DE60003328T2

DE60003328T2 - Ruthenium (ii) komplexe mit hoher antitumor und antimetastatischer wirkung

Info

Publication number: DE60003328T2
Application number: DE60003328T
Authority: DE
Inventors: Giovanni Mestroni; Enzo Alessio; Gianni Sava; Elisabetta Iengo; Sonia Zorzet; Alberta Bergamo
Original assignee: Sigea SRL
Current assignee: Sigea SRL
Priority date: 1999-10-28
Filing date: 2000-10-26
Publication date: 2004-04-29
Anticipated expiration: 2020-10-27
Also published as: DE60003328D1; EP1228077A1; ITMI992256A1; WO2001030789A1; CA2389171A1; ATE242779T1; EP1228077B1; AU1388201A; ES2200967T3; JP2003512470A; JP4570833B2; IT1314204B1; ITMI992256A0

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Klasse von Ruthenium(II)-Komplexen in der Therapie, speziell zur Behandlung von Tumore , die durch eine hohe Metastasenbildungsfähigkeit gekennzeichnet sind.
Stand der Technik
Die Suche nach neuen Antitumorverbindungen befindet sich in fortlaufender Entwicklung und ist hauptsächlich auf die Identifizierung neuer Verbindungen mit hoher Selektivität, hoher antimetastatischer Aktivität und reduzierter Toxizität für den Patienten gerichtet.
Verbindungen auf Basis von Übergangsmetallen, wie z.B. Cisplatin, werden seit vielen Jahren in der Chemotherapie von Tumoren verwendet; obwohl diese Produkte pharmakologisch wirksam sind, besitzen sie eine reduzierte antimetastatische Aktivität und zeigen schwere Nebenwirkungen, die durch die erhöhte systemische Toxizität verursacht werden.
Kürzlich wurden die Anwendungsmöglichkeiten einiger Ruthenium(II)-Komplexe mit cytotoxischer Aktivität und ihre mögliche Verwendung in der Therapie neoplastischer Krankheiten erwogen. Unglücklicherweise zeigen sie ebenfalls toxische Wirkungen für den Organismus, selbst wenn diese Verbindungen einen höheren Tropismus für die Tumore als die Cisplatin-Derivate zeigen (Sava et al., Anticancer Res. 11, 1103, 1991).
Zur Verbesserung der mit der Aktivität und Toxizität verbundenen Probleme wurden neue Ruthenium(III)-Komplexe in Form von wirksameren und weniger toxischen Prodrugs vorgeschlagen (Sava et al., Anticancer Res. 11, 1103, 1991, Sava et al. in Topics in Biological Inorganic Chemistry, 143, 1999), für die ein "in vivo"-Aktivierungsmechanismus durch Reduktion der Ruthenium(III)-Komplexe zu den entsprechenden reaktiven Ruthenium(II)-Typen entwickelt wurde.
Für diesen Mechanismus wurde eine Hypothese aufgestellt, wonach er in der hypoxischen und reduzierenden Umgebung des Tumorgewebes wirksamer ist, und dies würde die hohe Selektivität und Aktivität der Ruthenium(III)- Komplexe gegenüber festen Tumoren erlauben (Sava et al., Anticancer Res. 11, 1103, 1991, Sava et al. in Topics in Biological Inorganic Chemistry, 143, 1999).
Der Reduktionsprozeß würde in einem geringeren Ausmaß in gesunden Geweben auftreten, die normal vaskularisiert sind, und in denen der Sauerstoffpartialdruck höher (40 mmHg) als im Tumorgewebe (5 mmHg) ist. Höhere Mengen der aktivere und toxischeren Typen von Ruthenium(II) werden im Tumorgewebe relativ zum gesunden Gewebe gebildet, wobei ein Anreicherungseffekt zu einer selektiven Cytotoxizität gegenüber festen Tumorzellen führt.
Unter den oben genannten Ruthenium(III)-Komplexen erwiesen sich ImH[trans-RuCl₄Im₂] (B.K. Keppler et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 111: 166–168, 1986) und die Komplexe der Formel Na[trans-RuCl₄(Me₂SO)(L)] (WO 90/13553) als wirksam in der Verlangsamung des Wachstums des Primärtumors, und die neuesten Komplexe der Formel (LH)[trans-RuCl₄(Me₂SO)(L)] (WO 98/00431) zeigen eine deutliche antimetastatische Aktivität.
Trotz der in klinischen Anwendungen in der Chemotherapie erhaltenen positiven Ergebnisse ist die Suche auf dem Gebiet der Ruthenium-Derivate dennoch offen für die Identifizierung neuer Verbindungen mit optimalen Merkmalen aus Cytotoxizität und Selektivität für den Tumor und mit einer reduzierten systemischen Toxizität, um die Verwendung dieser Verbindungen sicherer und wirksamer zu machen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die therapeutische Verwendung von anionischen Ruthenium(II)-Komplexen mit Antitumor- und antimetastatischer Aktivität mit der Formel (I):
worin R₁, R₂ und R₃ identisch oder voneinander unterschiedlich sind und ausgewählt sind aus H, linearem oder verzweigtem, gesättigtem oder ungesättigtem C_1-6-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl und Aryl;
oder NR₁R₂R₃ ein 5- bis 7-gliedriger, gesättigter oder ungesättigter Stickstoffheterocyclus ist, der gegebenenfalls 1 oder mehr O-, S-, N-Atome oder mit einem Alkyl-, Aryl- oder Benzylrest substituiertes N enthält;
wobei der Stickstoffheterocyclus gegebenenfalls benzanelliert und/oder mit C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, C_1-4-Alkylthio, Aryl oder Benzyl substituiert sein kann;
das Gigenion Q⁺ durch ⁺NHR₁R₂R₃ dargestellt wird, worin R₁, R₂ und R₃ die oben angegebenen Bedeutungen beibehalten;
R₄ und R₅ identisch oder voneinander verschieden sind und ausgewählt sind aus H, C_1-6-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl und Aryl; oder R₄ und R₅ zusammen mit dem S-Atom, an das sie gebunden sind, einen 4- bis 7-gliedrigen Heterocyclus bilden.
