DE4006308A1

DE4006308A1 - Verwendung des monoklonalen antikoerpers br 55.2 gegen kleinzelliges lungenkarzinom

Info

Publication number: DE4006308A1
Application number: DE4006308A
Authority: DE
Inventors: Hans Dr Loibner; Dieter Dr Scholz
Original assignee: Sandoz AG; Sandoz Patent GmbH
Current assignee: Sandoz AG; Sandoz Patent GmbH
Priority date: 1990-02-28
Filing date: 1990-02-28
Publication date: 1991-08-29
Also published as: EP0445078B1; DE69114546D1; JP2996526B2; JPH04211612A; ATE130200T1; DE69114546T2; EP0445078A1; US5523085A

Description

Der monoklonale Antikörper BR 55.2, seine Herstellung und seine Verwendung zur Be handlung von malignen Erkrankungen, insbesondere von Adenokarzinomen, sind bekannt und in der EP-A 2 85 059 beschrieben.

Es wurde nun gefunden, daß diese Antikörper eine ausgezeichnete Wirkung auch gegen kleinzellige Lungenkarzinomzell(SCLC-)Linien (Targetzellen = T) besitzen, sie binden auf kleinzelligen Lungenkarzinom-Zellinien sowie Gefrierschnitten kleinzelliger Lungenkar zinome. Das bedeutet, daß das Tumor-assoziierte Antigen, das diese Antikörper definieren, nämlich das Y-Kohlehydrat-Antigen, überraschenderweise auch auf kleinzelligen Lungenkar zinomen häufig exprimiert wird. Diese Bindungsuntersuchungen wurden auf der SW 2 Zellinie in einem Zell-ELISA durchgeführt. Vergleichbare Ergebnisse erzielt man beispielsweise auch mit den kleinzelligen Lungenkarzinom Zellinien LX1, OH1, OH3, H69 und ZL2. Diese Unter suchungen wurden nach der in der Literatur bekannten Methode der Immunfluoreszenz durchgeführt (A. Johnstone, R. Thorpe: Immunochemistry in Practice: Blackwell Scientific Publications, Oxford, London, 1987).

Die Bindungsfähigkeit dieser Antikörper auf Gefrierschnitten kleinzelliger Lungenkarzinome wurde mittels der literaturbekannten immunhistochemischen Methode untersucht (R. B. Col vin, A. K. Bhan, R. T. McCluskey: Diagnostic Immunopathology, Raven Press, New York 1988), wobei sie bei 5 von 7 untersuchten kleinzelligen Lungenkarzinomen eine starke Bin dung zeigten.

Weiters wurde gefunden, daß diese Antikörper eine ausgezeichnete Zytolyse gegen kleinzel lige Lungenkarzinom-Zellinien durch die Aktivierung von humanen Effektormechanismen be sitzen. Die durch Antikörper hervorgerufene Zerstörung von Tumorzellen folgt zwei allgemeinen Mechanismen, der Komplement-abhängigen Cytolyse (complement dependent cytolysis = CDC) und der Antikörper-abhängigen Zellcytotoxizität (antibody dependent cell cytotoxicity = ADCC). Der monoklonale Antikörper BR 55.2 zeigt sowohl im CDC wie auch im ADCC mit humanem Komplement bzw. humanen Effektorzellen eine ausgezeichnete Wirkung.

In den Standard-Testmethoden werden entweder humanes Plasma oder Serum als Komplementquelle (bei CDC) bzw. frisch isolierte humane periphere mononukleare Blutzel len (PBMC) als Effektorzellen (E) (bei ADCC) verwendet. Diese Bedingungen sind sehr ar tifiziell. Die Untersuchungen wurden daher auch unter Verwendung von heparinisiertem humanem Blut in einem antikörperabhängigem Zell Lyse Assay zur Messung der Lyseef fizienz der kombinierten Mechanismen durchgeführt, wodurch Bedingungen geschaffen wer den, die der in vivo Situation näherkommen.

Folgende Materialien und Methoden wurden in den Tests eingesetzt:

Zell-Linien:
H-69 und SW 2: humane kleinzellige Lungenkarzinomzell-Linien (R. Waibl et al., Cancer Res. 1988, 48, 4318-4323).

