DE4113393C2 - Test procedure for substances that promote wound healing and angiogenesis - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Testverfahren mit dessen Hilfe Substanzen, die die Wundheilung und Angiogenese fördern aus biologischen (physiologischen) Flüssig keiten isoliert werden können.The invention relates to a test method with the Help substances that promote wound healing and angiogenesis convey from biological (physiological) liquid can be isolated.
Es ist bekannt, daß ein auf bestimmte Art aufbereite ter Anteil von Blut, wie z. B. das Präparat ACTOVEGIN (eingetragenes Markenzeichen) (DE-A-10 76 888, Jaeger und Mittenzwei) die Wundheilung fördert. Die die Wundheilung fördernde Wirksubstanz selbst ist jedoch nicht bekannt. Aus dieser Situation ergibt sich die grundsätzliche Schwierigkeit, ein definiertes Präpa rat herzustellen.It is known that one prepares in a certain way ter portion of blood, such as. B. the preparation ACTOVEGIN (registered trademark) (DE-A-10 76 888, Jaeger and Mittenzwei) promotes wound healing. The the However, the active substance itself promotes wound healing not known. The situation arises from this situation basic difficulty, a defined prep advice.
Aufgabe der Erfindung ist daher die Entwicklung ei nes Testverfahrens mit dessen Hilfe eine oder mehrere wundheilungs- bzw. angiogenesefördernde Substanz/en aus biologischen Flüssigkeiten (z. B. Blut, Lymphe, Urin, Molke usw.) isoliert und deren Struktur dann aufgeklärt werden kann.The object of the invention is therefore the development egg nes test procedure with the help of one or more wound healing or angiogenic substance from biological fluids (e.g. blood, lymph, Urine, whey, etc.) and their structure can be clarified.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird durch die kenn zeichnenden Merkmale der Ansprüche 1 und 2 gelöst. The object of the invention is characterized by the Drawing features of claims 1 and 2 solved.
"Die Wundheilung ist ein sehr komplexer Prozeß, der
sich in drei Phasen unterteilen läßt
1. exsudative Phase
2. proliferative Phase
3. Narbenbildung."Wound healing is a very complex process that can be divided into three phases
1st exudative phase
2nd proliferative phase
3. Scarring.
Ein erster provisorischer Wundverschluß wird dadurch erreicht, daß das im Bereich der Wunde austretende Blut gerinnt. Danach dringen Granulozyten und Serum in das Wundgebiet ein (exsudative Phase). In der pro liferativen Phase sprossen Kapillaren und wandern Fibroblasten, Histiozyten und andere Zellen in das Gerinnsel ein (Bildung eines Granulationsgewebes). In der Phase der Narbenbildung schließlich bilden sich die Kapillaren zurück, und der Defekt wird mit faser reichem Bindegewebe ausgefüllt. Das letztlich vorhan dene Narbengewebe ist kapillar- und zellarm" (Thews, Mutschler, Vaupel: Anatomie, Physiologie, Pathophysiologie des Menschen; Wissenschaftliche Ver lagsgesellschaft mbH Stuttgart 1989, S. 38).This creates a first provisional wound closure achieves that the emerging in the area of the wound Blood coagulates. Then granulocytes and serum penetrate into the wound area (exudative phase). In the pro liferative phase, capillaries sprout and migrate Fibroblasts, histiocytes and other cells in it Clot on (formation of granulation tissue). In the phase of scar formation eventually form the capillaries back, and the defect becomes fibrous filled in connective tissue. Ultimately, that was there their scar tissue is poor in capillaries and cells "(Thews, Mutschler, Vaupel: anatomy, physiology, Human pathophysiology; Scientific Ver lagsgesellschaft mbH Stuttgart 1989, p. 38).
