DE4433572A1

DE4433572A1 - Neue Kontrastmittel für die Röntgen-, Magnetresonanz- und Nukleardiagnostik, deren Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE4433572A1
Application number: DE19944433572
Authority: DE
Inventors: Wolf-Ruediger Press; Michael Dr Bauer; Hendrik Dr Randow; Werner Dr Krause
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1994-09-07
Filing date: 1994-09-07
Publication date: 1996-04-04

Description

Die Erfindung betrifft metallkomplexierende cyclische Peptide, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Ver bindungen enthaltende diagnostische und therapeutische Mittel.

Kontrastmittel sind Hilfsmittel für die Röntgen-, Nuklear- und Magnet-Resonanz-Diagnostik mit der Aufgabe, durch Einbringung in den menschlichen Körper die verschiedenen Körper- bzw. Organfunktionen erkennen zu lassen.

Alle zur Zeit verfügbaren Röntgenkontrastmittel für die Uro-/Angiographie und die Computer-Tomographie sind Verbindungen, die auf der Basis von Trÿodaromaten aufgebaut sind. Beispiele hierfür sind Amidotrizoat (ionisches Monomer), Iohexol, Iopamidol, Iopromid, Iopentol, Ioversol (nichtionische Monomere), Ioxaglat (ionisches Dimer), Iotrolan und Iodixanol (nichtionische Dimere).

Röntgenkontrastmittel ohne Jod sind nicht im Handel, ob wohl das Bedürfnis nach diesen Verbindungen sehr hoch ist. Der Nachteil der jodhaltigen Kontrastmittel liegt darin, daß in der Formulierung immer freie Jodidionen vorkommen, die zu Komplikationen an der Schilddrüse führen können.

Verschiedene Untersuchungen an Röntgenkontrastmitteln zeigten, daß die bisher bekannten Mittel unerwünschte Wirkungen mit einer mittleren Häufigkeit von 4,7% zur Folge haben. Weitere Untersuchungen zeigten, daß schwere unerwünschte Wirkungen mit einer Häufigkeit bis zu 0,4% auftreten (Katayama et al., Radiology; 175, 621-8, 1990).

Dies zeigt, daß ein Bedarf nach alternativen Diagnostika besteht.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Verbin dungen für die medizinische Diagnostik zur Verfügung zu stellen, welche die genannten Nachteile überwinden und gleichzeitig eine optimale Strahlenabsorption im diagnostisch verwendeten Röntgenstrahlenspektrum, eine ausreichende Anreicherung im zu untersuchenden Organ oder Gefäß und eine geringe Toxizität aufweisen.

Eine weitere Aufgabe besteht in der Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen sowie in der Schaffung von diagnostischen Mitteln, welche diese Verbindungen enthalten.

Es wurden nun Kontrastmittel gefunden, die völlig ohne Jod auskommen. Als strahlenabsorbierende Elemente werden Metallionen, wie z. B. Gadolinium, Ytterbium, Dysprosium oder Wismut verwendet. Überraschenderweise wurde gefunden, daß bei Einsatz von cyclischen Peptiden die Toxizität der freien Metallionen reduziert wird. Auch die übrigen Anforderungen an Kontrastmittel werden in über raschend hohem Maße erfüllt. Die praktische Anwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen wird durch deren hohe chemische Stabilität begünstigt.

Die bisher beschriebenen Komplexbildner für die Magnet- Resonanz-Tomographie sind alle vollsynthetisch herzu stellen und sind z. B. von DTPA oder von cyclischen Strukturen (Makrozyklus) abgeleitet.

Überraschend wurde nun gefunden, daß auch cyclische Peptide in der Lage sind, Gadolinium und andere paramagnetische Metallionen zu binden.

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung haben die allgemeine Formel I

{[z]ⁿ [M]^m} X_m-n (I)

worin
Z eine cyclische Aminosäuresequenz mit vier bis acht gleichen oder unterschiedlichen Aminosäureresten ist, wobei die Aminosäurereste aus natürlich vorkommenden L-α-Aminosäuren wie Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Tryptophan, Phenylalanin, Methionin, Glycin, Serin, Tyrosin, Threonin, Cystein, Asparagin, Glutamin, Asparaginsäure, Cysteinsäure, Glutaminsäure, γ-Carboxyglutaminsäure, Lysin, Arginin, Histidin, Citrullin, Homocystein, Homoserin, 4-Hydroxyprolin, 5-Hydroxylysin, Formylmethionin, Ornithin, Sarcosin, Taurin oder aus deren D-α-Aminosäuren oder aus deren homologen β-Aminosäuren gebildet sind oder die Reste

darstellen
oder wobei die Aminosäurereste aus substituierten D-α- oder L-α-Aminosäuren der allgemeinen Formel II oder deren homologen β-Aminosäuren gebildet sind,

