DE4427395A1 - Humanes zirkulierendes Cytokin CC-1 - Google Patents
Humanes zirkulierendes Cytokin CC-1Info
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- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/521—Chemokines
- C07K14/523—Beta-chemokines, e.g. RANTES, I-309/TCA-3, MIP-1alpha, MIP-1beta/ACT-2/LD78/SCIF, MCP-1/MCAF, MCP-2, MCP-3, LDCF-1, LDCF-2
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Description
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid aus
der Klasse der Cytokine, Cytokin CC-1 sowie dessen biologisch
aktive Fragmente und/oder Derivate, ein für das Cytokin CC-1
oder für seine biologisch aktiven Fragmente kodierendes Poly
nucleotid, insbesondere eine cDNA, ein Arzneimittel ent
haltend das erfindungsgemäße Peptid, ein Diagnostikmittel,
Verwendung von Cytokin CC-1 für zweite medizinische Indi
kationen sowie eine Nucleinsäuresonde hybridisierend für ein
Polynucleotid kodierend für Cytokin CC-1 oder eines seiner
Fragmente.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, daß sich aus humanem
Hämofiltrat ein Cytokin CC-1 isolieren läßt. Das Cytokin hat
die nachstehend angegebene Aminosäuresequenz
Auch Fragmente des Cytokins CC-1 weisen biologische Aktivität
auf. Die Fragmente sind erhältlich durch dem Fachmann bekann
te Methoden, beispielsweise durch Abdauung mit Peptidasen,
insbesondere Endoproteasen. Auch Fragmentierung des er
findungsgemäßen Peptids mittels peptidbindungspaltender
chemischer Reagenzien, insbesondere Cyanogenbromid liefert
auch biologisch aktive Fragmente.
Das erfindungsgemäße Peptid ist erhältlich durch ein Isola
tionsverfahren ausgehend von humanem Hämofiltrat.
Das humane Hämofiltrat wird gegebenenfalls mit Wasser ver
dünnt und angesäuert. Der pH-Wert beträgt vorzugsweise 1,5
bis 3,5, insbesondere 2,5 bis 3,0. Danach wird das Hämo
filtrat mit einem Kationenaustauscher behandelt, beispiels
weise einem mit Sulfonsäuregruppen modifizierten Träger
material (Fractogel medium 503 der Firma Merck). Die an den
Kationenaustauscher gebundenen Peptide werden mit relativ
hoch konzentrierter Salzlösung in einem sauren pH-Bereich,
der dem obigen entspricht, eluiert. Die Ionenstärke der
Elutionslösung entspricht dabei ungefähr einer 0,7 bis 1,3
molaren Natriumchloridlösung.
Das aufgefangene Eluat wird mit einem peptidfällenden Rea
genz, beispielsweise Ammoniumsulfat versetzt. Die Ausfällung
der Peptide erfolgt vorzugsweise bei niedrigeren Temperatu
ren, insbesondere im Bereich von 4 bis 10°C. Das so gewonnene
Präzipitat wird von der überstehenden Lösung befreit, in
Wasser aufgenommen und danach mit einem niederen peptid
fällenden Alkohol, wie Isopropanol versetzt. Darin schließt
sich eine weitere Kationenaustauscher-Chromatographie an.
Diese Chromatographie ist vorzugsweise eine Gradienten
elutions-Chromatographie mit einem Puffer geringer Ionen
stärke bis zu einem Puffer mit höherer Ionenstärke ent
sprechend ungefähr einer Ionenstärke von 0,7 bis 1,3 M NaCl.
Die biologisch aktiven Fraktionen werden gepoolt und mittels
präparativer Umkehrphasen-Chromatographie an mit C4 modifi
zierten Trägermaterialien weitergereinigt. Gegebenenfalls
erfolgen weitere chromatographische Reinigungsschritte.