Diese Prozesse setzen eine sehr differenzierte zeit liche Regulation voraus, die zudem örtlich begrenzt und gerichtet ist. Bestimmte Zelltypen wandern in ei ner bestimmten Phase zu bestimmten Positionen in das Wundgebiet ein. Bestimmte Zelltypen vermehren sich in bestimmten Phasen in bestimmten Anordnungen. Zerstör tes Material im Wundbereich wird abgebaut. In einer bestimmten Phase wird eine neue extrazelluläre Matrix u. a. aus Kollagen aufgebaut.These processes set a very differentiated time regulation, which is also local and is directed. Certain cell types migrate into egg certain phase to certain positions in the Wound area. Certain cell types multiply in certain phases in certain arrangements. Destroy Material in the wound area is broken down. In a certain phase is a new extracellular matrix u. a. made up of collagen.
Die Regulation dieser Prozesse erfolgt zumindest zum Teil durch für die verschiedenen Zellen spezifische Wachstumsfaktoren. Die Strukturen vieler solcher Wachstumsfaktoren wurden bereits aufgeklärt. Die Kon zentration dieser Faktoren muß also sowohl lokal als auch zeitlich reguliert sein.These processes are regulated at least at Part by specific for the different cells Growth factors. The structures of many such Growth factors have already been elucidated. The con The concentration of these factors must be local as well also be timed.
Zur Förderung der Wundheilung sind solche Wachstums faktoren deshalb höchstens in Ausnahmefällen geeig net, da sie weder lokal noch zeitlich differenziert appliziert werden können.Such growths are to promote wound healing factors are therefore only suitable in exceptional cases net, since it does not differentiate locally or temporally can be applied.
Der naheliegende Ansatz wäre es, die Beeinflussung der Wundheilung an Versuchstieren zu untersuchen.The obvious approach would be to influence to investigate wound healing in laboratory animals.
Diese Untersuchungen sind jedoch sehr aufwendig und lassen zudem keine relevanten Ergebnisse erwarten, da bei Tieren im gesunden Zustand die Bedingungen für die Wundheilung ohnehin optimal sind. Die Beeinflus sung einer gestörten Wundheilung müßte an kranken oder anders geschädigten Tieren untersucht werden, was praktisch schwer durchführbar ist. However, these studies are very complex and don't expect any relevant results, either in healthy animals, the conditions for wound healing is optimal anyway. The influences Solution to an impaired wound healing should be on sick or other injured animals are examined, which is practically difficult to carry out.
Das gleiche gilt für die Angiogenese, die Teil der Wundheilung ist, aber auch als isoliertes Phänomen auftritt.The same applies to angiogenesis, which is part of the Is wound healing, but also as an isolated phenomenon occurs.
Auf Grund dieser Situation ergab sich die Schwierig keit einen theoretischen Ansatz für einen zur Erfas sung der Wundheilung relevanten Test zu finden.Because of this situation, the difficulty arose a theoretical approach for one to capture solution relevant to wound healing.
Es ist bekannt, daß mit Zellkulturen der wachstums fördernde Effekt von Substanzen demonstriert werden kann. Hier gibt es eine große Zahl von Zelltypen und Wachstumsbedingungen (verschiedene Medien, verschiedene Zusätze, Zeit, Haftfläche, Einsatzmenge von Zellen, pH-Wert, usw.). Beispiele hierfür sind in der Fachliteratur bekannt, z. B. aus J. A. Eliason, J. P. Elliott, Invest. Ophtalmol. Visual Sci. 28 (1987), 1963-1969; P. Reynolds et al., J. Reprod. Fertil. 81 (1987) 233-240 oder C. L'Heveder et al., Int. J. Cosmet. Sci. 8 (1986) 81-92.It is known that with cell cultures of growth promoting effects of substances are demonstrated can. There are a large number of cell types and Growth conditions (different media, different Additives, time, adhesive area, amount of cells used, pH value, etc.). Examples of this are in the Technical literature known, e.g. B. from J.A. Eliason, J.P. Elliott, Invest. Ophtalmol. Visual sci. 28 (1987), 1963-1969; P. Reynolds et al., J. Reprod. Fertile. 81 (1987) 233-240 or C. L'Heveder et al., Int. J. Cosmet. Sci. 8 (1986) 81-92.
