DE60029566T2

DE60029566T2 - In-vitro herstellung von transplantierbarem knorpelgewebe

Info

Publication number: DE60029566T2
Application number: DE60029566T
Authority: DE
Inventors: Koichi Wilmette MASUDA; J-M. Eugene Lockport THONAR; Michael Riverside HEJNA
Original assignee: Rush University Medical Center
Current assignee: Rush University Medical Center
Priority date: 1999-03-01
Filing date: 2000-02-29
Publication date: 2007-07-26
Anticipated expiration: 2020-03-01
Also published as: US6197061B1; DE60044793D1; EP1158938A4; JP2002537896A; US20010012965A1; JP4237415B2; CA2362658C; EP1158938A1; EP1738717A3; AU771467B2; ATE333849T1; EP1738717B1; EP1738717A2; EP1158938B1; DE60029566D1; HK1102081A1; US6451060B2; ATE476155T1; CA2362658A1; AU3383900A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Knorpelgewebe zur chirurgischen Einpflanzung in menschliche Gelenke, damit Mängel beim Gelenkknorpel aufgefüllt oder Schäden oder zurückgebildeter Knorpel ausgetauscht wird.
Hintergrund der Erfindung
Knorpelverletzung und Erneuerung
Menschliche Gelenkoberflächen sind von Gelenkknorpel, einem Material, das eine geringe Reibung aufweist und beständig ist und das mechanische Kräfte verteilt und den darunter liegenden Knochen schützt, überzogen. Verletzungen des Gelenkknorpels sind üblich, insbesondere im Knie. Daten des Zentrums für Krankheitskontrolle (Center for Desease Control, CDC) und klinische Untersuchungen suggerieren, dass ungefähr 100.000 Gelenkknorpelverletzungen pro Jahr in den Vereinigten Staaten auftreten. Solche Verletzungen treten am häufigsten bei jungen aktiven Personen auf und führen zu Schmerz, Anschwellen und Verlust der Gelenkbewegung. Beschädigter Gelenkknorpel heilt nicht. Normalerweise tritt die Rückbildung des umliegenden nicht verletzten Knorpels im Zeitablauf auf, was zu chronischen Schmerzen und Körperbehinderung führt. Knorpelverletzungen führen daher häufig zu einem bedeutenden Verlust der produktiven Arbeitsjahre und haben einen enormen Einfluss auf die Aktivitäten und den Lebensstil des Patienten.
Gelenkoberflächenverletzungen können auf die Knorpelschicht beschränkt sein oder können sich auf den subchondralen Knochen ausbreiten. Der natürliche Krankheitsverlauf unterscheidet sich bei diesen beiden Verletzungsarten. Knorpelverletzungen, die nicht in den subchondralen Knochen penetrieren, weisen ein eingeschränktes Heilungsvermögen auf (1). Dies ist auf Eigenschaften zurückzuführen, die im Gewebe inhärent sind. Nahezu 95% des Gelenkknorpels ist extrazelluläre Matrix, die durch Chondrozyten, die darin verteilt sind, hergestellt und aufrechterhalten wird. Die ECM liefert die mechanische Integrität des Gewebes. Die begrenzte Chondrozytenzahl in dem umliegenden Gewebe ist außerstande, die durch die Verletzung verlorene ECM zu ersetzen. Eine kurze Überproduktion von Matrixkomponenten durch lokale Chondrozyten ist beobachtet worden (2), die Antwort ist jedoch unzureichend für die Erneuerung klinisch relevanter Mängel. Zelluläre Migration aus dem vaskulären System tritt bei rein chondraler Verletzung nicht auf und die extrinsische Heilung ist klinisch unbedeutend.
Osteochondrale Verletzungen, bei denen die subchondrale Knochenplatte durchdrungen ist, können infolge von Einströmen von reparierenden Zellen aus dem Knochenmark geheilt werden (1). Zahlreiche Studien haben jedoch gezeigt, dass die komplexe molekulare Anordnung der ECM, die zur normalen Knorpelwirkung erforderlich ist, nicht zurückgewonnen wird. Die Heilungsantwort ist gekennzeichnet durch Bildung von Fibroknorpel, einer Mischung aus Hyalinknorpel und fibrösem Gewebe. Dem Fibroknorpel fehlt die Haltbarkeit von Gelenkgewebe und unterliegt letztendlich dem Abbau während normaler Gelenkbenutzung. Viele osteochondrale Verletzungen werden über einen Zeitraum von wenigen bis mehreren Jahren klinisch asymptomatisch, bevor Sekundärabbau auftritt. Wie isolierte chondrale Verletzungen führen diese Verletzungen ultimativ zu einer schlichten Gelenkwirkung, Schmerzen und Unbeweglichkeit.
Molekulare Organisation der ECM:
Die physikalischen Eigenschaften von Gelenkknorpel sind eng mit der Molekularstruktur von Collagen Typ II und Aggrecan verbunden. Andere Moleküle, wie Hyaluronan und Collagen Typ IX spielen eine wichtige Rolle bei der Matrixorganisation. Collagen Typ II bildet ein dreidimensionales Netzwerk oder Netz, das dem Gewebe hohe Dehnbarkeit und Scher-Festigkeit verleiht (3). Aggrecan ist ein großes hydrophiles Molekül, das zu komplexen bis zu 200 bis 300 × 100⁶ Daltons aggregieren kann (4). Aggrecan-Moleküle enthalten Glycosaminoglycan-Ketten, die eine große Sulfatgruppen- und Karboxylatgruppenzahl enthalten. Bei physiologischem pH, sind die Glycosaminglycan-Ketten daher stark negativ geladen (5). Beim Knorpel sind Aggrecankomplexe in dem Collagen-Netzwerk verstrickt. Ein Donnan-Gleichgewicht wird hergestellt, bei dem kleine Cationen durch elektrische Kräfte, die durch die Sulfat- und Karboxylatgruppen erzeugt werden, zurückbehalten werden (6). Im Gegenzug wird Wasser durch osmotische Kraft, die durch eine große Anzahl an kleinen Cationen im Gewebe erzeugt wird, zurückbehalten.
Wenn das Gelenk mechanisch beladen wird, führt die Wasserbewegung zur Störung des elektrochemischen Gleichgewichts. Wenn die Beladung entfernt wird, stellt sich das Donnan-Gleichgewicht wieder ein, und das Gewebe kehrt in sein vorbeladenes Stadium zurück (7). Die physikalischen Eigenschaften des Gelenkknorpels sind eng mit den Molekularstrukturen von Collagen Typ II und Aggrecan verbunden. Andere Matrixmoleküle, wie Hyaluronan (8) und Collagen Typ IX (9), spielen wichtige Rollen bei der Matrixorganisation. Das Ausbleiben, die normale Molekularanordnung von ECM wiederherzustellen, führt zum Versagen der Gewebeheilung im Zeitablauf, was durch schlechtes Langzeitverhalten von Fibroknorpel als Reparaturgewebe gezeigt wird (10).
Eindeutige Unterteilungen wurden innerhalb der ECM gezeigt. Diese unterscheiden sich in Bezug auf die Zusammensetzung und dem Umsatz von Matrixmakromolekülen. Jedem Chondrozyten unmittelbar umgeben ist eine dünne ECM-Schale, die durch einen verhältnismäßig schnellen Umsatz der Matrixkomponenten gekennzeichnet ist (11). Dieser Bereich wird als perizelluläre Matrix bezeichnet (11). Die perizelluläre Matrix umgebend ist die territoriale Matrix. Weiter von den Zellen entfernt ist die interterritoriale Matrix (11). Der Umsatz der Matrix-Macromoleküle ist in der interterritorialen Matrix langsamer als in der perizellulären und territorialen Matrix (11). Die Rolle, die diese verschiedenen Unterteilungen bei der Wirkung des Gewebes insgesamt spielen, sind unklar. Aus der Perspektive der Gelenkknorpel-Heilung, stellen sie jedoch einen höheren Grad der Matrixorganisation dar, die bei der Wiederherstellung von verletztem Gewebe zu berücksichtigen ist.
