DE3925135A1 - Verfahren und vorrichtung zur automatisierten durchfuehrung und auswertung von agglutinationsreaktionen, insbesondere zur bestimmung leichter agglutination - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur automatisierten Durchführung und Auswertung von Agglu­ tinationsreaktionen, insbesondere zur Bestimmung leichter Agglutination. Zur Durchführung des Verfahrens wird ein aus Suspension, beispielsweise einer Erythrozyten-Suspension und Serum bestehendes Gemisch nach bekannten Vorschriften be­ handelt und das Ausmaß der Agglutination mit Hilfe der Photosedimentation bestimmt.

Vor Durchführung einer Bluttransfusion werden weltweit Anti­ körpertests durchgeführt, insbesondere ein Antihumanglubo­ lin-AHG-Test, um festzustellen, ob möglicherweise zusätz­ liche Unverträglichkeiten gegenüber den ABO- und Rh-Blut­ typen vorliegen, um die Sicherheit von Bluttransfusionen zu erhöhen. In Analogie zu den verschiedenen Reaktionen zur Feststellung des Bluttyps gibt es eine Reihe von immuno­ analytischen Methoden, bei deren Durchführungen Antikörper­ reagentien an fremde Erythrozyten und/oder sonstige Par­ tikel gebunden werden.

Die bekannten Verfahren arbeiten typischerweise auf analoger Basis. Das aufwendigste und am häufigsten eingesetzte Test­ verfahren ist der Antihumanglobulin-AHG-Test bzw. Coombs- Test. Die Vorrichtungen und Ausrüstungen zur Durchführung des AHG-Tests sind auch zur Durchführung anderer Agglutina­ tionsreaktionen geeignet.

Soweit bekannt, umfaßt der AHG-Test nachstehende Verfahrens­ schritte:

• - es werden Gemische aus Erythrozyten und Serum bereit­ gestellt,
• - das Gemisch wird inkubiert,
• - es wird ein wenigstens drei Schritte umfassender Waschvorgang zum Waschen der Zellen durchgeführt, der seinerseits nachstehende Schritte umfaßt:
  • - die Waschflüssigkeit wird zugeführt,
  • - das Gemisch wird geschüttelt,
  • - es erfolgt eine Trennung zwischen Gemisch und überschüssiger Flüssigkeit,
  • - überschüssige Waschflüssigkeit wird entfernt, etwa durch Abdekantieren,
• - es wird AHG-Serum zugeführt,
• - das Gemisch wird geschüttelt,
• - es erfolgt eine Trennung zwischen Gemisch und über­ schüssiger Flüssigkeit,
• - es wird leicht geschüttelt und es werden Maßnahmen zur Bestimmung des Ausmaßes der Agglutination durch­ geführt.

Für eine Anzahl von Proben schafft die wiederholte Durchfüh­ rung der oben angegebenen Folge von Verfahrensschritten er­ hebliche Anforderungen an Geduld und Aufmerksamkeit der Per­ son, welche diese Messungen ausführt. Weiterhin erhöht die ausgedehnte und unmittelbare Handhabung von Blutproben die Gefahr einer Infektion. Seit vielen Jahren sind Ausrüstungen handelsüblich zugänglich - beispielsweise vertrieben von HITACHI, DuPONT-SORVALL, METZ & DADE oder HERAEUS -, mit denen der dreimalige Zellwaschvorgang automatisiert durch­ geführt werden kann. Diese Geräte sind jedoch nicht zur automatisierten Durchführung der anderen Arbeitsschritte ge­ eignet. Darüber hinaus treten beim Arbeiten mit diesen be­ kannten Geräten nachstehende Schwierigkeiten und Nachteile auf:

• - beim Abdekantieren der von den Erythrozyten befreiten Waschflüssigkeit kommt diese in einem großen Flächen­ bereich mit der Innenwand des Separators in Kontakt, was die Gefahr einer Infektion erhöht,
• - im Verlauf der Durchführung des Waschvorganges gibt es keine Möglichkeit festzustellen, ob die Anzahl der Erythrozyten abgenommen hat, etwa durch Haemolyse, und ob der Separator wunschgemäß funktioniert,
• - die Bestimmung der Agglutination ist subjektiv, wes­ halb eine Standardisierung dieses Tests nicht möglich ist.

