DE4420572A1

DE4420572A1 - Verfahren und Anordnung zur Messung von fluoreszierenden Stoffen

Info

Publication number: DE4420572A1
Application number: DE19944420572
Authority: DE
Inventors: Hartmut Dr Rer Nat Lucht; Franz Dipl Ing Koenig
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-06-03
Filing date: 1994-06-03
Publication date: 1995-12-07
Anticipated expiration: 2014-06-04
Also published as: DE4420572C2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Anordnung zur Messung von fluoreszierenden Stoffen, insbesondere von fluoreszierenden Stoffen in Lösung oder in festen bevorzugt körnigen Medien.

Impulslaseranordnungen mit Wellenlängen bis in den UV- Bereich finden zunehmend als Anregungslichtquelle für die Fluoreszenzspektroskopie Anwendung. In dem Buch "Topics in Fluorescence Spectroscopy" Volume 1, 1991, Plenum Press, New York von J. R. Lakowicz findet sich dazu eine zusammenfassende Darstellung.

Zur Bestimmung von fluoreszierenden Proben ergibt die Strukturierung der Fluoreszenzspektren keine ausreichende Selektivität. Das Abklingverhalten der Fluoreszenz impulsartig angeregter Proben zeigt für die unterschiedlichen Spezies deutliche Unterschiede. Die zeitaufgelöste Erfassung der Fluoreszenz kann folglich eine Verbesserung der Selektivität ergeben.

Bei der Messung von fluoreszierenden Proben wird die Nachweisempfindlichkeit wesentlich durch das Streulicht bestimmt, das sich der Fluoreszenz überlagert. Da das Streulicht synchron zum anregenden Lichtimpuls auftritt, wird durch Auswertung der Meßwerte zu verzögerten Zeitpunkten das Streulicht unterdrückt und das Signal/Rauschverhältnis erheblich verbessert.

Die zeitaufgelöste Messung der Fluoreszenz erfolgt durch ultraschnelle Impulsoszillographen, Samplingoszillographen oder Boxcarintegratoren.

Sollen Proben noch bei Konzentrationen unter einem ppb nachgewiesen werden, so muß die Empfindlichkeit der Photodetektoren bis zur Möglichkeit der Registrierung einzelner Photonen gesteigert werden. Zur zeitaufgelösten Registrierung der Fluoreszenz werden dann statistische Meßverfahren notwendig. Für Blitzlampen als Anregungslichtquellen wird seit Jahren die zeitlich korrelierte Photonenzähltechnik erfolgreich eingesetzt. Dabei wird synchron zum anregenden Lichtimpuls eine Spannungsrampe gestartet, die durch das erste gemessene Photon der Fluoreszenz gestoppt wird. Die erzielte Rampenamplitude wird digitalisiert und einem Speicherkanal bzw. Zeitbereich als "count" zugeordnet. Die nach vielen Lichtimpulsen erhaltene Häufigkeitsverteilung der "counts" in den Speicherkanälen ergibt ein Abbild des zeitlichen Abklingens der Fluoreszenz. Zur Vermeidung von Verfälschungen der Abklingkurven gilt die Voraussetzung, daß die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten eines gemessenen Photons pro Laserimpuls sehr viel kleiner als eins ist. Für vertretbare Meßzeiten ergibt sich die Forderung nach einer hohen Repetitionsrate der Lichtimpulse.

Im Vergleich zu den Blitzlampen haben Laser bessere Strahlcharakteristik und um viele Größenordnungen höhere spektrale Energiedichte. Ihr Einsatz erschließt den Einsatz der Fibertechnik und ermöglicht eine erhebliche Steigerung der Nachweisempfindlichkeit.

Die Anregung der Proben zur Fluoreszenz erfolgt überwiegend im ultravioletten Spektralbereich. Als Laserlichtquellen werden N₂-Laser, Excimer-Laser oder 3. und 4. Harmonische der Nd:YAG-Laser eingesetzt, wobei die verwendeten Repetitionsraten unter 100 Hz liegen. Bei der Verwendung der zeitlich korrelierten Photonenzähltechnik entstehen folglich Meßzeiten von vielen Minuten, die unvertretbar sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde bei geringen Repetitionsraten der Lichtquellen, fluoreszierende Stoffe mit geringerer Meßzeit und höherer Nachweisempfindlichkeit zu messen, als es bisher möglich war, sowie über einen Konzentrationsbereich über viele Größenordnungen mit der kürzesten Meßzeit ein maximales Signal/Rauschverhältnis zu erzielen.

Erfindungsgemäß wird das durch die kennzeichnenden Merkmale der Ansprüche 1 bis 4 erreicht, deren Inhalt hierdurch ausdrücklich zum Bestandteil der vorliegenden Beschreibung wird, ohne an dieser Stelle den Wortlaut zu wiederholen.

Die Erfindung soll in einem Ausführungsbeispiel anhand von einer Zeichnung näher erläutert werden. Es zeigen.