Chirurgische Behandlung der Gelenkknorpel-Verletzung:
Gegenwärtige Verfahren zur chirurgischen Wiederherstellung von Gelenkgewebe lassen sich in drei Kategorien unterteilen: (1) Stimulierung der fibrocartilaginösen Heilung, (2) osteochondrale Transplantation, und (3) autologe Chondrocyten-Implantation.
Fibroknorpel, trotz seiner verhältnismäßig schlechten mechanischen Eigenschaften, kann temporäre symptomatische Abhilfe bei Gelenkverletzungen liefern. Verschiedene chirurgische Techniken sind entwickelt worden, um die Bildung von Fibroknorpel in Bereichen der Knorpelbeschädigung zu fördern. Diese umfassen subchondrales Bohren, Abnutzung und Mikrobruch. Das Konzept dieser Verfahren ist, dass die Durchdringung des subchondralen Knochens Chondro-Vorläuferzellen ermöglicht, vom Mark zu dem Defekt zu migrieren, um Heilung zu bewirken. Die klinische Erfolgsrate dieses Behandlungstyps ist schwierig zu beurteilen. In publizierten Reihen wurden nach zwei Jahren über Erfolgsraten so hoch wie 70% berichtet, diese Ergebnisse verschlechtern sich jedoch über die Zeit. Fünf Jahre nach der Behandlung ist die Mehrzahl der Patienten symptomatisch.
Bei osteochondraler Transplantation wird Gelenkknorpel mit einer Schicht aus subchondralem Knochen geerntet und in den Gelenkdefekt implantiert. Die Fixierung des Transplantats an den Wirt wird durch Heilung des Transplantatsknochens an den Wirtsknochen erreicht. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens ist, dass der transplantierte Knorpel die mechanischen Eigenschaften von normalem Gelenkknorpel aufweist und daher zyklischer Beladung widerstehen kann. Die Hauptnachteile sind auf der Seite des Spenders Morbidität (im Fall von Autoimplantat) und das Risiko der Krankheitsübertragung (im Fall von Allotransplantat). Zusätzlich kann Gewebeabstoßung bei Allotransplantaten auftreten, die das chirurgische Ergebnis kompromittieren. Osteochondrales Autoimplantieren (Mosaikplastie) hat kurzzeitige klinische Erfolge gezeigt. Die langfristige Effektivität ist unbekannt. Osteochondrale Allotransplantate sind bei ungefähr 65% der Fälle erfolgreich, wenn sie 10 Jahre nach der Implantation beurteilt wurden, sind aber im Allgemeinen größeren beschädigten Bereichen, die tief in den subchondralen Knochen reichen, vorbehalten.
Autologe Chondrozytenimplantation ist ein Verfahren zur Knorpelheilung, das isolierte Chondrozyten verwendet. Klinisch ist es eine Behandlung in zwei Stufen, wobei zuerst eine Knorpelbiopsie erhalten wird und anschließend nach einer Periode der ex vivo-Behandlung, kultivierte Chondrozyten in den Defekt eingeführt werden (12). Während der ex vivo-Verfahren wird die ECM entfernt und die Chondrozyten werden unter Bedingungen kultiviert, die die Zellteilung fördern. Sobald eine geeignete Anzahl an Zellen hergestellt worden ist, werden sie in den Gelenkdefekt implantiert. Die Einkapselung wird durch ein Periosteum-Stück erreicht, das an den umgebenen Wirtknorpel genäht wird. Die Zellen gliedern sich an die defekten Wände an und stellen extrazelluläre Matrix in situ her. Die Hauptvorteile dieses Verfahrens sind die Verwendung von autologem Gewebe und die Fähigkeit, den Zellbestand zu erweitern. Schwierigkeiten bei der Wiederherstellung von Gelenkknorpel durch dieses Verfahren lassen sich in drei Kategorien unterteilen: Zellhaftung, phänotypische Transformation und ECM-Herstellung.
Zellhaftung: Der Implatationserfolg individueller Zellen (ohne ECM) hängt kritisch von den Zellen ab, die an das defekte Bett anhaften. Es ist gezeigt worden, dass Knorpel-ECM anti-anhaftende Eigenschaften aufweist, von denen angenommen wird, dass sie durch kleine Proteoglycane, Dermatansulfat und Heparansulfat verliehen werden. Normale Chondrozyten besitzen Zelloberflächenrezeptoren Collagen Typ II (13) und Hyaluronan (11), aber es ist nicht klar, in welchem Ausmaß ex vivo manipulierte Zellen Rezeptoren für diese Matrixmoleküle besitzen, die funktional sind. Eine in vitro Chondrozyten-Bindungs-Studie an ECM deutet darauf hin, dass die Wechselwirkung schwach ist. Eine in vivo-Studie an Kaninchen lässt vermuten, dass nur 8% der implantierten Chondrozyten in dem defekten Bett nach der Implantation verbleiben.
Phänotypische Transformation: Während des Verfahrens der Ausbreitung des Zellbestands in vitro unterziehen sich Chondrozyten gewöhnlich phänotypischer Transformation oder Dedifferenzierung (14). Morphologisch ähneln die Zellen Fibroplasten. Die Typ II-Collagen- und Aggrecan-Synthese ist verringert und die Collagen Typ I-Synthese, typisch für Fibroknorpel, ist erhöht. Begrenzte Daten sind vorhanden, um die Behauptung zu stützen, dass sich die Zellen in situ im Anschluss an die Implantation redifferenzieren. Die Wiederherstellung des chondrozytischen Phänotyps ist für den Erfolg des Heilungsverlaufs kritisch, da Gewebe, das durch Zellen hergestellt wird, die phänotypisch fibroplastisch sind, schlecht als Ersatz von Gelenkgewebe wirkt.
ECM-Herstellung: Vor der Implantation werden die kultivierten Chondrozyten enzymatisch von der ECM entblößt. Die Zellen werden in das defekte Bett als Suspension injiziert. Das Transplantatkonstrukt ist unfähig, Beladung zu tragen und muss von einer Gewichtsbeladung über mehrere Wochen bis zu Monaten geschützt werden. Begrenzte Daten existieren über die ECM-Qualität, die ultimativ hergestellt wird. Sie wurde als Hyalin-ähnliches Gewebe nach einer „second-look" Arthroskopie zwei Jahre nach der Implantation gekennzeichnet. Die insgesamte Erholungsphase bei dieser Behandlungsform liegt bei 9–12 Monaten. Gute oder ausgezeichnete klinische Ergebnisse werden bei ungefähr 85% der femuralen kondylen Läsionen zwei Jahre nach der Implantation erreicht. Es ist jedoch nicht klar, ob die klinischen Ergebnisse über längere Zeiträume beibehalten werden.