Die durch die chromatographische Reinigung erhaltene Substanz
wurde der Strukturbestimmung zugeführt. Die Sequenzanalyse
erfolgte über einen Edman-Abbau des Peptids sowie der Spalt
produkte und wurden über einen ABI 473 A Sequenzer durchge
führt.
Aus der erfindungsgemäßen Peptidsequenz läßt sich ein Polynu
cleotid ableiten, kodierend für das Cytokin CC-1 (Fig. 1).
Das Polynucleotid ist insbesondere eine cDNA, die sowohl als
Ausgangspunkt einer gentechnischen Herstellung des Cytokins
CC-1 dienen kann, wie auch als analytisches Werkzeug zum
Nachweis des Auftretens von für das Protein kodierender DNA
oder mRNA.
Dabei können entsprechende Derivate als Hybridisierungssonden
eingesetzt werden. Beispielsweise weist die cDNA, die für
ein Fragment des erfindungsgemäßen Peptids kodiert, die
nachstehende Sequenz auf
Neben der gentechnischen Herstellung ist auch die aufbauende
Totalsynthese an üblichen Festphasen im Sinne der Merrifield-
Synthese möglich. Die Synthesenstrategie und der Aufbau des
Peptids mit den entsprechend geschützten Aminosäuren sind
dem Fachmann bekannt.
Das erfindungsgemäße Peptid kann als Arzneimittel Verwendung
finden. Seine biologische Aktivität entspricht der eines
Cytokins. Es ist daher geeignet, als Arzneimittel bei den
in Anspruch 7 genannten Indikationen eingesetzt zu werden.
Das erfindungsgemäße Peptid kann dabei in für Peptide üb
licher Weise parenteral, intravenös oder intramuskulär oder
intranasal, bukal verabreicht werden. Die Menge an zu ver
abreichenden Peptid beträgt zwischen 10 und 3000 µg pro
Darreichungseinheit.
Das erfindungsgemäße Diagnostikmittel enthält poly- oder
monoklonale Antikörper gegen das erfindungsgemäße Peptid
gegebenenfalls in fluoreszenz- oder radioaktivmarkierter Form
um in an sich bekannten ELISA oder RIA Assays eingesetzt zu
werden.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher be
schrieben.
500 l humanes Hämofiltrat wurden mit Wasser auf 2.000 l ver
dünnt und mit konzentrierter HCl der pH auf 2, 7 eingestellt.
Nach Auftrag auf eine Amicon-Vantage Säule (Füllmaterial
Merck Fractogel medium SO₃⁻) wurden die gebundenen Peptide
mit 1 M NaCl pH 3,0 eluiert.
Das Eluat (7 l) wurde mit Ammoniumsulfat versetzt und über
Nacht die Peptide bei 4°C ausgefällt. Das Peptidpräzipitat
wurde über einen Büchner-Filter filtriert.
Das gewonnene Präzipitat wurde in 2 l Wasser gelöst und mit
4,5 Teilen Isopropanol versetzt. Die ausgefällten Peptide
wurden erneut über einen Büchner-Filter abfiltriert.
Das Präzipitat nach Isopropanol-Fällung wurde in 4 l Wasser
gelöst und ein pH von 3,0 mit HCl eingestellt. Nach Auftrag
auf einen Kationenaustauscher (Säule: Amicon Vantage) wurde
die Säule eluiert und die Fraktionen gesammelt (Chromatogramm
siehe Fig. 2).
Puffer A: 10 mmol Natriumdihydrogenphosphat pH 3,0
Puffer B: Puffer A mit 1 M NaCl
Gradient: 0-100% B in 60 min.
Fluß 40 ml/min
Detektion: 280 nm
Chromatographieanlage: Biopilot (Pharmacia)
Fraktionen: à 2 min ab Start des Gradienten
Puffer B: Puffer A mit 1 M NaCl
Gradient: 0-100% B in 60 min.
Fluß 40 ml/min
Detektion: 280 nm
Chromatographieanlage: Biopilot (Pharmacia)
Fraktionen: à 2 min ab Start des Gradienten
Die Fraktionen 31 bis 34 wurden zur weiteren Behandlung ver
einigt.