Medium:
RPMI 1640 + 2 g/l NaHCO₃
100 E/ml Penicillin G
100 µg/ml Streptomycinsulfat
4 mM Glutamin
10% FCS (hitzeinaktiviert, frei von Gammaglobulin)

⁵¹Cr:
NA⁵¹CrO₄ 1 mCi/ml

Effektorzellen:
PBMC von frisch heparinisiertem humanem Blut

Ficoll-Paque:
Dichte 1077 ± 0,001 g/ml

PBS komplett:
8,0 g NaCl
0,2 g KH₂PO₄
0,2 g KCl
1,15 g Na₂HPO₄
0,13 g CaCl₂ · 2H₂O
0,1 g MgCl₂ · 6H₂O
auf 1 l mit H₂O dest. aufgefüllt

Isolierung der PBMC

15 ml verdünntes (50 ml heparinisiertes frisches Blut, 60 ml PBS komplett mit 0,1% Glu cose) Blut werden auf 15 ml Ficoll-Paque-Lösung überschichtet und die Röhrchen bei 400 g 30 bis 60 Minuten zentrifugiert. Der Plasmaüberstand wird abgegossen, die PBMC-Schichten gesammelt und mit PBS komplett +0,1% Glucose auf 50 ml verdünnt. Nach Zentrifugieren bei ca. 850 g (10 Minuten) wird das Pellet in 25-30 ml PBS komplett +0,1% Glucose noch mals zentrifugiert (80 g, 10 Minuten) und dann im Medium suspendiert. Die Zellen werden gezählt und mit Medium auf die notwendige Zelldichte verdünnt (2 × 10⁶ bis 9 × 10⁶ Zellen/ml). Je 100 µl werden in jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte pipettiert, und die Effektorzellen werden bei 37°C/5% CO₂ über Nacht inkubiert.

⁵¹Cr-Markieren der Targetzellen

Die Zellen werden 24 Stunden in frischem Medium inkubiert (mit 5% FCS), dann gewaschen und gezählt. Ca. 5,5 × 10⁶ Zellen werden in 350 bis 400 µl Medium suspendiert und 100 µCi (3,7 MBq) ⁵¹Cr zugesetzt. Nach Inkubation (60 bis 120 Minuten, 37°C/5% CO₂) in einem Miniroller werden zum Entfernen von überschüssigem ⁵¹Cr die Zellen sorgfältig gewaschen und mit Medium verdünnt (2,5 × 10⁵ Zellen/ml).

ADCC

Je 100 µl der Targetzell-Lösung werden in die Vertiefung der Mikrotiterplatte, die PBMC enthalten, gegeben. Dann werden 40 µl BR 55.2-Lösung in der gewünschten Verdünnung zugesetzt und 4 Stunden bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Anschließend werden die Überstände geerntet und in einem γ-Zähler gezählt.

Spontane Freisetzung:
Targetzellen in 100 µl Medium + 100 µl Medium und 10% FCS (anstatt der PBMC) + 40 µl PBS komplett (anstatt des Antikörpers)

Totale Freisetzung:
Targetzellen in 100 µl Medium + 100 µl 2% SDS, 50 mM Na₂CO₃ und 10 mM EDTA (anstatt der PBMC) + 40 µl PBS komplett (anstatt des Antikörpers).

Die Ergebnisse dieses Tests sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:

Tabelle 1

H-69

CDC

Je 100 µl Targettzell-Lösung werden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben, die auf die gewünschte Konzentration verdünnte Antikörperlösung wird zugesetzt und die Zellen werden 2 Stunden bei 37°C/5% CO₂ inkubiert. Anschließend werden 100 µl humanes Komplement pro Vertiefung hinzugefügt, die Zellen eine weitere Stunde bei 37°C/5% CO₂ inkubiert, die Überstände geerntet und im γ-Zähler gezählt.

Spontane Freisetzung:
Targetzellen in 100 µl Medium + 100 µl Medium und 10% FCS (anstatt Komplement) + 40 µl PBS komplett (anstatt Antikörperlösung)

Totale Freisetzung:
Targetzellen in 100 µl Medium + 100 µl 2% SDS, 50 mM Na₂CO₃ und 10 mM EDTA (anstatt Komplement) + 40 µl PBS komplett (anstatt Antikörperlösung)

Die Ergebnisse dieses Tests sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:

Tabelle 2

H-69

Vollblutlyse

Dieser Test wurde analog dem oben beschriebenen ADCC durchgeführt, wobei an Stelle der PBMC-Suspension jeweils 100 µl von heparinisiertem, mit Medium (Blut/Me dium = 3 : 1) verdünntem Blut verwendet wurden. Als Blutspender diente ein Patient mit progrediertem kleinzelligem Lungenkarzinom.