Gewebekonstruktion:
Jedes der derzeitigen Verfahren der Knorpelwiederherstellung weist substantielle Grenzen auf. Als Ergebnis sind verschiedene Laboransätze zur Herstellung von Knorpelgewebe in vitro vorgeschlagen worden. Diese umfassen im Allgemeinen das Säen von kultivierten Zellen (entweder Chondrozyten oder pluripotente Stammzellen) in ein biologisches oder synthetisches Gerüst. Die Hauptnachteile dieses Typs von Ansatz sind: (1) Schwierigkeiten des Gewinnens oder Beibehaltens des Chondrozytenphänotyps; (2) unbekannte biologische Wirkungen des Gerüstmaterials auf die implantierten und nativen Chondrozyten und andere Gelenkgewebe; und (3) eine begrenzte Anhaftung des hergestellten Gewebekonstruktes an das defekte Bett.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Herstellung eines implantierbaren Knorpelgewebes. Sein Herstellungsverfahren und seine Zusammensetzung addressieren die Hauptprobleme, die bei derzeitigen Techniken von Knorpelwiederherstellung auftreten. Die Hauptvorteile, Merkmale und Eigenschaften der vorliegenden Erfindung werden offensichtlich durch Berücksichtigung der folgenden Beschreibung und der angehängten Ansprüche.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft transplantierbare Knorpelmatrix und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Das durch dieses Verfahren hergestellte Gewebe hat die Eigenschaft, dass es über Zeit in Kultur ähnlich zu einer in der Natur vorkommenden Zell-assoziierten ECM wird. Zum Zeitpunkt der Implantation besitzt die Matrix in dem Knorpelgewebe eine Erneuerungsgeschwindigkeit (d. h. sie ist metabolisch aktiv), Sie ist reich an knorpelspezifischen Aggrecanproteoglycanen und enthält genug lange Hyaluronan-Ketten, um zu ermöglichen, dass diese Aggrecanmoleküle Aggregate sehr großer Größe bilden können, aber sie ist verhältnismäßig arm an Collagen-Pyridinium-Vernetzungen. Diese Eigenschaften verbessern die Implantierbarkeit des Gewebes und die darauf folgende Reifung des Gewebes in situ nach der Implantation, was zur Integrierung in den Wirt führt.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Chondrozyten aus chondrogenen Zellen enthaltendem Gewebe isoliert. Die isolierten chondrogenen Zellen werden in Alginatkultur bis zu einem Zeitpunkt kultiviert, der wirksam ist, die Bildung einer chondrogenen Zell-assoziierten Matrix zu ermöglichen. In einem wichtigen erfindungsgemäßen Aspekt weist die Zell-assoziierte Matrix mindestens ungefähr 5 mg/cc³ Aggrecan, ein Verhältnis von Aggrecan zu Hyaluronan (mg/mg) zwischen ungefähr 10:1 und ungefähr 200:1, ein Verhältnis von Aggrecan zu Collagen (mg/mg) zwischen ungefähr 1:1 und ungefähr 10:1 auf.
Chondrogene Zellen, jede mit einer perizellulären Matrix, werden gewonnen und auf einem halbdurchlässigen Membransystem in der Gegenwart von Serum oder Serum enthaltend exogen zugegebenem Wachstumsfaktor/Wachstumsfaktoren kultiviert. Die chondrogenen Zellen mit Zell-assoziierter Matrix werden bis zu dem Zeitpunkt kultiviert, bei dem die Bildung einer kohäsiven Knorpelmatrix wirksam ist.
In einem wichtigen Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines solchen in vitro hergestellten artikulären Gewebes bei der chirurgischen Reparatur von Knorpelschaden. Ein solcher Schaden würde akute Teil- und vollständige Knorpelverletzungen, osteochondrale Verletzungen und degenerative Abläufe umfassen. Eine solche chirurgische Reparatur umfasst offene chirurgische Techniken (Arthrotomie) und arthroskopische Anwendung, Einführung des in vitro hergestellten knorpelartigen Gewebes.
Beschreibung der Abbildung
1 stellt allgemein das Gesamtverfahren zur Herstellung transplantierbarer Knorpelmatrix gemäß der Erfindung dar.
2 beschreibt ein Verfahren zur Trennung von Zellen und ihrer Zell-assoziierten Matrix aus der entfernten Matrix und dem Alginatgel.
3 zeigt ein Kultivierungsverfahren auf einer halbdurchlässigen Membran.
4 zeigt das histologische Auftreten von in vitro erzeugter Knorpelmatrix, die erfindungsgemäß hergestellt wurde. Artikuläre Chondrozyten vom Rind wurden mit DMEM/F12, enthaltend 20% FBS, einer wirksamen Wachstumsfaktormenge, 10 μg/ml Gentamicin und 25 μg/ml Ascorbinsäure in 1,2% Alginat kultiviert. Nach 7 Kulturtagen, wurden die Kügelchen mit 55 mM Natriumcitrat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 6,8, aufgelöst. Die resultierende Suspension aus Zelle mit ihrer assoziierten Matrix wird bei 100 g 10 Minuten zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in dem gleichen oben beschriebenen Medium resuspendiert. Nach 7 zusätzlichen Kultivierungstagen wurde jeder Einsatz von der Gewebekulturplatte entfernt und das Gewebe wurde für die Histologie durch Toludin-Blau-Färbung bearbeitet.
5 zeigt die Wiederherstellung eines Knorpeldefekts einen Monat nach der Implantation von in vitro gebildetem Knorpelgewebe.
Detaillierte Beschreibung
Ein allgemeines erfindungsgemäßes Verfahren ist in 1 dargelegt. Erfindungsgemäß werden Chondrozyten isoliert und in Alginat kultiviert. Die resultierenden Chondrozyten, jede mit einer Zell-assoziierten Matrix, werden wieder gewonnen und anschließend weiter auf einer halbdurchlässigen Membran kultiviert. Das resultierende Knorpelgewebe ist anschließend zur Transplantation verwendbar.
Isolierung von Chondrozyten/chondrogenen Zellen
Chondrogene Zellen, die erfindungsgemäß verwendbar sind, können aus im Wesentlichen jedem chondrogene Zellen enthaltenden Gewebe isoliert werden. Der Ausdruck „chondrogene Zelle", wie er hier verwendet wird, soll jede Zelle bedeuten, die, wenn sie einem geeigneten Reiz ausgesetzt ist, in eine Zelle differenzieren kann, die Komponenten herstellen und absondern kann, die für Knorpelgewebe kennzeichnend sind. Die chondrogenen Zellen können direkt aus vorbestehendem Knorpelgewebe isoliert werden, z. B. Hyalinknorpel, elastischem Knorpel oder Fibroknorpel. Speziell können chondrogene Zellen aus artikulärem Knorpel (aus entweder gewichtstragendem oder nicht gewichtstragenden Gelenken), kostalem Knorpel, nasalem Knorpel, aurikulärem Knorpel, trachealem Knorpel, epiglottischem Knorpel, Schildknorpel, Aryknorpel und Ringknorpel isoliert werden. Siehe z. B. U.S. Patent Nr. 5,197,985 und 4,642,120 und Wakitani et al. (1994) J. bone Joint Surg. 76: 579–591, Kultur in Alginat zur Herstellung von Chondrozyten Zell-assoziierter Matrix.
Erfindungsgemäß werden aus dem Gewebe isolierte Chondrozyten/chondrogene Zellen bei einer Dichte von mindestens ungefähr 10⁴ Zellen/ml in einer Natriumalginatlösung resuspendiert. Die Zellen werden unter Bedingungen kultiviert, bei denen ihre sphärische Konformation beibehalten wird, die für die Herstellung einer Zell-assoziierten Matrix auf der Chondrozytenmembran, ähnlich zu der in vivo festgestellten, förderlich ist. In einem weiteren wichtigen Aspekt werden Chondrozyten in Alginat für mindestens ungefähr fünf Tage kultiviert, um die Bildung der Zell-assoziierten Matrix zu ermöglichen. Die verwendeten Media können ein anregendens Agens, wie fötales Rinderserum, enthalten, um die Herstellung der Zell-assoziierten Matrix zu verbessern.