Auch an der Wundheilung ist eine Vielzahl von Zellen beteiligt. Die Lösung der gestellten Aufgabe wird erst durch die Einführung ganz spezieller Zellkulturbedingungen ermöglicht. Es werden solche Zelltypen eingesetzt, die sich im Wundbereich vermeh ren, wie Endothelzellen, Fibroblasten, Epithelzellen.A large number of cells are also involved in wound healing involved. The solution to the task at hand only by introducing very special ones Allows cell culture conditions. There will be Cell types used that multiply in the wound area such as endothelial cells, fibroblasts, epithelial cells.
Durch Verwendung eines verarmten Mediums (hitzebehan delte Serumkomponente, suboptimale Konzentration an Wachstumsfaktoren, verringerte Mengen an Aminosäuren, Glucose usw., geringere Konzentration an Sauerstoff) wird eine pathologische Situation simuliert. Substan zen, die unter solchen Bedingungen die Zellvermehrung stimulieren, sind Kandidaten zur Entwicklung von wundheilungs- bzw. angiogenesefördernden Pharmaka.By using an impoverished medium (heat-treated delte serum component, suboptimal concentration Growth factors, reduced amounts of amino acids, Glucose etc., lower concentration of oxygen) a pathological situation is simulated. Substan zen, the cell proliferation under such conditions stimulate, are candidates to develop Pharmaceuticals that promote wound healing or angiogenesis.
Die Erfindung wird nun am Beispiel der Untersuchung des niedermolekularen Anteils von Blut ausführlich erläutert.The invention will now be based on the example of the investigation of the low molecular weight portion of blood in detail explained.
Endothelzellen werden im verarmten Medium in Kultur gehalten. Der Einfluß verschiedener Zusätze in stei gender Konzentration auf die Zellvermehrung ist in der Abb. 1 zusammengefaßt.Endothelial cells are kept in culture in the depleted medium. The influence of various additives in increasing concentration on cell proliferation is summarized in Fig. 1.
Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) zeigt dabei im an gewendeten Konzentrationsbereich keinen oder nur ei nen geringen wachstumsfördernden Effekt bei Endothelzellen. Der niedermolekulare Anteil von Blut allein zeigt bis zu sehr hohen Konzentrationen eben falls keine oder nur geringe Stimulation des Wachs tums. Wird der niedermolekulare Anteil von Blut je doch zusammen mit EGF eingesetzt, so zeigt sich eine ausgeprägte Stimulation des Wachstums. Dieser Effekt läßt sich mit EGF-Konzentrationen erzielen, die al lein keine oder höchstens geringe Stimulierung des Wachstums bewirken. Der niedermolekulare Anteil von Blut hat somit die bemerkenswerte und überraschende Eigenschaft, die Wirkung von EGF zu verstärken. Epidermal growth factor (EGF) shows in the concentration range applied no or only one low growth-promoting effect Endothelial cells. The low molecular weight part of blood alone shows up to very high concentrations if there is little or no stimulation of the wax tums. Will the low molecular weight fraction of blood ever but used together with EGF, one shows pronounced stimulation of growth. This effect can be achieved with EGF concentrations that al little or no stimulation of the Cause growth. The low molecular weight fraction of Blood therefore has the remarkable and surprising Property to increase the effect of EGF.
Im Hinblick auf die Anwendung zur Förderung der Wund heilung bzw. Angiogenese ist gerade diese Eigenschaft von außerordentlicher Bedeutung.With regard to the application to promote the wound This property is healing or angiogenesis of extraordinary importance.
