37,0
hatte. Tabelle 2. Bestimmung des Molekulargewichts
des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung mittels Gelpermeationschromatographie
Fraktion | Retentionszeit
(Min.) | Molekulargewicht
(Dalton) | Fläche (%) |
G
I | 10,012 | 1,8-2,2 × 106 | 11,4-13,4 |
G
II | 10,658 | 1,35-1,65 × 106 | 3,6-4,2 |
G
III | 12,230 | 6,2-7,8 × 105 | 4,5-5,1 |
G
IV | 14,459 | 1,05-1,3 × 106 | 0,7-0,9 |
G
V | 18,693 | 2,3-2,7 × 104 | 40,1-48,1 |
G
VI | 21,997 | 5,0-6,0 × 103 | 31,0-37,0 |
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6) Anwendung von Fourier-Transformations-Infrarot-(FT-IR-)Spektroskopie
zur Charakterisierung des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung
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Das
IR-Spektrum des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung wurde
unter Verwendung eines Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskops,
Bomem DA8.12, Hartman and Braun, Co., Kanada, unter Verwendung von
KBr gemessen. Das IR-Spektrum (5) zeigt
ein breites Absorptionsband bei 3400 cm-1,
was eine Hydroxylgruppe (-OH) anzeigt, ein Absorptionsband bei 1000-1100
cm-1, was eine Estergruppe (C-O) anzeigt, und
ein Absorptionsband bei 2800-2900 cm-1,
was Kohlenwasserstoffe anzeigt.
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7) Anwendung von NMR-Spektroskopie zur
Erläuterung
der Struktur des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung
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Das
NMR-Spektrum des Polysaccharids der vorliegenden Erfindung wurde
für ein
D2O-Lösungsmittel mit
500 MHz-Kernmagnetresonanzspektroskopie, Bruker AMX 500, Deutschland,
erhalten. Das Protonenkernmagnetresonanz-(1H-NMR-)Spektrum
zeigte ein typisches Spektrum von Glucose, welches sich aufgrund
von hydroxylierten Methin- oder Methylenprotonen bei δ 3,5-4,2 und aufgrund
der anomeren Wasserstoffprotonensignale bei δ 4,76 (Dublett, J = 2,6 Hz)
und 4,98 (Dublett, J = 3,0 Hz) (6) zeigte.
Das Verhältnis
der Wechselwirkung betrug 10:1. Diese Ergebnisse deuteten darauf
hin, daß D-Glucoseeinheiten α-verknüpft sind.
Das 13C-NMR- Spektrum (7) zeigte
6 starke Kohlenstoffsignale (δ 62,6,
66,0, 77,8, 78,9, 82,8 und 106,7) und 12 schwache Kohlenstoffsignale
(δ 63,0,
64,8, 63,6, 65,1, 72,3, 76,9, 77,3, 79,2, 82,1, 83,6, 83,8, 106,1,
106,2 und 106,7). Von diesen Signalen absorbierten C-6-Kohlenstoffsignale
bei δ 62,6,
64,8 und 65,1, C-3-Kohlenstoffsignale absorbierten bei δ 82,9, 83,6
und 83,8. Die C1-Kohlenstoffsignale
zeigten sich bei δ 106,7,
106,1 und 106,2. Diese spektralen Eigenschaften des Polysaccharids
der vorliegenden Erfindung zeigten, daß α-D-Glucoseeinheiten an den 1-,
3- und 6-Positionen
verknüpft
sind. Dieses Ergebnis deutete darauf hin, daß dieses Polysaccharid aus
einer großen
Hauptkette mit wenig Verzweigung besteht.
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Alle
Kohlenstoffe und Protonen wurden durch Heteronuclear Multiple Quantum
Correlation-(HMQC-)Experimente angepaßt. Die Protonen und die Protonenkorrelation
wurden mittels 1H-1H-COSY-Experimenten
bestimmt (8). Das Protonensignal bei δ 3,89 war
mit δ 3,56
spin-gekoppelt, δ 4,10
war mit δ 4,19 spin-gekoppelt, δ 3,67 war
mit δ 3,79
und δ 4,10
spin-gekoppelt,
und δ 3,69
war mit δ 3,79
spin-gekoppelt. So wurde herausgefunden, daß das Polysaccharid α(1→6)-Glucopyranoseverknüpfungen
aufweist. Die Long-Range-C-H-Kopplungen wurden in Heteronuclear
Multiple Bond Coherence-(HMBC-)Experimenten beobachtet, wie in 9 gezeigt.