H₂N-CR¹R²-COOH (II)

worin R¹ und R² gleich oder unterschiedlich sind und für ein Wasserstoffatom, eine verzweigte oder gerad kettige Alkyl- oder Arylgruppe mit bis zu 10 Kohlen stoffatomen, welche gegebenenfalls mit Hydroxy-, Amino-, Carboxygruppen COR³- oder mit Mercaptogruppen SR⁴- substituiert ist, stehen,
wobei R³ eine Hydroxygruppe, eine verzweigte oder geradkettige Alkyloxy- oder Aryloxygruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen, welche gegebenenfalls mit einer oder mehreren Hydroxy-, Amino- oder Carboxy gruppen substituiert ist, eine Aminogruppe oder eine N(RaR^b)-Gruppe bedeutet,
worin Ra und R^b gleich oder unterschiedlich sind und für verzweigte oder geradkettige Alkyl- oder Acylreste mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen stehen, welche gegebenenfalls mit einer oder mehreren Hydroxy-, Amino- oder Carboxygruppen substituiert sind,
R⁴ ein Wasserstoffatom, ein verzweigter oder geradkettiger Alkylrest mit bis zu 10 Kohlen stoffatomen oder eine geeignete Schwefelschutz gruppe wie ein Alkalimetallion, ein C_1-6-Acylrest, ein Benzoylrest, ein Hydroxyacetylrest, ein Acetamidomethylrest, ein p-Methoxybenzylrest, ein Ethoxyethylrest, ein Benzylrest, ein ortho- oder para-Hydroxybenzylrest, ein ortho- oder para-Acet oxybenzylrest, ein p-Nitrobenzylrest, ein 4-Pico lylrest, ein 2-Picolyl-N-oxidrest, ein 9-Anthryl methylrest, ein 9-Fluorenylrest, ein Ferrocenyl methylrest, ein Diphenylmethylrest, ein Bis(4- methoxyphenyl)methylrest, ein Dibenzosuberylrest, ein Triphenylmethylrest, ein Diphenyl-4-pyridyl methylrest, ein Phenylrest, ein 2,4-Dinitrophenyl rest, ein tert.-Butylrest, ein 1-Adamantylrest, ein Methoxymethylrest, ein Isobutoxymethylrest, ein 2- Tetrahydropyranylrest, ein Benzylthiomethylrest, ein Phenylthiomethylrest, ein Thiazolidinrest, ein Trimethylacetamidomethylrest, ein Benzamidomethyl rest, ein Acetylmethylrest, ein Carboxymethylrest, ein Cyanomethylrest, ein 2-Nitro-1-phenylethylrest, ein 2-(4′-Pyridyl)ethylrest, ein 2-Cyanoethylrest, ein 2,2-Bis(carboethoxy)ethylrest, ein 1-m-Nitro phenyl-2-benzoylethylrest, ein 2-Phenylsulfonyl ethylrest, ein 1-(4-Methylphenylsulfonyl)-2-methyl prop-2-ylrest, ein Silylrest, ein N-{[(p-Biphenyl) isopropoxy]carbonyl}-N-methyl-γ-aminobutyratrest, ein N-(tert.-Butoxycarbonyl)-N-methyl-γ-amino butyratrest, ein 2,2,2-Trichlorethoxycarbonylrest, ein tert.-Butoxycarbonylrest, ein Benzyloxy carbonylrest, ein p-Methoxybenzyloxycarbonylrest, ein N-Ethylrest, ein N-Methoxymethylrest, ein Ethylrest, ein tert.-Butylrest, ein substituierter Phenylrest, ein Sulfonatrest, ein Sulfenylthio carbonatrest oder ein 3-Nitro-2-pyridinsulfenylrest ist,
oder worin R¹ und R² die Bedeutung
CH₃-S-(CH₂)_p-, HOOC-(CH₂)_p-, H₂N-(CH₂)_p-, H₂N-C(=NH)-(CH₂)_p-, HO-(CH₂)_p-, CH₃-CH(OH)-, HS-(CH₂)_p-, H₂N-CO-(CH₂)_p-, (HOOC)₂CH-(CH₂)_p-,

wobei p die Ziffern 1, 2 oder 3 und
q die Ziffern 0,1 oder 2 bedeutet, haben,
M für ein Metallion der Ordnungszahlen 21-32, 37-51 oder 56-83 steht,
X ein Ion einer anorganischen oder organischen Säure oder Base ist, welches bei n = m entfällt,
n eine natürliche Zahl größer oder gleich Null bedeutet und für die Anzahl der positiven oder negativen Ladungen der Aminosäuresequenz Z steht,
m eine natürliche Zahl ist und für die Anzahl der positiven Ladungen des Metallions steht.

Die komplexbildenden cyclischen Peptide Z müssen in der Lage sein, die Metallionen zu binden. In Abhängigkeit von der Ladung, der Oxidationsstufe und des Ionenradius des Metallions muß das cyclische Peptid Z so gewählt werden, daß eine effektive und für die erfindungsgemäße Verwen dung ausreichende Bindung erzeugt wird.

Bevorzugt sind erfindungsgemäße Verbindungen der allge meinen Formel I, die komplexstabilisierende Gruppen der Art besitzen, daß die Aminosäuresequenz Z mindestens vier Aminosäurereste mit einer Gruppe COR³-, die sich von einer zweiten Carbonsäuregruppe ableitet, oder mit einer Mercaptogruppe SR⁴- enthält. Diese Carbonsäurederivat- oder Mercaptoderivatgruppen, wie sie zum Beispiel in Asparaginsäure, Cystein, Cysteinsäure, Glutaminsäure, Methionin oder in deren Derivaten vorhanden sind, haben den Vorteil, die Metallkomplexe zusätzlich zu stabili sieren. Hierdurch wird eine Freisetzung der toxischen Metallionen im Körper wirkungsvoll verhindert.