Wie bereits oben ausgeführt, verlaufen die einzelnen Prozesse der Wundheilung zeitlich und räumlich geord net. Je nach Phase der Wundheilung schwankt die Kon zentration eines Wachstumsfaktors in weiten Berei chen. Durch eine Verstärkung dieses streng regulier ten Prozesses ist eine Förderung der Wundheilung also möglich, die durch die Applikation des betref fenden Wachstumsfaktors selbst nicht erzielt werden könnte, wie im folgenden dargestellt wird: Dies wird bei der Rolle der Kapillareinsprossung im Wundheilungsprozeß besonders deutlich. In der proliferativen Phase sprossen Kapillaren in das Wund gebiet ein. Die Konzentration der betreffenden Wachstumsfaktoren muß also hoch sein. In der Phase der Narbenbildung erfolgt dagegen eine Rückbildung von Kapillaren. Die Konzentration der betreffenden Wachstumsfaktoren muß also niedrig sein.As already explained above, the individual runs Wound healing processes temporally and spatially ordered net. The con fluctuates depending on the phase of wound healing concentration of a growth factor in a wide range chen. By strengthening this strictly regulated The process is to promote wound healing So possible that by the application of the growth factor itself cannot be achieved could, as shown in the following: This is the role of capillary ingrowth Wound healing process particularly evident. In the proliferative phase sprouted capillaries into the wound area. The concentration of the concerned So growth factors must be high. In the phase on the other hand, scarring regresses of capillaries. The concentration of the concerned So growth factors must be low.
Die Zugabe der entsprechenden Wachstumsfaktoren zur Beeinflussung der Wundheilung würde die Rückbildung der Kapillaren hemmen und den Heilungsprozeß in die ser Phase stören. Durch den verstärkenden Effekt des niedermolekularen Anteils von Blut wird dagegen die Regulation des Heilungsprozesses nicht gestört; die betreffenden Prozesse werden nur verstärkt. The addition of the appropriate growth factors Influencing wound healing would result in regression inhibit the capillaries and the healing process in the disturb this phase. Due to the reinforcing effect of In contrast, the low molecular weight portion of blood becomes the Regulation of the healing process not disturbed; the relevant processes are only strengthened.
Das angestrebte Ziel, d. h. ein Testsystem mit wel chem, unabhängig von individuellen Abweichungen, mit relativ begrenztem Aufwand, eine wundheilungs- bzw. angiogenesefördernde Wirkung reproduzierbar erfaßt werden kann, wird mit der Bestimmung des Wachstums der Endothelzellen unter den beschriebenen Bedingun gen erreicht.The desired goal, i.e. H. a test system with wel chem, regardless of individual deviations, with relatively limited effort, a wound healing or angiogenesis-promoting effect reproducibly recorded can be with the determination of growth of endothelial cells under the conditions described reached.
Eine mögliche Ausführungsform dieses Tests ist im Beispiel dargestellt. Die Zusammenhänge werden durch die Abbildung veranschaulicht.A possible embodiment of this test is in Example shown. The connections are through the illustration illustrates.