Das Kohlenstoffsignal bei δ 66,0
zeigte eine Korrelation mit dem Methinproton bei δ 4,10, das
Kohlenstoffsignal bei δ 82,8
zeigte eine Korrelation mit dem Proton bei δ 3,56 und 4,10, das Kohlenstoffsignal
bei δ 71,8
zeigte Korrelationen mit Protonen bei δ 4,19, das Kohlenstoffsignal
bei δ 78,9
zeigte Korrelationen mit Protonen bei δ 3,79 und 4,10, das Kohlenstoffsignal
bei δ 62,6
zeigte Korrelationen mit Protonen bei δ 4,19, und das Kohlenstoffsignal
bei δ 106,7
zeigte eine Korrelation mit Protonen bei δ 3,79. Aus diesen Ergebnissen
wurde eine α(1→6)-Glucopyranoseverknüpfung identifiziert.
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Bei
Untersuchung der physikochemischen und spektroskopischen Eigenschaften
der vorliegenden Erfindung wurde die Struktur als α(1→6)-verknüpfte D-Glucopyranoseeinheit
mit teilweisen Verzweigungen in der 3-Position in einem Verhältnis von
10:1 identifiziert (2).
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Das
aus Panax ginseng isolierte Polysaccharid kann in verschiedenen
Mitteln verwendet werden, beispielsweise in einem Mittel zum Fördern des
Wachstums hämatopoetischer
Zellen, einem das Myeloid schützenden
Mittel, einem Hemmstoff gegenüber
Unterdrückung
von hämatopoetischen
Zellen, induziert durch Radio- oder Chemotherapie, einem Mittel
für die
Anti-Tumor-Immuntherapie,
einem Mittel zur Prävention
gegen Krebs und einem Mittel zum Verstärken der therapeutischen Wirksamkeit
von Radiotherapie.
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Die
vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele ausführlicher
erläutert.
Es versteht sich jedoch, daß die
Beispiele die Erfindung veranschaulichen, ihren Schutzumfang jedoch
in keinster Weise beschränken
sollen.
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BEISPIELE
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(Beispiel 1) Test zum Fördern des
Wachstums hämatopoetischer
Zellen
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1) Erzeugen der Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-bildenden
Einheit, GM-CFU
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Knochenmarkzellen
(1 × 10
5/Schale) wurden in 35 mm-Gewebekulturschalen
(mit 2 mm-Raster,
Nalge Nunc. International, Corning, NY, USA), die Iscoves modifiziertes
Dulbecco-Medium
(IMDM), ergänzt
mit 0,3% Agar, 20% Pferdeserum und 10% rekombinantem GM-CSF, enthielten,
ausplattiert. Polysaccharide der vorliegenden Erfindung wurden entsprechend
der Konzentration behandelt, und die Kulturen wurden für 7 Tage
bei 37°C
in 5% CO
2 in Luft gehalten. Kolonien von
mehr als 50 Zellen wurden gewertet. Tabelle 3 zeigt, daß die Anzahl
an GM-CFU von 40,67
in der Kontrolle auf 64,67 Kolonien in der Kultur mit Ginseng-Polysaccharid
in einer Menge von 50 μg/ml
anstieg. Tabelle 3. Steigerung der Anzahl an GM-CFU
in Knochenmarkzellen durch Kultivieren mit dem Polysaccharid der
vorliegenden Erfindung
Behandlung | Anzahl
an GM-CFU-Kolonien ± SD |
Knochenmarkzellen | 40,67 ± 4,67 |
Knochenmarkzellen
+ Ginseng-Polysaccharid (100 μg/ml) | 62,33 ± 1,20 |
Knochenmarkzellen
+ Ginseng-Polysaccharid (50 μg/ml) | 64,67 ± 2,91 |
Knochenmarkzellen
+ Ginseng-Polysaccharid (10 μg/ml) | 54,00 ± 3,51 |
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(Beispiel 2) Test auf myeloprotektive
Wirkung
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1) Eigenschaft der Hemmung der Unterdrückung von
hämatopoetischen
Zellen, induziert durch Bestrahlung
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Weibliche
BALB/c-Mäuse
mit einem Gewicht von 18-22 g wurden in eine Acrylbox gesetzt und 60Co-γ-Bestrahlung
in einer Dosierungsrate von 97,1 cGy/Min. ausgesetzt. Das Polysaccharid
der vorliegenden Erfindung wurde in Phosphatpufferlösung (PBS,
pH 7,4) gelöst,
unter Verwendung von 0,45 μm-Millipore-Membranen
(Corning, NY) filtriert und bei 4°C
bis zur Verabreichung an die Mäuse
gelagert. Die geeigneten Konzentrationen von Polysaccharid in einem
Volumen von 0,2 ml wurden mittels intraperitonealer Injektion an normale
Mäuse verabreicht.
