CN107735113B - 用于治疗缺血性疾病或损伤的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质及其可注射制剂 - Google Patents

用于治疗缺血性疾病或损伤的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质及其可注射制剂 Download PDF

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Abstract

公开了使用工程化的心脏成纤维细胞衍生的三维细胞外基质(ECM)的组合物和方法。ECM包括结构蛋白纤连蛋白，I型胶原蛋白，III型胶原蛋白和弹性蛋白，并且存在于工程化的细胞外基质中的结构蛋白质的60％‑90％是纤连蛋白。可用于治疗心脏病或缺血性疾病或损伤的组合物是可注射的组合物，其中ECM被切成小碎片或冻干成粉末。所公开的方法包括通过使由ECM制成的无细胞贴片与受伤组织接触而不伴随递送治疗细胞来治疗缺血性疾病或损伤的方法，以及通过使贴片本身或与治疗细胞种植的贴片接触受伤肢体组织来治疗缺血性肢体损伤的方法。

Description

用于治疗缺血性疾病或损伤的心脏成纤维细胞衍生的细胞外 基质及其可注射制剂
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年6月3日提交的美国临时申请序列号62/170,324的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
关于联邦资助的声明
研究或开发
本发明是在国立卫生研究院授予的DK080345和HHSN2682010000下由政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
背景技术
缺血是动脉血液流向组织，器官或四肢的中断。缺血导致细胞代谢所需的氧气和葡萄糖短缺，从而导致组织损伤或死亡(缺血性损伤)。
当心肌(心脏肌肉)血流量不足时，心肌缺血可导致心肌梗塞。心脏缺血性损伤是全球住院和死亡的主要原因，需要新的更有效的心脏缺血性损伤治疗来改善患者的结果。
具有不同于心脏缺血的病因学和标准治疗方案的肢体缺血是流向肢体的血液缺乏的结果。在美国，每年大约有两百万人患有肢体缺血。发生后，这些患者中有60％没有可用的良好治疗选择。缺血性溃疡是缺血性肢体损伤的常见形式，是易于反复感染的长期的、非痊愈性的疼痛创伤。通常，没有药物可以成功治疗缺血性肢体损伤。组织的血运重建和/或各种皮肤替代物的使用是常见的治疗方法，但是这些治疗并不总是足以挽救受伤的肢体，导致截肢作为唯一可行的治疗选择。
在先专利(美国专利号8,802,144，其通过引用全文并用于所有目的)和出版物(Schmuck，EG等人，Cardiovasc Eng Technol 5(1)(2014):119-131，在此引入作为参考)Schmuck等人描述了由工程心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质制成的生物支架，其可以用作将治疗细胞转移至受损或患病的心脏组织的平台。用治疗细胞接种生物支架作为将治疗细胞递送至损伤或患病的心脏组织的机制。这种治疗方法需要进行侵入性和具有潜在的高风险手术，以将细胞接种的贴片放置在受损心脏的表面上。而且，这种治疗方法需要使用对患者来说是非内源性的治疗细胞，这进一步增加了复杂性、潜在风险和额外的调控障碍。最后，这种治疗方法特定供于心脏组织的损伤和疾病，不会被期望用于非心脏组织(例如肢体缺血性损伤)中发生的伤害。
由于这些原因，使用先前公开的由工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质制成的生物支架的新组合物和方法是非常需要的。
发明内容
发明人在本文中证明，由美国专利8,802,144描述的工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质制成的可注射组合物可以被制造并递送到心脏中。此外，本发明人在此证实，工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质(无论是否接种治疗细胞)可以有效地治疗缺血性肢体损伤。最后，发明人在此证明，即使在不存在治疗性细胞的情况下，工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质也可以有效地治疗缺血性心脏和缺血性肢体损伤。
因此，在第一方面，本公开内容包括用于治疗心脏疾病，心脏损伤或缺血性损伤的可注射组合物。该组合物包括工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质的一个或多个片段，其包含结构蛋白纤连蛋白，I型胶原蛋白，III型胶原蛋白和弹性蛋白，其中工程化细胞外基质中存在的结构蛋白的60％至90％是纤连蛋白。一个或多个片段足够小以通过18号皮下注射针的注射开口。另外，该制剂包含可注射的药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，工程化的心脏细胞外基质的结构蛋白不是化学交联的。
在一些实施例中，一个或多个片段具有20-500μm的厚度。
在一些实施方案中，所述一个或多个片段是冻干粉末的形式。
在一些实施方式中，工程化的心脏细胞外基质还包含以下的一种或多种：基质细胞蛋白潜伏转化生长因子β1(LTGFB-1)，潜伏转化生长因子β2(LTGFB-2)，***生长因子(CTGF)，酸性和富含半胱氨酸的分泌蛋白质(SPARC)，多功能蛋白聚糖核心蛋白(VCAN)，半乳糖凝集素1，半乳糖凝集素3，基质gla蛋白(MGP)，硫酸化糖蛋白1和双糖链蛋白聚糖。
在一些实施方式中，制剂基本上没有完整的心脏成纤维细胞。在一些这样的实施方案中，制剂完全不含细胞。
在一些实施方式中，组合物还包含对心脏疾病，心脏损伤或缺血性损伤具有治疗作用的一种或多种细胞。在一些此类实施方式中，一种或多种细胞可包括骨骼肌成肌细胞，胚胎干(ES)细胞或其衍生物，诱导性多能干(iPS)细胞或其衍生物，多潜能成人生殖干细胞(maGCS)，骨髓间充质干细胞(BMSC)，极小胚胎样干细胞(VSEL细胞)，内皮祖细胞(EPC)，心脏生成细胞(CPC)，心脏球衍生细胞(CDC)，多潜能Isl1+心血管祖细胞(MICP)，心外膜衍生的祖细胞(EPDC)，脂肪衍生的干细胞，来自iPS或ES细胞的人间充质干细胞，来自iPS或ES细胞的人间充质基质细胞，以及它们的组合。
在一些实施方式中，组合物还包含一种或多种外源非细胞治疗剂。在一些这样的实施方式中，一种或多种外源性非细胞治疗剂可以包括一种或多种生长因子。在一些此类实施方式中，所述一种或多种生长因子可包括基质细胞衍生因子(SDF-1)、表皮生长因子(EDF)，转化生长因子-α(TGF-α)，肝细胞生长因子(HGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，成纤维细胞生长因子1(FGF-1)，成纤维细胞生长因子2(FGF-2)，转化生长因子-β(TGF-β)和角质形成细胞生长因子(KGF)。
