DE9421717U1 - Vorrichtung zur zeit- und ortsaufgelösten Fluoreszenz- bzw. Streulicht-Spektroskopie - Google Patents
Vorrichtung zur zeit- und ortsaufgelösten Fluoreszenz- bzw. Streulicht-SpektroskopieInfo
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Description
EUROPHOTON GmbH
Gesellschaft für Optische Sensorik
Mozartstraße 27
12247 Berlin
KEMl02
Vorrichtung zur zeit- und ortsaufgelösten Fluoreszenz- bzw. Streulicht-Spektroskopie
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur zeit- und ortsaufgelösten Fluoreszenz- und Streulicht-Spektroskopie
gemäß dem Oberbegriff desr Anspruchs 1.
Fluoreszenz- und Streulichtmessungen haben heute ein breites Anwendungsgebiet, wie z.B. die Bestimmung der Eigenschaften
von Polymeren, die Erforschung der Photosynthese und viele Anwendungen in der medizinischen und biologischen
Forschung und Entwicklung, wie DNA-Sequenzierung (Fluoreszenzlicht) oder optische Tomographie (Streulicht). Auf dem
Gebiet der Fluoreszenz- und Streulichtmessung ist die zeit- und ortsauflösende Einzelphotonen-Zählung (TSCSPC) Spektroskopie
eine der neusten Entwicklungen. Hiermit ist es möglich, Zeit- und Ortsinformationen von schwach emittierenden
Quellen simultan zu erfassen.
Aus der US-PS 5,148,031 ist eine Vorrichtung für die Erzielung räumlich und zeitlich aufgelöster Meßwerte einer
schwachen optischen Strahlung bekannt. Diese Vorrichtung weist eine gepulste Strahlungsquelle auf, der ein halbdurchlässiger
Spiegel nachgeordnet ist. Die durch den Spiegel hindurchtretende Strahlung gelangt auf die zu untersuchende
Probe. Die von der Probe hervorgerufenen Fluoreszenzen werden einem Polychromator zugeführt, dem ein photoelektronischer
Multiplier mit Delay-Line-Anode (Verzögerungsleitungs-Anode) nachgeordnet ist. Dieser weist zwei Ausgänge
auf, von denen je einer an einem Zeit-Amplituden-Wandler anliegt.
Die am halbdurchlässigen Spiegel reflektierte Strahlung wird auf eine Photodiode als Synchronisiereinheit gelenkt,
deren Ausgang mit den zweiten Eingängen des Zeit-Amplituden-Wandlers verbunden ist. Die Ausgänge des Zeit-Amplituden-Wandlers
sind wechselseitig mit einem Addierer bzw. Subtrahierer verbunden, deren Ausgänge an einer Datenspeicher-
und Prozeßeinheit liegen.
Diese Vorrichtung weist den Nachteil auf, daß Fehler, wie z.B. Langzeitdriften, Verschiebungen der Intensität, Wellenlänge
und des Zeitverhaltens der Strahlungsquelle und/oder der Elektronik, sowie Färb- und Intensitätsfehler des
Elektronenvervielfachers nicht korrigiert werden können.
Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß die Ortsauflösung
nur entlang einer Ortskoordinate erhalten werden kann.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, die zeit- und raumaufgelöste spektroskopische Meßmethode dahingehend
zu verbessern, daß alle intrinsischen Fehler des Meßsystems korrigiert werden und daß zusätzlich wahlweise eine echte
zweidimensionale Ortsauflösung erreicht wird.
Eine Vorrichtung zur zeit- und ortsaufgelösten Fluoreszenzbzw. Streulicht-Spektroskopie mit einer gepulsten Strahlungsquelle,
einem Strahlungsteiler, einer Einheit zur Ortsauflösung, die mindestens einen Polychromator oder eine
andere Einrichtung zur Ortsauflösung, z. B. ein Faserbündel aufweist, mit einem photoelektronischen Multiplier mit der
Fähigkeit zur Ortsauflösung, z. B. einer Delay-Line-Anode
bzw. eine MuItianoden-Vorrichtung sowie mit einer Einheit
zur zeitlichen Auflösung, die Zeit-Amplituden-Wandler, Addierer und Subtrahierer sowie einen Daten-Speicher und
Prozeßeinheit aufweist und der eine Synchronisiereinheit zugeordnet ist, ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet,
daß der Strahlungsquelle ein zu untersuchendes Objekt und ein Referenz-Objekt zugeordnet sind und daß mindestens eine
den Polychromator bzw. eine andere Einrichtung zur Ortsauflösung wahlweise mit der Probe bzw. der Referenz optisch
verbindende Einrichtung vorgesehen ist.
Insbesondere wird der zeitliche und räumliche spektrale Fluoreszenz- bzw. Streulichtverlauf abwechselnd für die
Probe und für eine Referenz im Sekunden- oder Subsekundentakt ermittelt und diese Signale werden anschließend am
Ende der Messung zur Korrektur von Systemfehlern miteinander verkoppelt.
Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann eine "Globalanalyse"
durchgeführt werden, d. h. eine simultane Analyse von mehreren Fluoreszenz- bzw. Streulichtabklingkurven unter
Kopplung eines Parameters oder mehrerer Parameter. Weiterhin erfolgt eine automatische Zuordnung der wellenlängen-
bzw. ortsabhängigen Fluoreszenz- bzw. Streulichtverfallskurve mit den zugehörigen Streulicht- bzw. Pseudostreulicht-Referenzkurven,
die beide paarweise in einer "Konvolution" in der Analyse verwendet werden.
Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung können mehrere Proben
und Referenzen durch den Lichtstrahl nacheinander abgetastet werden, indem entweder die Proben bzw. Referenzen
nacheinander in den Lichtstrahl geschoben·werden oder der
Lichtstrahl über die Proben und Referenzen gescannt wird.
Für die Aufnahme des zu untersuchenden und des Referenz-Objektes
kann eine Probenzelle und eine Referenzzelle vorgesehen sein, die flüssige Proben und Referenzmaterialien
enthalten.
Die Vorrichtung kann aber auch für die Untersuchung lichtdurchlässiger
oder -undurchlässiger Proben ohne Probenbzw. Referenzzelle verwendet werden, indem die optisch
verbindende Einrichtung in direktem Kontakt auf der Vorderbzw. Rückseite mit der Probe und der Referenz steht.
Die optisch verbindende Einrichtung kann in unterschiedlicher Form ausgeführt sein. So ist es möglich, daß zwischen
der Meßzelle und der Referenzzelle einerseits und dem Polychromator andererseits als optisch verbindende Einrichtung
ein Lichtleiter vorgesehen ist, dessen eines Ende mit dem Polychromator fest verbunden ist und dessen anderes
Ende sowohl der Referenzzelle als auch der Meßzelle zuordenbar ist. Bei dieser Vorrichtung wird also das eine Ende des
Lichtleiters zwischen der Referenzzelle und der Meßzelle
hin- und hergeschwenkt.
Eine andere Möglichkeit besteht darin, daß im Strahlengang vor dem Polychromator als optisch verbindende Einrichtung
ein wahlweise in den Strahlengang zwischen Polychromator und Meßzelle bzw. Polychromator und Referenzzelle
einschwenkbarer Spiegel vorgesehen ist.
In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß als
optisch verbindende Einrichtung je ein der Probe bzw. der Referenz fest zugeordnetes Lichtleitfaserbündel vorgesehen
ist, die abwechselnd in den Strahlengang des Polychromators bzw. einer anderen Einheit zur Ortsauflösung einschwenkbar
sind.
Die Einrichtung zur wahlweisen optischen Verbindung des Polychromators mit der Meß- bzw. der Referenzzelle ist mit
einer Steuereinheit verbunden, die eine Verschiebeeinrichtung und einen Timer aufweisen sollte. Die Verschiebeeinrichtung
ist zweckmäßig über eine mechanische Verbindung mit dem in seiner Lage zu verändernden Bauteil wie dem
Lichtleiter bzw. Spiegel verbunden.
Eine weitere zweckmäßige Ausführungsform sieht vor, daß die
Einheit zur räumlichen Auflösung eine Vorrichtung zur Strahlaufweitung aufweist, der im Strahlengang eine lichtdurchlässige
Probenplatte zugeordnet ist und daß der Probenplatte ein Lichtleiterbündel nachgeordnet ist, das mit
einem Zeit-Raumdetektor optisch verbunden ist. Mit dieser Vorrichtung ist es möglich, eine Vielzahl von Proben gleichzeitig
zu untersuchen. Die Probenplatte enthält dazu eine Vielzahl von Probenzellen, die in m Spalten und &eegr; Zeilen
geordnet sind, wobei in einer Zeile die Probenzellen als Referenzzellen
dienen und in n-1 Zeilen die Probenzellen als Meßzellen dienen. Die Vorrichtung zur Strahlenaufweitung
besteht aus &eegr; Lichtleitfasern und der das Licht sammelnde Lichtleiter weist ebenfalls &eegr;-Lichtleitfasern auf. Auch in
diesem Fall ist eine Steuereinheit vorgesehen, die eine Verschiebevorrichtung mit Schrittschaltcharakter für die
Probenplatte sowie einen Timer aufweist. Bei dieser Vorrichtung wird also die erste Zeile der &eegr; Zeilen der Probenplatte
für die Referenzmessung genutzt, während die übrigen
Zeilen Proben enthalten, die simultan in einer Zeile und
Zeile für Zeile durch Verschiebung der Probenplatte analysiert werden.
An Stelle der Verschiebung der Probenplatte ist es möglich, die Probenplatte rasterartig abzutasten und für
die notwendige Ablenkung des Laserstrahls einen computergesteuerten beweglichen Spiegel vorzusehen.