Bevorzugt sind weiterhin Verbindungen, in denen die Aminosäuresequenz Z die Reste der natürlich vorkommenden Aminosäuren Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Trp, Phe, Met, Gly, Ser, Tyr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg oder His enthält.

Besonders bevorzugt sind Verbindungen, die nicht die Reste von natürlich vorkommenden sondern von synthe tischen Aminosäuren enthalten. Diese Peptide haben den Vorteil, daß sie nicht von körpereigenen Enzymen abgebaut werden können, sondern unverändert ausgeschieden werden. In diesen bevorzugten Verbindungen enthält die Aminosäuresequenz Z die Reste von D-α-Aminosäuren, (β- Aminosäuren oder von substituierten Aminosäuren der allgemeinen Formel II

H₂N-CR¹R²-COOH (II)

worin R¹ und R² die oben angegebene Bedeutung haben.

Weitere bevorzugte Strukturvariationen sind Derivati sierungen des Komplex-Grundkörpers mit spezifischen Liganden, die sich an vorausbestimmten Stellen (Rezeptoren) im Organismus anheften und daher zu einer selektiven Bilddarstellung führen.

Bevorzugte Metallionen sind Mn, Fe, Ga, Tc, In, La, Ce, Nd, Sm, Gd, Dy, Yb, W, Tl oder Bi.

Komplexe, die das bevorzugte Metallion Bi enthalten, können in der Röntgendiagnostik eingesetzt werden.

Komplexe, die als bevorzugte Metallionen Mn, Fe oder Gd enthalten, können in der Magnetresonanz-Tomographie eingesetzt werden.

Bei Verwendung von Komplexen, die paramagnetische Metallionen wie z. B. Gadolinium enthalten, können mit derselben Verbindung sowohl Magnetresonanz- als auch Röntgenaufnahmen gemacht werden. Dies bedeutet auch, daß mit nur einer einzigen Injektion sequentiell zuerst eine Röntgen- und anschließend eine Magnetresonanzaufnahme durchgeführt werden kann. Die Reihenfolge der diag nostischen Maßnahmen kann auch umgekehrt sein.

Wird anstelle von Gd- oder anderer Ionen ein Radioisotop wie z. B. Technetium, Indium oder Thallium verwendet, so können diese Komplexe auch in der Nukleardiagnostik eingesetzt werden. Die Messung erfolgt dann mit einer Gammakamera.

Bei Verwendung von z. B. Indium können die Komplexe sowohl für die Diagnostik als auch für die Therapie verabreicht werden.

Eine weitere Therapiemöglichkeit stellt die Verwendung der Gadolinium-haltigen Komplexe in der Neutronen einfangtherapie dar.

Insbesondere bevorzugt sind die erfindungsgemäßen Verbindungen

die für die Magnetresonanz-Tomographie und gleichzeitig für die Röntgendiagnostik geeignet sind,
die Verbindung

die für die Magnetresonanz-Tomographie geeignet ist,
die Verbindungen

die für die Röntgendiagnostik geeignet sind und die Verbindung

die für die Nukleardiagnostik geeignet ist.

Die hervorragende Eignung der Verbindungen der allgemei nen Formel I für die Röntgendiagnostik wird durch die Verbindung

belegt.

Einer Maus wurden 1 mmol/kg dieser Verbindung intravenös appliziert. Anschließend wurde eine Röntgenaufnahme gemacht. Fig. 2 zeigt, daß die Nieren des Tieres sehr gut zu erkennen sind.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbin dungen der allgemeinen Formel I.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß

a) in gewünschter Reihenfolge und in an sich bekannter Weise (R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-54 (1963)) Aminosäuren nacheinander amidisch mit an Kunst harz gekoppelten Aminosäuren verknüpft werden und nach abgeschlossener Peptidsynthese vom Kunstharz abgespalten werden, oder daß
b) für die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) codierende Oligo- oder Polynucleotide mittels bekannter Verfahren zur chemischen Synthese dieser Verbindungen bei der die Hydroxyl-Gruppe am C-5′ eines Nucleotides mit der Phosphat-Gruppe eines weiteren Nucleotides verbunden wird oder mittels Detektion der codierenden mRNA-Stränge mit markierten Oligonucleotiden, Isolierung dieser mRNA, anschließender Umwandlung in cDNA sowie deren Amplifikation über Polymerase-Kettenreaktion hergestellt werden, in einen gebräuchlichen Expressions-Vektor einge bracht werden und in prokaryontischen oder eukaryon tischen Zellen exprimiert werden.