Kontrolltiere erhielten zur gleichen Zeit 0,2 ml PBS. Blut wurde
mit einem heparinisierten Kapillarröhrchen (Chase Instruments Corp.,
Norcross, GA) aus den Augenlidern der Mäuse entnommen. Eine Blutzellanalyse
wurde unter Verwendung eines automatischen Blutzellanalysators,
Zell-DYN 4000, durchgeführt.
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➀ Auswirkung auf Knochenmark-
und Milzzellstruktur nach Bestrahlung
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Fünf Tage
nach Bestrahlung mit 4,5 Gy wurde die Anzahl an Knochenmark- und
Milzzellen in den Mäusen
gemessen. Die Anzahl aller Zellen wurde jeweils durch das Trypan-Blau-Ausschlußverfahren
bestimmt.
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Die
Anzahl an Milzzellen und Knochenmarkzellen in den bestrahlten Kontrollmäusen, denen
nur PBS verabreicht worden war, betrug weniger als 10% bzw. 62%
in den nicht-bestrahlten normalen Mäusen. Diese Werte erhöhten sich
in der Milz um das 1,8-fache und in der Knochenmarkzellstruktur
um das 1,3-fache im Vergleich zu Mäusen, denen 24 Stunden vor
der Bestrahlung das Polysaccharid in einer Menge von 100 mg/kg injiziert
worden war. 10 zeigt die Ergebnisse.
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➁ Frühe Erholung der Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-bildenden
Einheit (GM-CFU) nach subletaler Bestrahlung
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Das
Polysaccharid der vorliegenden Erfindung wurde in PBS gelöst und mittels
intraperi tonealer Injektion 24 Stunden vor der Bestrahlung in einer
Menge von 100 mg/kg oder 200 mg/kg verabreicht. Dann wurden die
Mäuse mit
einer subletalen Dosis von 4,5 Gy bestrahlt. Die Anzahl an GM-CFU
wurde am fünften
Tag nach der Bestrahlung gemessen.
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Tabelle
4 zeigt, daß die
Anzahl an GM-CFU in den bestrahlten PBS-Kontrollmäusen mit
17% des normalen Werts ohne Bestrahlung sehr niedrig war, wohingegen
es zu einer deutlichen Zunahme von GM-CFU in der Gruppe mit Verabreichung
von Polysaccharid von bis zu 63-80% des Normalwerts kam. Dies zeigt,
daß sich
die Gruppe mit Verabreichung von Polysaccharid im Vergleich zur
Kontrollgruppe 3,7- bis 4,7-mal früher erholt. Tabelle 4. Auswirkung des Polysaccharids
auf die Anzahl an GM-CFU in Knochenmarkzellen nach Bestrahlung
Gruppe | Anzahl
an GM-CFU-Kolonien ± SD |
KM-Zellen
von nicht-bestrahlten normalen Mäusen | 59,33 ± 2,29 |
KM-Zellen
von bestrahlten PBS-Kontrollmäusen | 10,00 ± 1,14 |
KM-Zellen
von bestrahlten Mäusen
mit Verabreichung von Polysaccharid (100 mg/kg) | 47,33 ± 3,96 |
KM-Zellen
von bestrahlten Mäusen
mit Verabreichung von Polysaccharid (200 mg/kg) | 37,17 ± 2,77 |
-
➂ Verbessernde Auswirkung
auf Peripherblutzellen
-
Fünf Tage
nach Bestrahlung mit einer subletalen Dosis von 4,5 Gy nahm die
Anzahl weißer
Blutzellen von 3,463 ± 0,236