在一些实施方式中，一个或多个片段足够小以通过27号皮下注射针的注射开口。
第二方面，本公开内容包括用于治疗患有心脏疾病，心脏损伤或缺血性疾病或损伤的对象的方法。该方法包括向对象注射有效量的如上所述的制剂，由此降低心脏病，心脏损伤或缺血性疾病或损伤的严重程度。
在一些实施方式中，所述心脏疾病，心脏损伤，缺血性疾病或损伤由急性心肌梗塞，心力衰竭，病毒感染，细菌感染，先天性缺陷，中风，糖尿病足溃疡，外周动脉疾病(PAD)，PAD相关的溃疡或肢体缺血引起。
第三方面，本公开内容包括用于制备可注射组合物的方法。该方法包括以下步骤：(a)获得具有20-500μm厚度且包含结构蛋白纤连蛋白、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白和弹性蛋白的脱细胞工程化的心脏成纤维细胞衍生细胞外基质，其中存在于工程化的细胞外基质中的结构蛋白的60％至90％是纤连蛋白；(b)(i)将工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质切成足够小以便能够穿过18号皮下注射针的注射口的片段，或(ii)将工程化的成纤维细胞源细胞外细胞外基质冻干成粉末；和(c)将切块或冻干的工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质与可注射的药学上可接受的载体混合。
在一些实施方式中，该方法还包括使得到的组合物通过具有小于0.60mm2的最小流动面积的一个或多个通道的步骤。“最小流动面积”指的是通道的最小横截面积，如在垂直于通过通道的流动方向的横截面上测量的。例如，如果通道是标准皮下针，则最小通流面积将是限定皮下针内表面横截面的圆的面积。具有0.838mm内径的标准18号的皮下针具有基于圆形公式的面积(横截面面积＝πr2)的最小流动面积0.552mm2。在一些这样的实施例中，一个或多个通道中的至少一个具有小于0.040mm2的最小流通面积。
在一些实施方式中，获得工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质的步骤通过下述进行：(a)从心脏组织分离心脏成纤维细胞或从诱导性多能干(iPS)细胞衍生心脏成纤维细胞；(b)使心脏成纤维细胞在培养中扩增1-15代；和(c)将扩增的心脏成纤维细胞以每平方厘米100,000至500,000个细胞的细胞密度在培养物中铺板。在进行这些步骤中，心脏成纤维细胞分泌具有20-500μm厚度的3维心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质(CF-ECM)。在一些此类实施方式中，该步骤还包括使CF-ECM与脱细胞剂接触，由此使心脏细胞外基质脱细胞。
在一些实施方式中，该方法进一步包括向可注射组合物中加入对心脏疾病，心脏损伤或缺血性损伤有治疗作用的一种或多种细胞的步骤。在一些此类实施方式中，一种或多种细胞可包括骨骼肌成肌细胞，胚胎干(ES)细胞或其衍生物，诱导性多能干(iPS)细胞或其衍生物，多潜能成人生殖干细胞(maGCS)，骨髓间充质干细胞(BMSC)，极小胚胎样干细胞(VSEL细胞)，内皮祖细胞(EPC)，心脏生成细胞(CPC)，心脏球衍生细胞(CDC)，多潜能Isl1+心血管祖细胞(MICP)，心外膜衍生的祖细胞(EPDC)，脂肪衍生的干细胞，来自iPS或ES细胞的人间充质干细胞，来自iPS或ES细胞的人间充质基质细胞，以及它们的组合。
在一些实施方式中，该方法还包括向可注射组合物中加入一种或多种非细胞治疗剂的步骤。在一些此类实施方式中，一种或多种非细胞治疗剂可以包括一种或多种生长因子。在一些此类实施方式中，所述一种或多种生长因子可包括基质细胞衍生因子(SDF-1)、表皮生长因子(EDF)，转化生长因子-α(TGF-α)，肝细胞生长因子(HGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，成纤维细胞生长因子1(FGF-1)，成纤维细胞生长因子2(FGF-2)，转化生长因子-β(TGF-β)和角质形成细胞生长因子(KGF)。
在第四方面，本公开内容包括用于治疗患有缺血性疾病或损伤的对象的方法。该方法包括使呈现局部缺血性疾病或损伤的对象的组织与具有20-500μm厚度的无细胞工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质(CF-ECM)接触，所述细胞外基质包含结构蛋白纤连蛋白、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白和弹性蛋白，其中存在于工程化的细胞外基质中的结构蛋白质的60％-90％为纤连蛋白，并且其中没有细胞被接种到工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质上。进行该方法的结果是，缺血性疾病或损伤的严重程度降低。
在一些实施方式中，无细胞的工程化心脏细胞外基质包含以下的一种或多种：基质细胞蛋白潜伏转化生长因子β1(LTGFB-1)，潜伏转化生长因子β2(LTGFB-2)，***生长因子CTGF)，酸性和富含半胱氨酸的分泌蛋白质(SPARC)，多功能蛋白聚糖核心蛋白(VCAN)，半乳糖凝集素1，半乳糖凝集素3，基质gla蛋白(MGP)，硫酸化糖蛋白1和双糖链蛋白聚糖。
在一些实施方式中，通过下述步骤获得无细胞的工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质：(a)从心脏组织分离心脏成纤维细胞或从诱导性多能干(iPS)细胞衍生心脏成纤维细胞；(b)使心脏成纤维细胞在培养中扩增1-15代；和(c)将扩增的心脏成纤维细胞铺以每平方厘米100,000至500,000个细胞的细胞密度在培养物中铺板，其中心脏成纤维细胞分泌具有20-500μm厚度的3维心脏细胞外基质；和(d)使心脏细胞外基质与脱细胞剂接触，由此使心脏细胞外基质脱细胞。
在一些实施方式中，该方法还包括使呈现缺血性疾病或损伤的对象的组织与一种或多种外源性非细胞治疗剂接触。在一些此类实施方式中，一种或多种非细胞治疗剂包括一种或多种生长因子。在一些此类实施方式中，所述一种或多种生长因子可包括基质细胞衍生因子(SDF-1)、表皮生长因子(EDF)，转化生长因子-α(TGF-α)，肝细胞生长因子(HGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，成纤维细胞生长因子1(FGF-1)，成纤维细胞生长因子2(FGF-2)，转化生长因子-β(TGF-β)和角质形成细胞生长因子(KGF)。
在一些实施方式中，其中所述缺血性疾病或损伤由心肌梗塞，中风，糖尿病足溃疡，外周动脉疾病(PAD)，PAD相关的溃疡或肢体缺血引起。在一些此类实施方式中，缺血性疾病或损伤由肢体缺血引起。在一些此类实施方式中，肢体缺血是动脉粥样硬化或糖尿病的结果。