Die Isolierung von "capillary endothelial cells" (CEC) aus Meerschweinchenherzen erfolgte nach S. Nees et al., Eur. J. Cell Biol. 24; 287-297 (1981). Die Medien setzten sich wie folgt zusammen:Isolation of "capillary endothelial cells" (CEC) from guinea pig hearts was carried out according to S. Nees et al., Eur. J. Cell Biol. 24; 287-297 (1981). The Media are composed as follows:
Sucrosemedium:
20% Sucrose (Merck, Darmstadt) in Medium 199 (Gibco)
37°C;Sucrose medium:
20% sucrose (Merck, Darmstadt) in medium 199 (Gibco) 37 ° C;
Kulturmedium:
Medium 199 (Gibco) mit 20% fötalem Kälberserum (FCS)
(Flow Laboratories);Culture medium:
Medium 199 (Gibco) with 20% fetal calf serum (FCS) (Flow Laboratories);
Enzymlösung:
0,1% Collagenase (Sigma, Deisenhofen) und 0,1%
Trypsin (Biochrom, Berlin) in PBS-d (Biochrom), 37
°C;Enzyme solution:
0.1% collagenase (Sigma, Deisenhofen) and 0.1% trypsin (Biochrom, Berlin) in PBS-d (Biochrom), 37 ° C;
PBS-d:
Phosphate-buffered-saline solution ("d" heißt "Ca2+-
und Mg2+- deficient") pH-Wert 7,2PBS-d:
Phosphate-buffered-saline solution ("d" means "Ca 2+ - and Mg 2+ - deficient") pH 7.2
171 mM NaCl
3,35 mM KCl
8,1 mM Na₂HPO₄
1,8 mM KH₂PO₄171 mM NaCl
3.35 mM KCl
8.1 mM Na₂HPO₄
1.8 mM KH₂PO₄
PBS:
Phosphate-buffered-saline solution, pH-Wert 7,2PBS:
Phosphate-buffered-saline solution, pH 7.2
137 mM NaCl
2,7 mM KCl
6,5 mM Na₂HPO₄
1,5 mM KH₂PO₄
0,7 mM CaCl₂
0,5 mM MgCl₂137 mM NaCl
2.7 mM KCl
6.5 mM Na₂HPO₄
1.5 mM KH₂PO₄
0.7 mM CaCl₂
0.5 mM MgCl₂
Alle Lösungen sollten 100 IU/ml Penicillin, 10 µg/ml Streptomycin und 2,5 µg/ml Fungizon (alle von Biochrom) enthalten. All solutions should be 100 IU / ml penicillin, 10 µg / ml Streptomycin and 2.5 µg / ml fungizone (all from Biochrom) contain.
Ein aus einem Meerschweinchen (200-300 g) isolier tes Herz wird kanuliert und zuerst retrograd mit 20 ml Sucrosemedium, dann mit 10 ml Enzymlösung perfun diert. Abgelöste mikrovaskuläre Endothelzellen in der Enzymlösung überschichten das Sucrosemedium und las sen sich leicht ernten. Die Zellen aus vier Herzen werden vereinigt und dreimal mit je 50 ml Kulturmedium gewaschen (10 min, 250 g). Sie werden dann in zwei bis vier 35 mm-Petrischalen mit je 2 ml Kulturmedium ausgesät und im feuchten Brut schrank bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Das Medium wird nach 24 h erneuert, danach werden die Kulturen zweimal pro Woche mit frischem Medium gefüt tert.A heart isolated from a guinea pig (200-300 g) is cannulated and first perfected retrograde with 20 ml sucrose medium, then with 10 ml enzyme solution. Detached microvascular endothelial cells in the enzyme solution cover the sucrose medium and are easy to harvest. The cells from four hearts are combined and washed three times with 50 ml of culture medium (10 min, 250 g). They are then sown in two to four 35 mm Petri dishes, each with 2 ml culture medium and cultivated in a moist incubator at 37 ° C and 5% CO 2 . The medium is renewed after 24 hours, after which the cultures are fed twice a week with fresh medium.