Eine weitere Möglichkeit der Abtastung der Proben besteht in der Anwendung der konfokalen Laser-Scanning-Lichtmikroskopie.
Um zu gewährleisten, daß bei sehr großem Datendurchsatz eine Einzelphotonenzählung durchgeführt wird, daß also
nicht bei Auftreffen eines Photons auf die Katode das durch das vorhergehende Photon ausgelöste Meßverfahren noch nicht
abgeschlossen ist, ist vorgesehen, daß die Ausgänge der Zeit-Amplituden-Wandler mit Eingängen einer Koinzidenzeinheit
verbunden sind, deren Ausgang mit der Datenspeicher- und Prozeßeinheit verbunden ist.
Es ist vorteilhaft, als Referenz, ein Pseudo-Streuelement, vorzusehen, z.B. die zu untersuchende flüssige Probe mit
einem Elektronen-Akzeptor oder -Donator zu versetzen. Diese Referenz weist ein identisches Spektrum bei stark reduzierter
Fluoreszenzlebensdauer auf.
Zur Erweiterung Ortserfassung um eine weitere Dimension ist es möglich, den an sich bekannten DL-MCP-PMT (microchannel
plate photomultiplier tube mit Delay Line Anode) mit Hilfselektroden zu versehen, der auch in Einstrahlkonfiguration
ohne Referenzprobe einsetzbar ist.
Durch Anwendung der vorgenannten Maßnahmen wird ein Zweistrahl-Spektrometer für die TSCSPC-Spektroskopie möglich,
das die bekannten Fehler der Einstrahl-Methode beseitigt. Insbesondere werden die Langzeit-Drift der Strahlungsquelle,
z.B. einer Laserstrahlungsquelle, sowie Farbfehler und Intensitätsfehler des Photoelektronenvervielfachers
beseitigt. Weiterhin wird die Ortserfassung um eine zusätzliche Dimension verbessert.
Die Erfindung soll in Ausführungsbeispielen anhand von Zeichnungen erläutert werden. Es zeigen:
Fig. 1 - ein vereinfachtes Blockschaltbild des erfindungsgemäßen Systems;
Fig. 2 - ein Blockschaltbild, bei dem die Raumkoordinate
durch die Wellenlänge der beobachteten Fluoreszenz dargestellt wird, und bei dem ein beweglicher
Lichtleiter zwischen Polychromator und Probe bzw. Referenz vorgesehen ist;
Fig. 3 - ein Blockschaltbild, bei dem die Raumkoordinate durch eine Vielproben-Platte erzielt wird;
Fig. 4 - ein Blockschaltbild mit einem Spiegel zwischen der Probenzelle und einer Referenzzelle;
Fig. 5 - eine Anordnung mit zwei hin- und herschwingenden Lichtleiterbündeln.
Fig. 6 - eine Delay-line-Anode mit Zusatzanoden zur zweidimensionalen
Ortsauflösung.
Das System der Fig. 1 weist eine gepulste Lichtquelle 1 auf, z.B. einen Laser oder eine Blitzlicht-Lampe, einen
halbdurchlässigen Spiegel 2, der den Lichtstrahl aufspaltet, eine Einheit 3 zur räumlichen Auflösung, z.B. einen
Polychromator oder ein Faserbündel, sowie einen Zeit-Raum-Detektor 4 auf. Dieser Detektor 4 kann z.B. eine
MCP-PMT mit Delay Line Anode (DL-MCP-PMT), ein Multianoden- -Photomultiplier oder eine Variante des DL-MCP-PMT mit
zusätzlichen Hilfsanoden, z.B. mit keilförmigen Elektroden
(WE-DL-MCP-PMT) zur Aufnahme der zweiten Ortskoordinate, eine CCD-Zeile oder -Matrix oder ein anderer zeit- und
raumauflösender Detektor sowie zusätzliche weitere Komponenten aufweisen. Die Signalausgänge des Zeit-Raum-Detektors 4
sind mit den Eingängen einer Einheit 5 zur zeitlichen Auflösung verbunden, die z.B. ein elektronischer Komplex mit
Start-Stoppeingängen sein kann und z. B. einen Multiparameter-MCA (MCA = multi-channel analyser) enthalten kann.
Dieser elektronische Komplex liegt in Reihe zu einer Synchronisiereinheit 6, z.B. einer PIN-Photodiode, die Referenzlichtimpulse
vom halbdurchlässigen Spiegel 2 erhält. Eine Steuereinheit 7 ist sowohl mit der Einheit 3 zur räumlichen
Auflösung als auch mit der Einheit 5 zur zeitlichen Auflösung verbunden.