在第五方面，本公开内容包括用于治疗患有缺血性肢体损伤的对象的方法。该方法包括使呈现局部肢体损伤的对象的组织与具有20-500μm厚度的工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质(CF-ECM)接触，所述细胞外基质包含结构蛋白纤连蛋白、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白和弹性蛋白，其中存在于工程化的细胞外基质中的结构蛋白质的60％-90％为纤连蛋白。通过实施该方法，可以减轻缺血性肢体损伤的严重程度。
在一些实施方式中，工程化的心脏细胞外基质包含以下的一种或多种：基质细胞蛋白潜伏转化生长因子β1(LTGFB-1)，潜伏转化生长因子β2(LTGFB-2)，***生长因子CTGF)，酸性和富含半胱氨酸的分泌蛋白质(SPARC)，多功能蛋白聚糖核心蛋白(VCAN)，半乳糖凝集素1，半乳糖凝集素3，基质gla蛋白(MGP)，硫酸化糖蛋白1和双糖链蛋白聚糖。
在一些实施方式中，工程化的心脏细胞外基质接种有对于缺血性肢体损伤具有治疗性的一种或多种细胞。在一些实施方式中，对缺血性肢体损伤具有治疗性的一种或多种细胞可包括骨骼肌成肌细胞，胚胎干(ES)细胞或其衍生物，诱导性多能干(iPS)细胞或其衍生物，多潜能成人生殖干(maGCS)细胞，骨髓间充质干细胞(BMSC)，极小胚胎样干细胞(VSEL细胞)，内皮祖细胞(EPC)，脂肪来源的干细胞，来源于iPS或ES细胞的人间充质干细胞，来源于iPS或ES细胞的人间充质基质细胞，以及它们的组合。
在一些实施方式中，通过下述步骤获得工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质：(a)从心脏组织分离心脏成纤维细胞或从诱导性多能干(iPS)细胞衍生心脏成纤维细胞；(b)将心脏成纤维细胞在培养中扩增1-15代；和(c)将扩增的心脏成纤维细胞以每平方厘米100,000至500,000个细胞的细胞密度在培养物中铺板，其中心脏成纤维细胞分泌具有20-500μm厚度的3维心脏细胞外基质。
在一些实施方式中，该方法还包括使呈现缺血性损伤的对象的组织与一种或多种外源性非细胞治疗剂接触。在一些此类实施方式中，一种或多种非细胞治疗剂可以包括一种或多种生长因子。在一些此类实施方式中，所述一种或多种生长因子可包括基质细胞衍生因子(SDF-1)、表皮生长因子(EDF)，转化生长因子-α(TGF-α)，肝细胞生长因子(HGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，成纤维细胞生长因子1(FGF-1)，成纤维细胞生长因子2(FGF-2)，转化生长因子-β(TGF-β)和角质形成细胞生长因子(KGF)。
在一些实施方式中，缺血性肢体损伤是动脉粥样硬化或糖尿病的结果。
所公开的组合物和方法在下面进一步详述。
附图说明
当考虑以下的详细描述时，本发明将被更好地理解，并且除了上述内容之外的特征，方面和优点将变得显而易见。这样的详细描述参考了以下附图。
图1显示用黑色组织染料染色的片段化CF-ECM。片段化方案产生异源CF-ECM片段。片段显示为CF-ECM的小”片”。图2显示用黑色组织染料染色的片段化CF-ECM。
图3显示用黑色组织染料染色的片段化CF-ECM。
图4显示用黑色组织染料染色的片段化CF-ECM。
图5显示用黑色组织染料着色并通过心脏导管注射到猪LV中的CF-ECM可注射制剂。应请注意CF-ECM以何种方式存在于间隙空间中。
图6是显示通过超声心动图测量的MI后不同时间四个不同治疗组的射血分数变化的图。仅贴片处理将变化稳定在-10％。
图7是显示通过超声心动图测量的MI后不同时间四个不同治疗组的收缩末期容积的图。
图8是显示四个不同治疗组在MI后第28天的收缩末期容积变化的图。
图9是显示四个不同处理组的横截面病理学测量结果的图。显示的测量值为瘢痕厚度(左上图)，铰点厚度(右上图)，远端壁厚(左下图)和左心室梗塞百分比(右下图)。
图10A是显示灌注指数作为后肢缺血模型中四个治疗组术后天数的函数的图。具体地说，小鼠在双重结扎股动脉后接受下述处理：1.0x106GFP+MSC的CF-ECM、仅CF-ECM没有细胞、仅通过肌内注射递送的GFP+MSC或安慰剂。灌注指数是通过比较患肢到正常肢体的血流量(通过扫描激光多普勒成像)来计算。用CF-ECM处理的动物比经细胞处理的和安慰剂对照具有显著更高的血流量(p＝0.003)。
图10B示出了在后肢缺血模型中的四个治疗组的激光多普勒扫描和对应照片的代表性图像。
图10C是显示无自体截肢作为后肢缺血模型中四个治疗组术后天数的函数的图。与细胞和安慰剂处理的动物相比，CF-ECM处理的动物具有更大的足部保留。
图10D是显示改良缺血指数作为后肢缺血模型中四个治疗组术后天数的函数的图。改良缺血指数是对肢体健康的总体评估。与细胞处理的和安慰剂对照相比，改良缺血指数显示CF-ECM治疗动物强烈的改善趋势。
图11显示了对于每个治疗组的受影响的小腿和大腿肌肉的代表性苏木精和伊红染色。受影响组织的定量组织学评分显示在表1中。
图12显示了在小鼠后肢缺血模型中用CF-ECM转移的GFP+间充质干细胞(MSC)的数据。
图13证明了用CF-ECM转移的GFP+MSC降低了心肌梗塞(MI)后重塑。
图14证明了用CF-ECM转移的GFP+MSC降低了MI后重塑。
图15证明了用CF-ECM转移的GFP+MSC降低了MI后重塑。
图16证明了相对于假处理，单独施用CF-ECM的功效。
图17证明了相对于假处理，单独施用CF-ECM的功效。
图18显示了MSC向可注射的CF-ECM中的1小时接种结果。
图19显示了MSC向可注射CF-ECM中的18小时接种。
图20显示相对于单独注射MSC，注射MSC联合可注射的ECM四(4)小时后细胞保留增加。蓝色＝MSC注射。黄色＝可注射CF-ECM+MSC注射。
图21显示注射MSC联合可注射的ECM后24小时和48小时的增加的细胞保留。
尽管本发明容许各种修改和替代形式，但是其具体实施方式已经通过附图中的示例示出并且在本文中进行了详细描述。然而，应该理解的是，这里对特定实施方式的描述并不意图将本发明限制到所公开的特定形式，而是相反，本发明覆盖如所附权利要求所限定的落入本发明的精神和范围内的所有修改、等同物和替代方案。
发明详述
本申请公开了先前公开的工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质(CF-ECM)的可注射制剂及其制备和使用方法。这样的制剂可用于治疗心脏疾病或损伤，以及其他缺血性损伤，如缺血性肢体损伤。有利地，该制剂可以通过注射(而不需要侵入性手术)直接递送至靶组织。
本申请还公开了未接种治疗性细胞的无细胞工程化CF-ECM用于治疗心脏疾病或损伤的用途，以及使用CF-ECM(带或不带治疗细胞)治疗缺血性肢体损伤的用途。CF-ECM形成的贴片可以很好地粘附在目标组织上，而不需要胶水或缝线，灵活移动，并且成功地将接种的细胞递送到目标组织。
工程化的CF-ECM包括结构蛋白纤连蛋白，I型胶原蛋白，III型胶原蛋白和弹性蛋白，也可以包含其他结构蛋白。在一些实施方式中，工程化的CF-ECM包含V型结构蛋白蛋白胶原。