Anschließend wird das lineare Peptid in an sich bekannter Weise cyclisiert (J.S. Davies: Cyclic, Modified and Conjugated Peptides, in: Amino Acids and Peptides, The Royal Chemical Society (publ.), Athenaeum Press Ltd., Newcastle, vol. 23, S. 201-244 (1992) und vol. 24, S. 211-248 (1993)). Die Aktivierung der entsprechenden Carbonsäuren erfolgt nach den dem Fachmann bekannten Verfahren zum Beispiel nach der Carbodiimid-Methode (Fieser, Reagents for Organic Synthesis 10, 142) oder unter Verwendung von O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HAPyU), 2-(1H- Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluoro borat (TBTU), Benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino) phosphoniumhexafluorophosphat (BOP) oder Benzotriazol-1- yloxy-tris(pyrrolidino)-phosphoniumhexafluorophosphat (PyBOP). Bevorzugt wird das Cyclisierungsverfahren nach Carpino et al. (L.A. Carpino, A. El-Faham, F. Albericio: Racemization Studies during Solid-Phase Peptide Synthesis Using Azabenzotriazole-based Coupling Reagents, Tetra hedron Letters 35 (15), 2279-82 (1994)).

Der Einbau der Metallionen in die cyclischen Peptide erfolgt nach einem der dem Fachmann bekannten Verfahren, in dem ein Metall in Form eines Salzes oder Oxides gegebenenfalls in Gegenwart eines Reduktionsmittels und gegebenenfalls eines Hilfsliganden mit dem cyclischen Peptid Z umgesetzt wird. Geeignete Metallsalze sind beispielsweise Nitrate, Acetate, Carbonate, Chloride oder Sulfate, welche in polaren Lösungsmitteln wie Wasser oder wäßrigen Alkoholen suspendiert oder gelöst und mit der entsprechenden Menge des komplexbildenden Liganden umgesetzt werden. Soweit gewünscht, können vorhandene acide Wasserstoffatome oder Säuregruppen durch Kationen anorganischer und/oder organischer Basen oder Aminosäuren substituiert werden.

Geeignete anorganische Kationen sind beispielsweise das Lithiumion, das Kaliumion, das Calciumion und insbeson dere das Natriumion. Geeignete Kationen organischer Basen sind unter anderem solche von primären, sekundären oder tertiären Aminen, wie zum Beispiel Ethanolamin, Diethanolamin, Morpholin, Glucamin, N,N-Dimethylglucamin und insbesondere N-Methylglucamin. Geeignete Kationen von Aminosäuren sind beispielsweise die des Lysins, des Arginins und des Ornithins sowie die Amide ansonsten saurer oder neutraler Aminosäuren.

Bevorzugte radioaktive Metallionen sind ^99mTc, ⁶⁷Ga, ^113mIn, ¹¹¹In und Tl.

Bevorzugte Metallionen mit paramagnetischen Eigenschaften sind die Ionen von Mn, Fe und Gd.

Bevorzugte Metallionen für die Röntgendiagnostik sind Bi, Dy und Gd.

Bevorzugtes Metallion für die Neutroneneinfangtherapie ist Gd.

Die vorliegende Erfindung stellt ferner diagnostische oder therapeutische Mittel zur Verfügung, welche durch den Gehalt einer Verbindung der allgemeinen Formel I gekennzeichnet ist. Durch geeignete Wahl des Metallions sind die Mittel für unterschiedliche diagnostische und therapeutische Verfahren geeignet.

Ist das erfindungsgemäße Mittel zur Anwendung in der Röntgendiagnostik bestimmt, so muß das Zentralion der Verbindung der allgemeinen Formel I über eine optimale Strahlenabsorption im diagnostisch verwendeten Röntgen strahlenspektrum verfügen. Bevorzugte Metalle sind Bi, Dy und Gd.

Ist das erfindungsgemäße Mittel zur Anwendung in der Magnetresonanz-Tomographie bestimmt, so muß das Zentralion der Verbindung der allgemeinen Formel I paramagnetisch sein. Bevorzugte Metalle sind Mn, Fe und Gd.

Ist das erfindungsgemäße Mittel zur Anwendung in der Neutroneneinfangtherapie bestimmt, so ist das Zentralion der Verbindung der allgemeinen Formel I Gd.

Ist das erfindungsgemäße Mittel zur Anwendung in der Radiodiagnostik bestimmt, so muß das Zentralion des Komplexsalzes radioaktiv sein. Dies sind insbesondere die Ionen der Elemente der Ordnungszahlen 27, 29, 30-32, 37-39, 42-51, 62, 64, 70, 75 und 77. Bevorzugte Isotope sind ^99mTc, ¹⁸⁶Re, ¹¹¹In, ⁶⁷Ga, ^113mIn und Tl.