Die gepoolten Fraktionen 31 bis 34 wurden sukzessive in zwei
Chromatographie-Läufen über eine präparative Reverse-Phase-
Säule aufgetrennt (Chromatogram siehe Fig. 3a und b).
Säule: 3 cm × 12,5 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Parcosil RP-C4 25-45, 300 A
Puffer A: 0,01 N HCl
Puffer B: Puffer A mit 30% Methanol und 50% Isopropanol
Gradient: 0-100% B in 60 min.
Fluß: 15 ml/min
Detektion: 280/254 nm
Chromatographieanlage: BioCAD (Perseptive)
Fraktionen: à 1 min ab Start des Gradienten.
Füllmaterial: Parcosil RP-C4 25-45, 300 A
Puffer A: 0,01 N HCl
Puffer B: Puffer A mit 30% Methanol und 50% Isopropanol
Gradient: 0-100% B in 60 min.
Fluß: 15 ml/min
Detektion: 280/254 nm
Chromatographieanlage: BioCAD (Perseptive)
Fraktionen: à 1 min ab Start des Gradienten.
Die Fraktionen 22 und 23 aus dem ersten präparativen Lauf
sowie die Fraktion 24 des zweiten Laufes wurden gepoolt und
das Lösungsmittel über einen Rotationsverdampfer abgezogen.
Danach wurden die Fraktionen über eine semipräparative RP-C4
Säule aufgetrennt (Chromatogram siehe Fig. 4).
Säule: 1 cm × 12,5 cm Stahlsäule
Füllmaterial: Parcosil RP-C4 5 µ, 300 A
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B: Puffer A mit 80% Acetonitril
Gradient: 0-30% B in 60 min.
Fluß: 2 ml/min
Detektion: 214 nm
Chromatographieanlage: Kontron 322
Fraktionen: à 1 min ab Start des Gradienten.
Füllmaterial: Parcosil RP-C4 5 µ, 300 A
Puffer A: 0,1% TFA
Puffer B: Puffer A mit 80% Acetonitril
Gradient: 0-30% B in 60 min.
Fluß: 2 ml/min
Detektion: 214 nm
Chromatographieanlage: Kontron 322
Fraktionen: à 1 min ab Start des Gradienten.
Die Fraktion 33 und 34 enthält die zu über 95% aufgereinigte
Substanz, die im folgenden in ihrer Struktur aufgeklärt
wurde:
Edman-Abbau des Peptids sowie der Spaltprodukte erfolgte über
einen ABI 473 A Sequenzer nach Auftragen auf eine Polybrene-
Membran in Mengen zwischen 100 und 400 pmol unter Verwendung
des Standard-Programmes.
¹⁴C-Carboxymethylierung und nachfolgende Aufreinigung über
analytische Vydac C18 RP-Säule (4,6 mm × 25 cm). Detektion
der carboxymethylierten Fraktion im Radioaktivitätsmonitor.
Nachfolgend Lys-C-Spaltung von 50% des carboxymethylierten
Peaks mit der Endopeptidase Lys-C. Die Spaltung erfolgte bei
37°C über 3 Stunden in den vom Hersteller (Boehringer, Mann
heim) angegebenen Puffern bei einem Verhältnis von Enzym zu
Peptid von 1 : 25. Die Spaltprodukte wurden über RP-Chromato
graphie mit einer analytischen Vydac-C18-Säule getrennt.
Sammeln der einzelnen Peaks und Sequenzierung zur Komplett
bestimmung der Sequenz.
Die Spaltung der restlichen 50% des carboxymethylierten Pep
tids erfolgt mit Chymostrypsin in den vom Hersteller
(Boehringer, Mannheim) angegebenen Puffern bei einem Ver
hältnis von Enzym zu Peptid von 1 : 25, die nachfolgende
Aufreinigung über analytische Vydac C18 RP-Säule (4,6 mm ×
25 cm). Die einzelnen Peaks werden gesammelt und zur
Komplettbestimmung der Sequenz analysiert.