优选地，纤连蛋白分子构成工程化CF-ECM中存在的结构蛋白分子的60％至90％。在一些实施方式中，纤连蛋白分子构成ECM中存在的结构蛋白分子的70％至90％。在一些实施方式中，纤连蛋白分子构成工程化的CF-ECM中存在的结构蛋白分子的80％至90％。
在其被片段化或冻干之前，工程CF-ECM具有20-500μm的厚度。在一些实施例中，未片段化的CF-ECM具有30-200μm或50-150μm的厚度范围。在一些实施方式中，超过80％的存在的结构蛋白分子是纤连蛋白分子。
优选地，工程化的CF-ECM的结构蛋白不是化学交联的。
除了结构蛋白之外，心脏ECM可以包括一种或多种基质细胞蛋白，例如生长因子和细胞因子，以及其他物质。心脏ECM中可存在的其他蛋白质的非限制性示例包含潜伏转化生长因子β1(LTGFB-1)，潜伏转化生长因子β2(LTGFB-2)，***生长因子CTGF)，酸性和富含半胱氨酸的分泌蛋白质(SPARC)，多功能蛋白聚糖核心蛋白(VCAN)，半乳糖凝集素1，半乳糖凝集素3，基质gla蛋白(MGP)，硫酸化糖蛋白1，蛋白-赖氨酸6-氧化酶和双糖链蛋白聚糖。在一些实施方式中，ECM可以任选地包含以下的一种或多种：转化生长因子β1(TGFB-1)，转化生长因子β3(TGFB-3)，表皮生长因子样蛋白8，生长/分化因子6，颗粒蛋白，半乳糖凝集素3结合蛋白，巢蛋白1，巢蛋白2，核心蛋白聚糖，脯精蛋白(prolargin)，血管内皮生长因子D(VEGF-D)，冯维勒布兰德因子A1，冯维勒布兰德因子A5 A，基质金属蛋白酶14，基质金属蛋白酶23，血小板因子4，凝血酶原，肿瘤坏死因子配体超家族成员11和神经胶质衍生的连接蛋白(nexin)。
任选地，工程化的CF-ECM是脱细胞的，因此基本上没有完整的心脏成纤维细胞。在一些实施方式中，CF-ECM可以使用本领域已知的方法用对心脏疾病或损伤有治疗作用的一种或多种细胞接种。可用于接种生物支架的治疗细胞类型的示例包括但不限于骨骼肌成肌细胞，胚胎干(ES)细胞或其衍生物，诱导性多能干细胞(iPS)，多潜能成人生殖干细胞(maGCS)，骨髓间充质干细胞(BMSC)，极小胚胎样干细胞(VSEL细胞)，内皮祖细胞(EPC)，心脏生成细胞(CPC)，心脏球衍生细胞(CDC)，多潜能Isl1+心血管祖细胞(MICP)，心外膜衍生的祖细胞(EPDC)，脂肪衍生的干细胞，(来自iPS或ES细胞的)人间充质干细胞，(来自iPS或ES细胞的)人间充质基质细胞，以及它们的组合。所有这些细胞类型在本领域中都是众所周知的。
工程化CF-ECM的制造方法以及关于其结构和组成的更多信息公开于例如美国专利第8,802,144号中，其通过引用纳入本文。
所公开的可注射组合物包括工程化CF-ECM的一个或多个片段以及可注射的药学上可接受的载体，其中片段足够小以能够自由通过皮下注射针头开口。在一些实施例中，片段足够小以穿过标称内径为0.838mm的18号的皮下注射针头的开口。在其他实施方式中，片段足够小以通过19号(标称内径0.686mm)，20号(标称内径0.603mm)，21(标称内径0.514mm)，22号(公称内径为0.413mm)，23号(公称内径为0.337mm)，24号(公称内径为0.311mm)，25号(公称内径为0.260mm)，26号(公称内径为0.260mm)和/或27号(标称内径0.210mm)皮下注射针头。
在一个非限制性例子中，片段可以通过用例如剃刀刀片、解剖刀或剪刀切割工程化的CF-ECM而形成。任选地，一旦产生，片段可以被悬浮并且通过皮下注射针一次或多次。
在另一个非限制性示例中，可以通过将工程化的CF-ECM冻干(冷冻干燥和粉末化)来形成片段。冻干是用于制备药物组合物的公知技术。在一些情况下，使用冻干来控制片段大小。
如本文所用，“药物组合物”是指治疗有效量的CF-ECM片段以及合适的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂或辅助剂，统称为“药学上可接受的载体”。如本文所用，术语“有效量”和“治疗有效量”是指足以产生所需治疗响应的活性治疗剂的量，没有过度的不良副作用，如严重毒性、严重刺激或严重过敏反应。显然，具体的“有效量”将随着所治疗的特定病症，患者的身体状况，被治疗的动物的类型，治疗的持续时间，并行治疗的性质(如果有的话)以及所用的具体制剂和化合物或其衍生物的结构等因素而不同。本领域普通技术人员使用常规实验可以容易地确定最佳有效量。
此外，如本文所用，“药学上可接受的载体”是本领域技术人员公知的，并且包括但不限于0.01-0.1M，优选0.05M磷酸盐缓冲液或0.9％盐水。另外，这样的药学上可接受的载体可以是水性或非水性溶液、悬液和乳液。非水性溶剂的示例是丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性载体包括但不限于水，醇/水溶液，乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。
肠胃外载剂包括氯化钠溶液，林格氏右旋糖，右旋糖和氯化钠，乳酸林格氏液和不挥发油。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂如基于林格氏右旋糖的那些，等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗菌剂，抗氧化剂，调整剂(collating agent)，惰性气体等。
可注射组合物可用于治疗心脏疾病或损伤，缺血性肢体损伤或由于中断对组织的血液供应而造成的其它损伤。在一些情况下，使用用于经心内膜递送的任何适当手段将可注射组合物递送到心脏腔室的心内膜壁中。例如，递送导管可以用于递送可注射组合物以治疗心脏疾病或病症。其他递送装置可以用于实现如本文所述的可注射组合物的治疗性或诊断性递送。例如，可注射组合物可以使用诸如Myostar(Biosense Webster公司)，Helix(Biocardia公司)，Bullfrog(Mercator MedSystems公司)或C-Cath(Cardio3生物科学公司)的心脏针尖注射导管递送。有利地，通过本文描述的注射方法递送可注射组合物侵入性极小，并且可以在没有全身麻醉，体外循环(例如，通过心肺机的循环)，循环支持或胸部开口的情况下实现。因此，患者的并发症预期和风险显著降低。
在一些情况下，使用任何适当的手段将可注射组合物递送至心脏外壁(心外膜)，用于心外膜递送。例如，本文所述的可注射组合物的心外膜递送可以使用包括针和/或注射器的递送装置来实现。
本申请进一步公开了用于无细胞工程化的CF-ECM的治疗用途，包括但不限于治疗心脏疾病或损伤，缺血性肢体损伤或由于中断对组织的血液供应而造成的其它损伤。
本申请进一步公开了工程化的CF-ECM，具有或不具有接种的治疗细胞，治疗缺血性肢体损伤和相关难治愈缺血性溃疡的治疗用途。
下述实施例仅出于示例目的，并不旨在以任何方式限制本发明范围。事实上，除了本文所示和所述的那些以外，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言从前面的描述和以下实施例将变得显而易见，并落入所附权利要求的范围内。