auf 0,476 ± 0,034 × 10
3/μl
ab. Die Anzahl der Blutplättchen
verringerte sich von 585,0 ± 39,0 auf
354,5 ± 26,0 × 10
3/μl,
und die Anzahl der Neutrophilen und der Lymphozyten zeigte ebenfalls
eine deutliche Abnahme. Wie in Tabelle 5 zu sehen ist, erfolgte
die hämatopoetische
Erholung in den mit Polysaccharid behandelten Mäusen 2-mal schneller als bei
der bestrahlten Kontrollgruppe, insbesondere hinsichtlich der Anzahl von
Neutrophilen. Tabelle 5. Verbessernde Auswirkung des
Polysaccharids auf die hämatopoetische
Erholung nach subletaler Bestrahlung
Blutzellen | Nicht-bestrahlt, normal ± SD | Bestrahlt |
PBS-Kontrolle ± SD | Verabreichung von Polysaccharid
(100 mg/kg) ± SD | Verabreichung von Polysaccharid
(200 mg/kg) ± SD |
Anzahl an WBZ × 103/μl | 3,463 ± 0,236 | 0,476 ± 0,034 | 0,948 ± 0,111 | 0,793 ± 0,055 |
Anzahl an Neutrophilen × 103/μl | 0,367 ± 0,043 | 0,0404 ± 0,005 | 0,182 ± 0,028 | 0,271 ± 0,037 |
Anzahl an Lymphozyten × 103/μl | 2,975 ± 0,259 | 0,330 ± 0,041 | 0,680 ± 0,099 | 0,378 ± 0,036 |
Anzahl an RBZ × 103/μl | 8,565 ± 0,121 | 7,550 ± 0,379 | 7,935 ± 0,145 | 7,663 ± 0,131 |
Anzahl an Blutplättchen × 103/μl | 585,0 ± 39,0 | 354,5 ± 26,0 | 441,5 ± 38,2 | 360,1 ± 20,4 |
-
➃ Verstärkende Wirkung von koloniebildender
Einheit – Milz
-
Knochenmarkzellen
wurden am fünften
Tag aus den mit einer subletalen Dosis bestrahl ten Mäusen (5
Mäuse/Gruppe),
denen 24 Stunden vor der Bestrahlung PBS oder das Polysaccharid
in einer Menge von 100 mg/kg verabreicht worden war, entnommen.
Die Empfängermäuse (10
Mäuse/Gruppe)
erhielten eine Bestrahlung bei einer letalen Dosis von 9 Gy. Knochenmarkzellen
(105) wurden intravenös in die Schwanzvenen der Empfängermäuse injiziert.
Die Anzahl an Kolonien in den Milzen wurde 8 Tage später nach
Fixierung mit Bouin-Lösung
mikroskopisch gezählt.
-
In
den bestrahlten PBS-Kontrollmäusen
ist keine Kolonie zu detektieren, wohingegen eine Behandlung der
Mäuse mit
Polysaccharid in einer Menge von 100 mg/kg 17,47 ± 2,33
CFU-S erzeugte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6. Auswirkung des Polysaccharids
auf die Bildung von CFU-S
Gruppe | CFU-S/1 × 105 Knochenmark ± SD |
Nicht-bestrahlte
normale Mäuse | 39,25 ± 4,26 |
Bestrahlte
PBS-Kontrollmäuse | keine
Detektion |
Bestrahlte
Mäuse mit
Verabreichung von Polysaccharid (100 mg/kg) | 17,47 ± 2,33 |
-
2) Hemmende Wirkung auf die Unterdrückung der
hämatopoetischen
Eigenschaft, induziert durch Anti-Krebsmittel
-
➀ Frühe Erholung der Knochenmark-
und Milzzellstruktur und der Anzahl von GM-CFU nach Behandlung mit Cyclophosphamid
-
50
mg/kg des Polysaccharids wurden 24 Stunden nach Verabreichung von
250 mg/kg Cyclophosphamid verabreicht. Die Knochenmark- und Milzzellen
wurden am neunten Tag aus den Mäusen
gesammelt, und die Lebensfähigkeit
aller Zellen wurde unter Verwendung des Trypan-Blau-Ausschlußverfahrens
bestimmt.