Massenbestimmung des Gesamtpeptids erfolgt mit Sciex API III
sowie der Fragmente nach Lys-C- und Chymotrypsinspaltung.
Sequenzierung und Massenbestimmung ergeben die oben an
gegebene Sequenz mit einer Masse von 8674 Dalton.
Ein Datenbankvergleich wurde durchgeführt an Swiss-Prot und
EMBL-Peptid und Nucleinsäuredatenbank. Sequenzhomologie zu
verschiedenen Mitgliedern der Superfamilie der Intercrine
wurden festgestellt, dabei höchste Homologie zu Macrophage
Inflammatory Protein MIP I alpha und MIP I beta.
Aus humane Nebennierengewebe wurde mit Hilfe eines automati
schen Nucleinsäureextraktors (ABI, 340) Gesamt-RNA präpariert.
Aus 5 µg dieser RNA wurde die mRNA unter Verwendung von MMLV-
RTase (Gibco-BRL) und eines synthetischen Oligo(dT)-Primers
(UNIP-2, CCTGAATTCTAGAGCTCA(T)₁₇) in cDNA-Erststrang umge
schrieben. Parallel dazu wurden ausgehend von der bekannten
Peptid-Sequenz zwei "degenerierte" PCR-Primerpaare syntheti
siert, welche sämtliche Codierungsmöglichkeiten für die ent
sprechenden Aminosäuresequenzen enthielten (siehe separates
Blatt "CC-1-Aminosäuresequenz und abgeleitete PCR-Primer").
Das erste Primerpaar (CC-1-2/1, CC-1-2/2) war dabei in bezug
auf die Aminosäuresequenz eher N-terminal lokalisiert,
während das zweite Primerpaar (CC-1-2/3, CC-1-2/4) nach C-
terminal verschoben positioniert war. Dies sollte eine
Verstärkung in zwei Stufen (Vorverstärkung, Nachverstärkung)
ermöglichen, um die Spezifität der Reaktion zu erhöhen.
Folgende Reaktionen wurden durchgeführt:
- 1. In zwei verschiedenen Ansätzen wurden je 1/15 des cDNA- Ansatzes 40 PCR-Zyklen mit den Primerkombinationen CC- 1-2/1/UNIP-2 bzw. CC-1-2/2/UNIP-2 unterzogen (Vor verstärkung, 2 Ansätze). Ein Zyklus bestand aus:
- 2. Je 1/30 der beiden Ansätze wurde danach mit den Primer kombinationen CC-1-2/3/UNIP-2 bzw. CC-1-2/4/UNIP-2 in 20 Zyklen nachamplifiziert (Nachverstärkung, 4 Ansätze):
Nachverstärkung mit CC-1-2/4/UNIP-2 konnte ein homogenes
PCR-Produkt erhalten werden (siehe "Agarosegelelektrophorese
der PCR-Fragmente"). Der PCR-Ansatz wurde durch Centrikon
C-100 (Amicon)-Zentrifugation von nicht umgesetzten Primern
befreit, zusammen mit 50 ng pBluescript Eco-RI-restringiert
(die PCR-Primer enthalten zur leichteren Klonierung Eco-RI-
Schnittstellen) und anschließend ligiert. Die Ligations
produkte wurden in E.coli XL-1 Blue propagiert, die Plasmid-
DNA weißer Kolonien mit Qiagen-Säulen (Diagen) präpariert
und mit Hilfe eines Fluoreszenzsequenzers sequenziert. Die
klonierte cDNA kann nun als hochspezifische Hybridisierprobe
zum Screening einer cDNA- oder Genbank eingesetzt werden.
Ausgehend von der Sequenz können zudem spezifische Primer
für eine direkte Amplifikation der restlichen cDNA aus
Gesamt-DNA einer humanen cDNA-Bank abgeleitet werden.