Der Anmelder hat überraschend gefunden, daß die erfindungsgemäßen Ruthenium(II)-Komplexe unerwartete Antitumoraktivitäten in bezug auf Aktivität und therapeutische Breite zeigen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch pharmazeutische Zusammensetzungen dargestellt, die die Ruthenium(II)-Komplex der Formel (I) als Wirkstoff in Verbindung mit geeigneten Hilfsstoffen und/oder Verdünnungsmitteln und/oder Stabilisatoren enthalten.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Kit zur Herstellung der Ruthenium(II)-Verbindungen mit der Formel (I) bereit.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung der Ruthenium(II)-Komplexe der Formel (I) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von festen Tumoren bereit, insbesondere von denjenigen, die durch hohe metastasierende Eigenschaften gekennzeichnet sind.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Ruthenium(II)-Komplexen der Formel (I) für therapeutische Zwecke:
worin die Bedeutungen von R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ und Q⁺ nachfolgend angegeben werden.
Die Gruppen R₁, R₂ und R₃, entweder verschieden oder identisch, werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus H, linearem oder verzweigtem, gesättigtem oder ungesättigtem C_1-6-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl und Aryl besteht;
oder NR₁R₂R₃ ist ein 5- bis 7-gliedriger entweder gesättigter oder ungesättigter Stickstoffheterocyclus, der gegebenenfalls ein oder mehrere O-, S- oder N-Atome oder mit einem Alkyl-, Aryl- oder Benzylrest substituiertes N enthält; wobei der Stickstoffheterocyclus gegebenenfalls benzanelliert und/oder mit C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, C_1-4-Alkylthio, Aryl oder Benzyl substituiert sein kann.
Wenn NR₁R₂R₃ ein 5-gliedriger Stickstoffheterocyclus ist, ist er bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt, die aus Imidazol, N-Methylimidazol, Pyrazol und Oxazol besteht; besonders bevorzugt ist der Stickstoffheterocyclus Imidazol.
Wenn NR₁R₂R₃ ein 6-gliedriger Heterocyclus ist, ist er bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt, die aus Pyridin, 3,5-Lutidin und 4-Methylpyridin besteht.
Wenn NR₁R₂R₃ ein 7-gliedriger Heterocyclus ist, ist er bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt, die aus Azepin, Diazepin und Oxazepin besteht.
Wenn der Heterocyclus benzanelliert ist, ist er schließlich bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt, die aus Indazol, Isochinolin, Benzimidazol und 1,5,6-Trimethylbenzimidazol besteht.
In den erfindungsgemäßen Komplexen stellt Q⁺ eine NH⁺R₁R₂R₃-Stickstoff-Gruppe dar, worin R₁, R₂ und R₃ die oben zugewiesenen Bedeutungen beibehalten.
Im erfindungsgemäßen Komplex weist der Sulfoxidligand R₄-SO-R₅ R₄ und R₅ auf, die entweder identisch oder voneinander verschieden sind und aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus H, C_1-6-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl und Aryl besteht; oder R₄ und R₅ bilden zusammen mit dem S-Atom, an das sie gebunden sind, einen 4- bis 7-gliedrigen Heterocyclus. In den erfindungsgemäßen Komplexen ist der Sulfoxidligand R₄-SO-R₅ bevorzugt Dimethylsulfoxid (R₄= R₅= Methyl) oder Diethylsulfoxid (R₄= R₅ = Ethyl). Diese Produkte können durch Reduktion der entsprechenden Ruthenium(III)-Komplexe erhalten werden, worin mit einem entsprechenden Ruthenium(III)-Komplex die Verbindung der folgenden Formel (II) gemeint ist:
worin Die Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ und Q⁺ die oben genannten Bedeutungen beibehalten. Verbindungen der Formel (II) sind z.B. wie in WO 98/00431 beschrieben erhältlich, das hier als Verweis eingeführt wird.
Die erfindungsgemäßen Ruthenium(II)-Komplexe sind überraschend wirksamer als die bekannten Ruthenium(II)-Komplexe und als die entsprechenden Ruthenium(III)-Verbindungen der Formel (II) und unerwartet weniger toxisch als beide Komplexe.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die als Wirkstoff den Ruthenium(II)-Komplex der Formel (I) in Kombination mit geeigneten Hilfsstoffen, Verdünnungsmitteln oder pharmakologisch akzeptablen Stabilisatoren enthalten.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen sind in Form einer Lösung oder Suspension oder ansonsten in Form eines Gels, granularen Pulvers, von Tabletten, Pillen, Kapseln oder Einlagen.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können neben den Verbindungen der Formel (I) einen oder mehrere Antitumorwirkstoffe enthalten, wie z.B. Cisplatin, Vincristin, Vinblastin, 5-Fluoruracyl, Cyclophosphamid, Bleomycin, Anthracyclin, Taxol oder andere Ruthenium-Komplexe. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung im Augenblick der Verwendung oder unmittelbar vor der Verwendung durch Reduktion der entsprechenden Ruthenium(III)-Komplexe der Formel (II) mit Reduktionsmitteln hergestellt, die bevorzugt aus der Gruppe von physiologisch kompatiblen Reduktionsmitteln ausgewählt werden.
Diese Reduktionsmittel werden aus denjenigen mit einem Redoxpotential ausgewählt, worin die Summe der zwei Halbpotentiale (die Summe aus dem Reduktionspotential des Komplexes und dem Potential des Reduktionsmittels mit entgegengesetztem Vorzeichen) positiv ist, um eine wirksame Reduktion sicherzustellen. Potentialmessungen werden durchgeführt wie von Alessio et al. beschrieben, Inorganica Chimica Acta, 1993, 203: 205–217.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die physiologisch kompatiblen Reduktionsmittel aus der Gruppe ausgewählt, die aus Ascorbinsäure, Cystein und Glutathion besteht.