-
Bei
der Gruppe mit Verabreichung von Cyclophosphamid wurde die Anzahl
an Knochenmarkzellen auf 76% der normalen Menge, jedoch statistisch
nicht signifikant reduziert. In der Gruppe, der das Polysaccharid zusammen
mit Cyclophosphamid verabreicht wurde, kam es zu keiner signifikanten
Veränderung
der Anzahl an Knochenmarkzellen.
-
Die
Milzzellstruktur dagegen erwies sich als empfindlicher für die Behandlung
mit Cyclophosphamid. In Mäusen,
denen eine Kombination aus Polysaccharid (100 mg/kg) und Cyclophosphamid
verabreicht wurde, nahm die Anzahl an Milzzellen um das 2,1-fache
zu im Vergleich zu Kontrollmäusen,
die mit Cyclophosphamid behandelt wurden und 68% des normalen Werts
zeigten.
-
Des
weiteren wurde die Anzahl an GM-CFU der mit Cyclophosphamid behandelten
Mäuse um
40% der normalen Menge signifikant reduziert, wohingegen die Anzahl
an GM-CFU der Mäuse,
denen Polysaccharid in Kombination mit Cyclophosphamid verabreicht
wurde, um das 1,94-fache größer war
als in den mit Cyclophosphamid behandelten Kontrollmäusen. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Tabelle
7. Steigerung der Anzahl an Knochenmark- und Milzzellen und GM-CFU
durch das Polysaccharid in Kombination mit Cyclophosphamid
-
(Beispiel 3) Test zur Aktivierung von
Antitumor-Immunzellen
-
1) Test zur Aktivierung von natürlichen
Killer-(NK-)Zellen
-
C3H/HeN-Mäuse wurden
in Gruppen mit je fünf
Mäusen
aufgeteilt und erhielten PBS oder Polysaccharid in einer Menge von
10, 50, 100, 200 mg/kg mittels intraperitonealer Injektion. Ein
vierstündiger [
51Cr]-Freisetzungstest wurde verwendet, um
die Erzeugung von natürlichen
Killer zellen zu bestimmen. Kurz gefaßt wurden Milzzellen (1,5 × 10
6 Zellen/ml) 24 Stunden nach Verabreichung
des Polysaccharids hergestellt und mit [
51Cr]-markierten
Zielzellen, YAC-1 (Effektorzellen:Zielzellen = 100:1) für 4 Stunden
in 96-Well-Mikroplatten mit U-förmigem
Boden kultiviert. Die Platten wurden geerntet und die in den Überständen freigesetzte Radioaktivität wurde
unter Verwendung eines γ-Zählers (Reckmann
Inst., Palo Alto, CA, USA) bestimmt. Der Prozentsatz der spezifischen
Freisetzung wurde als % der spezifischen Freisetzung = (ER-SR)/(MR-SR) × 100 berechnet,
wobei ER die mittlere Zahl aus der experimentellen Gruppe ist, SR
die mittlere Zahl der in Medium alleine inkubierten Zielzellen ist
und MR die mittlere Zahl der mit 0,5% Triton X-100 behandelten Zielzellen
ist. Die mit Polysaccharid in einer Menge von 100 mg/kg behandelte
Gruppe zeigte eine Zytotoxizität
von 42,4% gegenüber
der YAC-1-Tumorzelle, was um das 3,5-fache höher ist als die 12,1% der Kontrolle.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Tabelle 8. Test zur Aktivierung natürlicher
Killer-(NK-)Zellen
Gruppe | %
Zytotoxizität
bei E:T = 100:1 (Mittelwert ± SD) |
Kontrollgruppe | 12,1 ± 0,2 |
Verabreichung
von Polysaccharid (10 mg/kg) | 18,4 ± 2,4 |
Verabreichung
von Polysaccharid (50 mg/kg) | 25,3 ± 0,5 |
Verabreichung
von Polysaccharid (100 mg/kg) | 42,4 ± 3,6 |
Verabreichung
von Polysaccharid (200 mg/kg) | 12,4 ± 1,2 |
-
2) Test zur Aktivierung von zytotoxischen
T-Lymphozyten
-
Die
Plasmazytom-Zellinie MOPC 315 (American Type Culture Collection,
Rockville, MD) wurde in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM),
enthaltend Penicillin, Streptomycin und 10% fötales Kälberserum (FCS), kultiviert.