Für die Durchführung des Tests wurden konfluente CEC- Primärkulturen zur Synchronisation drei Tage in Testmedium mit niedrigem Serumgehalt und bovinem Se rumalbumin (BSA) (Sigma) (zur Stabilisierung) kulti viert. Dieses Testmedium (nach Nees) bestand aus Medium 199 mit 0,5% hitzeinaktiviertem fötalem Käl berserum (FCS; Sigma) (56°C, 30 min), 1,7% BSA und Penicillin/Streptomycin/Fungizon (s. o.). Dieses Medium sichert die Anheftung und das Überleben der CEC bei geringer Aussaatdichte, erlaubt aber kaum Wachstum. Danach wurden die CEC in Einzelzellen dissoziiert mit 0,5 ml 0,1% Collagenase/0,1% Trypsin (s. o.), wodurch andere, in geringer Anzahl vorhandene Zelltypen - vermutlich makrovaskuläre Endothelzellen (S. Nees: persönliche Mitteilung) - nicht abgelöst werden. Nach der Zellzählung wurde die Zellsuspension in einer Konzentration von 1000 Zel len/well (Napf) mit 0,1 ml Testmedium pro well in Mikrotiterplatten mit 96 wells ausgesät.Confluent CEC- Primary cultures for synchronization three days in Low serum test medium with bovine Se rumalbumin (BSA) (Sigma) (for stabilization) cult fourth. This test medium (according to Nees) consisted of Medium 199 with 0.5% heat inactivated fetal calf berserum (FCS; Sigma) (56 ° C, 30 min), 1.7% BSA and Penicillin / streptomycin / fungizon (see above). This Medium ensures attachment and survival of the CEC with low sowing density, but hardly allowed Growth. After that, the CEC were in single cells dissociates with 0.5 ml 0.1% collagenase / 0.1% Trypsin (see above), which causes others, in small numbers existing cell types - presumably macrovascular Endothelial cells (S. Nees: personal communication) - cannot be replaced. After the cell count, the Cell suspension in a concentration of 1000 cells len / well (well) with 0.1 ml test medium per well in Microtiter plates seeded with 96 wells.
Nach der Aussaat wurden 0,1 ml/well Testsubstanz in Testmedium zugefügt. Wegen der geringen Aussaatdichte benötigen die Zellen keine Erneuerung des Mediums während der folgenden drei Wochen Kultur. Der nieder molekulare Anteil von Kälberblut sowie Fraktionen da von dürfen maximal mit 1 mg/ml (bezogen auf Trocken gewicht) eingesetzt werden, höhere Konzentrationen wirken offenbar toxisch (möglicherweise wegen des ho hen Salzgehalts). EGF wurde in einer Konzentration von 1 ng/ml verwendet.After sowing, 0.1 ml / well of test substance was in Test medium added. Because of the low sowing density the cells do not need to renew the medium during the next three weeks of culture. The down molecular part of calf blood as well as fractions of a maximum of 1 mg / ml (based on dry weight) are used, higher concentrations appear to be toxic (possibly because of the ho hen salinity). EGF was in a concentration of 1 ng / ml.
Das Wachstum der Kulturen wurde dann durch Zellzäh lung oder MTT-Test (T. Mosmann, J. Immunol. Meth. 65: 55 (1983), L. M. Green et al., J. Immunol. Meth. 70; 257 (1984)) analysiert. Der MTT-Test mißt die Aktivi tät von mitochondrialen Dehydrogenasen. Alternativ läßt sich der Saure-Phosphatase-Test nach Connolly et al. (Analyt. Biochem. 152; 136-140 (1986)) oder der Einbau von 3H-Thymidin verwenden. The growth of the cultures was then determined by cell counting or MTT test (T. Mosmann, J. Immunol. Meth. 65: 55 (1983), LM Green et al., J. Immunol. Meth. 70; 257 (1984)) analyzed. The MTT test measures the activity of mitochondrial dehydrogenases. Alternatively, the acid phosphatase test according to Connolly et al. (Analyt. Biochem. 152; 136-140 (1986)) or the incorporation of 3 H-thymidine.
Beim MTT-Test werden die wells mit je 200 µl PBS ge spült, dann 30 min bei 37°C mit - pro well - 10 µl MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra zolium bromide; Thiazolyl blue) (Sigma; 5 mg/ml PBS) und 100 µl PBS inkubiert. Nach dem Absaugen und Spü len mit je 200 µl PBS werden die blau angefärbten Zellen mit - pro well - 20 µl 6% SDS (Natrium dodecylsulfat, Sigma) in H2O und 200 µl 0,04 N HCl in Isopropanol lysiert.In the MTT test, the wells are rinsed with 200 μl PBS each, then 30 min at 37 ° C. with - per well - 10 μl MTT ( 3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetra zolium bromide; Thiazolyl blue) (Sigma; 5 mg / ml PBS) and 100 µl PBS. After aspirating and rinsing with 200 ul PBS each, the blue stained cells are lysed with - per well - 20 ul 6% SDS (sodium dodecyl sulfate, Sigma) in H 2 O and 200 ul 0.04 N HCl in isopropanol.