Die Ergebnisse dieses Tests sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:

SW-2
BR 55.2 µg/Vertiefung
% Lyse
20
106
5	106
1	101
0,2	73
0,05	28
0	15

Der Antikörper BR 55.2 ist daher zur Therapie von Lungenkarzinomen geeignet. Die dafür notwendigen Dosen sind dabei abhängig von den verschiedenen Umständen, beispielsweise vom Alter des Patienten, Grad der Erkrankung, Art der Verabreichung, und können vom Fachmann für den speziellen Fall festgelegt werden. Sie variieren auch bei kombinierter Verwendung mit anderen Chemotherapeutika, z. B. mit Cytostatika. Die Verabreichung kann parenteral durch Injektion oder durch Infusion durchgeführt werden, gegebenenfalls in Kom bination mit Effektorzellen.

Bindungsfähigkeit/Zell-ELISA

Nunc-Immunoplates werden nach Vorbehandlung mit Poly-L-Lysin-Hydrobromid [20 000-30 000; 20 µg/ml in PBS def. (138 mM NaCl, 1,5 mM KH₂PO₄, 2,7 mM KCl, 6,5 mM Na₂HPO₄, pH 7,2); 100 µl/Vertiefung; 30 Minuten/Raumtemperatur] und zweimaligem Waschen mit PBS def. (200 µl/Vertiefung) mit einer Zellsuspension der Zellinie SW2 in der Konzentration von 4 × 10⁶ Zellen/ml über Nacht bei +4°C inkubiert (je µl Zellsuspension/ well; Medium = RPMI 1640 + 2,0 g/l NaCO₃, 100 U/ml Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin sulfat, 4 mM Glutamin, 10% FCS). Nach Zentrifugation und Absaugen des Überstandes wer den die Zellen mit je 50 µl/Vertiefung Glutardialdehyd (0,1% in phys. NaCl) 5 Minuten bei Raumtemperatur fixiert, zentrifugiert und nach Absaugen dieses Überstandes mit je 200 µl/ Vertiefung PBS def./1% Rinderserumalbumin/0,1% NaN₃ 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen.

Die Inkubation des Antikörpers (Verdünnungspuffer ist PBS def.) erfolgt nach Absaugen des Überstandes und zweimaligem Waschen mit je 200 µl PBS/Tween 20 (0,5%) pro Vertiefung 1 Stunde bei 37°C. Als höchste Konzentration für die Bestimmung der Bindung des An tikörpers an die SKBR-5 Zellen wählt man ∼20 µg/ml. Ungebundener Antikörper wird mit 2 × 100 µl eiskaltem PBS/Tween 20 (0,05%) pro Vertiefung herausgewaschen und der Peroxidase-konjugierte Antikörper (Rabbit-anti-mouse-lgG) zupipettiert. Das entsprechende Konjugat für den Nachweis des Antikörpers ist Rabbit-anti-mouse lgG/PO oder Rabbit-anti-mouse lgG-F(ab')₂PO (z. B. die Reagenzien von Fa. Dianova) 1 : 1000 in PBS def./2% FCS. Nach einer Inkubationszeit von 40 Minuten bei 37°C werden die Ver tiefung 3 × mit obiger PBS/Tween 20-Lösung gewaschen und je 100 µl folgender Sub stratlösung zupipettiert: 40 mg Orthodiphenylendiamindihydrochlorid, 100 ml staining buffer (24,3 mM Zitronensäure, 51,4 mM Na₂HPO₄), 20 µl H₂O₂ (30%).

Nach ca. 5 Minuten wird die Farbentwicklung durch 50 µl/Vertiefung 4N H₂SO₄ abgestoppt. Die Auswertung der Bindung des Antikörpers an die Zellen nach dem Prinzip des Zell-ELISAs erfolgt durch Messen der OD bei 490 nm (Referenzmessung 620 nm).

Alle Waschschritte werden durch Zentrifugieren und Resuspendieren der Zellen durchgeführt, da die Zellinie SW 2 keine anhaftende Zellinie ist. Das Ergebnis der Unter suchungen ist in Diagramm 1 wiedergegeben.

Diagramm 1

Claims

1. Verwendung des Antikörpers BR 55.2 zur Behandlung von kleinzelligen Lungenkar zinomen.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Antikörper BR 55.2 parenteral verabreicht wird.

3. Verwendung nach Ansprüchen 1 und 2, wobei der Antikörper BR 55.2 gemeinsam mit Effektorzellen verabreicht wird.

4. Eine pharmazeutische Kombination, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine wirksame Menge des Antikörpers BR 55.2 gemeinsam mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger material enthält.