MOPC 315-Zellen wurden in einer Menge von 1 × 10
6 subkutan
(s.c.) Balb/c-Mäusen
injiziert. Nach 3 Tagen wurde das Polysaccharid den Mäusen jeden
zweiten Tag viermal in Konzentrationen von 50, 10, 2 mg/kg intraperitoneal
injiziert. Nach 14 Tagen wurden Milzzellen geerntet, und die CTL-Aktivität wurde gegen
51Cr-markierte Zielzellen getestet. Variable
Anzahlen von Effektorzellen wurden mit 10
4 51Cr-markierten MOPC315-Tumorzellen dreifach gemischt und in
96-Well-Gewebekulturplatten mit U-förmigem Boden kultiviert. Nach
4 Stunden wurden die Platten bei 400 g für 5 Min. zentrifugiert, und
0,1 ml Überstand
wurde gesammelt und in einem Gammazähler ausgezählt. Die Gruppe, der das Polysaccharid
in einer Menge von 2, 10, 50 mg/kg verabreicht worden war, zeigte
18,6, 22,4 bzw. 17,8% Zytotoxizität gegen MOPC 315-Zellen. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 9. Test zur Aktivierung von zytotoxischen
T-Lymphozyten (CTL) durch das Polysaccharid
Gruppe | %
Zytotoxizität
bei E:T = 100:1 (Mittelwert ± SD) |
Kontrollmäuse | 0,9 ± 0,2 |
Mäuse mit
Verabreichung von Polysaccharid (2 mg/kg) | 18,6 ± 1,0 |
Mäuse mit
Verabreichung von Polysaccharid (10 mg/kg) | 22,4 ± 1,6 |
Mäuse mit
Verabreichung von Polysaccharid (50 mg/kg) | 17,8 ± 1,2 |
-
3) Test auf tumorizide Wirkung der peritonealen
Makrophagen, kultiviert mit dem Polysaccharid
-
Peritoneale
Makrophagen von C3H/HeN-Mäusen
wurden isoliert und in einer Menge von 2 × 10
5 Zellen/Well
in 96-Well-Mikroplatten mit U-förmigem
Boden ausgesät
und mit oder ohne Polysaccharid für 24 Stunden bei 37°C, 5% CO
2 inkubiert. Die peritonealen Makrophagen
wurden mit PBS gewaschen, um das Polysaccharid zu entfernen, und
mit YAC-1-Zellen in einer Menge von 1 × 10
4 Zellen/Well
in der Gegenwart von
3H-Thymidin in einer
Menge von 2 μCi/Well
inkubiert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen unter Verwendung einer
automatischen Mehrfachwell-Erntevorrichtung
geerntet, und die Menge an Radioaktivität in den Zielzellen wurde in
einem Flüssigszintillationszähler gemessen.
Die peritonealen Makrophagen, die mit 10, 50, 100 μg/ml Polysaccharid
kultiviert wurden, hemmten das Wachstum von YAC-1-Krebszellen um
52,6, 69,2 bzw. 59,8%. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 gezeigt. Tabelle 10. Tumorizide Wirkung der mit
dem Polysaccharid kultivierten Makrophagen
Behandlung | %
Inhibition |
Peritoneale
Makrophagen (PM) | 15,9 ± 4,1 |
PM
+ Polysaccharid (10 μg/ml) | 59,8 ± 6,9 |
PM
+ Polysaccharid (50 μg/ml) | 69,2 ± 2,6 |
PM
+ Polysaccharid (100 μg/ml) | 52,6 ± 5,0 |
-
4) Test auf Antitumorigenizität in vivo
-
MOPC
315-Tumorzellen (1 × 106 Zellen/Maus) wurden Balb/c-Mäusen subkutan
injiziert. 10, 2, 0,5 mg/kg Polysaccharid und PBS wurden ab dem
dritten Tag nach der Implantation des Tumors jeden zweiten Tag 8-mal
intraperitoneal injiziert. 11 zeigt,
daß in
Mäusen,
denen 10, 2, 0,5 mg/kg des Polysaccharids verabreicht wurden, die
Tumorgröße im Vergleich
zu den Kontrollmäusen
nach 30 Tagen um 22%, 46%, 16% reduziert war.