Die diagnostischen und therapeutischen Zusammensetzungen können übliche galenische Hilfs- und Trägerstoffe enthalten.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen radiopharmazeu tischen Mittel erfolgt in an sich bekannter Weise, indem man die erfindungsgemäßen cyclischen Peptide Z der allgemeinen Formel I (gegebenenfalls unter Zugabe der in der Galenik üblichen Zusätze) in wäßrigem Medium löst oder suspendiert und anschließend die Lösung oder Suspension gegebenenfalls lyophilisiert oder sterili siert. Geeignete Zusätze sind beispielsweise physiologisch unbedenkliche Puffer (wie zum Beispiel Tromethamin), Zusätze von Hilfsliganden (wie zum Beispiel Natriumcitrat oder Natriumtartrat), Reduktionsmittel (wie zum Beispiel Zinn(II)-chlorid) oder - falls erforderlich - Elektrolyte wie zum Beispiel Natriumchlorid oder, falls erforderlich, (einen) in der Galenik üblichen Hilfs stoff(e) (zum Beispiel Lactose, Methylcellulose, Mannit) und/oder Tensid(en) (zum Beispiel Lecithine, Tween®, Myrj®). Die verwendeten Zusätze müssen in ihrer Zusammensetzung eine Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen erlauben.

Bei der nuklearmedizinischen in vivo-Anwendung werden die erfindungsgemäßen Mittel in Mengen von 1×10^-5 bis 5×10⁴ nmol/kg Körpergewicht, vorzugsweise in Mengen zwischen 1×10^-3 bis 5×10² nmol/kg Körpergewicht dosiert. Ausgehend von einem mittleren Körpergewicht von 70 kg beträgt die Radioaktivitätsmenge für diagnostische Anwendungen zwischen 0,05 und 50 mCi, vorzugsweise 1 bis 10 mCi pro Applikation. Die Verabreichung erfolgt normalerweise durch intravenöse, intraarterielle oder peritoneale Injektion von 0,1 bis 5 ml einer Lösung der erfindungs gemäßen Mittel. Bevorzugt ist die intravenöse Appli kation. Details ihrer Anwendung und Dosierung werden zum Beispiel in "Radiotracers for Medical Applications", CRC-Press, Boca Raton, Florida, beschrieben.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen kommen zur Anwendung für die Radiodiagnostik und Radiotherapie in Form ihrer Komplexe mit den Radioisotopen der Elemente mit der Ordnungszahl 27, 29, 30-32, 37-39, 42-51, 62, 64, 70, 75 und 77.

Die erfindungsgemäßen radiopharmazeutischen Mittel erfüllen die vielfältigen Voraussetzungen für die Eignung als Radiopharmaka für die Radiodiagnostik und die Radio therapie. So sind sie hervorragend dazu geeignet, sich nach i.v. Applikation in Zielgeweben anzureichern und ermöglichen so eine nicht-invasive Diagnose entsprechen der Gewebe. Die Wasserlöslichkeit der erfindungsgemäßen radiopharmazeutischen Mittel wird - falls erforderlich - durch die in der Galenik üblichen Hilfsstoffe wie oben beschrieben gewährleistet.

Weiterhin weisen die erfindungsgemäßen radiopharma zeutischen Mittel nicht nur eine hohe Stabilität in vitro auf, sondern auch eine überraschend hohe Stabilität in vivo, so daß eine Freigabe oder ein Austausch des im Komplex gebundenen Radionuklids nicht oder klinisch nicht relevant erfolgt.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittel erfolgt in an sich bekannter Weise, indem man die erfindungsgemäßen Komplexbildner unter Zusatz eines Reduktionsmittels, vorzugsweise Zinn-(II)-salzen wie -chlorid oder -tartrat (gegebenenfalls unter Zugabe von Tromethamin) mit geringen Zusätzen von Elektrolyten (z. B. Natriumchlorid) und Stabilisatoren (z. B. Gluconat, Phosphate oder Phosphonate) versetzt. Das erfindungs gemäße pharmazeutische Mittel liegt in Form einer Lösung oder in lyophilisierter Form vor und wird kurz vor der Applikation beispielsweise mit einer Lösung Tc-99m-Pertechnetat, eluiert aus kommerziell erhältlichen Generatoren, oder einer Perrhenatlösung versetzt.

Zur Herstellung der Radiopharmaka wird ein erfindungs gemäßes Cold Kit zur Verfügung gestellt. Dieses Cold Kit beinhaltet ein erfindungsgemäßes cyclisches Peptid Z der allgemeinen Formel (I), ein Reduktionsmittel und gegebe nenfalls einen oder mehrere Hilfsliganden in Lösung, in trockenem Zustand oder in lyophilisierter Form. Das Cold Kit umfaßt ferner eine Gebrauchsanweisung mit einer Reaktionsvorschrift zur Umsetzung des erfindungsgemäßen cyclischen Peptids Z der allgemeinen Formel (I) mit einem Permetallat eines radioaktiven Metallions unter Bildung einer erfindungsgemäßen Verbindung der allgemeinen Formel (I).