Die Extinktion des gut gemischten Lysats, die linear mit der Zelldichte korreliert, wurde in einem "Multiskan" (Pharmacia) bei einer Wellenllänge von 570 nm bestimmt. Zur Ermittlung des Stimulationsfaktors wurde die Extinktion bei 570 nm der jeweiligen Testsubstanz-Konzentration durch die Extinktion bei 570 nm der jeweiligen Kulturen divi diert, die nur Testmedium erhalten hatten.The absorbance of the well mixed lysate, which is linear correlated with the cell density was in one "Multiskan" (Pharmacia) at a wavelength of 570 nm determined. To determine the The absorbance at 570 nm was the stimulation factor the respective test substance concentration by the Absorbance at 570 nm of the respective cultures divi that only received test medium.
Die Abbildung illustriert die Dosisabhängigkeit der Wirkung der TestsubstanzenThe figure illustrates the dose dependency of the Effect of the test substances
- - niedermolekularer Anteil von Kälberblut- low molecular weight calf blood
- - Kontrollösung (Salze, Aminosäuren, Zucker, Metabolite entsprechend der Zusammensetzung des niedermolekularen Anteils von Kälberblut)- control solution (salts, amino acids, sugar, Metabolites according to the composition of the low molecular weight portion of calf blood)
- - EGF- EGF
auf die Proliferation kapillarer koronarer Endothelzellen (CEC). on the proliferation of capillary coronary Endothelial cells (CEC).
Die Abbildung zeigt den Einfluß des niedermolekularen Anteils von Kälberblut auf das Wachstum koronarer kapillarer Endothelzellen.The figure shows the influence of the low molecular weight Proportion of calf blood on coronary growth capillary endothelial cells.
Primäre kapillare Koronar-Endothelzellen (CEC) wurden in einer Dichte von 1000 Zellen/well in 96 well- Mikrotiterplatten ausgesät und drei Wochen mit 0,2 ml Testmedium kultiviert, das verschiedene Konzentratio nen folgender Testsubstanzen enthielt:Primary capillary coronary endothelial cells (CEC) were at a density of 1000 cells / well in 96 well Microtiter plates are sown and three weeks with 0.2 ml Test medium cultivated, the different concentration contained the following test substances:
- 1. niedermolekularer Anteil von Kälberblut +1 ng/ml EGF1. low molecular weight calf blood +1 ng / ml EGF
- 2. Kontrollösung +1 ng/ml EGF2. Control solution +1 ng / ml EGF
- 3. EGF3. EGF
- 4. niedermolekularer Anteil von Kälberblut4. low molecular weight portion of calf blood
- 5. Kontrollösung5. Control solution
Danach wurde die Zelldichte mit dem MTT-Test be stimmt.The cell density was then assessed using the MTT test Right.
Die Abszisse bezeichnet die Konzentrationen der ein gesetzten Substanzen in µg/ml (niedermolekularer An teil von Kälberblut, Kontrollösung) bzw. pg/ml (EGF), die Ordinate den Wachstumsstimulationsfaktor, bezogen auf die Zelldichte im Testmedium ohne Testsubstanz. Jeder Meßpunkt stellt den Mittelwert aus 8 Bestimmun gen (wells) dar.The abscissa denotes the concentrations of the one substances in µg / ml (low molecular weight An part of calf blood, control solution) or pg / ml (EGF), the ordinate is related to the growth stimulation factor on the cell density in the test medium without test substance. Each measuring point represents the mean of 8 determinations gene (wells).