Die Reduktion wird durch Verwendung eines Äquivalenzverhältnisses zwischen dem Ruthenium(III)-Komplex und dem Reduktionsmittel im Bereich von 5 : 1 bis 1 : 2 durchgeführt (die Anzahl der Äquivalente eines Stoffes, der an einer Redoxreaktion teilnimmt, wird durch Dividieren der Masse des Stoffes in Gramm durch sein Äquivalenzgewicht erhalten. Das Äquivalenzgewicht wiederum wird durch Dividieren des Molekulargewichts des Stoffes durch die Veränderung der Oxidationszahl erhalten).
Das Äquivalenzverhältnis zwischen dem Ruthenium(III)-Komplex und dem Reduktionsmittel ist bevorzugt 1. Unter diesen Bedingungen ist die Reduktion von Ruthenium(III) zu Ruthenium(II) vollständig und unmittelbar.
Als Alternative kann die Reduktion des Ruthenium(III)-Komplexes der Formel (II) in Gegenwart von anorganischen Reduktionsmitteln, wie z.B. Sn²⁺ oder Ce³⁺, oder elektrochemisch oder ansonsten in Gegenwart von H₂ erfolgen.
In einer ihrer weiteren Ausführungsformen stellt die Erfindung ein Kit zur Herstellung des Ruthenium(II)-Komplexes der Formel (I) mit zwei Komponenten bereit, worin die erste Komponente der entsprechende Ruthenium(III)-Komplex ist und die zweite ein Reduktionsmittel wie oben beschrieben ist. Beide Kit-Komponenten sind in Form von Lösungen, die in getrennten Behältern vorliegen, die im Augenblick der Verwendung oder unmittelbar vor der Verwendung vermischt werden, oder in einer festen Form als einzelne Verbindungen, die mit geeigneten Lösungsmitteln solubilisiert werden, wenn sie verwendet werden oder unmittelbar vor der Verwendung; als Alternative ist das Kit aus zwei Behältern zusammengesetzt, deren Inhalt im Augenblick der Verwendung oder unmittelbar vor der Verwendung vermischt wird, und worin der erste die Verbindung der Formel (II) enthält, die in trockener Form mit dem Reduktionsmittel vermischt wurde, und letzterer das Lösungsmittel enthält.
Die Lösungsmittel, die zur Herstellung sowohl der Lösung des Ruthenium(III)-Komplexes als auch des Reduktionsmittels verwendet werden, sind wäßrige Lösungsmittel, wie isotonische Lösungen von 0,9% NaCl oder gepufferte Lösungen wie Phosphatpuffer, Citratpuffer etc., und sind bevorzugt identisch in beiden Lösungen. Bevorzugt wird der Ruthenium(III)-Komplex der Formel (II) in einer wäßrigen Lösung in einer Konzentration im Bereich von 0,1 bis 20 g/l und mit einem pH im Bereich von 3 bis 8 aufgelöst.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung des Ruthenium(II)-Komplexes der Formel (I) zur Herstellung von Medikamenten zur Verwendung in der Vorbeugung und Behandlung von Tumoren und Metastasen. Die Verwendung dieser erfindungsgemäßen Verbindungen hat sich als sehr wirksam für feste Tumore erwiesen, speziell für diejenigen, die durch eine hohe Metastasenbildungsfähigkeit gekennzeichnet sind, speziell diejenigen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Kolonkarzinomen oder Tumoren des Magen-Darm-Traktes, Mammakarzinomen, Lungentumoren oder Lungenmetastasen aus hochinvasiven Tumoren besteht.
Die parenterale, orale, topische oder transdermale Verabreichung ist bevorzugt. Bevorzugt wird der Ruthenium(II)-Komplex im Augenblick der Verwendung und unmittelbar vor der Verwendung durch Vermischen des entsprechenden Ruthenium(III)-Komplexes mit einem Reduktionsmittel wie zuvor beschrieben hergestellt.
Bevorzugt wird das Reduktionsmittel aus der Gruppe ausgewählt, die aus Ascorbinsäure, Cystein und Glutathion besteht. Das Vermischen kann durch schwaches mechanisches Rühren oder durch ein anderes, dem Fachmann bekanntes Verfahren durchgeführt werden. Für erläuternde, aber nicht einschränkende Zwecke der Erfindung werden die folgenden Beispiele angegeben.
Experimenteller Teil
Herstellung von Ruthenium(II)-Komplexen der Formel (I)
Beispiel 1: Herstellung des Ruthenium(II)-Komplexes durch Reduktion von {trans-RuCl₄(Me₂SO)(Im)}ImH (Im = Imidazol) mit Ascorbinsäure
Zu einer auf pH 7,2 gepufferten 0,15 M NaCl-Lösung von {trans-RuCl₄(Me₂SO)(Im)}ImH (Im = Imidazol) (10 g/l) wird ein äquivalente Menge Ascorbinsäure gegeben. Bald nach dem Vermischen wir die erhaltene Lösung mittels ¹H-NMR analysiert. Das aufgezeichnete Spektrum zeigt die vollständige Reduktion des Ruthenium(III)-Kerns zu Ruthenium(II) mit einer äußerst schnellen Reaktionskinetik.
Die Tatsache, daß das Signal, das dem mit Ruthenium koordinierten Me₂SO entspricht, bei 3,60 ppm ausgelesen wird (wohingegen das Me₂SO-Signal, das mit dem Ruthenium(III)-Komplex koordiniert ist, bei –15 ppm sein muß), und daß die spektrale Breite gleich 3 Hz ist (während der entsprechende wert im Spektrum des Ruthenium(III)-Komplexs 370 Hz sein muß), zeigte die Umwandlung des Rutheniumkerns von paramagnetisch zu diamagnetisch.