Die Verwendung des Cold Kits, das aus einem verschließ baren Gefäß besteht, welches eine vorbestimmte Menge des cyclischen Peptides Z aufweist und außerdem eine ausrei chende Menge eines Reduktionsmittels enthält, um die Verbindung mit ⁹⁹m Tc zu markieren und zur Herstellung einer radiopharmazeutischen Zubereitung dient, ist ebenfalls ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

In einer Methode zur Durchführung einer radiodiagnosti schen Untersuchung wird die radiopharmazeutische Zusammensetzung in einer Menge von 0,1 bis 30 mCi, bevorzugt von 0,5 bis 10 mCi pro 70 kg Körpergewicht einem Patienten verabreicht und die vom Patienten abgegebene Strahlung aufgezeichnet.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:

Beispiel 1

Die Herstellung von cyclischem Tetraaspartat erfolgte in zwei Schritten: Zunächst wurde lineares Tetraaspartat entsprechend konventionellen Methoden synthetisiert, das anschließend cyclisiert wurde.

a) 6 mmol DIEA und 2,4 mmol geschützte Asparaginsäure [Fmoc-Asp(OButyl)-OH] werden unter Schütteln zu 2 g 2-Chlortrityl-Harz (Novabiochem) in 20 ml getrocknetem Methylenchlorid gegeben und anschließend wird eine Stunde bei Zimmertemperatur gerührt.
Weitere 0,5 ml DIEA und 3 ml Methanol werden zugege ben und nochmals für 15 min. gerührt. Dann wird das Harz abgesaugt und gewaschen (DMF, Methylenchlorid, Isopropanol, Diethylether) und unter vermindertem Druck getrocknet.
In einem Merrifield-System wird die Kette in der üblichen Weise verlängert. Die Mengenverhältnisse DIEA/TBPipU/ Asparaginsäure/Harz betragen 4/2/2/1. Mittels Kaisertest wird die Reaktion auf Vollständig keit überprüft.
Die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe erfolgt mit Piperidin (20%)/DMF, die Ablösung vom Harz mit Methylenchlorid/TFE/Essigsäure im Verhältnis 8/1/1. Nach Einengen unter vermindertem Druck wird der erhaltenen Lösung Wasser zugesetzt. Anschließend wird unter vermindertem Druck eingeengt.
b) Die Cyclisierung wird nach den üblichen Methoden durchgeführt (z. B. mit O-(7-azabenzotriazol-1-yl)- 1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HAPyU), 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluoroborat (TBTU), Benzotriazol-1-yloxy-tris- (dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphat (BOP), Benzotriazol-1-yloxy-tris(pyrrolidino)-phosphonium hexafluorophosphat (PyBOP) oder mit Carbodiimid).
Aus 420 mg H-[Asp(OtBu)]₄-OH (Molmasse 703) wurde durch Lösen in 600 ml Dimethylformamid eine 10^-3 molare Lösung hergestellt. Zu dieser Lösung wurden 300 mg HAPyU (20% molarer Überschuß) gegeben und 3 min gerührt. Nach Zugabe von 308 µl N-Ethyldiiso propylamin färbte sich die klare Lösung gelb. Nach 1h war mittels HPLC nur noch wenig Ausgangsmaterial nachzuweisen. Nach weiteren 30 min Rühren bei Raum temperatur wurde Dimethylformamid im Ölpumpenvakuum weitgehend entfernt und das rohe Produkt mit Ether verrieben.
Das Rohprodukt wurde ohne weitere Reinigung in 95%iger Trifluoressigsäure gelöst und 1h zur Entfer nung der tert. Butylgruppen gerührt. Die leicht braun gefärbte Reaktionslösung wurde filtriert, eingeengt und mit Diethylether versetzt. Der weiße Niederschlag wurde abgesaugt, mit Diethylether gewaschen und ge trocknet. Das Rohprodukt wurde ohne weitere Reinigung massenspektrometrisch untersucht. Es wurden Peaks bei 461,1 (M+H), 483,3 (M+Na) und 499,2 (M+K) gefunden.
Elementaranalyse des Komplexbildners (bezogen auf lösungsmittelfreie Substanz)
ber. (%) C 41,7; H 4,4; N 12,2 O 41,7
Die gefundenen Werte entsprachen den erwarteten.
Fig. 1 zeigt das Massenspektrum des Komplexbildners. Molekulargewicht (M+1): ber. 461
gef. 461,1
c) Die Herstellung des Gadoliniumkomplexes wurde in der dem Fachmann vertrauten Art und Weise durchgeführt.
Eine Suspension von 230 mg (0.5 mmol) der cyclischen Tetraasparaginsäure in 5 ml Wasser wurde mit 90 mg (0.25 mmol) Gadoliniumoxid versetzt und 2 h bei 80°C gerührt. Dann wurde mit einer Mikrobürette 1N Natron lauge bis zum Neutralpunkt zugegeben und anschließend 1 h gerührt. Die erhaltene Lösung wurde dann bei 80°C nach Zugabe von 25 mg Aktivkohle 2 h gerührt und anschließend filtriert. Das Filtrat ergab nach Gefriertrocknung einen farblosen Feststoff.
d) In einem biologischen Versuch wurden einer Maus 1 mmol/kg des Gadoliniumkomplexes intravenös verabreicht und anschließend eine Röntgenaufnahme gemacht. Fig. 2 zeigt die nach Applikation gut zu erkennenden Nieren des Tieres.

Beispiel 2

Die Herstellung des Komplexbildners erfolgte in Analogie zu der unter 1 beschriebenen Verbindung.

Elementaranalyse des Komplexbildners (bezogen auf lösungsmittelfreie Substanz)
ber. (%) C 40,2; H 4,5; N 12,5 O 35,7; S 7,1
Die gefundenen Werte entsprachen den erwarteten.