实施例
实施例1：工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质的可注射制剂
在本实施例中，我们从心脏成纤维细胞产生工程化的ECM，使工程化ECM去细胞化，并使工程化的ECM片段化以制造工程化CF-ECM的注射制剂。通过导管注射将所得制剂成功递送到猪心脏中。因此，本实施例展示了可使用低侵入性非手术方法被递送至心脏的工程化CF-ECM的替代组合物。此外，片段化的制剂极大地增加了递送的工程化CF-ECM的表面积，导致对先前公开的心脏疾病或损伤应用以及本申请首次公开的缺血性伤口应用两者的益处增加。
方法和结果
工程化的心脏成纤维细胞衍生细胞外基质(CF-ECM)。使用之前描述的方法(参见美国专利号8,802,144和Schmuck，EG等人，Cardiovasc Eng Technol 5(1)(2014)：119-131,二者通过引用纳入本文)制造工程化的成纤维细胞衍生的细胞外基质。简而言之，通过CO2窒息处死雄性Lewis大鼠(260-400g)，迅速切出心脏，去除心房并将心室置于含有1％青霉素/链霉素的冰冷的PBS中。在杜尔贝科改良的伊戈培养基(DMEM)、73U/mL胶原酶2、2μg/mL胰酶(4x)中将心脏切碎并消化，并在37℃搅拌65分钟。消化的组织通过70μm细胞过滤器筛分，并在4℃下以1000×g离心20分钟。将细胞沉淀重新悬浮并铺在两个T75培养瓶中。使细胞在标准培养条件下(37℃，5％CO2，100％湿度)附着2小时，然后通过用PBS洗涤去除非贴壁细胞，并且将培养基(DMEM，10％胎牛血清FBS)，1％青霉素/链霉素)取代并培养至融合。
CF-ECM支架的形成通过下述过程诱导：在高葡萄糖DMEM+10％FBS和1％青霉素/链霉素中培养以大约1.1x105-2.2x105/cm2的密度铺板的心脏成纤维细胞(2-3代)，并在37℃，5％CO2和100％湿度下培养7至15天。通过除去培养基并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗成纤维细胞，从培养皿中取出成纤维细胞(片状)。然后将细胞片用PBS溶液中的2mM EDTA在37℃下孵育，直到它们离开平板表面(大约五分钟)。
优化的工程化CF-ECM脱细胞方案。然后将得到的心脏成纤维细胞细胞片剥去细胞。室温(RT)下在转器上，所述片经历两次交替15分钟低渗/高渗Tris缓冲盐水(TBS)(低渗，高渗，低渗，高渗)洗涤。高渗TBS包括500mM NaCl/50mM Tris，并具有7.6-8.0的碱性pH。类似地制备低渗TBS，只是它仅包含10mM Tris(碱性pH7.6-8.0)。
接下来，室温下在旋转器上，使用等渗TBS中的1％磷酸三正丁酯(TnBP)将片材洗涤72小时。等渗Tris包括150mM NaCl/50mM Tris(碱性pH7.6-8.0)。随后，将片材在PBS中冲洗2分钟，接着在旋转器上在37℃下在低渗TBS中的90U/mL DNA酶(Qiagen公司)中洗涤3小时。接着在低渗TBS中进行2x2分钟的冲洗，之后将贴片移到不同的盘中。然后在室温下旋转器上，在乙醇中洗涤2x2分钟，并在分子级H2O中洗涤2小时。将得到的脱细胞的工程化的CF-ECM在4℃储存在PBS中直到准备好使用。
可注射的CF-ECM片段化方案。如上所述制备的CF-ECM用剃刀刀片、解剖刀或剪刀切割，直到产生小(约2mm×2mm)片段。将小CF-ECM片段悬浮在1-5mL等渗缓冲液(盐水，PBS，TBS，Plasmalyte A)中并转移至适当大小的管中。然后将含有CF-ECM片段的悬浮液通过连接至3-5ml注射器的18号针头15-20次。随后将得到的CF-ECM悬浮液通过连接至3-5m注射器的21号针头15-20次。随后将得到的CF-ECM悬浮液通过连接至3-5m注射器的24号针头15-20次。随后将得到的CF-ECM悬浮液通过连接至3-5m注射器的27号针头15-20次。然后将得到的CF-ECM悬浮液在5000-10,000×g下离心10-15分钟。
为了形成最终的可注射组合物，将片段化的CF-ECM悬浮于适于注射的体积(0.5-5mL)的等渗注射溶液(生理盐水，Plasmalyte A)中。片段化的CF-ECM是小而不均匀的片状片段(参见图1-4)。
可注射的片段化CF-ECM组合物的测试。
在心脏注射导管(27号针头导管)中测试片段化的CF-ECM的可注射组合物。试验证实，即使留置一小时的时间(在导管中静置的时间)，CF-ECM片段也可以穿过导管而不会堵塞。进一步的测试表明，CF-ECM片段易于与细胞结合，并且仍然可以作为接种的材料。在一个测试中，将细胞结合到完整的CF-ECM支架上，然后片段化以供注射。在另一个测试中，将CF-ECM支架片段化，然后将细胞与片段混合物结合。
将含有CF-ECM片段的可注射组合物通过注射导管注入猪心室。进一步的测试显示CF-ECM片段被成功地递送到猪心脏中。在注射之前通过对CF-ECM染黑色在心室中检测到CF-ECM的可注射组合物。可注射的CF-ECM主要在左心室的间质空间中观察到(见图5)。
结论
本实施例表明，含有片段化的工程化的CF-ECM可注射制剂可以通过注射心脏导管(例如Helix或Myostar)以极小侵入方式向心脏施用。相反，之前公开的CF-ECM“贴片”必须通过执行侵入性外科手术而被植入到目标组织上。此外，通过CF-ECM的片段化，所使用的CF-ECM的总表面积增加超过40倍，这可能导致增加的治疗功效。
如以下实施例所示，即使在没有治疗细胞的情况下，完整的CF-ECM支架也可以用作治疗受损心脏组织或缺血性肢体损伤的治疗剂。因此，可注射的CF-ECM片段制剂可以用作独立疗法，或者可以接种治疗性细胞用于移植。在用作治疗性细胞递送平台时，CF-ECM片段可与任何贴壁细胞类型配对。贴壁细胞快速附着于CF-ECM，并可通过针头和注射器或针尖导管递送至病变心肌(或任何器官/组织)，增加目标组织中的细胞保留。
实施例2：工程化的CF-ECM“贴片”在大鼠心肌梗塞模型中显示治疗效果，即使在没有接种的细胞的情况下也是如此
工程化的CF-ECM先前被公开为用于将治疗细胞递送至受损或疾病心脏组织的平台(参见例如美国专利号8,802,144；Schmuck，EG等人，Cardiovasc Eng Technol5(1)(2014):119-131，二者通过引用纳入本文)。在这个实施例中，我们报告了令人惊讶的发现，即使在缺乏治疗性细胞的情况下，工程化的CF-ECM“贴片”也具有治疗效果，如在心肌梗塞(MI)的大鼠模型中所证明。
方法和结果