Die Figur 2 stellt ein detailliertes Blockschaltbild des Systems mit der Zweistrahl-Proben-Referenz-Konfiguration
dar. Das System dient der Messung der wellenlängenabhängigen Lebensdauer der fluoreszierenden oder streuenden Probe
und weist die folgenden Komponenten auf:
eine gepulste Lichtquelle 1, z.B. ein Laser, einen halbdurchlässigen
Spiegel 2, eine Einheit 3 zur räumlichen Auflösung mit einer Referenzzelle 8, die z.B. aus einem
Streuelement oder Pseudostreuelement besteht. Weiterhin sind eine Probenzelle 9, Filter 10 - 13, ein Lichtleiter
14, z.B. ein optisches Quarz-Faser-Bündel oder eine Einzelfaser, vorgesehen, der an einer mechanischen Verbindung 15
befestigt ist, die ihrerseits mit einer Steuereinheit 7 verbunden ist. Der Ausgang des Lichtleiters 14 ist an einen
Polychromator 16 gekoppelt. Der Ausgang des Polychromators 16, der identisch ist mit dem Ausgang der Einheit 3 zur
räumlichen Auflösung, ist mit der Vorderseite des Zeit-Raum-Detektors 4 (MCP-PMT) verbunden. Dieses PMT enthält
eine Photokatode 17, zwei Vielkanalplatten 18 und eine Delay-Line-Anode 19 mit zwei Anschlüssen 20 und 21, deren
Ausgangssignale nach Verstärkung (nicht dargestellt) an die "Constant-Fraction-Discrminators (CFD) 22 und 23 gelangen.
Die Ausgangssignale der CFD sind die Stopp-Eingangssignale für zwei Zeit-Amplituden-Wandler (TAC) 24, 25. Die Start-Eingangssignale
für die TAC werden aus der Synchronisiereinheit 6, z.B. einer schnellen Photodiode, hergeleitet, deren
Ausgang wie im Fall der beiden Stop-Eingänge diskriminiert wird (nicht dargestellt). Start- und Stop-Signale können
auch vertauscht werden (invertierte Konfiguration), wodurch
ein erhöhter Datendurchsatz erzielt wird.
Die Ausgänge beider TAC sind mit einem schnellen Analogoder Digital-Addierer 2 6 bzw. einem Subtrahierer 27 verbunden.
Subtrahierer und Addierer sind mit einer schnellen Datenspeicher- und Prozeß-Einheit 28 verbunden, z.B. mit
einem zweidimensionalen Vielkanalanalysator auf Transputerbasis bzw. einem Signalprozessor. Eine elektromechanische
Verschiebevorrichtung 29, die durch die Steuereinheit 7 gesteuert wird, ist mit dem Lichtleiter 14 durch die mechanische
Verbindung 15 verbunden und wird durch einen Timer 30 gesteuert, der in Reihe zur Datenspeicher- und Prozeß-Einheit
28 liegt.
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Das neue dieses Ausführungsbeispiels besteht also in dem schwenkbaren Lichtleiter 14 mit der mechanischen Verbindung
15 zu einer Steuereinrichtung 7, einer Referenzzelle 8 und die Verbindung der Steuereinheit 7 mit der Datenspeicher-
und Prozeß-Einheit 28.
Die Fig. 3 stellt ein detailliertes Blockschaltbild des TSCSPC-Systems mit einer Vielprobenplatte dar, das für die
simultane Bestimmung der Fluoreszenzänderungen von N flüssigen oder festen Proben geeignet ist. Das System in Fig. 3
weist wiederum eine gepulste Lichtquelle 1, z.B. einen Laser, einen halbdurchlässigen Spiegel 2 sowie eine Einheit
3 zur räumlichen Auflösung auf. Die Besonderheit bei diesem Ausführungsbeispiel besteht darin, daß die Einheit 3 eine
Vorrichtung zur optischen Strahlaufweitung des anregenden Laserstrahls, z.B. ein "zylindrisches" optisches System
oder ein optisches Faserbündel aufweist. Weiterhin ist ein kohärenter Lichtleiter 32, der aus &eegr; Einzelfasern für die
Sammlung des fluoreszierenden oder gestreuten Lichts besteht, vorgesehen, der von N Proben einer Reihe der zweidimensionalen
Probenplatte 3 3 ausgestrahlt wird. Die Vorrichtung zur optischen StrahlaufWeitung 31, die Licht emittiert,
und der Lichtleiter 3 2 als Lichtsammler bestehen aus Quarzglas, um für UV-Licht durchlässig zu sein. Die Probenplatte
33 trägt N Proben, die in n-Reihen 35 angeordnet sind, von denen jede m Proben 34 aufweist, so daß
N = &eegr; &khgr; m
darstellt.
darstellt.
Die erste Reihe 3 6 der &eegr; Reihen 35 enthält keine Probe und dient so als Referenzreihe zur Bestimmung der
Hintergrund-Fluoreszenz und Streuung. Die Probenplatte 3 3 ist über einen Steg 38 an eine Verschiebevorrichtung 37
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gekoppelt und wird durch die Steuereinheit 40 gesteuert. Die Verschiebevorrichtung wird durch einen Timer 30 gesteuert,
der seinerseits mit der Datenspeicher- und Prozeß-Einheit 28 der Einheit 5 zur zeitlichen Auflösung verbunden
ist. Alternativ kann der Laserstrahl über eine fixierte Probenplatte gescannt werden, indem er über computergesteuerte
bewegliche Spiegel eingekoppelt wird..