Außerdem wurden im Spektrum weiter koordinierte Imidazoliumsignale (8,53 ppm, H2; 7,83 und 7,54 ppm H4, H5) und von freiem Imidazolium (8,46 ppm, H2; und 7,39 ppm H4, H5) beobachtet. Die Signale bei 4,83, 4,67 und 4,35 ppm entsprachen den Signalen der oxidierten Ascorbinsäure.
Entsprechend der obigen Information erwies es sich, daß die Reduktion des Ruthenium(III)-Komplexes die dianionische Spezies erzeugt hat, {trans-RuCl₄(Me₂SO)(Im)}^2-, entsprechend Ruthenium(II).
Beispiel 2: Herstellung des Rutheniumkomplexes (II) durch Reduktion von {trans-RuCl₄(Me₂SO)(Pyz)}PyzH (Pyz = Pyrazin) mit Ascorbinsäure
Zu einer wäßrigen Lösung des Ruthenium(III)-Komplexes {trans-RuCl₄(Me₂SO)(Pyz)}PyzH (Pyz = Pyrazin) in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, wird eine äquivalente Menge (1 : 1) von Ascorbinsäure gegeben. Unmittelbar nach dem Vermischen wird die erhaltene Lösung mittels ¹H-NMR analysiert. Das aufgezeichnete Spektrum betont die vollständige Reduktion des Ru(III)- zum Ru(II)-Kern, entsprechend der Beobachtung im vorhergehenden Beispiel. Die Multiplettsignale bei 9,66 und 8,70 ppm des Spektrums betonten die Gegenwart von Pyrazin, das an das Ruthenium der dianionischen {trans-RuCl₄(Me₂SO)(Pyz)}^2--Spezies koordiniert ist. Die Signale des freien PyzH⁺ werden bei 8,69 ppm ausgelesen. Die Protonen des Me₂SO, das an Ruthenium(II) koordiniert ist, werden bei ca. 3,65 ppm detektiert.
Beispiel 3: Herstellung des Ruthenium(II)-Komplexes durch Reduktion von {trans-RuCl₄(Me₂SO)(Im)}ImH mit Ascorbinsäure (Äquivalenzverhältnis = 2,5 : 1)
Eine wäßrig Lösung des Ruthenium-Komplexes {trans-RuCl₄(Me₂SO)(Im)}ImH (1,832 g/l), die Ascorbinsäure enthält (1,41 × 10^-2 g/l), wurde hergestellt. Unmittelbar nach dem Rühren wurde die Lösung in eine Quarzküvette (Lichtweg: 1 cm) überführt, und die UV/VIS-Spektren wurden zu definierten Zeitpunkten aufgezeichnet. Die Abnahme der Extinktion (Abs) bei 390 nm, die Hauptabsorptionsbande, zeigte die Reduktion des Ruthenium(III)-Komplexes zu Ruthenium(II).
Untersuchungen zur biologischen Aktivität
Beispiel 4: In vivo-Aktivitätstests der Zusammensetzungen der erfindungsgemäßen Ruthenium(II)-Komplexe an Mäusen, die an MCa-Mammakarzinom erkrankt sind: Hemmaktivität auf die Bildung von Lungenmetastasen
Sechs Gruppen, die aus 6 verwandten weiblichen Mäusen von Stamm CBA/Lac mit einem Gewicht von 23 ± 3 g bestanden, wurden am Tag 0 mit 106 lebensfähigen Zellen (gemäß Bestimmung mit Trypan-Blau-Ausschlußtest) vom MCa-Mammakarzinom in einem Volumen von 0,05 ml von Dulbeccos auf pH 7,4 gepufferter, calcium- und magnesiumfreier physiologischer Kochsalzlösung (D-PBS) durch intramuskuläre Injektion mit einer sterilen Insulinspritze geimpft. die Tumorzellen stammen aus Spendern des gleichen Stammes, wurden mit einer sterilen Insulinspritze gemäß dem gleichen Verfahren zwei Wochen zuvor transplantiert. Die Tumorzellen in PBS-Suspension wurden hergestellt durch mechanisches Zerkleinern der aus Spendermäusen erhaltenen Tumormasse und durch weiteres Entfernen von Gewebe und Zelltrümmern durch Filtration durch eine Doppelschicht aus steriler Gaze und weiteres Zentrifugieren mit 250 × g für 10 Minuten. Die verwandten Tiere stammten aus einer Kolonie, die von Chester Beatthy, London (UK) erhalten und an der Universität Triest gemäß den Verfahren zur Aufzucht von verwandten Tieren gezüchtet wurden. Die MCa-Mammakarzinom-Tumorlinie stammt aus einem in flüssigem Stickstoff aufbewahrten Vorrat von Tumorzellen, die ursprünglich vom Rudjer Boskovic Institute, Zagreb (HR) erhalten wurden.
Ab Tag 12 bis zum Tag 17 nach der Tumorimplantation wurden die sechs Gruppen von Mäusen intraperitoneal unter Verwendung einer sterilen Insulinspritze jeweils wie folgt behandelt:

Gruppe 1: Kontrolle: 10 mg/kg Körpergewicht/Tag von steriler pyrogenfreier physiologischer Lösung;
Gruppe 2: ASC: 6,69 mg/kg Körpergewicht/Tag von Ascorbinsäure in steriler und pyrogenfreier physiologischer Lösung;
Gruppe 3: CYST: 12 mg/kg Körpergewicht/Tag von Cystein in steriler und pyrogenfreier physiologischer Lösung;
Gruppe 4: RUT: 35 mg/kg Körpergewicht/Tag des Ruthenium(III)-Komplexes, (ImH)(trans-RuCl₄(Me₂SO)(Im)], in pyrogenfreier und steriler physiologischer Lösung;
Gruppe 5: RUT-ASC: 35 mg/kg Körpergewicht/Tag des Ruthenium(III)-Komplexes, (ImH)[trans-RuCl₄(Me₂SO)(Im)], und 12 mg/kg Körpergewicht/Tag von Cystein in steriler und pyrogenfreier physiologischer Kochsalzlösung;
Gruppe 6: RUT-CYST: 35 mg/kg Körpergewicht/Tag des Ruthenium(III)-Komplexes, (ImH)[trans-RuCl₄(Me₂SO)(Im)], und 12 mg/kg Körpergewicht/Tag von Cystein in steriler und pyrogenfreier physiologischer Kochsalzlösung.