工程化心脏成纤维细胞衍生细胞外基质(CF-ECM)。使用之前描述的方法(参见美国专利号8,802,144和Schmuck，EG等人，Cardiovasc Eng Technol 5(1)(2014):119-131,二者通过引用纳入本文)制造工程化的成纤维细胞衍生的细胞外基质。简而言之，通过CO2窒息处死雄性Lewis大鼠(260-400g)，迅速切出心脏，去除心房并将心室置于含有1％青霉素/链霉素的冰冷的PBS中。在杜尔贝科改良的伊戈培养基(DMEM)、73U/mL胶原酶2、2μg/mL胰酶(4x)中将心脏细碎并消化，并在37℃搅拌65分钟。消化的组织通过70μm细胞过滤器筛分，并在4℃下以1000×g离心20分钟。将细胞沉淀重新悬浮并铺在两个T75培养瓶中。使细胞在标准培养条件下(37℃，5％CO2，100％湿度)附着2小时，然后通过用PBS洗涤去除非贴壁细胞，并且将培养基(DMEM，10％胎牛血清FBS)，1％青霉素/链霉素)取代并培养至融合。
大鼠LAD永久性结扎模型。在12周龄雄性Lewis大鼠中通过左前降支结扎(LAD永久性结扎模型；参见Kumar D.等，Coron Artery Dis.2005年2月；16(1):41-44)来诱导心肌梗塞。结扎LAD并闭合胸部，建模心肌梗塞(MI)MI后48小时，打开胸部，进行四种不同治疗之一：(1)将没有细胞的CF-ECM贴片置于梗塞区域(仅贴片)；(2)用大鼠间充质干细胞(MSC)接种2小时的CF-ECM贴片置于梗塞区域(接种贴片)；(3)将大鼠间充质干细胞(MSC)置于没有CF-ECM贴片的梗死区域(仅细胞)；和(4)在梗塞区域(假)没有细胞或CF-ECM贴片。
超声心动图。在MI后第0、7、14、21和28天对每只大鼠进行连续超声心动图。MI导致进行性的有害的左心室扩张。如通过射血分数的变化(图6)和收缩末期体积(图7和8)所测量的，与假手术相比，接种的贴片和贴片均产生可测得的治疗效果。
横切面病理学。处死大鼠，在梗塞的心脏上进行横切面病理学检查。具体而言，测量瘢痕厚度，铰点厚度，远端壁厚度和左心室组织梗死百分比。与假处理相比，用接种的贴片和仅贴片处理导致铰点厚度，瘢痕厚度和远端壁厚度的增加(图9)。
结论
总之，这些结果令人惊讶地表明无细胞CF-ECM贴片可以在不存在接种的细胞的情况下用作治疗心脏疾病或损伤的治疗剂。
实施例3：工程化CF-ECM“贴片”在小鼠肢体局部缺血模型中显示治疗效果，无论是否存在接种的细胞皆如此
工程化的CF-ECM先前被公开为用于将治疗细胞递送至受损或疾病心脏组织的平台(参见例如美国专利号8,802,144；Schmuck，EG等人，Cardiovasc Eng Technol5(1)(2014):119-131，二者通过引用纳入本文)。在本实施例中，令人惊讶的发现：工程化的CF-ECM“贴片”在缺血性肢体损伤模型中具有治疗效果，无论是否有治疗性细胞接种到贴片上皆如此。
方法
成纤维细胞衍生的细胞外基质。使用之前描述的方法(参见美国专利号8,802,144和Schmuck，EG等人，Cardiovasc Eng Technol 5(1)(2014):119-131,二者通过引用纳入本文)制造工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质(CF-ECM)。简言之，通过CO2窒息处死雄性Lewis大鼠(260-400g)，迅速切出心脏，去除心房并将心室置于含有1％青霉素/链霉素的冰冷的PBS中。在杜尔贝科改良的伊戈培养基(DMEM)、73U/mL胶原酶2、2μg/mL胰酶(4x)中将心脏细碎并消化，并在37℃搅拌65分钟。消化的组织通过70μm细胞过滤器筛分，并在4℃下以1000×g离心20分钟。将细胞沉淀重新悬浮并铺在两个T75培养瓶中。使细胞在标准培养条件下(37℃，5％CO2，100％湿度)附着2小时，然后通过用PBS洗涤去除非贴壁细胞，并且将培养基(DMEM，10％胎牛血清FBS)，1％青霉素/链霉素)取代并培养至融合。
CF-ECM支架的形成通过下述过程诱导：在高葡萄糖DMEM+10％FBS和1％青霉素/链霉素中培养以大约1.1x105-2.2x105/cm2的密度铺板的心脏成纤维细胞(2-3代)，并在37℃，5％CO2和100％湿度下培养10至14天。通过在37℃下用2mM EDTA溶液孵育从培养皿中取出成纤维细胞作为片。然后通过与分子级水一起孵育，随后在4℃和0.15％过乙酸中孵育24-48小时并恒定搅拌，使得到的成纤维细胞的细胞片脱细胞。然后用无菌水、之后用PBS反复冲洗得到的基质。
得到的CF-ECM支架大约是直径为16mm，厚度为200μm的半透明支架，其容易处理并且自然贴附于组织，不需要缝合线或胶合剂。
GFP+胚胎干细胞衍生的间充质干细胞。第22代人ESC系H9 Cre-LoxP(组成型EGFP表达)获自WiCell公司(威斯康星州麦迪逊市)。将细胞在
Figure GDA0003062264800000161
(BD生物科学公司)包被的烧瓶中的mTeSRTM培养基(StemCell科学公司)中培养3-4代，而不去除分化的区域。分化的细胞经分离并培养于组织培养塑料上在MSC生长培养基(10％MSC表征的FBS，MEM非必需氨基酸，α-MEM)中，直到所有细胞具有成纤维细胞样形态。细胞表现出以下流式细胞术概况：CD14-，CD31-，CD34-，CD45-，CD73+，CD90+和CD105+。在植入前将7.5x 105个GFP+MSC接种在成纤维细胞外基质支架上2小时或悬浮于500μl PBS中用于注射。
对这些细胞进行体外测试以确定MSC表型。为了成脂和成骨分化，将MSC置于24孔板中并生长至汇合。加入成脂和成骨分化培养基(Miltenyi生物技术公司，加利福尼亚州奥本市)并每3-4天更换一次共21天。通过油红O染色(Sigma-Aldrich公司，密苏里州圣路易斯市)检测脂肪细胞脂滴。通过茜素红S染色(Sigma-Aldrich公司)检测成骨细胞钙化。对于软骨形成分化，将2.5x105个细胞放入深孔96孔板中并离心以制成团块。培养基每3-4天更换一次，共24天。使用阿尔新蓝(染色葡糖胺聚糖)染色的软骨细胞团块的石蜡包埋切片检测软骨细胞。
小鼠后肢缺血模型和治疗性递送。所有程序均按照威斯康星大学麦迪逊机构动物护理和使用委员会的政策和指导方针进行。如先前所述(Westvik TS，Fitzgerald TN，MutoA，Maloney SP，Pimiento JM，Fancher TT等，“老年小鼠髂骨结扎后的肢体缺血刺激无动脉生成的血管生成(Limb ischemia after iliac ligation in aged mice stimulatesangiogenesis without arteriogenesis)”，Journal of vascular surgery.2009；49:464-473)产生后肢缺血模型。简而言之，用2-5％吸入异氟烷麻醉重18.1+/-1.4g的免疫活性雌性Balb/C小鼠。将动物剥离从剑突至尾部至膝盖水平的毛发，然后以仰卧位置于加热的水毯上并维持吸入1-3％异氟烷。中线切口进入髂总动脉。使用钝性解剖，暴露并从静脉和周围组织中分离左侧髂总动脉，然后用约6-0丝以约3mm的间隔双重结扎。结扎后，关闭腹壁和皮肤。通过腹股沟切口进入左股动脉。如上所述分离股动脉并暴露于腹股沟韧带的远侧至腘动脉的近侧。最后，将股动脉用6-0丝双重结扎并在结扎之间平分。然后将研究剂皮下或肌内施用(见下文)，关闭皮肤，并使动物康复。