Ausgänge der Zeit-Amplituden-Wandler 24 und 25 sind mit einer Koinzidenzeinheit 3 9 verbunden, deren Ausgang mit der
Datenspeicher- und Prozeß-Einheit 28 verbunden ist. Die Koinzidenzeinheit ist nur bei hohem Datendurchsatz
erforderlich. Das schmale Ende des kohärenten Lichtleiters 32 ist gegenüber der Photokatode 17 des Zeit-Raum-Detektors
4 mit der Verzögerungsleitungsanode 19 positioniert, deren Anschlüsse 20, 21 mit der Einheit 5 zur zeitlichen Auflösung
analog der Figur 2 verbunden sind. Das Fenster des MCP-PMT kann zur besseren Ortsauflösung des Systems aus
einem "Faseroptikfenster" bestehen.
In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel mit einer Vielzahl von Proben ist die Koinzidenzeinheit 3 9 mit den TAC-Ausgängen
24 und 25 verbunden und ebenso die Datenspeicher- und Prozeß-Einheit 28. Die Synchronisiereinheit 6 und deren
Verbindung entsprechen der Fig. 2.
Das TSCSPC-System mit einer Probe und Referenz (Fig. 2) arbeitet wie folgt:
Es sei angenommen, daß die Energieversorgung eingeschaltet ist, eine Probe in die Probenzelle 9 sowie eine Referenzprobe
in die Referenzzelle 8 eingesetzt ist und ein Laser kurze, z.B. Pikosekunden, Lichtimpulse hoher Frequenz
aussendet. Der Laserstrahl wird durch den halbdurchlässigen Spiegel 2 in zwei Teilstrahlen aufgespalten. Der durch den
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Spiegel durchtretende Teil des Strahles (ca. 90 %) gelangt durch die Referenzzelle 8 in die Probenzelle 9, in der sich
die Probe befindet. Der reflektierte Teil des Strahles (ca. 10 %) gelangt an die zeitliche Synchronisiereinheit 6, z.B.
eine PIN-diode, deren Ausgang an den Starteingängen der TAC
24 und 25 liegt. Das elektrische Ausgangssignal der PIN-Photodiode
triggert die TAC 24, 25.
Der durch den halbdurchlässigen Spiegel 2 hindurchgetretene Teil des Laserstrahls erzeugt in der Probe der Probenzelle
9 Fluoreszenz und erzeugt in der Referenzzelle 8 Streulicht oder einen ultraschnellen Fluoreszenzzabfall (Pseudostreulicht).
Zur Steuerung der Fluoreszenzintensität sind die kontinuierlich verstellbaren Abschwäche-Filter 10, 11 mit
neutraler Dichte vorgesehen. Ein Filter 13 ist ein "Longpas-Kanten-Filter11,
um das gesamte Erregerlicht des Lasers zu entfernen. Als weiteres Filter kann ein Polarisationsfilter
vorgesehen sein. Das keilförmige Filter 12 ist für die Kompensation kleiner Differenzen der optischen Weglänge beider
Zweige vorgesehen. Das von der Probe und der Referenz emittierte Licht gelangt abwechselnd auf den Lichtleiter 14,
der unmittelbar hinter den Filtern vorgesehen ist und der auf einer mechanischen Verschiebevorrichtung 29 angeordnet
ist, die ihrerseits durch eine Steuereinheit 7 gesteuert wird. Über die mechanische Verbindung 15 kann der Lichtleiter
14 entweder dem Filter 12 oder dem Filter 13 zugeordnet werden. In der erstgenannten Position tritt das emittierte
Licht der Referenzzelle 8 in den Lichtleiter 14 ein, während in der zweiten Position die Fluoreszenz der Probenzelle
9 in den Lichtleiter 14 eintritt. Der Ausgang des Lichtleiters 14 ist an einen Polychromator gekoppelt, in dem das
Licht abgelenkt und entsprechend der Wellenlänge räumlich aufgelöst wird. Das räumlich aufgelöste Licht, das den
Polychromator verläßt, trifft auf die Photokatode 17 des Zeit-Raum-Detektors 4 (innerhalb des gestrichelten Berei-
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ches). Jedes Photon, das auf die Photokatode 17 auftrifft,
verursacht das Emittieren eines Elektrons, das beim Durchgang durch die Vielkanalplatten verstärkt wird. Am Ausgang
der zweiten Vielkanalplatte entsteht ein Kegel aus einer Vielzahl Elektronen, die einen Impuls einer elektrischen
Ladung darstellen. Dieser elektrische Impuls trifft auf einen bestimmten Punkt der Verzögerungsleitungsanode 19,
der dem entsprechenden Punkt auf der Photokatode 17 entspricht, auf der das Photon ursprünglich auftraf. Daraus
ergibt sich, daß dieser Punkt einer bestimmten Wellenlänge entspricht, die durch den Polychromator 16 erzeugt wird.