Es gibt bereits Vorschläge, die keinen Bezug zu dem Coombs- Test haben, die jedoch geeignet erscheinen, einige von des­ sen Verfahrensschritten zu automatisieren. So wird mit der Ungarischen Patentschrift 1 92 531 ein multifunktionaler Sepa­ rator beschrieben. Dieser Separator weist besondere Trenn­ rohre auf, die mehrere Kammern haben, nämlich wenigstens eine Gravitations-Kammer und eine Trennkammer, wobei die Flüssigkeit zwischen diesen Kammern in beiden Richtungen frei strömen kann. Deshalb kann in dem bekannten Trennrohr das Mischen und Trennen von Flüssigkeit durchgeführt werden. Zu dem bekannten Gerät gehört ein Saugrohr, das in das Trennrohr eingeführt werden kann; mit Hilfe dieses Saug­ rohres kann das Abdekantieren von Flüssigkeit durchgeführt werden. Jedoch kann dieses Abdekantieren lediglich bei agglutinierten Proben durchgeführt werden, weil das nicht­ agglutinierte, abgetrennte Erythrozyten-haltige Material nicht in der Trennkammer verbleiben kann, sondern abgesaugt wird. Folglich tritt ein nicht hinzunehmender Verlust an Zellen auf. Entsprechend dem Vorschlag nach diesem Ungari­ schen Patent ist das Trennrohr in der Trennvorrichtung, insbesondere einer Zentrifuge in der Weise befestigt, daß die Längsachse der Trennkammer und deren Wände im Verlauf der Rotation nicht senkrecht zur Rotationsachse der Zentri­ fuge ausgerichtet sind. Das heißt, entsprechend diesem be­ kannten Vorschlag kann eine Bestimmung der Agglutination mit Hilfe der Photosedimentation nicht durchgeführt werden, weil sich die Niederschlagsfront an den geneigten Wänden des Trennrohres verschmiert. Andere bekannte Geräte zur auto­ matisierten Bestimmung der Agglutination, wie etwa das von GROUPPAMATIC unter der Bezeichnung "GAMMA STA A" vertriebene Gerät weisen unabhängig vom Separator getrennte, aufwendige Meßeinrichtungen vor. Diese sind zur Bestimmung einer leich­ ten Agglutination nicht ausreichend empfindlich.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin ein Verfahren und eine Vorrichtung zur automatisierten Durch­ führung und Auswertung von Agglutinationsreaktionen, ins­ besondere zur Bestimmung leichter Agglutination anzugeben, wobei die oben angegebene Folge von Verfahrensschritten innerhalb eines Trennrohres durchgeführt wird.

Weiterhin soll es möglich sein, eine Verunreinigung der Innenwand des Separators zu verhindern. Weiterhin soll es möglich sein, einen möglicherweise auftretenden Verlust von Zellen, insbesondere eine Abnahme der Erythrozyten beim Ab­ dekantieren von Flüssigkeit zu kontrollieren.

Ausgehend von einem Verfahren zur automatisierten Durchfüh­ rung und Auswertung von Agglutinationsreaktionen, insbeson­ dere zur Bestimmung leichter Agglutination, wobei ein aus Suspension und Serum bestehendes Reaktionsgemisch bereitge­ stellt wird, das inkubierte Gemisch abgetrennt und geschüt­ telt wird und das Ausmaß der Agglutination mit Hilfe der Photosedimentation bestimmt bestimmt wird, ist die erfin­ dungsgemäße Lösung dieser Aufgabe gekennzeichnet durch ein Verfahren mit nachstehenden Verfahrensschritten:

• - das Abtrennen und Schütteln des Gemisches sowie die Bestimmung der Agglutination erfolgt in wenigstens einem Trennrohr einer Zentrifuge;
• - hierbei wird das Trennrohr in vorgegebener Richtung - vorzugsweise senkrecht zur Rohrlängsachse bzw. pa­ rallel zur Rotationsachse des Zentrifugen-Rotors - durchleuchtet und die optische Dichte des Reaktions­ gemisches fortlaufend bestimmt;
• - sofern sich die ermittelten Werte der optischen Dichte ändern, werden die Meßwerte dahingehend ausgewertet, ob an einer Meßwertkurve, welche die Durchlässigkeit (%) in Abhängigkeit von der Zeit wiedergibt, ein Wendepunkt auftritt;
• - sofern ein Wendepunkt auftritt, wird eine Referenz­ kurve gebildet, welche diesen Wendepunkt geradlinig mit dem Ursprung der Meßwertkurve verbindet;
• - es wird der Meßwert mit der größten Abweichung von dieser Referenzkurve bestimmt; und
• - sofern diese Abweichung mehr als 3% Durchlässigkeit beträgt, wird dies als Abwesenheit von Agglutination gewertet.

Dieses erfindungsgemäße Verfahren beruht auf nachstehenden Beobachtungen und Erwägungen.

Im Verlauf einer Vielzahl von Untersuchungen wurde festge­ stellt, daß das beste Verfahren zur Bestimmung der Aggluti­ nation die zentrifugale Photosedimentation ist. Jedoch be­ nötigen die bekannten Instrumente und Vorrichtungen ein großes Probenvolumen. Die Übertragung dieser Anwendung auf die Serologie würde einen ganz erheblichen Verbrauch an Testmaterialien erfordern, welche etwa dem Zehnfachen der üblicherweise eingesetzten Mengen entspricht. Im Verlauf der von den Erfindern durchgeführten Untersuchungen ist festge­ stellt worden, daß mit der üblicherweise eingesetzten Pro­ benmenge auch die Bestimmung der Agglutination mit Hilfe der Photosedimentation durchgeführt werden kann; in der Tat ist es möglich, auf diesem Wege auch lediglich eine kleine bzw. geringfügige Agglutination sicher festzustellen. Obwohl die bekannten Bedingungen der Photosedimentation angewandt wur­ den, ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung festgestellt worden, daß die erhaltenen Sedimentationskurven eine Beson­ derheit aufweisen, die es erlaubt, sowohl eine leichte Agglutination wie eine Abwesenheit von Agglutination von der üblichen Agglutination sicher zu unterscheiden. Nach Auswer­ tung einer erheblichen Anzahl von Blutproben konnte festge­ stellt werden, daß deren Sedimentationskurven einen ausge­ prägten Wendepunkt aufweisen, wenn die Probe keine Agglome­ rate enthält, das heißt, wenn die Probe lediglich einzelne, individuelle Erythrozyten enthält. Im Verlauf dieser Unter­ suchungen sind die Sedimentationskurven als Abhängigkeit der Durchlässigkeit (%) von der Zeit aufgestellt worden. Das Vorhandensein von Agglutination kann anhand des Unterschie­ des zwischen der tatsächlich gemessenen Sedimentationskurve und einer Referenzkurve ermittelt werden. Diese Referenz­ kurve verbindet in Form einer geraden Linie den Ursprung der Sedimentationskurve mit dem Wendepunkt der Sedimentations­ kurve. Es wird daraufhin der Meßwert mit der größten Abwei­ chung von dieser Referenzkurve ermittelt. Sofern diese Ab­ weichung mehr als 3% Durchlässigkeit beträgt, wird dies als Anzeichen für eine Abwesenheit von Agglutination gewertet.

Aufgrund dieser Untersuchungen und Ergebnisse ist das er­ findungsgemäße Verfahren entwickelt worden.