Die Reduktionsmittel Ascorbinsäure und Cystein wurden in einem 1 entsprechenden Äquivalenzverhältnis zum Ruthenium(III)-Komplex verwendet. Die Redoxreaktion war unmittelbar. Die Verabreichung fand nach der analytischen Kontrolle der vollständigen Reduktion des Ruthenium(III)-Komplexes zu Ruthenium(II) statt.
Am Tag 17 nach der Tumorimplantation wurde das Wachstum des Primärtumors ausgewertet und der Tumor chirurgisch nach allgemeiner Anästhesie der Tiere mit Ketamin entfernt. Die Tumorgröße wurde durch Messung beider orthogonaler Achsen des Tumors mittels Greifzirkel bestimmt; das Gewicht in Gramm des um diese Achsen entwickelten Rotationskörpers wurde gemessen unter Berücksichtigung einer Tumordichte von 1 und unter Verwendung der Formel (π/6) · a² · b, worin a die Neben- und b die Hauptachse war.
Am Tag 21 nach der Tumorimplantation wurden die Mäuse durch zervikale Dislokation getötet, und die Lungenmetastasen wurden analysiert. Die aus dem Tier unmittelbar nach der Tötung entfernten Lungen wurden in einzelne Lappen unterteilt, die dann unmittelbar mit einem schwach vergrößernden Mikroskop untersucht wurden, das mit einem Okularraster zur Messung der Metastasengröße ausgerüstet war, aus denen die zwei orthogonalen Achsen a und b (mit a ≤ b) identifiziert werden. Die Metastasen wurden dann auf der Grundlage ihrer Abmessungen gruppiert, und das metastatische Tumorgewebe wurde als Summe der Massen jeder einzelnen Metastase berechnet, wobei jede davon als um die oben genannten Achsen entwickelter Rotationskörper betrachtet wurde, und wobei das Volumen durch die gleiche Formel berechnet wurde, die für den Primärtumor verwendet wurde. Die erhaltenen experimentellen Daten wurden dann durch geeignete statistische Tests verarbeitet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben, worin die Anzahl und Gewichte der in jeder Gruppe von Tieren erhaltenen Lungenmetastasen gezeigt sind. Tabelle 1
Die in Tabelle 1 angegebenen Daten zeigen, daß Cystein (Gruppe 3) und Ascorbinsäure (Gruppe 2) bei alleiniger Verwendung keine relevante Wirkung auf die Lungenmetastasen ausüben, während der Ruthenium(III)-Komplex (Gruppe 4) und die Zusammensetzungen der erfindungsgemäßen Ruthenium(II)-Komplexe (Gruppen 5 und 6) eine deutliche Reduktion der Anzahl und eine noch deutlichere Abnahme des Gewichts der Lungenmetastasen im Vergleich zu den Kontrollen verursachten. Es ist offensichtlich, daß die erfindungs gemäßen Ruthenium(II)-Zusammensetzungen (Gruppen 5 und 6) eine deutlichere Wirkung als das entsprechende Ruthenium(III) (Gruppe 4) auf die Anzahl der Metastasen haben. In Bezug auf das Metastasengewicht wurde die stärkere Wirkung in den Zusammensetzungen beobachtet, die Cystein als Reduktionsmittel enthalten (Gruppe 6). Es ist außerdem relevant, daß im Vergleich zur Behandlung mit den Ruthenium(III)-Komplexen gemäß dem Stand der Technik (Gruppe 4) die Verwendung von erfindungsgemäßen Ruthenium(II)-Komplexen (Gruppen 5 und 6) die Bildung von Metastasen verhinderte, wie es durch das ap/at-Verhältnis zwischen Tieren ohne Metastasen und der Anzahl der gesamten Tiere im Vergleich zu den Kontrollbehandlungen gezeigt und durch statistische Analyse (Fischer-Test) bestätigt wird.
Beispiel 5: In-vivo-Aktivitätstest der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen auf Mäuse, die an MCa-Mammakarzinom erkrankt sind: Hemmaktivität der Bildung von Lungenmetastasen
In einem weiteren Experiment ähnlich dem vorhergehenden wurden sechs Gruppen von Tieren, die jeweils aus 7 verwandten weiblichen CBA/Lac-Mäusen mit einem Gewicht von 23 ± 3 g zusammengesetzt waren, am Tag 0 mit Zellen von MCa-Mammakarzinom gemäß dem im vorhergehenden Beispiel beschriebenen Protokoll geimpft. Ab dem Tag 10 bis zum Tag 15 nach der Tumorimplantation wurden die sechs Gruppen von Mäusen intraperitoneal unter Verwendung einer sterilen Insulinspritze jeweils wie folgt behandelt:

Gruppe 1: Kontrolle: 10 ml/kg Körpergewicht/Tag von steriler und pyrogenfreier physiologischer Lösung;
Gruppe 2: GLU: 23,5 mg/kg Körpergewicht/Tag von Glutathion in steriler und pyrogenfreier physiologischer Lösung;
Gruppe 3: CYST: 12 mg/kg Körpergewicht/Tag von Cystein in steriler und pyrogenfreier physiologischer Kochsalzlösung;
Gruppe 4: RUT: 35 mg/kg Körpergewicht/Tag von Ruthenium(III)-Komplex, (ImH)[trans-RuCl₄(Me₂SO)(Im)], in steriler und pyrogenfreier physiologischer Kochsalzlösung;
Gruppe 5: RUT-GLU: 35 mg/kg Körpergewicht/Tag von Ruthenium(III) [trans-RuCl₄(Me₂SO)(Im)] und 23,5 mg/kg Körpergewicht/Tag von Glutathion in steriler und pyrogenfreier physiologischer Kochsalzlösung;
Gruppe 6: RUT-CYST: 35 mg/kg Körpergewicht/Tag von Ruthenium(III)-Komplex (ImH)[trans-RuCl₄(Me₂SO)(Im)] und 12 mg/kg Körpergewicht/Tag von Cystein in steriler und pyrogenfreier physiologischer Kochsalzlösung.