Der elektrische Impuls in der Verzögerungsleitungsanode 19 wird in zwei Teile aufgespalten, die über Anschlüsse 20, 21
weitergeleitet werden und durch die CFD 22, 23 diskriminiert werden. Sie werden dann als Stopp-Eingangssignale der
Zeit-Amplituden-Wandler 24, 25 verwendet. Diese Signale stoppen die Zeit-Amplituden-Wandler, die vorher durch ein
Signal der Synchronisiereinheit 6 gestartet wurden. Ein Zeit-Amplituden-Wandler ist eine Einrichtung, deren Ausgangsspannung
proportional dem Zeitintervall zwischen den Signalen ist, die an den Start-Stopp-Eingängen ankommen.
Die CFD 22, 23 eliminieren Jitter in den Start-Stopp-Signalen, die durch Variationen der Signal-Intensität hervorgerufen
werden. Die Filter 10, 11 begrenzen die Lichtintensität in dem Umfang, wie es für die Einzelphotonenzählung erforderlich
ist. Das Filter 12 entfernt Erregerlicht des Lasers, das die Fluoreszenz beeinflußt, und das keilförmige
Filter 12, das aus transparentem Glas hergestellt ist, korrigiert Differenzen in der optischen Weglänge beider
Zweige. Das Polarisationsfilter korrigiert Einflüsse, die durch Rotation von Molekülen in flüssigen Proben hervorgerufen
werden.
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Die Ausgangsspannung Ul des Zeit-Amplituden-Wandlers 24 ist
proportional dem Zeitintervall t + x/v, während die Ausgangsspannung
U2 des Zeit-Amplituden-Wandlers 25 proportional dem Zeitintervall t + (1 -x)/v ist, worin t die Zeitdifferenz
zwischen den Photonen ist, die die Synchronisiereinheit 6 und die Photokatode 17 erreichen. 1 ist die Länge
der Verzögerungsleitungsanode 19, &ngr; ist die Geschwindigkeit der Ladungsausbreitung und &khgr; die Koordinate, bei der der
Ladungspuls auf die Verzögerungsleitungsanode 19 trifft, was in diesem Fall dem Abstand zwischen diesem Punkt des
Auftreffens und dem Ende des Anschlusses 20 oder 21 entspricht.
Der Addierer 26 addiert die Spannungen Ul und U2, voraus
sich eine Ausgangsspannung ergibt, die proportional zu 2t + l/v ist, d.h. sie trägt die Information der Zeit. Die
Ausgangsspannung des Subtrahierers 27 ist gleich der Differenz Ul -U2 und proportional zu 2x - l/v, d.h. sie trägt
die Information der Raumkoordinate x, die der Wellenlänge der Fluoreszenzquelle entspricht. Der Ausgang des Addierers
26 und des Subtrahierers 27 liegen an den Eingängen der Datenspeicher- und Prozeß-Einheit 28. Die Steuereinheit 7
der Verschiebevorrichtung 29 gibt Informationen über die Lage des Lichtleiters 14 (d.h. ob er sich gegenüber dem
keilförmigen Filter 12 oder dem Filter 13 befindet) zu einem der Eingänge der Daten-Speicher und Prozeßeinheit 28.
Im Fall der WE-DL-MCP-PMT oder ähnlicher Multianoden MCP-PMT's zur zweidimensionalen Ortserfassung (z.B. Spiral-Anoden)
werden die Ladungen Q^ und Q2, die auf den
beiden keilförmigen Elektroden 51, 52 (Fig. 6) deponiert wurden, durch zwei rauscharme Verstärker geführt und mit
- 15 -
zwei AD-Wandlern ausgelesen. Die Y-Koordinate berechnet
sich dann einfach aus
Ql
Y= &khgr; J
Qi + Q2
wobei J die Gesamtlänge der Anode in Y-Richtung ist.
wobei J die Gesamtlänge der Anode in Y-Richtung ist.
Bezugnehmend auf Fig. 3 soll der TSCSPC mit einer Vielprobenplatte
erläutert werden. Der Laser und der halbdurchlässige Spiegel als Strahlteiler sind die gleichen wie in vorhergehenden
Systemen (Fig. 2) . Der durch den halbdurchlässigen Spiegel durchtretende Teil des Laserstrahles tritt in
die Vorrichtung 31 zur optischen StrahlaufWeitung, z.B.
eine Zylinderlinse oder ein optisches Faserbündel und trifft auf die Probenplatte als schmale Linie. Diese schmale
Linie tritt durch die Probenplatte 33 und regt die Proben, die z.B. in einer Gelschicht in &eegr;-Reihen und m-Spalten
angeordnet sind, von hinten bzw. von vorn an. Eine Reihe kann Referenzproben enthalten, während die übrigen
Reihen (n -1) die zu untersuchenden Proben enthalten.