Dieser Test ist somit der Schlüssel zur Isolierung der Wirksubstanz(en) aus dem Substanzgemisch des nie dermolekularen Anteils von Blut. Mit Hilfe bekannter ter Anreicherungsverfahren wie Fällungen mit org. Lö sungsmitteln, Salzfällungen, Chromatographie an Molekularsieben und Ionenaustauschern, Affinitäts chromatographie, HPLC mit normalen und reversed Pha sen, lassen sich die Komponenten des nieder molekularen Anteils von Blut auftrennen und mit Hilfe des Tests läßt sich bestimmen, in welchen Fraktionen sich die aktive(n) Substanz(en) befindet(n). Auf diese Weise gelangt man schließlich zur reinen Wirk substanz, deren chemische Struktur dann aufgeklärt werden kann.This test is the key to isolation the active substance (s) from the substance mixture of the never the molecular fraction of blood. With the help of well-known enrichment process such as precipitation with org. Lö solvents, salt precipitation, chromatography Molecular sieves and ion exchangers, affinity chromatography, HPLC with normal and reversed Pha the components of the separate molecular portion of blood and with the help The test can determine in which fractions the active substance (s) is (are). On in this way one finally comes to the pure effect substance, the chemical structure of which is then elucidated can be.
Als Pharmakon hat eine solche Wirksubstanz eine Be deutung, die weit über die des Substanzgemisches (niedermolekularer Anteil von biologischen Flüssig keiten wie z. B. Blut) hinausgeht. Mit den sich bei einer solchen Monosubstanz bietenden Untersuchungsmöglichkeiten können die optimale Dosie rung und die Bedingungen zur Aufrechterhaltung eines wirksamen Spiegels bestimmt werden. Der therapeuti sche Nutzen wird somit erhöht. Darüber hinaus kann der Wirkungsmechanismus besser studiert werden, was wiederum zu einer gezielteren Anwendung führt.As a pharmaceutical, such an active substance has a Be interpretation that goes far beyond that of the mixture of substances (low molecular weight portion of biological liquid such as Blood). With yourself of such a single substance Examination options can determine the optimal dose and the conditions for maintaining a effective mirror can be determined. The therapeutic The benefit is increased. Furthermore, can the mechanism of action can be better studied what in turn leads to a more targeted application.
Mit dem beschriebenen Testsystem können selbstver ständlich entsprechende Wirksubstanzen auch aus ande rem biologischem Ausgangsmaterial isoliert werden. With the test system described can ver correspondingly active substances from others be isolated from the biological starting material.
Die gewerbliche Anwendung beschränkt sich nicht dar auf, ein Testverfahren zum Screening und zur Isolie rung von wundheilungs- und angiogenesefördernden Sub stanzen entwickelt zu haben. Das Testverfahren kann auch zur qualitativen und quantitativen Aktivitäts bestimmung im Rahmen der Qualitätskontrolle (Aus gangsmaterial, Zwischenprodukt, Endprodukt) von wundheilungs- bzw. angiogenesefördernden Präparaten eingesetzt werden. Dies gilt für Präparate mit be kanntem wie mit unbekanntem Wirkprinzip.The commercial application is not limited to this on, a screening and isolation test of wound healing and angiogenic promoting sub to have developed stamping. The test procedure can also for qualitative and quantitative activity determination in the context of quality control (Aus material, intermediate, end product) of preparations that promote wound healing or angiogenesis be used. This applies to preparations with be known as with an unknown active principle.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
| 8181 | Inventor (new situation) |
Free format text: ANSSAR-HAEDENKAMP, GESA, DR., 8300 ALTDORF, DE SCHIELE, ULRICH, DR., 8000 MUENCHEN, DE KUNTZ, GUENTER, DR., 8032 GRAEFELFING, DE ANDERSEN-BECKH, BETTINA, DR., 3550 MARBURG, DE |
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| D2 | Grant after examination | ||
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Owner name: NYCOMED ARZNEIMITTEL GMBH, 80939 MUENCHEN, DE |
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