Bei einem alternativen Aspekt der Erfindung kann das Kulturmedium für die Chondrozyten außerdem exogen zugegebene spezifische Wachstumsfaktoren umfassen. Die Zugabe spezifischer Wachstumsfaktoren, z. B. solchen, die nicht schon in fötalem Rinderserum vorhanden sind, wie osteogenes Protein-1, können als wirksamer Stimulator der Matrixbildung wirken. Wachstumsfaktoren, andere als solche, die in fötalem Rinderserum vorhanden sind, können vorteilhaft sein, da sie als humane rekombinante Proteine verfügbar werden. Die Verwendung von humanen Wachstumsfaktoren ist insofern vorteilhaft, dass sie mit geringerer Wahrscheinlichkeit eine Immunantwort in dem Gelenk verursachen (die Verwendung von fötalem Rinderserum erfordert umfassendes Spülen des neu gebildeten Gewebes vor dessen Implantation). In diesem erfindungsgemäßen Aspekt wird Wachstumsfaktor zu dem Medium in einer Menge gegeben, um nahezu maximal die Bildung von Zell-assoziierter Matrix zu stimulieren.
Bei einem weiteren wichtigen Aspekt der Erfindung, erzeugt die Amplifizierung von Chondrozyten oder chondrogenen Zellen in Alginat nicht den Verlust des Chondrozytenphänotyps, wie es auftritt, wenn die Amplifizierung in einer Monoschichtkultur durchgeführt wird. „Chondrozytenphänotyp" bedeutet, wie er hier verwendet wird, eine Zelle, die (i) eine sphärische Form und die Fähigkeit hat, zu synthetisieren und innerhalb der Matrix bedeu tende Mengen an (ii) Aggrecan und (iii) Collagen Typ II anzuhäufen, ohne (iv) in der Matrix eine wirksame Collagen Typ I-Menge anzuhäufen. Eine minimale Menge von Collagen Typ I bedeutet hier weniger als ungefähr 10% aller Collagenmoleküle, die in die Matrix eingeführt werden. In Alginat kultivierte Chondrozyten behalten ihre sphärische Form (typisch für Chondrozyten) und behalten eine große Matrixmenge bei. Die Matrix ähnelt histologisch dem Hyalinknorpel und ist reich an Aggrecan und Collagen Typ II.
Zusätzlich zu den bereits erwähnten drei Parametern muss ein phänotypisch stabiler Chondrozyt die Fähigkeit beibehalten, Hauptmakromoleküle in einer knorpelähnliche Matrix wirksam einzuführen. Normale Chondrozyten können kleine mRNA-Mengen für Collagen Typ I exprimieren, die sie nicht translatieren. Darüber hinaus können über mehrere Monate in Alginatkörnchen kultivierte artikuläre Chondrozyten einige Collagen Typ I-Moleküle synthetisieren, aber diese können nie in die sich bildende Matrix eingeführt werden. Folglich kennzeichnet das Auftreten kleiner Mengen von neu synthetisierten Collagen Typ I-Molekülen in dem Medium nicht notwendigerweise den Beginn der Entdifferenzierung. Darüber hinaus ist Hyaluronan kein Marker des chondrozytischen Phänotyps, da es in großen Mengen von vielen anderen Zelltypen synthetisiert wird. Es ist jedoch ein wichtiger Bestandteil der Knorpelmatrix.
Zellen, die phänotypisch stabil sind, sollten mindestens ungefähr 10-mal mehr Aggrecan als Collagen (auf einer Mengenbasis) synthetisieren. Das Verhältnis von Aggrecan zu Hyaluronan in der Matrix sollte immer über ungefähr 10 bleiben.
Chondrozyten mit Zell-assoziierter Matrix
Die Chondrozytenkultur in Alginat führt zur Herstellung einer ECM, die in zwei Bestandteile organisiert ist: einem Zell-assoziierten Matrixbestandteil, der metabolisch den perizellulären und territorialen Matrizes von natürlichen Geweben ähnelt und (ii) einem weiteren entfernten Matrixbestandteil, der metabolisch der interterritorialen Matrix von natürlichem Gewebe ähnelt.
Die Bildung einer stark strukturierten Zell-assoziierten Matrix um jeden Chondrozyten ist aus verschiedenen Gründen wichtig. Erstens wird die Zell-assoziierte Matrix an die Zelle über Rezeptoren, wie CII (das an Kollagen bindet) und CD44 (das an Hyaluronan in Proteoglycanaggregaten bindet) verankert. Sobald diese Matrix wieder hergestellt worden ist, ist die Wahrscheinlichkeit wesentlich geringer, dass die Zellen entdifferenziert werden. Zweitens wandelt der Chondrozyt Proteoglycanaggrecan um und gestaltet folglich diese Matrix verhältnismäßig schnell neu. Der Chondrozyt ist wesentlich weniger wirksam bei der Neugestaltung der weiter entfernten Matrix.
In einem wichtigen Aspekt der Erfindung umfasst der Zell-assoziierte Matrixbestandteil der hergestellten ECM während der Kultur in Alginat Aggrecan (das Hauptknorpelproteoglycan), Collagen Typen II, IX und XI und Hyaluronan. Aggrecanmoleküle werden prinzipiell in Aggregaten gebildet, die an Rezeptoren (einschließlich CD44) auf der Chondrozyten-Zellmembran über Hyaluronanmoleküle gebunden sind.
Die jeweiligen Verhältnisse jedes Bestandteils in der Zell-assoziierten Matrix hängen von der Kultivierungslänge ab. In einem wichtigen Aspekt der Erfindung weist die Zell-assoziierte Matrix mindestens ungefähr 5 mg/cc³ Aggrecan, ein Verhältnis von Aggrecan zu Hyaluronan (mg/mg) zwischen 10:1 und 200:1, und ein Verhältnis von Aggrecan zu Collagen (mg/mg) von 1:1 bis ungefähr 10:1 auf. Darüber hinaus kann die Molekularzusammensetzung der Zell-assoziierten Matrix (um jede Zelle) und der weiter entfernten Matrix (zwischen den Zellen) durch spezifische Modifikationen der Kulturbedingungen geändert werden. Diese Modifikation umfasst die physikalische Anordnung des Kultursystems und die Anwendung verschiedener Wachstumsfaktoren. Die Manipulierung der Matrixherstellung und Organisierung sind zentral für die technische Herstellung von artikulärem Knorpel in vitro zur chirurgischen Behandlung von Knorpelverletzung.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung erhöhen sich die Collagenmengen und die Pyridinolinvernetzungen von Collagen mit der Kultivierungsdauer. Die Vernetzungen zeigen insbesondere einen dramatischen Anstieg in der Konzentration nach zweiwöchiger Kultivierung. Indem die Kultivierungsdauer verhältnismäßig kurz gelassen wird, können die Collagen-Fibrillen in der Zell-assoziierten Matrix nicht übermäßig vernetzt werden. Ein Gewebe, das gute funktionelle Eigenschaften aufweist, aber verhältnismäßig wenig Vernetzungen aufweist, ist einfacher zu formen und wird eher in den Wirtsknorpel integriert als ein hartes, reich vernetztes Gewebe.
Gewinnung von Chondrozyten mit ihrer Zell-assoziierten Matrix
Die Chondrozyten-Gewinnung mit ihrer Zell-assoziierten Matrix wird erreicht durch Löslichmachen der Alginatkörnchen nach einer ausreichenden Kultivierungsdauer. Ein Weg ist in 2 dargelegt. Die Alginatkörnchen 20 werden zunächst unter Verwendung von bekannten Techniken löslich gemacht. Die resultierende Zellsuspension wird anschließend zentrifugiert, wobei die Zellen mit ihrer Zell-assoziierten Matrix 40 (in dem Sediment) von den Komponenten der weiter entfernten Matrix 30 (in dem Überstand) getrennt werden.
Chondrozyten-Kultivierung mit ihrer Zell-assoziierten Matrix auf einer halbdurchlässigen Membran.
In diesem Aspekt der Erfindung werden die Chondrozyten mit ihrer Zell-assoziierten Matrix, die wie zuvor beschrieben isoliert wurden, weiter auf einer halbdurchlässigen Membran kultiviert. Das halbdurchlässige Kultivierungssystem der Erfindung ist in 3 gezeigt.