Die Herstellung des Gadoliniumkomplexes wurde in der dem Fachmann vertrauten Art und Weise durchgeführt.

Beispiel 3

Elementaranalyse des Komplexbildners (bezogen auf lösungsmittelfreie Substanz)
ber. (%) C 38,5; H 4,6; N 12,8 O 29,3; S 14,7
Die gefundenen Werte entsprachen den erwarteten.

Die Herstellung des Mangankomplexes wurde in der dem Fachmann vertrauten Art und Weise durchgeführt.

Beispiel 4

Elementaranalyse des Komplexbildners (bezogen auf lösungsmittelfreie Substanz)
ber. (%) C 41,7; H 4,4; N 12,2 O 41,7
Die gefundenen Werte entsprachen den erwarteten.

Die Herstellung des Wismutkomplexes wurde in der dem Fachmann vertrauten Art und Weise durchgeführt.

Beispiel 5

Elementaranalyse des Komplexbildners (bezogen auf lösungsmittelfreie Substanz):
ber. (%) C 40,2; H 4,5; N 12,5 O 35,7; S 7,2
Die gefundenen Werte entsprachen den erwarteten.

Beispiel 6

Beispiel 7

Elementaranalyse des Komplexbildners (bezogen auf lösungsmittelfreie Substanz):
ber. (%) C 38,5; H 4,6; N 12,8 O 29,3; S 14,7
Die gefundenen Werte entsprachen den erwarteten.

Die Herstellung des Technetiumkomplexes wird in der dem Fachmann vertrauten Art und Weise durchgeführt.

Dazu wird eine Lösung von 5,75 mg Dinatrium-L-tartrat (Aldrich) bei Raumtemperatur in 1 ml bidest. Wasser gelöst und unter Argonschutzgas bereitgehalten. 0,375 µmol des Komplexbildners werden in 250 µl 0,1 molare Dinatriumhydrogenphosphatlösung (pH 8,5) bei Raumtemperatur gelöst und mit Argon abgeschlossen. 5 mg Zinn-(II)-chlorid (Aldrich) werden in 1 ml 0,01 molare Salzsäure gelöst und unter Argon bereitgehalten. 1 ml der Dinatrium-L-tartratlösung werden in 50 µl der Komplex bildnerlösung und 7,5 µl der Zinn-(II)-chloridlösung versetzt und anschließend gefriergetrocknet. Vor Einsatz in der Nukleardiagnostik werden 1-10 mCi Na-Pertechnetat zugegeben. Die radioaktive Dosis pro Patient beträgt 1-10 mCi.

Beispiel 8

Elementaranalyse des Komplexbildners (bezogen auf lösungsmittelfreie Substanz)
ber. (%) C 41,8; H 4,4; N 12,2 O 41,7
Die gefundenen Werte entsprachen den erwarteten.