Die Reduktionsmittel Glutathion und Cystein wurden in einem Äquivalenzverhältnis von 1 zum Ruthenium(III)-Komplex verwendet. Die Redoxreaktion erfolgte unmittelbar.
Die Verabreichung fand nach der analytischen Kontrolle der vollständigen Reduktion der Ruthenium(III)- zu Ruthenium(II)-Komplexen statt. Am Tag 16 nach der Tumorimplantation wurde das Wachstum des Primärtumors wie im vorhergehenden Beispiel beschrieben ausgewertet.
Am Tag 23 nach der Tumorimplantation wurden die Mäuse getötet und die Metastasen wie im vorhergehenden Beispiel ausgewertet. Die erhaltenen experimentellen Daten wurden durch geeignete statistische Tests verarbeitet und sind in Tabelle 2 angegeben, worin die Anzahl und das Gewicht der in der behandelten Gruppe von Tieren erhaltenen Lungenmetastasen ebenfalls angegeben sind. Tabelle 2
Aus den in Tabelle 2 gezeigten Daten ist die antimetastatische Wirkung der erfindungsgemäßen Ruthenium(II)-Komplexe (Gruppen 5 und 6) im Vergleich zur Wirkung der entsprechenden Verbindung von Ruthenium(III) (Gruppe 4) klar ersichtlich; diese Wirkung bezieht sich sowohl auf die Reduktion der Anzahl von Metastasen als auch, sogar signifikanter, auf die Reduktion ihres Gewichts.
Beispiel 6: In-vivo-Aktivitätstest der Ruthenium(III)- und Ruthenium(II)-Komplexe des Standes der Technik in BD2Fl-Mäusen, die am Lewis-Lungenkarzinom (LLC) erkrankt sind
Gruppen von 7 weiblichen BD2Fl-Mäusen wurden mittels intramuskulärer Injektion am Tag 0 mit Zellen des Lewis-Lungenkarzinoms (LLC) geimpft. Ab Tag 8 bis zum Tag 13 wurden die Tiere mit dem Ruthenium(III)-Komplex [trans-RuCl₄(DMSO)(Im)](ImH) (Verbindung der Formel II) und mit dem Ruthenium(II)-Komplex trans-RuCl₂(DMSO)₄ behandelt, die beide zum Stand der Technik gehören. Am Tag 20 nach der Tumorimplantation wurden die Mäuse getötet und die Metastasen ausgewertet. Alle Verfahren der Experimente wurden wie in den vorhergehenden Beispielen berichtet durchgeführt.
Die erhaltenen experimentellen Daten, verarbeitet durch geeignete statistische Tests, sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3
Die in Tabelle 3 angegebenen Daten zeigen, daß der Ruthenium(III)-Komplex der Formel (II) ([trans-RuCl₄(DMSO)(Im)](ImH)), der zum Stand der Technik gehört, wirksamer in der Reduktion der Lungenmetastasen als der Ruthenium(II)-Komplex (trans-RuCl₂(DMSO)₄) des Standes der Technik ist.
Toxizitätstests
Beispiel 7: Wirkungen der in-vivo-Behandlung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen auf Mäuse, die an MCa-Mammakarzinom erkrankt sind
Vier Gruppen, von denen jede aus 7 weiblichen verwandten CBA/Lac-Mäusen mit einem Gewicht von 23 ± 3 g bestand, wurden am Tag 0 mit MCa-Mammakarzinomzellen gemäß den in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Protokoll geimpft. Ab dem Tag 11 bis zum Tag 16 nach der Tumorimplantation wurden die vier Gruppen von Mäusen intraperitoneal unter Verwendung einer sterilen Insulinspritze jeweils wie folgt behandelt:

Gruppe 1: Kontrolle: 10 ml/kg Körpergewicht/Tag von steriler und pyrogenfreier physiologischer Lösung;
Gruppe 2: CYST: 2 mg/kg Körpergewicht/Tag von Cystein in steriler und pyrogenfreier physiologischer Lösung;
Gruppe 3: RUT: 35 mg/kg Körpergewicht/Tag des Ruthenium(III)-Komplexes (ImH)[trans-RuCl₄(Me₂SO)(Im)] in steriler und pyrogenfreier physiologischer Lösung;
Gruppe 4: RUT-CYST: 35 mg/kg Körpergewicht/Tag des Ruthenium(III)-Komplexes (ImH)[trans-RuCl₄(Me₂SO)(Im)] und 12 mg/kg Körpergewicht/Tag von Cystein in steriler und pyrogenfreier physiologischer Lösung.

Das Reduktionsmittel (Cystein) wurde in einem Äquivalenzverhältnis von 1 zum Ruthenium(III)-Komplex verwendet. Die Redoxreaktion erfolgte unmittelbar.
Die Verabreichung fand nach analytischer Kontrolle der vollständigen Reduktion der Ruthenium(III)- zu den Ruthenium(II)-Komplexen statt.