-
5) Test auf Krebsprophylaxewirkung
-
Balb/c-Mäuse wurden
in vier Gruppen unterteilt, und jede Gruppe enthielt 50 Mäuse. 0,5
mg Benzo[α]pyren
in 1% wäßriger Gelatine
wurde 24 Stunden nach der Geburt subkutan in den Schulterblattbereich injiziert,
und das Polysaccharid, das in Mengen von 0,5, 2, 10 mg/ml in Trinkwasser
gelöst
war, wurde für
9 Wochen nach Entwöhnen
nach Belieben verabreicht. Die Mäuse
wurden getötet,
die Lungen wurden entnommen und dann in Bouin-Lösung fixiert. Die Anzahl an
Knötchen
in den Lungen wurde unter dem Mikroskop gezählt. Wie in Tabelle 11 zu sehen
ist, betrug die Häufigkeit
des Auftretens von Lungentumoren in der Gruppe mit BP alleine 62%,
und sie wurde durch Behandlung mit Polysaccharid signifikant reduziert,
nämlich
auf 31%, 23% bzw. 45%. Tabelle 11. Hemmung der Tumorhäufigkeit
durch das Polysaccharid
Gruppe | %
Häufigkeit
von Lungentumor |
Benzo[α]pyren (BP) | 60 |
BP
+ Polysaccharid (0,5 mg/ml) | 30 |
BP
+ Polysaccharid (2 mg/ml) | 22 |
BP
+ Polysaccharid (10 mg/ml) | 44 |
-
6) Test auf Zytokin-mRNA-Expression
-
Milzzellen
(2 × 106 Zellen/ml) von C3H/HeN-Mäusen wurden
mit verschiedenen Konzentrationen des Polysaccharids (5 μg/ml, 50 μg/ml, 200 μg/ml) auf
6-Well-Platten ausgesät
und für
1, 3, 6, 24 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen
gewaschen und die gesamte RNA wurde isoliert. Ein Mikrogramm der gesamten
RNA wurde bei 37°C
für 60
Min. revers transkribiert. Die reverse Transkriptase wurde bei 95°C für 5 Minuten
inaktiviert, und cDNA wurde mittels Polymerasekettenreaktion (PCR)
unter den Bedingungen von 2,5 U Taq-Polymerase, je 10 μM dNTPs,
40 pmol Zytokinprimer und 1,5 mM Magnesiumchlorid vervielfältigt. Das
PCR-Produkt wurde
auf 2% Agarosegel, gefärbt
mit Ethidiumbromid, Elektroforese unterzogen und mit DNA-Größenmarker, λDNA-BstEII-Verdau,
verglichen. Jede Zytokin-mRNA-Expression wurde unter Verwendung
eines Bildanalysierers mit MCID-Softwareprogramm quantifiziert und
mit β-Actin verglichen.
Die Expression von IL-2, IFNγ,
IL-12-mRNA aus Th1-Zellen, IL-4, IL-5, IL-10 aus Th2-Zellen und
TNFα, GM-CSF,
IL-1β aus
Makrophagen wurde induziert. Die Ergebnisse sind in 12 gezeigt.
-
(Beispiel 4) Test der verstärkenden
Auswirkung auf die Radiosensitivität von Tumorzellen
-
1) Test der Erzeugung von Stickstoffoxid
-
Da
die radiosensibilisierende Wirkung von NO gut dokumentiert ist,
schätzten
wir die NO-Produktion und
die radiosensibilisierende Wirkung von Polysaccharid in Line1-Zellinien
ab. Die Ansammlung von NO2 -, einem
stabilen Endprodukt der NO-Bildung, in Tumorzellkulturüberständen wurde
als relative Messung der NO-Produktion verwendet. Zellen wurden
auf eine 96-Well-Platte
in einer Menge von 5 × 104 Zellen/Well mit dem Polysaccharid (100 μg/ml) oder
IFN-y (50 U/ml) ausgesät.
Nach Inkubation für
24 Stunden wurden 100 μl zellfreier Überstand
mit 100 μl Griess-Reagens
(0,1% Naphthylethylendiamindihydrochlorid in H2O:1%
Sulfanylamid in 5% H3PO4 =
1:1) für
10 Min. bei Raumtemperatur inkubiert, und die Absorption wurde bei
550 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesers gemessen. Die Konzentration
von NO2 - wurde aus
einer linearen Regressionsanalyse unter Anwendung der Methode der
kleinsten Quadrate eines Natriumnitritstandards, der mit jedem Experiment
erzeugt wurde, bestimmt. Wie es in 13 zu
sehen ist, erzeugten Zellen, die mit dem Polysaccharid (100 μg/ml) behandelt
wurden, 21,6 μM
NO2 -, und IFNγ erzeugte
16,7 μM
NO2 -. Wenn Zellen
mit Polysaccharid (100 μg/ml)
in Kombination mit IFN-γ (50
U/ml) behandelt wurden, kam es zu einer synergistischen Wirkung.