Claims (8)
1. Cytokin CC-1 mit nachfolgender Aminosäuresequenz
sowie dessen biologisch aktive Fragmente und/oder Deri
vate, insbesondere amidierte, acetylierte, phosphory
lierte und/oder glycosylierte Derivate.
2. Polynucleotid kodierend für Cytokin CC-1 nach Anspruch
1 und/oder dessen Fragmente.
3. Polynucleotid nach Anspruch 2 dadurch gekennzeichnet,
daß dieses ein cDNA-Fragment der nachstehenden Formel
ist
4. Verfahren zur Herstellung eines Cytokins-CC-1 gemäß
Anspruch 1 durch Extraktion von Hämofiltrat, Kationen
austauscher-Extraktion, gefolgt von Elution der ad
sorbierten Substanzen,
Ammoniumsulfat-Fällung der im Eluat vorhandenen Peptide und Proteine,
Aufnahme des Präzipitats in wäßriger Lösung und erneute Fällung mit einem niederen Alkohol sowie Kationenaus tauscher-Chromatographie, sowie Umkehrphasen-Chromato graphie.
Ammoniumsulfat-Fällung der im Eluat vorhandenen Peptide und Proteine,
Aufnahme des Präzipitats in wäßriger Lösung und erneute Fällung mit einem niederen Alkohol sowie Kationenaus tauscher-Chromatographie, sowie Umkehrphasen-Chromato graphie.
5. Arzneimittel enthaltend Cytokin CC-1 gemäß Anspruch 1
als wirksamen Bestandteil.
6. Diagnostikmittel enthaltend poly- oder monoklonale An
tikörper gegen Cytokin CC-1 oder mit der für das
Cytokin kodierenden Nucleinsäure oder mRNA.
7. Verwendung von Cytokin CC-1 zur Herstellung eines Arz
neimittels zur Behandlung von Störungen der Migration
von Zellen, Erkrankungen des Immunsystems, Tumoren
sowie Disfunktion regulatorischer Wachstumsfunktionen,
insbesondere Verwendung von CC-1 in der Tumortherapie
als Knochenmarksprotektor, insbesondere in Kombination
mit Zytostatika und sonstiger Chemotherapie und/oder
Wachstumsfaktoren.
8. Nucleinsäuresonden hybridisierend mit einem Polynu
cleotid nach Anspruch 2.
Priority Applications (12)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19944427395 DE4427395A1 (de) | 1994-08-03 | 1994-08-03 | Humanes zirkulierendes Cytokin CC-1 |
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CA002179638A CA2179638A1 (en) | 1993-12-24 | 1994-12-22 | Human circulating cytokine cc-1 |
EP95905105A EP0736095B1 (de) | 1993-12-24 | 1994-12-22 | Humanes zirkulierendes cytokin cc-1 |
JP51777495A JP3630685B2 (ja) | 1993-12-24 | 1994-12-22 | ヒト循環サイトカインcc−1 |
US10/760,557 US20050106678A1 (en) | 1993-12-24 | 2004-01-21 | Human circulating cytokine CC-1 |
US11/601,848 US20080234187A1 (en) | 1993-12-24 | 2006-11-20 | Human circulating cytokine CC-1 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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Country Status (1)
Country | Link |
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DE (1) | DE4427395A1 (de) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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US6495129B1 (en) | 1994-03-08 | 2002-12-17 | Human Genome Sciences, Inc. | Methods of inhibiting hematopoietic stem cells using human myeloid progenitor inhibitory factor-1 (MPIF-1) (Ckbeta-8/MIP-3) |
US6811773B1 (en) | 1993-12-22 | 2004-11-02 | Human Genome Sciences, Inc. | Human monocyte colony inhibitory factor (M-CIF) polypeptides |
-
1994
- 1994-08-03 DE DE19944427395 patent/DE4427395A1/de not_active Withdrawn
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---|---|---|---|---|
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