Fig. 1 eine schematische Darstellung der Anordnung zur Messung von fluoreszierenden Stoffen.

Der N₂-Laser 1 richtet Laserimpulse über die Strahlteiler 2 und 3, den Umlenkspiegel 4 und die Linse 24 auf die Eintrittsöffnung des Lichtleitkabels 25. Der Laser hat eine Impulsleistung von 50 kW, eine Repetitionsrate von 20 Hz und eine Halbwertsbreite des Impulses von 0,5 ns.

Das Lichtleitkabel 25 endet an der Probe 5, in der die Moleküle zur Fluoreszenz angeregt werden.

Der Strahlteiler 2 lenkt einen kleinen Lichtanteil der Laserimpulse auf die PIN-Photodiode 6, die die Meßelektronik synchronisiert. Der Strahlteiler 3 spiegelt einen kleinen Lichtanteil auf den Meßkopf 13, der die Laserimpulsenergie für eine Kompensation der Energieschwankungen der Laserimpulse mißt.

Die Fluoreszenz von der Probe gelangt über das Lichtleitkabel 26 und einen Spekralfilter in einer Wechseleinrichtung 23 auf den Meßkopf mit Photomultiplier 9 mit dem nachgeschalteten HF-Verstärker 10. Der Multiplier hat eine hohe Verstärkung, so daß einzelne Photoelektronen an der Photokathode als Stromimpulse am HF-Verstärker registriert werden.

Das Fluoreszenzlicht am Photomultiplier hat aufgrund der Lichtlaufzeit in den Kabeln zum Licht an der PIN- Photodiode 6 eine erhebliche Verzögerung. Der an der Photodiode 6 erzeugte elektrische Impuls wird in der Delayelektronik 7 um die entsprechende Zeit verzögert und erzeugt in der Torschaltung 8 einen Torimpuls von 20 ns für den Integrator 11, der den Signalstrom vom HF-Verstärker 10 für den Zeitraum der Torung integriert. Durch Veränderung der Verzögerungszeit in der Delayelektronik 7 kann die Torung an einem geeigneten Zeitpunkt der Fluoreszenzabklingkurve erfolgen. Das Ausgangssignal N_S des Integrators 11 wird über einen im Mikrocontroller 16 befindlichen 8 Bit-Analog/Digitalwandler, kurz ADU ge schrieben, digitalisiert und als Datenwort über das serielle Interface 20 dem Personalcomputer 27 übermittelt. Zur gleichen Zeit wird über den Meßkopf 13 und einer Sample and Hold-Schaltung 14 in dem Controller 16 ein Referenzsignal N_A digitalisiert.

Die Steuerelektronik 12 erzeugt die notwendigen Impulse für den beschriebenen zeitlichen Meßablauf. Die Baugruppen Quarzgenerator 17, RESET-Generator 18, Referenzquelle 19, serielles Interface 20 und Speicherinterface 21 sind periphere Einheiten, die zum Betrieb des Controllers erforderlich sind.

Über die Ansteuerung 22 kann eine Umschaltung von Spektralfiltern in einer Wechseleinrichtung 23 erfolgen.

Ein Photoelektron an der Photokathode erzeugt am Eingang des ADU ein Signal

N_S=ΔU_ADU = e M R V t_INT/t_Ht_INT.

Dabei bedeuten e die Elementarladung, M die Verstärkung des Photomultipliers, t_H die Halbwertsbreite eines durch ein Photoelektron erzeugten Anodenimpulses, R den Lastwider stand am Photomultiplier, V die Signalverstärkung im HF- Verstärker, τ_INTIntegrationszeitkonstante im Integrator 11 und t_INT die Torbreite.

Bei der Messung von Proben im Spurenbereich, deren Fluoreszenz pro Laserimpuls wenige Photoelektronen oder nur hin und wieder ein Photoelektron erzeugen, wird die Spannung und folglich die Verstärkung des Photomultiplier solange erhöht bis ΔU_ADU im Mittel am ADU wenigstens ein Bit ergibt. Impulse, erzeugt durch thermisch emittierte Elektronen an den Photomultiplierdynoden, müssen noch deutlich unter der ADU-Schwelle liegen. Beim Auftreten von n Photoelektronen pro Laserschuß erhöht sich die Signalgröße am Eingang des ADU zu

N_S=n ΔU_ADU.

Die Bit-Zahl am Ausgang des ADU erhöht sich proportional zu n.

Um Energieschwankungen der Laserimpulse zu kompensieren, wird das Signal N_S mit N_R dividiert.

Die Messung der Probe erfolgt durch Akkumulation vieler Lichtimpulse, die mit dem Personalcomputer festgelegt werden können. Proben geringster Konzentrationen können selbst wenn sie nur bei jedem 10. Laserschuß ein Photoelektron erzeugen durch die Akkumulation von 1000 Lichtimpulsen sicher erkannt werden. Bei einer Repetitionsrate von 20 Hz entspricht das einer Meßzeit von 50 s.