Der vom halbdurchlässigen Spiegel 2 reflektierte Teil des
Laserstrahls triggert die Synchronisiereinheit 6, z.B. eine PIN-Photodiode, deren Signale an die Starteingänge der
Zeit-Amplituden-Wandler 24, 25 gehen und diese auf diese Weise starten. Das laserinduzierte Fluoreszenz-Licht tritt
in den Lichtleiter 32 ein, in der die Fluoreszenz jeder individuellen Probe aufgefangen und durch eine individuelle
Faser auf eine bestimmte Stelle der Photokatode geleitet wird. Durch das auftreffende Photon wird ein Elektron in
der Photokatode emittiert, welches nach Verstärkung als elektrischer Impuls an einem bestimmten Ort auf die Verzögerungsleitungsanode
19 trifft, so daß jeder Punkt auf dieser Verzögerungsleitung einer individuellen Probe entspricht.
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Der elektrische Puls wird in der Verzögerungsleitung in zwei Teile gespalten, die durch die Anschlüsse 20, 21
weitergeleitet und in der vorher beschriebenen Art weiterverarbeitet werden.
Um einen sogenannten "Zwei-Photonen-Fall" auszuschließen, d.h. daß ein zweites Photon auf die Photokatode trifft,
während die Verarbeitung des ersten Photons noch abläuft, ist eine Koinzidenzeinheit 39 vorgesehen, die solche unerwünschten
Vorgänge dadurch ausschließt, daß geprüft wird, ob 1 = x/v + (1 -x)/v erfüllt ist, da das die Bedingung für
die Gültigkeit des "Ein-Photonen-Falles" ist, wobei 1 die Gesamtlänge der Delay-Line-Anode darstellt. Fälle, die
diese Bedingung nicht erfüllen, werden ausgeschlossen. Das erfaßte Fluoreszenz- und Streulicht der ersten Referenzreihe
(die keine Probe enthält), d.h. die Hintergrund-Emission der Glasplatte und der Gelschicht kann für die Korrektur
der erfaßten Probenfluoreszenz der übrigen (n -1)-Reihen
genutzt werden.
Bei dem Ausführungsbeispiel der Fig. 4 sind prinzipiell die gleichen Baugruppen wie beim Ausführungsbeispiel der Fig. 2
vorgesehen. Der Unterschied besteht darin, daß anstelle eines Lichtleiters 14 mit einem gegenüber der Referenz und
der Probe beweglichen Ende ein schwingender Spiegel 41 zwischen der Referenzzelle 8 und der Probenzelle 9 vorgesehen
ist.
Beim Ausführungsbeispiel der Fig. 5 sind zwei hin- und herschwingende Lichtleitfaserbündel 42 und 43 vorgesehen,
die zwischen Lichteintrittsleisten 44 bzw. 45 sowie Lichtaustrittsleisten 46 bzw. 47 gebündelt sind. Diese Anordnung
ist insbesondere für die optiche Tomographie einsetzbar. Bei der dargestellten Probe 48 und der Referenz 49 kann es
sich z. B. um menschliche Mamalia handeln, die auf das
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Vorhandensein eines Karzinoms (51) untersucht werden sollen. Dabei stellt die Probe 48 die Brust mit dem Karzinom
dar, während die Referenz 49 die karzinomfreie Brust darstellt. Für die Untersuchung werden abwechselnd die Lichtleitfaserbündel
42 und 43 vor den MCP-PMT 50 geschwenkt. Die Lichteintrittsleisten 44 bzw. 45 nehmen dabei dann die
Form von halbkugelförmigen, der Brust angepaßten, Büstenhaltern ähnlichen Gebilden an. Die Messung erfolgt in der
Weise, wie sie in den vorherigen Ausführungsbeispielen beschrieben wurde.