将小鼠分成4个治疗组：A组：装载有1.0x 106GFP+MSC的CF-ECM经皮下递送到内收肌上。B组：只有CF-ECM而无细胞皮下递送到内收肌。C组：仅GFP+MSC通过肌内注射进入内收肌。D组：生理盐水组成的对照组通过肌内注射进入内收肌。使用27G针头和1mL注射器进行肌内注射，大约在股动脉周围分布的4处位点注射到外展肌中。CF-ECM定向于细胞侧并均匀分布以覆盖股骨结扎。
终点。所有四组中的动物在处理后存活至35天，然后处死。使用数字摄影、纵向激光多普勒测定和半定量组织病理学测量组织坏死和后肢灌注。另外，如先前所述(参见Westvik TS，Fitzgerald TN，Muto A，Maloney SP，Pimiento JM，Fancher TT等，“老年小鼠髂骨结扎后的肢体缺血刺激无动脉生成的血管生成(Limb ischemia after iliacligation in aged mice stimulates angiogenesis without arteriogenesis)”，Journal of vascular surgery.2009；49:464-473)计算改良的缺血(MII)指数分数。
扫描激光多普勒灌注。术后第2、7、14、21、28、35天使用Moor仪器有限公司(英国德文郡阿克明斯特密耳威)的moorLDI激光多普勒成像仪进行激光多普勒扫描。简而言之，在扫描期间，将小鼠用2-5％吸入异氟烷麻醉并维持在1.5％异氟烷。小鼠以仰卧位固定，多普勒扫描仪场内(6.0cm×3.2cm)包含下肢腹面。以10ms/像素的分辨率扫描小鼠。室温是24.4±1℃。每个时间点每只动物进行三次扫描并平均为最终测量。使用moorLDI图像软件进行分析。使用2mm的感兴趣的圆形区域在刚好在第一个数位的远端的爪的腹面的中心进行分析。
组织病理学。后肢从脊柱脱离骨盆而分离。然后在内侧切下尾肢皮肤以允许适当的固定。在Surgipath Decalcifier I(Leica公司)中将组织脱钙24小时，然后在10％***中固定。将组织在大腿和小腿处横切，包埋在石蜡中，切下10μm切片并用甲血毒素和伊红染色。兽医病理学家开发了定量评分***来评估核集中，脂肪浸润，骨髓坏死，纤维化和肌纤维异质性。
结果
在CF-ECM上递送的GFP+ESC衍生的MSC导致严重肢体缺血的小鼠模型中灌注的显著改善。26只Balb/C小鼠经股动脉结扎成功诱导严重后肢缺血。在建模时，将小鼠随机分成四组：安慰剂注射，hMSC注射，仅CF-ECM支架和hMSC接种的CF-ECM支架。所有小鼠在手术和治疗中幸存下来，由于细胞活力较差，仅细胞注射组中的两只小鼠被排除在分析之外。
通过激光多普勒扫描在手术后第2天确认严重局部缺血(图10A)。在35天的实验过程中，安慰剂注射和hMSC注射(图10A-10B)相比，仅CF-ECM和hMSC接种的CF-ECM中存在显著的时间处理相互作用(p＝0.03)。用接种了hMSC的CF-ECM处理的动物具有最低的自体截肢率(图10C)。与安慰剂注射和hMSC注射相比，仅CF-ECM和接种hMSC的CF-ECM组的改良缺血指数评分最高(图10D)。
定量组织学分析。缺血小腿(IC)和大腿(IT)的定量组织学评分由认证的兽医病理学家(DS)进行(表1)。骨髓坏死是严重缺血的指标，在所有组中都被标记为严重。肌纤维异质性是再生的标志，相比安慰剂注射组(IC＝2.+/-0.3,IT＝2.1+/-0.2)和仅hMSC注射组(IC＝3.0+/-0.4,IT＝2.6+/-0.2)，肌纤维异质性在CF-ECM组(IC＝3.7+/-0.3；IT＝3.0+/-0.2)和接种hMSC的CF-ECM(IC＝3.8+/-0.3,IT＝3.2+/-0.2)组中显著增加(p＝0.04)。核集中(IC p＝0.35,IT p＝0.59)、脂肪浸润(IC p＝0.37,IT p＝0.63)、骨髓坏死(IC p＝0.32,IT p＝0.64)和纤维化(IC p＝0.62,IT p＝0.64)中总体上没有差异。IC(p＝0.60)或IT(p＝0.97)(图11)中的每高能量视野中的肌细胞不受治疗的影响，但是所有治疗中IC(p＝0.0001)和IT(0.0004)的肌细胞面积显著降低。
表1显示受影响组织的定量组织学评分。注意与大腿(p＝0.0035)和小腿(p＝0.05)中的细胞处理和假对照相比，CF-ECM处理的动物中肌细胞异质性显著增加。肌细胞异质性是肌肉再生的标志。
结论
本实施例显示工程化的CF-ECM“贴片”可以用来有效治疗肢体缺血。贴片可以用作无细胞疗法，或用可能的治疗性细胞接种。
表1：受影响组织的定量组织学评分
Figure GDA0003062264800000191
实施例4：即使在没有接种的细胞的情况下，工程化的CF-ECM片也显示治疗效果
使用大鼠心肌梗死模型来测定有和没有接种细胞的CF-ECM功效。当用CF-ECM转移大鼠MSC(rMSC)时，MI后的δ射血分数保留(图12)，收缩末期体积增加(图13)，并且MI后重建减少(图14和15)。CF-ECM+MSC的组合改善了收缩末期容积，射血分数，铰点厚度和瘢痕厚度。即使没有接种的细胞，单独CF-ECM也能改善射血分数，铰点厚度和疤痕厚度。
如图16和17所示，单独施用CF-ECM相对于假处理可有效降低收缩末期容积(ESV)并增加射血分数。
总之，这些测定表明单独施用CF-ECM足以改善射血分数，收缩末期容积，收缩末期压力，舒张末期容积和收缩末期容积关系(ESPVR)。因此，单独施用CF-ECM是有益的。
实施例5：间充质干细胞(MSC)注射和保留试验
可注射的CF-ECM为临床应用提供了许多优势。例如，CF-ECM的注射是低侵入性的并且可以被递送用于心脏再生疗法，而不需要心脏直视手术。这是很重要的，因为心脏细胞疗法对其有益的许多人由于病重而无法进行心脏直视手术。可注射CF-ECM的极小侵入性注射将增加可接受心脏细胞治疗的病人库。注射CF-ECM可以提供给心脏的更多区域，包括直接递送到心脏壁，而不需要细胞迁移以实现移植细胞的有利布置。
用GFP+MSC将CF-ECM接种1小时18小时。如图18和19分别所示，MSC迁移到CF-ECM材料的聚集体中。
使用健康大鼠进行细胞保留测定(无心肌梗塞；n＝5)。向心脏注射：(1)用QTRACKERTM525探针标记的1x106个rMSC；(2)用QTRACKERTM655探针标记的1x106个rMSC并接种到可注射的CF-ECM中。在以下时间点收集数据：4小时，24小时，48小时，6天和7天。使用3D低温成像评估细胞保留。
如图20所示，可注射的CF-ECM在注射后四(4)小时增加细胞保留。如图21所示，可注射的CF-ECM在注射后24和48小时增加细胞保留。考虑到与在4小时时间点观察到的与CF-ECM结合的rMSC的类似分布，可能QTRACKERTM655探针丢失，并且多余的GFP信号被误解为“裸”rMSC。
这些数据表明可以使用针尖心脏导管递送CF-ECM的可注射制剂，与“裸”注射MSC(即无可注射CF-ECM的注射)相比，CF-ECM在4小时显著增加了心脏壁中的细胞保留。表达eGFP的细胞系的利用使得在4小时的时间点之后难以解释数据。例如，QTRACKERTM655探针报道基因表达在24小时后难以检测。