Zur Bestimmung von Stoffen hoher Konzentration werden pro Laserschuß sehr viele Photoelektronen im Photomultiplier erzeugt. Die sich aus diesen Photoelektronen ableitende Signale N_S überschreiten den Dynamikbereich des ADU. Im Mikrocontroller 16 werden diese Überschreitungen registriert und über die Schnittstelle 28 den Photomultipliermeßkopf 9 ein Steuersignal übermittelt. Das Steuersignal bewirkt im Meßkopf 9 eine Reduzierung der Hochspannung an dem Photomultiplier. Die Verstärkung des Photomultipliers und folglich die Signale N_S werden verkleinert, bis der Dynamikbereich der Probensignale im ADU-Bereich liegt. Das Photonenrauschen der Meßergebnisse wird proportional zur sinkenden Verstärkung des Photomultipliers reduziert. Proben mit Konzentrationen über viele Größenordnungen lassen sich ohne optische Veränderungen mit kurzer Meßzeit bestimmen.

Bezugszeichenliste

1 N₂-Laser
2, 3 Auskoppelspiegel
4 Umlenkspiegel
5 Probe
6 Photodetektor
7 Verzögerungsschaltung
8 Torschaltung
9 Meßkopf mit Photomultiplier
10 HF-Verstärker
11 Integratorschaltung
12 Steuerelektronik für den Microcontroller
13 Meßkopf zur Messung der Laserimpulsenergie
14 Sample and Hold - Schaltung
15 Triggerschaltung
16 Microcontroller
17 Quarzgenerator
18 Reset-Schalter
19 Referenzquelle für den Microcontroller
20 serielles Interface
21 Speicherinterface
22 Ansteuerung für die Filterwechseleinrichtung
23 Filterwechseleinrichtung
24 Fokussierungsoptik
25, 26 Lichtleitkabel
27 Personalcomputer
28 Schnittstelle zum Meßkopf mit Photomultiplier.

Claims

1. Verfahren zur Messung von fluoreszierenden Stoffen, bei dem Lichtimpulse festgelegter Wellenlänge die Stoffe anregen und die erzeugte Fluoreszenzstrahlung zu längeren Wellenlängen verschoben gemessen werden und bei dem die Anregungsimpulse geringe bis mittlere Repetitionsraten haben, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenzlichtimpulse von den Stoffen zeitlich verzögert zum anregenden Lichtimpuls in festgelegten Zeitabschnitten gemessen werden, daß aus einzelnen Photonen der Fluoreszenz mittels Photomultiplier elektrische Signale abgeleitet werden, die über dem elektrischen Rauschen der Meßelektronik liegen, daß diese Signale in einem nachfolgenden Analog/Digitalwandler wenigstens ein Bit ergeben, daß bei Auftreten von vielen Photonen in den Zeitabschnitten in den nachfolgenden Analog/Digital wandler eine proportional zu der Anzahl der Photonen höhere Bit-Zahl erzielt wird und daß Signale, die von dem elektronischen Rauschen der Meßelektronik abgeleitet werden, bei der Digitalisierung mit hoher statistischer Wahrscheinlichkeit kein Bit ergeben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß beim Auftreten von sehr vielen Photonen in den Zeitbereichen und bei Überschreitung des Digitalisierungsbereiches der Analog/Digitalwandler in der nachfolgenden Auswerteelektronik ein Steuersignal abgeleitet wird, das die Hochspannung für den Photomultiplier und folglich die Verstärkung soweit reduziert, bis die aus den Photonen abgeleiteten Signale den Digitalisierungsbereich der Analog/Digital wandler nicht überschreiten.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß viele Photomultiplier zu einem Vielkanalplattenphotomultiplier zusammengefaßt sind.

4. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß einem Impulslasers (1) Auskoppel spiegel (2), (3), eine Fokussierungs-Optik (24), ein Lichtleitkabel (25) und die Probe (5) nachgeordnet sind, daß zum Nachweis der durch den Laser ausgelösten Fluoreszenz der Probe (5) ein weiteres Licht leitkabel (26), der Meßkopf mit den Photomulti plier (9), der HF-Verstarker (10) und Analog/Digital wandler (16) sowie eine Auswerteelektronik (16) nach geordnet sind, daß die Auswerteelektronik eine Schnittstelle (28) enthält, die bei Überschreitung des Digitalisierungbereiches des Analog/Digitalwandlers ein Signal zur Reduzierung der Hochspannung der Photomultiplier an den Meßkopf (23) übergibt, und daß dem Auskoppelelement (2) ein Photodetektor (6), eine Verzögerungsschaltung (7) und eine Torschaltung (8) folgen, die zu zeitlich definierten Bereichen die von der Fluoreszenz abgeleiteten elektrischen Signale mißt.