Erfindungsgemäß wird ein Zellkulturstück 50 in einen Plastikträgerrahmen 60 hineingelegt. Das Kulturmedium 70 fließt durch das Zellkulturstück 50. In einem wichtigen erfindungsgemäßen Aspekt umfasst das Zellkulturstück 50 eine halbdurchlässige Membran 80. Die halbdurchlässige Membran 80 ermöglicht, dass das Medium in dem Zellkulturstück in einer Menge fließt, die für das vollständige Eintauchen der Chondrozyten und ihrer Zell-assoziierten Matrix 90 effektiv ist.
In einem wichtigen erfindungsgemäßen Aspekt ermöglicht die halbdurchlässige Membran 80, dass die Chondrozyten kontinuierlichen Nährstoffzugang haben, während die Diffusion von Abfallprodukten aus der Umgebung der Zellen ermöglicht wird. Bei diesem Aspekt sollte die Membran eine Porengröße aufweisen, die wirksam die Migration von Chondrozyten durch die Poren und das anschließende Verankern an die Membran verhindert. Bei diesem erfindungsgemäßen Aspekt sollte die Porengröße nicht mehr als ungefähr 5 Micron sein. Darüber hinaus sollte die benutzte Membran eine Porendichte aufweisen, um der Membran ausreichend Stärke zu verleihen, so dass sie aus ihrem Kulturrahmen ohne Kräuseln entfernt werden kann und sollte ausreichend Stärke haben, so dass das Gewebe auf der Membran manipuliert und in ihre gewünschte Größe geschnitten werden kann. Bei diesem Aspekt der Erfindung weist die Membran eine Porendichte von mindestens ungefähr 8 × 10⁵ Poren/cm² auf. Die Membran kann aus jedem Material hergestellt sein, das sich zur Verwendung in Kultur eignet. Beispiele geeigneter Membransysteme umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt: (i) Falcon Zellkulturstück [Polyethylenterephthalat (PET)-Membran, Porengröße 0,4 oder 3,0 Micron, Durchmesser 12 oder 25 mm], (ii) Coaster Transwell-Platte [Polycarbonat-Membranen, Porengröße 0,1, 0,4, 3,0 oder 5,0 Micron, Durchmesser 12 oder 24,5 mm], (iii) Nunc Gewebekulturstück [Polycarbonat-Membranstück: Porengröße 0,4 oder 3,0 Micron, Durchmesser 10 oder 25 mm], Minizell-Kulturplattenstück (PTFE (Polytetrafluorethylen)-Membran, Polycarbonat, Porengröße 0,4 oder 3,0 Micron, Durchmesser 27 mm]).
Die chondrozytische Zellen enthaltenden Kügelchen werden zunächst in gleichen Teilen Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium und Ham's F12-Medium, enthaltend 20% fötales Rinderserum (Hyclone, Logan, UT) ungefähr 25 μg/ml Ascorbat und 50 μg/ml Gentamicin oder einem anderen Antibioticum (Gibco), kultiviert. Bei einer alternativen Methode werden die Kügelchen in einem anderen Mediumtyp, der die Erhaltung von Chondrozyten in Kultur unterstützt, kultiviert. Bei einer alternativen Methode werden die Kügelchen in einer geschlossenen Kammer, die das kontinuierliche Pumpen von Medium ermöglicht, kultiviert. Bei einem wichtigen Aspekt enthält das Medium fötales Rinderserum, enthaltend endogenen insulinähnlichen Wachstumsfaktor-1 bei einer Konzentration von mindestens 10 ng/ml. Bei dieser Verwendung kann fötales Rinderserum auch als Wachstumsfaktor in Erwägung gezogen werden. Geeignete Wachstumsfaktoren, die exogen zu dem Medium gegeben werden können, um die Bildung der Zell-assoziierten Matrix maximal zu stimulieren, umfassen, sind aber nicht auf diese beschränkt, osteogenes Protein-1 (OP-1), morphogenes Knochenprotein-2 und andere morphogene Knochenproteine, transformierenden Wachstumsfaktor beta und Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor.
Bei einem anderen Aspekt der Erfindung werden die Zellen mit ihrer wieder hergestellten Zell-assoziierten Matrix in einem Medium auf der halbdurchlässigen Membran für einen Zeitraum kultiviert, der wirksam die Bildung einer kohäsiven Knorpelmatrix ermöglicht. Die Kulturzeiten sind im Allgemeinen mindestens ungefähr drei Tage unter Standardkulturbedingungen. Die Teilinhibierung der Matrixreifung vor der Implantation ist wichtig zur Bereitstellung einer Matrix, die als reifer Knorpel nicht zu starr ist, aber die ausreichend Bruchfestigkeit aufweist, um ihre Form und Struktur während der Handhabung beizubehalten. Ein solches Gewebe sollte verformbar genug sein, um in den Defekt unter Druck eingepasst zu werden.
Bei einem weiteren Aspekt der Erfindung können die mechanischen Eigenschaften der Knorpelmatrix durch Erhöhen oder Verringern der Zeitdauer, die das Knorpelgewebe auf der Membran kultiviert wird, kontrolliert werden. Längere Kultivierungszeiten führen zu einer erhöhten Vernetzungsdichte.
Knorpelmatrix
Bei einem wichtigen erfindungsgemäßen Aspekt weist die Knorpelmatrix, die sich auf der halbdurchlässigen Membran bildet, eine Aggrecankonzentration von mindestens ungefähr 5 mg/cc³ auf. Die Knorpelmatrix enthält eine Hyaluronanmenge, die wirksam ermöglicht, dass die insgesamt neu synthetisierten Moleküle in die Proteoglycanaggregate eingeführt werden können. Die Matrix des auf der Membran gebildeten Gewebes enthält aggregierte Aggrecan moleküle in einer Konzentration von nicht weniger als 5 mg/cc³, ein Verhältnis von Aggrecan zu Hyaluronan von ungefähr 10:1 bis ungefähr 200:1 und ein Verhältnis von Aggrecan zu Collagen von ungefähr 1:1 bis ungefähr 10:1. Darüber hinaus stellt die kurze Kultivierungsdauer sicher, dass die Konzentration der Pyridinium-Vernetzungen niedrig genug bleibt, um das Umarbeiten des Gewebes in vivo zu ermöglichen, aber hoch genug ist, um dem Orthopäden eine leichte Handhabung zu erlauben.
In einem wichtigen Aspekt sollte die Knorpelmatrix, die sich auf der Membran bildet, eine Dicke von weniger als 2 mm aufweisen, da Zellen in einem dickeren Blatt voraussichtlich nicht so leicht Zugang zu Nährstoffen gewinnen werden. Knorpelmatrix wird im Allgemeinen eine scheibenähnliche Struktur entsprechend der Membran aufweisen, es besteht aber kein Erfordernis, dass die Knorpelmatrix eine scheibenähnliche Struktur hat. In diesem erfindungsgemäßen Aspekt sollte die Form der Knorpelmatrix wirksam sein, um es dem Orthopäden zu ermöglichen, das Gewebe zu handhaben (entweder eine Scheibe oder ein Blatt) und in die Größe zu schneiden, die für eine Presspassung in den Defekt erforderlich ist. Die Größe der Knorpelmatrix wird im Allgemeinen etwas größer sein als die Größe des Defekts.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen Verfahren zur Durchführung der Erfindung und sollten als beispielhaft, aber nicht den Erfindungsumfang einschränkend, der durch die beigelegten Ansprüche definiert ist, angesehen werden.
Beispiele
Beispiel I
Verfahren
Chondrozyten
Ausführbarkeitsstudien wurden unter Verwendung von Chondrozyten aus jungen artikulärem Rinderknorpel, wie nachfolgend beschrieben, durchgeführt. Ein ähnlicher Ansatz kann verwendet werden (und wurde verwendet), um Knorpelmatrixbildung bei humanen Erwachsenen artikulären Chondrozyten zu fördern.