Am Tag 17 nach der Tumorimplantation wurden die Mäuse getötet, der Primärtumor und die Milz wurden entfernt und wie im vorhergehenden Beispiel analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben, die zeigt: die Gewichtsveränderung des Primärtumors (prozentuale Veränderung im Vergleich zu den Kontrollen) ab dem Tag 11 bis zum Tag 17, das Gewicht der Tiere am Tag 11 und 17, die Körpergewichtsveränderung (ausgedrückt als Prozentwert im Vergleich zu den Kontrollen) und das Milzgewicht am Tag 17. Tabelle 4
Die in Tabelle 4 angegebenen Daten zeigen, wie das Körpergewicht und das Milzgewicht, die Indikatoren für die systemische Toxizität der Behandlung sind, sich als der Kontrolle (Gruppe 1) ähnlicher zeigten, wenn die Mäuse mit den erfindungsgemäßen Ruthenium(II)-Komplexen behandelt wurden (Gruppe 4), als wenn sie nur mit Ruthenium(III) (Gruppe 3) behandelt wurden. Diese Daten sind in Übereinstimmung mit einer niedrigeren systemischen Toxizität der erfindungsgemäßen Ruthenium(II)-Komplexe im Vergleich zu den Ruthenium(III)-Komplexen der entsprechenden Formel.
Beispiel 8: Wirkung der in-vivo-Behandlung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen auf Mäuse, die an MCa-Mammakarzinom erkrankt sind.
Vier Gruppen, die jeweils aus 6 weiblichen verwandten CBA/Lac-Ratten mit einem Gewicht von 23 ± 3 g bestanden, wurden am Tag 0 mit Tumorzellen gemäß dem in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Protokoll geimpft. Ab Tag 12 bis zum Tag 17 nach der Tumorimplantation wurden die vier Gruppen von Mäusen intraperitoneal unter Verwendung einer sterilen Insulinspritze jeweils wie folgt behandelt:

Gruppe 1: Kontrolle: 10 ml/kg Körpergewicht/Tag von steriler und pyrogenfreier physiologischer Lösung;
Gruppe 2: ASC: 6,69 mg/kg Körpergewicht/Tag von Ascorbinsäure in steriler und pyrogenfreier physiologischer Lösung;
Gruppe 3: RUT: 35 mg/kg Körpergewicht/Tag des Ruthenium(III)-Komplexes (ImH)[trans-RuCl₄(Me₂SO)(Im)] in steriler und pyrogenfreier physiologischer Lösung;
Gruppe 4: RUT + ASC: 35 mg/kg Körpergewicht/Tag des Ruthenium(III)-Komplexes (ImH)[trans-RuCl₄(Me₂SO)(Im)] und 6,69 mg/kg Körpergewicht/Tag von Ascorbinsäure in steriler und pyrogenfreier physiologischer Kochsalzlösung.

Das Reduktionsmittel (Ascorbinsäure) wurde in einem Äquivalenzverhältnis von 1 zum Ruthenium(III)-Komplex verwendet. Die Redoxreaktion war unmittelbar.
Die Verabreichung fand nach analytischer Kontrolle der vollständigen Reduktion des Ruthenium(III)-Komplexes zu Ruthenium(II) statt.
Am Tag 18 nach der Tumorimplantation wurden der Primärtumor und die Milz wie zuvor beschrieben entfernt und gewogen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben, die zeigt: die Gewichtsveränderung des Primärtumors (Veränderung in % gegenüber den Kontrollen) von Tag 12 bis Tag 18, das Tiergewicht an den Tagen 12 und 18 und die Körpergewichtsveränderung (prozentuale Veränderung im Vergleich zu den Kontrollen). Tabelle 5
Das Experiment bestätigt die niedrigere Toxizität der Ruthenium(II)-Komplexe der Erfindung (Gruppe 4) im Vergleich zu den Ruthenium(III)-Komplexen des Standes der Technik (Gruppe 3).
Es ist aus den in Tabellen 4 und 5 angegebenen Daten ersichtlich, daß die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen weniger toxisch als die entsprechenden Ruthenium(III)-Komplex der Formel (II) sind. Tatsächlich ist nicht nur die Abnahme des Körpergewichts geringer, sondern ebenfalls ist das Milzgewicht im wesentlichen unverändert, im Gegensatz zum Ablauf in der Gruppe mit der Ruthenium(III)-Verbindung.
Als Ergebnis aller durchgeführten Aktivitäts- und Toxizitätsuntersuchungen ist es daher möglich zu schließen, daß die Ruthenium(II)-Verbindungen der Erfindung deutlich aktiver als die entsprechenden Ruthenium(III)-Komplexe und als die Ruthenium(II)-Komplexe sind, die zum Stand der Technik gehören. Außerdem besitzen die erfindungsgemäßen Komplexe unterwartet eine niedrigere systemische Toxizität, im Gegensatz zu der Erwartung aus dem Stand der Technik.
Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, daß eine neue therapeutische Alternative zur Behandlung von Tumoren mit einer höheren und selektiveren Wirksamkeit und mit geringerer systemischer Toxizität im Vergleich zu allen bekannten Behandlungen auf Basis von Ruthenium-Komplexen hier offenbart wird.