Claims

1. Verbindungen der allgemeinen Formel I {[Z]ⁿ [M]^m} X_m-n (I)worin
Z eine cyclische Aminosäuresequenz mit vier bis acht gleichen oder unterschiedlichen Aminosäureresten ist,
wobei die Aminosäurereste aus natürlich vorkommenden L-α-Aminosäuren wie Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Tryptophan, Phenyl alanin, Methionin, Glycin, Serin, Tyrosin, Threonin, Cystein, Asparagin, Glutamin, Asparagin säure, Cysteinsäure, Glutaminsäure, γ-Carboxy glutaminsäure, Lysin, Arginin, Histidin, Citrullin, Homocystein, Homoserin, 4-Hydroxyprolin, 5-Hydroxy lysin, Formylmethionin, Ornithin, Sarcosin, Taurin oder aus deren D-α-Aminosäuren oder aus deren homologen β-Aminosäuren gebildet sind oder die Reste darstellen
oder wobei die Aminosäurereste aus substituierten D-α- oder L-α-Aminosäuren der allgemeinen Formel II oder deren homologen β-Aminosäuren gebildet sind,H₂N-CR¹R²-COOH (II)worin R¹ und R² gleich oder unterschiedlich sind und für ein Wasserstoffatom, eine verzweigte oder geradkettige Alkyl- oder Arylgruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen, welche gegebenenfalls mit Hydroxy-, Amino-, Carboxygruppen COR³- oder mit Mercaptogruppen SR⁴- substituiert ist, stehen,
wobei R³ eine Hydroxygruppe, eine verzweigte oder geradkettige Alkyloxy- oder Aryloxygruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen, welche gegebenenfalls mit einer oder mehreren Hydroxy-, Amino- oder Carboxygruppen substituiert ist, eine Aminogruppe oder eine N(RaR^b)-Gruppe bedeutet,
worin Ra und R^b gleich oder unterschiedlich sind und für verzweigte oder geradkettige Alkyl- oder Acylreste mit bis zu 10 Kohlen stoffatomen stehen, welche gegebenenfalls mit einer oder mehreren Hydroxy-, Amino- oder Carboxygruppen substituiert sind,
R⁴ ein Wasserstoffatom, ein verzweigter oder geradkettiger Alkylrest mit bis zu 10 Kohlen stoffatomen oder eine geeignete Schwefelschutz gruppe wie ein Alkalimetallion, ein C_1-6-Acyl rest, ein Benzoylrest, ein Hydroxyacetylrest, ein Acetamidomethylrest, ein p-Methoxybenzylrest, ein Ethoxyethylrest, ein Benzylrest, ein ortho- oder para-Hydroxybenzylrest, ein ortho- oder para- Acetoxybenzylrest, ein p-Nitrobenzylrest, ein 4- Picolylrest, ein 2-Picolyl-N-oxidrest, ein 9- Anthrylmethylrest, ein 9-Fluorenylrest, ein Ferrocenylmethylrest, ein Diphenylmethylrest, ein Bis(4-methoxyphenyl)methylrest, ein Dibenzo suberylrest, ein Triphenylmethylrest, ein Diphenyl-4-pyridylmethylrest, ein Phenylrest, ein 2,4-Dinitrophenylrest, ein tert.-Butylrest, ein 1-Adamantylrest, ein Methoxymethylrest, ein Isobutoxymethylrest, ein 2-Tetrahydropyranylrest, ein Benzylthiomethylrest, ein Phenylthiomethyl rest, ein Thiazolidinrest, ein Trimethylacet amidomethylrest, ein Benzamidomethylrest, ein Acetylmethylrest, ein Carboxymethylrest, ein Cyanomethylrest, ein 2-Nitro-1-phenylethylrest, ein 2-(4′-Pyridyl)ethylrest, ein 2-Cyanoethyl rest, ein 2,2-Bis(carboethoxy)ethylrest, ein 1-m- Nitrophenyl-2-benzoylethylrest, ein 2-Phenyl sulfonylethylrest, ein 1- (4-Methylphenyl sulfonyl)-2-methylprop-2-ylrest, ein Silylrest, ein N-{[(p-Bipheny1)isopropoxy]carbonyl}-N methyl-γ-aminobutyratrest, ein N-(tert.-Butoxy carbonyl)-N-methyl-γ-aminobutyratrest, ein 2,2,2- Trichlorethoxycarbony1rest, ein tert.-Butoxy carbonylrest, ein Benzyloxycarbonylrest, ein p-Methoxybenzyloxycarbonylrest, ein N-Ethylrest, ein N-Methoxymethylrest, ein Ethylrest, ein tert.-Butylrest, ein substituierter Phenylrest, ein Sulfonatrest, ein Sulfenylthiocarbonatrest oder ein 3-Nitro-2-pyridinsulfenylrest ist,
oder worin R¹ und R² die Bedeutung CH₃-S-(CH₂)_p-, HOOC-(CH₂)_p-, H₂N-(CH₂)_p-, H₂NC(=NH)-(CH₂)_p-, HO-(CH₂)_p-, CH₃-CH(OH)-, HS-(CH₂)_p-, H₂N-CO-(CH₂)_p-, (HOOC)₂CH-(CH₂)_p-, wobei p die Ziffern 1, 2 oder 3 und q die Ziffern 0, 1 oder 2 bedeutet, haben,
M für ein Metallion der Ordnungszahlen 21-32, 37-51 oder 56-83 steht,
X ein Ion einer anorganischen oder organischen Säure oder Base ist, welches bei n = m entfällt,
n eine natürliche Zahl größer oder gleich Null bedeutet und für die Anzahl der positiven oder negativen Ladungen der Aminosäuresequenz Z steht,
m eine natürliche Zahl ist und für die Anzahl der positiven Ladungen des Metallions steht.

2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz Z mindestens vier Amino säurereste mit einer Gruppe COR³-, die sich von einer zweiten Carbonsäuregruppe ableitet oder mit einer Mercaptogruppe SR⁴- enthält.

3. Verbindungen nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekenn zeichnet, daß die Aminosäuresequenz Z die Reste der Aminosäuren Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Trp, Phe, Met, Gly, Ser, Tyr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg oder His enthält.

4. Verbindungen nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekenn zeichnet, daß die Aminosäuresequenz Z die Reste von D-α-Aminosäuren enthält.

5. Verbindungen nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekenn zeichnet, daß die Aminosäuresequenz Z die Reste von (3-Aminosäuren enthält.

6. Verbindungen nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekenn zeichnet, daß die Aminosäuresequenz Z Reste der substituierten D-α- oder L-α-Aminosäuren der allge meinen Formel II oder deren homologen β-Aminosäuren enthält, H₂N-CR¹R²-COOH (II)worin R¹ und R² die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben.

7. Verbindungen nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekenn zeichnet, daß das Metallion M Mn, Fe, Ga, Tc, In, La, Ce, Nd, Sm, Gd, Dy, Yb, W, Tl oder Bi ist.

8. Verbindungen nach Anspruch 1, nämlich

9. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) in an sich bekannter Weise Aminosäuren nach einander amidisch zu einem Peptid verknüpft und
b) das Peptid in an sich bekannter Weise cyclisiert und
c) in an sich bekannter Weise ein geeignetes Salz oder Oxid eines Metallions mit dem cyclischen Peptid umsetzt.

10. Diagnostisches oder therapeutisches Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Verbindung nach Anspruch 1 und geeignete Hilfs- und Trägerstoffe enthält.