- 18 -
Claims (1)
- AnsprücheVorrichtung zur zeit- und ortsaufgelösten Fluoreszenz- bzw. Streulicht-Spektroskopie, mit einer gepulsten Strahlungsquelle, einem Strahlungsteiler, einer Einheit zur räumlichen Auflösung, die mindestens einen Polychromator oder eine andere Einrichtung zur Ortsauflösung aufweist, mit einem photoelektronischen Multiplier sowie mit einer Einheit zur zeitlichen Auflösung, die Zeit-Amplituden-Wandler, Addierer und Subtrahierer sowie eine Daten-Speicher- und Prozeß-Einheit aufweist und der eine Synchronisiereinheit zugeordnet ist,
dadurch gekennzeichnet,daß der Strahlungsquelle (1) ein zu untersuchendes Objekt und ein Referenz-Objekt zugeordnet sind und daß mindestens eine den Polychromator (16) bzw. eine andere Einrichtung zur Ortsauflösung wahlweise mit der Probe bzw. der Referenz optisch verbindende Einrichtung vorgesehen ist.2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für die Aufnahme des zu untersuchenden und des Referenz-Objektes eine Probenzelle (9) und eine Referenzzelle (8) vorgesehen sind.3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die optich verbindende Einrichtung in direktem Kontakt mit der Probe und der Referenz steht.- 19 -Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als optisch verbindende Einrichtung ein Lichtleiter (14) vorgesehen ist, dessen eines Ende mit dem Polychromator (16) fest verbunden ist und dessen anderes Ende sowohl der Referenz als auch der Probe zuordenbar ist.Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als optisch verbindende Einrichtung im Strahlengang vor dem Polychromator (16) ein wahlweise in den Strahlengang zwischen Polychromator (16) und der Probe bzw. zwischen Polychromator (16) und der Referenz einschwenkbarer Spiegel (41) vorgesehen ist.Vorrichtung nach mindestens einem · der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als optisch verbindende Einrichtung je ein der Probe bzw. der Referenz fest zugeordnetes Lichtleitfaserbündel (42, 43) vorgesehen ist, die abwechselnd in den Strahlengang des MCP-PMT (50) einschwenkbar sind.7. Vorrichtung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur wahlweisen optischen Verbindung des Polychromators (16) mit der Probe bzw. der Referenz mit einer Steuereinheit (7) verbunden ist.8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Steuereinheit (7) eine Verschiebevorrichtung (29) und einen Timer (30) aufweist.9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Verschiebevorrichtung (29) über eine mechanische Verbindung (15) mit dem Lichtleiter (14) verbunden ist.10. Vorrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Einheit (3) zur räumlichen Auflösung eine Vorrichtung (31) zur Strahlaufweitung aufweist, der im Strahlengang eine lichtdurchlässige Probenplatte (3 3) zugeordnet ist und daß der Probenplatte (33) ein Lichtleiter (32) nachgeordnet ist, der mit einem Zeit-Raum-Detektor (4) optisch verbunden ist.11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Probenplatte (33) Probenzellen (35) aufweist, die in m Spalten und &eegr; Zeilen geordnet sind, wobei in einer Zeile die Probenzellen (35) als Referenzzellen dienen und (n - 1)-Zeilen mit Probenzellen (35) als Meßzellen dienen, daß die Vorrichtung zur Strahlaufweitung (31) aus &eegr; Lichtleitfasern besteht und der Lichtleiter (32) ebenfalls &eegr; Lichtleitfasern aufweist.- 21 -12. Vorrichtung nach Anspruch 10 und 11, dadurch gekennzeichnet/ daß der Probenplatte (33) eine Steuereinheit (40) zugeordnet ist, die eine Verschiebevorrichtung (37) mit Schrittschaltcharakter sowie einen Timer (30) aufweist.13. Vorrichtung nach Anspruch 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ablenkung des Anregungslaserstrahls und rasterartigen Abtastung der Probenplatte (33) ein computergesteuerter beweglicher Spiegel vorgesehen ist.14. Vorrichtung nach Anspruch 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß die konfokale Scanning-Lichtmikroskopie angewendet wird.15. Vorrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausgänge der Zeit-Amplituden-Wandler (24, 25) mit Eingängen einer Koinzidenzeinheit (39) verbunden sind, deren Ausgang mit der Datenspeicher- und Prozeß-Einheit (28) verbunden ist.16. Vorrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Referenz eine Pseudo-Streu-Referenzprobe vorgesehen ist.- 22 -17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Pseudo-Streu-Referenzprobe aus der Probe und zugesetztem Elektronen- bzw. Energie-Akzeptor oder -Donator besteht.18. Vorrichtung nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet/ daß ein DL-MCP-PMT mit Hilfselektroden (51, 52) zur zweidimensionalen Ortserfassung versehen ist.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE9421717U DE9421717U1 (de) | 1994-08-12 | 1994-08-12 | Vorrichtung zur zeit- und ortsaufgelösten Fluoreszenz- bzw. Streulicht-Spektroskopie |
Applications Claiming Priority (2)
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---|---|---|---|
DE4429383A DE4429383A1 (de) | 1994-08-12 | 1994-08-12 | Verfahren und Vorrichtung zur zeit- und ortsaufgelösten Fluoreszenz- bzw. Streulicht-Spektroskopie |
DE9421717U DE9421717U1 (de) | 1994-08-12 | 1994-08-12 | Vorrichtung zur zeit- und ortsaufgelösten Fluoreszenz- bzw. Streulicht-Spektroskopie |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE9421717U1 true DE9421717U1 (de) | 1996-07-04 |
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ID=25939353
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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DE9421717U Expired - Lifetime DE9421717U1 (de) | 1994-08-12 | 1994-08-12 | Vorrichtung zur zeit- und ortsaufgelösten Fluoreszenz- bzw. Streulicht-Spektroskopie |
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- 1994-08-12 DE DE9421717U patent/DE9421717U1/de not_active Expired - Lifetime
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