-
2) Schätzung
der radiosensibilisierenden Wirkung
-
Line1-Zellen
in der logarithmischen Wachstumsphase wurden geerntet und auf 6
mm2-Kulturschalen mit
dem Polysaccharid, IFN-γ oder
Polysaccharid in Kombination mit IFN-γ für 16 Stunden ausgesät und bestrahlt.
Die Anzahl an Zellen pro Schale wurde so manipuliert, daß unter
jeder Bedingung 50-200 Kolonien überlebten.
Nach 7 Tagen Inkubation wurden die Kolonien mit 1% Methylen-Blau
in absolutem Methanol gefärbt
und gezählt.
Kolonien, die >50
Zellen enthielten, wurden gewertet. Das Verstärkungsverhältnis (ER) wird berechnet durch
Teilen der Bestrahlungsdosis unter Kontrollbedingungen durch die
Bestrahlungsdosis unter Bedingungen mit Behandlung mit verschiedenen
Mitteln auf dem Niveau 1% an überlebender
Fraktion. 14 zeigt die Bestrahlungs-Überlebenskurven
für Line1-Zellen,
die mit dem Polysaccharid (100 μg/ml)
und IFN-γ (50
U/ml) behandelt wurden. Das ER für
das Polysaccharid betrug 1,28, für
IFN-γ betrug
es 1,14. Das ER der kombinierten Wirkung von Polysaccharid und IFN-γ betrug 1,66.
-
3) Test der radiosensibilisierenden Wirkung
in vivo
-
Um
die radiosensibilisierende Wirkung des Polysaccharids in vivo zu
untersuchen, wurden Line1-Zellen in weibliche Balb/c-Mäuse transplantiert.
Die Behandlung wurde begonnen, sobald die Tumore ein mittleres Volumen
von 1000 mm3 erreicht hatten. Das Tumorvolumen
wurde durch direkte Messung einer Schieblehre bestimmt, anhand der
Formel (Länge × Breite × Tiefe/2)
berechnet und als mittleres Volumen ± SE aufgezeichnet. Mäusen wurde
PBS oder das Polysaccharid (200 mg/kg) jeden zweiten Tag intraperitoneal
injiziert. Nach der Behandlung wurden die Mäuse einer Bestrahlung mit 20
Gy in einer Dosisrate von 65,8 cGy/Min. unterworfen. Wenn die Verabreichung
von Polysaccharid und die Bestrahlung kombiniert wurden, gingen
die Tumore tatsächlich
um 45% im Vergleich zu den Kontrollmäusen im gleichen Zeitraum zurück (15).
-
(Beispiel 5) Test auf akute Toxizität
-
Um
die akute Toxizität
des Polysaccharids zu messen, wurden 2 g/kg, 1 g/kg, 200 mg/kg oder
40 mg/kg des Polysaccharids intraperitoneal injiziert. Die Anzahl
der Todesfälle
während
des 30-tägigen
Zeitraums wurde bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt. Tabelle 12. Test der akuten Toxizität
Dosis
des Polysaccharids | 2
g/kg | 1
g/kg | 200
mg/kg | 40
mg/kg |
Anzahl
toter Mäuse | 0 | 0 | 0 | 0 |
-
Das
Polysaccharid der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung herkömmlicher
Träger
als ein pharmazeutisches Präparat
ausgestaltet werden. Die Formulierung kann auf unterschiedliche
Weise verwendet werden, beispielsweise in Form von Tabletten, Dispergiermittel,
Granulat, Kapseln, Lösungen
oder Injektionen in oralen oder nicht-oralen Dosierungsformen.
-
Die
Dosis des Polysaccharids kann in Abhängigkeit vom Zustand, dem Gewicht,
dem Alter und dem Geschlecht des Patienten variiert werden. Im allgemeinen
sind 100-1.000 mg/Tag/60 kg bevorzugt.