总之，CF-ECM可以制成片状制剂或可注射制剂。两种制剂都允许靶向递送细胞。使用片状制剂和可注射制剂，治疗性细胞保留得到极大的改善。另外，我们证明CF-ECM本身具有天然的生物活性。
本申请中所列的所有参考文献均通过引用纳入本文用于所有目的。虽然这里已经讨论了所公开的主题的具体实施例和示例，但是这些示例是说明性的而不是限制性的。本领域的技术人员阅读了本说明书和下面权利要求后将清楚了解许多变化。

Claims (24)

1.一种用于治疗心脏疾病、心脏损伤或缺血性损伤的未接种治疗细胞的无细胞可注射组合物，其包含：
(a)工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质的一个或多个片段，其包含结构蛋白纤连蛋白，I型胶原蛋白，III型胶原蛋白和弹性蛋白，其中该工程化的细胞外基质中存在的结构蛋白质的60％-90％是纤连蛋白，其中所述一个或多个片段足够小以通过18号皮下注射针的注射开口；和
(b)可注射的药学上可接受的载体。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述工程化的心脏细胞外基质的结构蛋白不是化学交联的。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述一个或多个片段具有20-500μm的厚度。
4.如 权利要求1所述 的组合物，其中所述一个或多个片段为冻干粉末的形式。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述工程化的心脏细胞外基质还包含以下的一种或多种：基质细胞蛋白潜伏转化生长因子β1(LTGFB-1)，潜伏转化生长因子β2(LTGFB-2)，***生长因子(CTGF)，酸性和富含半胱氨酸的分泌蛋白质(SPARC)，多功能蛋白聚糖核心蛋白(VCAN)，半乳糖凝集素1，半乳糖凝集素3，基质gla蛋白(MGP)，硫酸化糖蛋白1和双糖链蛋白聚糖。
6.如权利要求1所述的组合物，还包含一种或多种外源性非细胞治疗剂。
7.如权利要求6所述的组合物，其中所述一种或多种外源性非细胞治疗剂包括一种或多种生长因子。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述一种或多种生长因子选自表皮生长因子(EDF)，转化生长因子-α(TGF-α)，肝细胞生长因子(HGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，成纤维细胞生长因子1(FGF-1)，成纤维细胞生长因子2(FGF-2)，转化生长因子-β(TGF-β)、基质衍生因子-1(SDF-1)和角质形成细胞生长因子(KGF)。
9.如权利要求1所述的组合物，其中所述一个或多个片段足够小以穿过27号皮下注射针的注射开口。
10.权利要求1所述的组合物在制备用于治疗患有心脏疾病，心脏损伤，缺血性疾病或缺血性损伤的对象的可注射药物中的应用。
11.如权利要求10所述的应用，其中所述心脏疾病，心脏损伤，缺血性疾病或缺血性损伤由急性心肌梗塞，心力衰竭，病毒感染，细菌感染，先天性缺陷，中风，糖尿病足溃疡，外周动脉疾病(PAD)，PAD相关的溃疡或肢体缺血造成。
12.具有20-500μm厚度的无细胞工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质在制备用于治疗具有缺血性疾病或损伤的对象的药物中的应用，所述细胞外基质包含结构蛋白纤连蛋白、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白和弹性蛋白，其中存在于工程化的细胞外基质中的结构蛋白质的60％-90％为纤连蛋白，并且其中没有细胞被接种到工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质上。
13.如权利要求12所述的应用，其中所述无细胞工程化的心脏细胞外基质还包含以下的一种或多种：基质细胞蛋白潜伏转化生长因子β1(LTGFB-1)，潜伏转化生长因子β2(LTGFB-2)，***生长因子(CTGF)，酸性和富含半胱氨酸的分泌蛋白质(SPARC)，多功能蛋白聚糖核心蛋白(VCAN)，半乳糖凝集素1，半乳糖凝集素3，基质gla蛋白(MGP)，硫酸化糖蛋白1和双糖链蛋白聚糖。
14.如权利要求12所述的应用，还包括使呈现缺血性疾病或损伤的对象的组织与一种或多种外源性非细胞治疗剂接触。
15.如权利要求14所述的应用，其中所述一种或多种非细胞治疗剂包括一种或多种生长因子。
16.如权利要求15所述的应用，其中所述一种或多种生长因子选自基质衍生因子(SDF-1)、表皮生长因子(EDF)，转化生长因子-α(TGF-α)，肝细胞生长因子(HGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，成纤维细胞生长因子1(FGF-1)，成纤维细胞生长因子2(FGF-2)，转化生长因子-β(TGF-β)和角质形成细胞生长因子(KGF)。
17.如权利要求12所述的应用，其中所述缺血性疾病或损伤由心肌梗塞，中风，糖尿病足溃疡，外周动脉疾病(PAD)，PAD相关的溃疡或肢体缺血引起。
18.如权利要求17所述的应用，其中所述肢体缺血是动脉粥样硬化或糖尿病的结果。
19.具有20-500μm厚度的工程化的心脏成纤维细胞衍生的无细胞细胞外基质在制备用于治疗具有缺血性肢体损伤的对象的药物中的应用，所述细胞外基质包含结构蛋白纤连蛋白，I型胶原蛋白，III型胶原蛋白和弹性蛋白，其中存在于工程化的细胞外基质中的结构蛋白质的60％-90％是纤连蛋白，其中没有细胞被接种到工程化的心脏成纤维细胞衍生的细胞外基质上。
20.如权利要求19所述的应用，其中所述工程化的心脏细胞外基质还包含以下的一种或多种：基质细胞蛋白潜伏转化生长因子β1(LTGFB-1)，潜伏转化生长因子β2(LTGFB-2)，***生长因子CTGF)，酸性和富含半胱氨酸的分泌蛋白质(SPARC)，多功能蛋白聚糖核心蛋白(VCAN)，半乳糖凝集素1，半乳糖凝集素3，基质gla蛋白(MGP)，硫酸化糖蛋白1和双糖链蛋白聚糖。
21.如权利要求19所述的应用，还包括使呈现缺血性损伤的对象的组织与一种或多种外源性非细胞治疗剂接触。
22.如权利要求21所述的应用，其中所述一种或多种非细胞治疗剂包括一种或多种生长因子。
23.如权利要求22所述的应用，其中所述一种或多种生长因子选自基质衍生因子(SDF-1)、表皮生长因子(EDF)，转化生长因子-α(TGF-α)，肝细胞生长因子(HGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，成纤维细胞生长因子1(FGF-1)，成纤维细胞生长因子2(FGF-2)，转化生长因子-β(TGF-β)和角质形成细胞生长因子(KGF)。
24.如权利要求19所述的应用，其中所述缺血性肢体损伤是动脉粥样硬化的结果。
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