Claims

Ruthenium(II)-Komplex der Formel (I) zur therapeutischen Verwendung:
worin R₁, R₂ und R₃ identisch oder voneinander unterschiedlich sind und ausgewählt sind aus H, linearem oder verzweigtem, gesättigtem oder ungesättigtem C_1-6-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl und Aryl; oder NR₁R₂R₃ ist ein 5- bis 7-gliedriger, gesättigter oder ungesättigter Stickstoffheterocyclus, der gegebenenfalls 1 oder mehr Atome, ausgewählt aus O, S und N, oder mit einem C_1-4-Alkylthiorest, Aryl oder Benzyl substituiertem N, enthält; der Stickstoffheterocyclus kann gegebenenfalls Benzo-kondensiert und/oder mit C_1-4-Alkyl, C_1-4-Alkoxy, C_1-4-Alkylthio, Aryl oder Benzyl substituiert sein; und worin: Q⁺ = NH⁺R₁R₂R₃, worin R₁, R₂ und R₃ die oben angegebenen Bedeutungen beibehalten; und worin: R₄ und R₅ identisch oder voneinander verschieden sind und ausgewählt sind aus H, C_1-6-Alkyl, C_3-7-Cycloalkyl und Aryl, oder R₄ und R₅ bilden zusammen mit dem S-Atom, an das sie gebunden sind, einen 4- bis 7-gliedrigen Heterocyclus.
Komplex gemäss Anspruch 1, worin R₁, R₂ und R₃ ausgewählt sind aus H und Ethyl.
Komplex gemäss Anspruch 1, worin NR₁R₂R₃ ein 5-gliedriger Heterocyclus ist, ausgewählt aus Imidazol, N-Methylimidazol, Pyrazol und Oxazol.
Komplex gemäss Anspruch 1, worin NR₁R₂R₃ ein 6-gliedriger Heterocyclus ist, ausgewählt aus Pyridin, 3,5-Lutidin und 4-Methylpyridin.
Komplex gemäss Anspruch 1, worin NR1R2R3 ein 7-gliedriger Heterocyclus ist, ausgewählt aus Azepin, Diazepin und Oxazepin.
Komplex gemäss Anspruch 1, worin NR1R2R3 ein Benzo-kondensierter Stickstoffheterocyclus ist, ausgewählt aus Indazol, Isochinolin, Benzimidazol und 1,5,6-Trimethyl-benzimidazol.
Komplex gemäss mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, worin R₄-SO-R₅ ausgewählt ist aus Dimethylsulfoxid und Diethylsulfoxid.
Komplex gemäss mindestens einem der Ansprüche 1, 3 und 7, worin NR₁R₂R₃ Imidazol ist, Q⁺ ist Imidazolium und R₄-SO-R₅ ist Dimethylsulfoxid. 9. Komplex gemäss mindestens einem der Ansprüche 1, 2 und 7, worin NR₁R₂R₃ Imidazol ist, Q⁺ ist Ammonium und R₄-SO-R₅ ist Dimethylsulfoxid. 10. Pharmazeutische Zusammensetzung, die den Ruthenium(II)-Komplex wie in mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert, als aktive Verbindung in Kombination mit geeigneten Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln und/oder pharmakologisch annehmbaren Stabilisatoren enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Form einer Lösung oder Suspension vorliegt. 12. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie in Form einer Gelsalbe, eines granularen Pulvers, einer Tablette, einer Pille, einer Kapsel oder einer Einlage vorliegt.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 10, worin die Ruthenium(II)-Komplexe mit einem oder mehreren Antitumorwirkstoffen kombiniert sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss mindestens einem der Ansprüche 10 bis 13, herstellbar unmittelbar vor der Anwendung durch Vermischen des entsprechenden Ruthenium(III)-Komplexes mit einem physiologisch kompatiblen Reduktionsmittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 14, worin das Reduktionsmittel ausgewählt ist aus Ascorbinsäure, Cystein und Glutathion. 16. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss mindestens einem der Ansprüche 14 und 15, worin der Ruthenium(III)-Komplex in einem Äquivalenzverhältnis zum Reduktionsmittel im Bereich von 5 : 1–1 : 2 verwendet wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 16, worin das Äquivalenzverhältnis zwischen Ruthenium(III)-Komplex und Reduktionsmittel 1 beträgt.
Kit zur Herstellung des Ruthenium(II)-Komplexes wie in mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert, worin die erste Komponente der entsprechende Ruthenium(III)-Komplex ist, und die zweite ist ein Reduktionsmittel.
Kit gemäss Anspruch 18, worin beide Komponenten in fester Form in getrennten Behältern vorliegen und unmittelbar vor der Verwendung in einem geeigneten Lösungsmittel vermischt und solubilisiert werden.
Kit gemäss Anspruch 18, worin beide Komponenten in Form von Lösungen vorliegen, die unmittelbar vor der Verwendung miteinander vermischt werden.
Kit gemäss Anspruch 18, worin das Reduktionsmittel ausgewählt ist aus Ascorbinsäure, Glutathion und Cystein.
Kit gemäss mindestens einem der Ansprüche 18 bis 21, worin beide Komponenten in einem Äquivalenzverhältnis von Ruthenium(III)-Komplex zu Reduktionsmittel im Bereich von 5 : 1–1 : 2 vorliegen.
Kit gemäss Anspruch 22, worin das Äquivalenzverhältnis 1 ist.
Verwendung eines Ruthenium(II)-Komplexes wie in mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung und Behandlung von Tumoren und Metastasen.
Verwendung gemäss Anspruch 24, worin die Tumore fest und durch eine hohe Metastasenbildungsfähigkeit gekennzeichnet sind.
Verwendung gemäss Anspruch 25, worin die Tumore ausgewählt sind aus Colonkarzinomen, Mammakarzinomen, Lungentumoren und Lungenmetastasen aus metastatischen Tumoren.
Verwendung gemäss mindestens einem der Ansprüche 24 bis 26, worin die Verabreichung parenteral, oral, topisch oder transdermal erfolgt.
Verwendung gemäss mindestens einem der Ansprüche 24 bis 27, worin der Ruthenium(II)-Komplex unmittelbar vor der Verwendung durch Vermischen des entsprechenden Ruthenium(III)-Komplexes mit einem Reduktionsmittel hergestellt wird.
Verwendung gemäss Anspruch 28, worin das Reduktionsmittel ausgewählt ist aus Ascorbinsäure, Cystein und Glutathion.