Kulturbedingungen
Artikulärer Knorpel in voller Dicke wurde aus dem Carpometacarpalgelenk von 14 bis 18 Monate alten jungen Ochsen seziert, wobei spezielle Vorsicht geboten wurde, eine Verunreinigung durch synoviales Gewebe zu verhindern. Die Knorpelteile wurden bei 37°C 1 h mit 0,4% Pronase (Calbiochem, La Jolla, CA) und anschließend 16 h mit 0,025% Collagenase P aus Clostridium hystolyticum (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) in DMEM/F12 (Gibco BRL, Grand Island, NY), enthaltend 5% fötales Rinderserum, verdaut. Der resultierende Verdau wurde durch einen 40-μm Zellfilter (Katalog Nr. 2340, Beckton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) filtriert, und die Chondrozyten wurden gewonnen. Die Chondrozyten wurden bei einer Dichte von 4 × 10⁶ Zellen/ml in einer 1,2%-Lösung aus sterilem Alginat (Kelton LV, Kelco, Chicago, IL) in 0,15 M NaCl suspendiert. Die Zellsuspension wurde anschließend durch eine 22-Eichnadel gedrückt und in eine 102 mM Calciumchloridlösung getropft. Kügelchen wurden stehen gelassen, damit diese Lösung 10 min. polarisieren kann und anschließend zweimal in 0,15 M NaCl und danach zweimal in DMEM/F12 gewaschen. Die Kügelchen wurden dann zu dem vollständigen Kulturmedium (200 Kügelchen in 10 ml), bestehend aus DMEM/F12, 10 μg/ml Gentamicin, 20% fötales Rinderserum, eine wirksame Wachstumsfaktormenge und 25 μg/mlg Ascorbinsäure (Gibco BRL) übertragen. Die Kulturen wurden bei 37°C in einer befeuchteten 5% CO₂ Luftatmosphäre mit dem Medium, das täglich durch frisches Medium ausgetauscht wurde, stehen gelassen. Nach 7 Kulturtagen wurde das Medium gesammelt und die Kügelchen bei 4°C durch 20-minütige Inkubierung in 55 mM Natriumzitrat, 0,15 M NaCl, pH 6,8 aufgelöst. Die resultierende Zellsuspension (mit ihrer assoziierten Matrix) wurde bei 4°C mit 100 g 10 min. zentrifugiert. Das die Zelle mit ihrer Zell-assoziierten Matrix enthaltende Sediment wurde wieder in DMEM/F12, enthaltend 20% fötales Rinderserum, eine wirksame Wachstumsfaktormenge und den oben beschriebenen Ergänzungen suspendiert.
Drei Milliliter vollständiges Medium wurden zu jeder Vertiefung einer Falcon-Zellkultur Insert-Companion-Platte (Katalog Nr. 3090) gegeben und in dem Brutschrank bei 37°C in Gegenwart von 5% CO₂ 20 min. stehen gelassen. Ein Falcon-Zellkultur-Einsatz (Katalog Nr. 3090, 0,45 μm, PET-Membran, transparent, Durchmesser 23,1 mm, Beckton Dickinson) wurde aseptisch in jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen gelegt. Ein 2,5 ml Aliquot (entsprechend den Zellen und ihrer assoziierten Matrix, die in 200 Kügelchen vorhanden ist) wurde auf jeden Einsatz gelegt. Die Kulturen wurden bei 37°C in einer befeuchteten 5% CO₂-Atmosphäre gehalten. Nach 7 zusätzlichen Kultivierungstagen (die als Tage 8–14 in Kultur bezeichnet werden), wurde jeder Einsatz aus der Gewebekulturplatte entfernt und die PET-Membran unter Verwendung eines Skalpells geschnitten.
Charakterisierung der Chondrozyten und Knorpelmatrix, die nach 7 Kulturtagen in Alginatkörnchen gebildet wurden.
Am Tag 7 wurden sowohl (i) gesamte Kügelchen, als auch (ii) die Zellen, die mit ihrer Zell-assoziierten Matrix nach der Auflösung der Kügel chen gewonnen wurden, fixiert, unterteilt und durch Kontrastphasenmikroskopie, wie zuvor beschrieben, sichtbar gemacht. Die Matrix in beiden Matrixabschnitten (Zell-assoziierte Matrix und weiter entfernte Matrix) wurden auf Proteoglycan-, Hyaluronan-, Collagen-Mengen, und Collagen-Vernetzungen, wie oben beschrieben, untersucht.
Charakterisierung der Chondrozyten und Knorpelmatrix, die nach 7 Kulturtagen in Alginatkügelchen, gefolgt von 7 weiteren Kulturtagen auf der Membran, gebildet wurden.
Am Tag 14 wurde das morphologisch Äußere des Gewebes auf der Membran durch Histologie bestimmt, seine Zusammensetzung wurde unter Verwendung einer Vielzahl von biochemischen Tests bestimmt, und der Stoffwechsel der Chondrozyten wurde in Kultur bewertet.
(i) Histologie.
Am Tag 14 wurde das sich immer noch auf der PET-Membran befindende Gewebe unter Verwendung von 4% Paraformaldehyd in PBS fixiert und in Paraffin eingebettet. 8 μm dicke Abschnitte wurden geschnitten und mit Toluidin-Blau für sulfierte Glycosaminglyane gefärbt. Für Elektronenmikroskopie wurde ein kleines Gewebestück geschnitten und in 2% Glutaraldehyd, 0,1 M Natriumcacodylatpuffer, 10 μM CaCl₂, pH 7,4 fixiert.
(ii) Biochemische Zusammensetzung des Gewebes.
Am Ende der Kultivierungsdauer (Tag 14) wurde das von der Membran entfernte Gewebe auf trockenen Verbandmull übertragen und das Nassgewicht gemessen. Das Gewebe wurde anschließend lyophilisiert und wieder gewogen, um eine Messung des Wassergehaltes zu erhalten. Das lyophilisierte Gewebe wurde bei 56°C 24 h mit Papain (20 μg/ml) in 0,1 M Natriumacetat, 50 mM EDTA, 5 mM Cysteinhydrochlorid, pH 5,53 verdaut.
Die DNA-Menge wurde unter Verwendung des bisbenzimidazolfluoreszierenden Farbstoffverfahrens [Hoechst 33258 (Polyscience, Warrington, PA)] mit Kalbthymus-DNA als Standard gemessen.
Der Gesamtgehalt sulfiertem Glycosaminglycan wurde durch den Dimethylmethylen-Blau (DMMB: Pollyscience)-Test, wie zuvor beschrieben, bestimmt.
Der Hydroxyprolingehalt wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung der PICO-Etikett-Markiertechnik nach der Hydrolyse der Probe bei 110°C 16 h in 6 N HCl gemessen. Der Collagengehalt in jeder Probe wurde durch Multiplizieren des Hydroxyprolingehalts mit 8,2 berechnet.
Der Hyaluronangehalt wurde unter Verwendung der Sandwich-ELISA-Technik, wie zuvor beschrieben, gemessen und im Verhältnis zum Collagengehalt angegeben.
(iii) Charakterisierung der am Kultivierungstag 14 synthetisierten Collagentypen.
Am Kulturtag 14 (d. h. 7 Tage, nachdem die Chondrozyten und ihre Zell-assoziierte Matrix auf die Membran des Gewebekultureinsatzes gelegt wurde) wurde das Gewebe auf der Membran 16 h in DMEM, enthaltend [³H]-Prolin, 50 μCi/ml, fötales Rinderserum, 200 μl/ml, Ascorbinsäure, 25 μg/ml) und beta-Aminoproprionitril (BAPN), 10 μg/ml inkubiert, um die Bildung von Vernetzungen zu verhindern. Das Gewebe wurde anschließend zerkleinert und über Nacht mit 1,0 M NaCl, 50 mM Tris, enthaltend Proteinaseinhibitoren (1 mM N-Ethylmalmeimid, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 5 mM EDTA) bei 4°C extrahiert. Der Rückstand wurde aus dem NaCl-Extrakt durch Zentrifugierung bei 3.000 UpM 15 min. getrennt und in 1% SDS aufgelöst. Das Markierungsmedium, das NaCl-Extrakt und die SDS-Fraktion wurden gegen destilliertes Wasser dialysiert, um nicht eingeführte Isotope zu entfernen. Die Proben wurden weiter gegen 0,5 M Essigsäure dialysiert und über Nacht bei 4°C mit Pepsin (100 μg/ml) in 0,2 M NaCl, 0,5 M Essigsäure inkubiert. Das Pepsin wurde anschließend durch Zugabe von NaOH zu jeder Probe, um den pH auf 8,6 zu erhöhen, inaktiviert. Die Proben wurden anschließend gegen 0,4 M NaCl, 10 mM Tris, pH 7,4 dialysiert. Aliquote der Proben wurden mittels SDS-PAGE in einem 8% Acrylamidgel unter reduzierten Bedingungen untersucht. Das Gel wurde anschließend der Fluorgraphie unterworfen und die Bilder wurden gescannt und wie zuvor beschrieben quantifiziert.
(iv) Charakterisierung von am Kultivierungstag 14 synthetisierten Proteoglycanen.
Am Kultivierungstag 14 wurde das Gewebe 4 h in DMEM/F12, enthaltend ³⁵S-Sulfat, 20 μCi/ml, 20% fötales Rinderserum (200 μl/ml) und einer wirksamen Wachstumsfaktormenge inkubiert. Das Gewebe wurde anschließend mit 4 M Guanidinchlorid, 0,05 M Natriumacetat, pH 6,0, in der Gegenwart von Proteaseinhibitoren, wie zuvor beschrieben, extrahiert. Radioaktiv markierte Proteoglycane wurden durch DEAE-Säulenchromatographie unter Verwendung eines schrittweise Natriumchloridkonzentrationsgradienten gereinigt. Die gereinigten Proteoglycane wurden auf Größe durch Siebchromatographie auf Sepharose CL2B (Pharmacia) unter Dissoziationsbedingungen untersucht.
(v) Quantifizierung von Collagen-spezifischen Vernetzungen
Collagen-spezifische Vernetzungen (Pyridinolin und Desoxypyridinolin) wurden unter Verwendung von Fluoreszenznachweise, gefolgt von Umkehrphasen-HPLC, wie zuvor beschrieben, quantifiziert. Kurz gesagt wurden die Proben in 6 N HCl 24 h bei 110°C hydrolisiert und die Hydrolisate wurden auf eine CF-1 Zellulosesäule aufgetragen, um die vernetzenden Aminosäuren zu trennen. Die gebundene Fraktion wurde mit destilliertem Wasser eluiert und getrocknet. Die Proben wurden durch Umkehrphasen-HPLC auf einer C18 ODS-Säule (Beckman) getrennt, und die Fluoreszenz der eluierten Höchstwerte wurde unter Verwendung eines Spektrofluorimeters, wie zuvor beschrieben, verfolgt. Die Konzentrationen der vernetzenden Aminosäure wurden als äquivalente externer Pyridionolin und Desoxypyridinolin-Standards angegeben.
(vi) Messung der mechanischen Eigenschaften des in vitro gebildeten Knorpelgewebes
Die Druckfestigkeits- und Dehnfestigkeitseigenschaften des transplantierbaren Konstruktes wurden unter Verwendung von Standardverfahren bestimmt. Bei den Druckfestigkeitsuntersuchungen wurden Scheiben (6,4 mm Durchmesser) aus den Konstrukten geschnitten und in einer einachsigen begrenzten Druckfestigkeitsvorrichtung auf einer automatischen Untersuchungsmaschine (Dynastat: IMASS, Cambridge, MA, USA) unter Computerkontrolle, wie zuvor beschrieben, untersucht (15). Daten über das Gleichgewicht von Beladung und Verformung wurden erhalten und der Gleichgewichts-begrenzte Druckfestigkeitsmodulus wurde berechnet unter Verwendung der Rezeptur von Kwan et al. (16). Für die Verformungsuntersuchungen wurden kegelförmige Proben (1 mm breite im Eichmaßbereich) aus den Konstrukten (17) geschnitten und der Verlängerung bei einer konstanten Dehngeschwindigkeit bis zum Fehlschlagen unterworfen. Die Beladung beim Fehlschlagen wurde normalisiert auf die anfängliche Querschnittsfläche, um die ultimative Belastung zu bestimmen. Bei allen Untersuchungen wurden die Proben in einen physiologischen Salzpuffer eingetaucht.
Ergebnisse
Untersuchungen der nach 7 Kulturtagen in Alginatkügelchen gebildeten Matrix
Am Kulturtag 7 enthielten durch Chondrozyten, die in Gegenwart von Wachstumsfaktor kultiviert wurden, gebildetes Gewebe eine opulente, voluminöse ECM. Die Prüfung der Zellen in den Kügelchen durch Phasenkontrastmikroskopie zeigte den Beweis eines nur mäßigen Grads der Zellteilung. Nach dem Auflösen der Kügelchen mit 55 mM Natriumzitrat in 0,9% NaCl, wurden die Zellen und ihre assoziierte Matrix ebenfalls sichtbar gemacht. Die Struktur dieser Zell-assoziierten Matrix wurde gut konserviert, in Einklang mit der Ansicht, dass die Zell-assoziierte Matrix eng an die Zellmembran über Zelloberflächen-Rezepturen, wie CD44, Inegrine und Anchorin CII gebunden ist. Biochemische Analysen zeigten, dass die akkumulierte Matrix sich primär aus Proteoglycan zusammensetzt und in geringerem Maß aus Hyaluronan. Sie enthielt verhältnismäßig wenig Collagen sofort nach der Übertragung auf die Membran des Kultureinsatzes. Collagen-spezifische Vernetzung war zu diesem Zeitpunkt kaum nachweisbar.
Untersuchungen der Matrix, die nach 7 zusätzlichen Kulturtagen auf der Membran gebildet wurde.
Zwischen den Kulturtagen 8 und 14 wurden die einzelnen Zellen und ihre assoziierte Matrix progressiv in eine einzelne Masse knorpelartigem Gewebe eingeführt. Das regenerierte knorpelartige Gewebe hatte eine scheibenähnliche Struktur mit einer Dicke von ungefähr 1 mm. Der regenerierte Knorpel wurde leicht aus dem Gewebekultureinsatz durch Schneiden der Membran gewonnen. Histologische Untersuchung des Gewebes ergab, dass es eine knorpelähnliche Matrix enthielt, die sich stark mit Toluidin-Blau färben ließ und die reich an Proteoglycanen war (4). Die Färbung war besonders stark in den territorialen (perizellulären) Bereichen der Matrix. Die meisten Chondrozyten waren sphärisch in Form (wie von Chondrozyten, die phänotypisch stabil sind, erwartet wird). Eine dünne Schicht abgeflachter Zellen (ähnlich in Form von Chondrozyten, die auf der der Oberflächen naheliegensten Schicht des artikulären Knorpels festgestellt wurde) wurden auf der Oberfläche der Kultur beobachtet und auf der Grenzfläche zu der Membran des Gewebekultureinsatzes. Die Prüfung durch Elektronenmikroskopie zeigte die Gegenwart dünner Fibrillen in den territorialen Bereichen und die Abwesenheit von Fibrillen in dem interterritorialen Bereich.
Biochemische Analysen des Gewebes am Tag 14 der Kultur ergaben, dass sie als native artikuläre Knorpelmatrix sehr reich an Proteoglycan war und ausreichende Hyaluronanmengen enthielt. Im Gegensatz dazu war Collagen in einer viel niedrigeren Konzentration als im Knorpel vorhanden. Darüber hinaus war die Konzentration der Pyridinolin-Vernetzungen (18 mmol/mol Collagen), die durch Vernetzen der Collagenfibrillen bewirken, dass das fibriläre Netzwerk schwieriger zu resorbieren ist, wesentlich niedriger als im artikulären Knorpel. Darüber hinaus war die Steifheit dieses Gewebes beträchtlich niedriger als bei normalem artikulärem Knorpel von Erwachsenen; das Gewebe war trotzdem leicht zu handhaben. Es sollte für einen Orthopäden, wenn es notwendig ist, leicht sein, es in den Defekt der artikulären Knorpeloberfläche durch Pressen anzupassen. Bevorzugt sollte dieses knorpelartige Gewebe in einer Größe seziert werden, die 0,5 mm größer als der tatsächliche Defekt ist, damit der Chirurg es durch Pressen dem Defekt anpassen kann. Eine solche Anpassung würde ermöglichen, dass das implantierte Gewebe in engem Kontakt mit dem Knorpel des Patienten steht. Dieser Weg kann sich nützlich erweisen, um die Integration in das artikuläre Gewebe des Patienten zu maximieren.
Aggrecan, das Haupt-Proteoglycan von normalem artikulärem Gewebe, macht mehr als 90% der ³⁵S-Proteoglycane aus, die am Kulturtag 14 synthetisiert und in die Matrix eingeführt worden waren. Kleine, nichtaggregierte ³⁵S-Proteoglycane wurden aus dem Gewebe in viel kleineren Mengen zurückgewonnen. Die Analyse der neu synthetisierten Collagene zeigte, dass die Chondrozyten meistens Knorpel-ähnliches Collagen Typ II herstellen, obgleich kleine Mengen anderer Knorpel-Collagene nachgewiesen wurden.
Die Messung der mechanischen Eigenschaft des in vitro gebildeten Knorpelgewebes ergab, dass der Gleichgewichts-begrenzte Kompressionsmodul nach einwöchiger Kultur in dem Einsatz 0,001 MPa betrug, was ausgesprochen niedriger als bei normalem Knorpel mit voller Dicke (ungefähr 0,4 MPa) ist. Zu diesem Zeitpunkt war der Höchstwert der Dehnungsbeanspruchung 0,01 MPa, was ebenfalls niedriger als bei normalem Vollknorpel war. Jedoch erhöhten sich beide Werte merklich mit der Kultivierungsdauer.
Beispiel II
In vivo Tieruntersuchung
Herstellung des zu implantierenden Gewebes. Der artikuläre Knorpel aus Kaninchen, die 1–1,5 kg wiegen, wurde aus jedem Gelenk seziert und mit Pronase und Collagenase sequentiell verdaut. Die so erhaltenen Chondrozyten wurden in Alginatkörnchen eingekapselt und eine Woche kultiviert. Nach 12 Wochen wurden die Körnchen durch Zugabe von Natriumcitratlösung aufgelöst und die Zellen mit ihrer Zell-assoziierten Matrix durch milde Zentrifugierung zurückgewonnen. Nach dem Waschen mit physiologischem Salz wurden die Zellen in einen Gewebekultur-Einsatz gelegt (Falcon, Katalog Nr. 3090) und es wurde ermöglicht, dass sie wieder ein knorpelähnliches Gewebe über 7 Kulturtage in DMEM/Ham F-12-Medium, ergänzt mit 20% FBS, 25 μg/ml Ascorbinsäure, 10 μg/ml Gentamicin bilden. Die Transplantate zur Transplantation wurden anschließend aus dem Gewebekultureinsatz entfernt und in sterile Kulturröhrchen gelegt.
Transplantation. Zwölf männliche Kaninchen (3–3,5 kg) wurden operiert. Nach Vollnarkose mit Ketamin und Xylozin, gefolgt von Isofluran-Inhalierung, wurden die Kaninchen in eine Rückenlagenposition gelegt. Nach ordentlicher Sterilisierung und Drapierung wurden die Kniegelenke bloßgelegt durch einen medialen parapatellaren Ansatz. Ein Einschnitt der Kapsel wurde durchgeführt, und die Kniescheibe wurde seitlich ausgekugelt. Ein Knorpel defekt mit 3,5 mm Volldicke wurde erzeugt (unter Verwendung eines Biopsieausstanzes) am Zentrum der patellaren Grube. Die Defekte wurden anschließend wie folgt behandelt.
Gruppe 1 (Kontrolle): Der Defekt wurde nicht behandelt.
Gruppe 2 (knorpelartiges Transplantat): Ein knorpelartiges Transplantat (wie oben hergestellt) wurde in den Defekt eingelagert. In allen Fällen wurde das Gelenk mehrmals mit sterilem Salz, enthaltend Antibiotika, gewaschen und mit chirurgischen Nähten geschlossen. Das Tier konnte sich von der Anästhesie im Käfig erholen. Nach 4 Wochen wurden die Tiere wie oben beschrieben geopfert und eine Fotographie der Knorpeloberfläche wurde gemacht.
Ergebnisse:
Der Defekt in Gruppe 1 zeigte spontane Teilreparatur durch ein weißes Narbengewebe. Auf der anderen Seite wurde der Defekt in Gruppe 2 mit transparentem Knorpel gefüllt, dessen Oberfläche der Oberfläche von normalem artikulärem Knorpel entspricht (5).
Referenzen

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Claims

Verfahren zur Herstellung einer kohäsiven Knorpelmatrix, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bilden einer Chondrogenzellen-assoziierten Matrix durch Kultivieren von chondrogenen Zellen; (b) Gewinnen der chondrogenen Zellen mit der Zell-assoziierten Matrix und (c) Bilden einer kohäsiven Knorpelmatrix durch Kultivieren der chondrogenen Zellen mit der Zell-assoziierten Matrix auf einer halbdurchlässigen Membran in der Gegenwart von Wachstumsfaktor, wobei die halbdurchlässige Membran eine Porengröße von weniger als 5 Mikron aufweist.
Verfahren zur Herstellung der kohäsiven Knorpelmatrix nach Anspruch 1, wobei die chondrogenen Zellen in einem Alginatmedium kultiviert werden.
Verfahren zur Herstellung der kohäsiven Knorpelmatrix nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Chondrogenzellen-assoziierte Matrix Aggrecan, Kollagen Typen II, IX und XI und Hyaluronan umfasst.
Verfahren zur Herstellung der kohäsiven Knorpelmatrix nach Anspruch 3, wobei das Verhältnis von Aggrecan zu Hyaluronan in der Chondrogenzellen-assoziierten Matrix mindestens über 10:1 (G/G) beträgt.
Verfahren zur Herstellung der kohäsiven Knorpelmatrix nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die halbdurchlässige Membran eine Porendichte von mindestens 8 × 10⁵ Poren pro cm² aufweist.
Verfahren zur Herstellung der kohäsiven Knorpelmatrix nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Wachstumsfaktor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus osteogenem Protein-1, knochenmorphogenetischen Proteinen, transformierendem Wachstumsfaktor Beta, insulinähnlichem Wachstumsfaktor und deren Mischungen.
Verfahren zur Herstellung der kohäsiven Knorpelmatrix nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die kohäsive Knorpelmatrix Aggrecan, Kollagen Typen II, IX und XI und Hyaluronan umfasst.
Verfahren zur Herstellung der kohäsiven Knorpelmatrix nach Anspruch 7, wobei die kohäsive Knorpelmatrix ein Verhältnis von Aggrecan zu Hyaluronan von mindestens über 10:1 (G/G) aufweist.