Dieses erfindungsgemäße Verfahren betrifft ein Verfahren zur automatisierten Durchführung und Auswertung von Agglutina­ tionsreaktionen, insbesondere zur Bestimmung leichter Agglu­ tination, wobei ein aus Suspension und Serum bestehendes Reaktionsgemisch bereitgestellt wird. Das inkubierte Gemisch wird abgetrennt, geschüttelt und das Ausmaß der Agglutina­ tion mit Hilfe der Photosedimentation bestimmt. Ein wesent­ licher Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß dieses Abtrennen und Schütteln der Mischung, so­ wie die Bestimmung der Agglutination in wenigstens einem Trennrohr in der Weise durchgeführt wird, daß das Trennrohr in einer vorgegebenen Richtung - vorzugsweise senkrecht zur Rohrlängsachse und parallel zur Rotationsachse des Zentri­ fugen-Rotors - durchleuchtet wird, und die optische Dichte des Gemisches fortlaufend gemessen wird. Sofern sich diese optische Dichte ändert, werden deren Meßwerte dahin ausge­ wertet, ob an der zugrunde liegenden Funktion bzw. an einer Meßwertkurve, welche die Durchlässigkeit (%) in Abhängigkeit von der Zeit wiedergibt, ein Wendepunkt auftritt. Sofern ein solcher Wendepunkt auftritt, wird eine Referenzkurve ge­ bildet; bei dieser Referenzkurve handelt es sich um eine gerade Linie, welche den Wendepunkt mit dem Ursprung der Meßwertkurve/Funktion verbindet. Es wird daraufhin der Meß­ wert/Funktionswert mit der größten Abweichung von der Refe­ renzkurve ermittelt. Sofern diese Abweichung wenigstens 3% Durchlässigkeit beträgt, wird daraus auf die Abwesenheit von Agglutination geschlossen.

Diese größte Abweichung kann als Δ Tmax bezeichnet werden. Sofern die Beziehung

0 < Δ Tmax < 2% Durchlässigkeit

erfüllt ist, stellt dies ein Anzeichen für eine leichte Agglutination dar.

Vorzugsweise ist vorgesehen, das Ausmaß der Agglutination aus dem anfänglichen Anstieg der Meßwertkurve/Funktion zu bestimmen, der anzeigt, ob ein Wendepunkt vorliegt oder nicht.

Sofern sich die optische Dichte des Reaktionsgemisches nicht ändert, sondern konstant bleibt, wird dies als Anzeichen für eine sehr hohe Agglutination gewertet; dies entspricht einer Durchlässigkeit von etwa 95% mit Fehlerabweichungen nach oben oder nach unten.

Wie bereits gesagt, wird die erfindungsgemäße, automatisier­ te Durchführung und Auswertung von Agglutinationsreaktionen in einem Trennrohr durchgeführt. Die Durchführung in einem Trennrohr setzt weitere überraschende Beobachtungen und Er­ fahrungen voraus, die einen weiteren Bestandteil der vorlie­ genden Erfindung bilden. Zur Vermeidung von Verlusten beim Abdekantieren wird ein besonders ausgebildetes Trennrohr verwendet. Das erfindungsgemäß vorgesehene Trennrohr ist in Form von zwei, miteinander verbundenen, kommunizierenden Gefäßen ausgebildet. Das erfindungsgemäß vorgesehene Trenn­ rohr weist zwei Rohrabschnitte auf, die über einen Verbin­ dungsabschnitt miteinander verbunden sind. Das eine Trenn­ rohr ist an seinem Ende verschlossen. Das geschlossene Trennrohr wird mit Waschflüssigkeit derart gefüllt, daß der Waschflüssigkeit-Meniskus den oberen Wandabschnitt des hori­ zontalen Verbindungsabschnittes berührt. Das Abdekantieren wird in der Weise durchgeführt, daß während des Absaugens von Waschflüssigkeit der Waschflüssigkeits-Meniskus un­ unterbrochen längs der Wand des geschlossenen Rohrabschnit­ tes entlangwandert.

Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung be­ trifft daher ein Verfahren zur automatisierten Durchführung und Auswertung von Agglutinationsreaktionen, insbesondere zur Bestimmung von leichter Agglutination, wobei ein aus Suspension und Serum bestehendes Reaktionsgemisch bereit­ gestellt wird. Das inkubierte Gemisch wird gewaschen, wo­ bei die Zuführung, die Abtrennung und das Abdekantieren der Waschflüssigkeit mit Hilfe eines Saugrohres erfolgt; alter­ nativ kann das Abdekantieren der Waschflüssigkeit nach der Zuführung eines Reagenzes erfolgen. Dem Gemisch wird wenig­ stens ein Reagenz zugesetzt; danach wird abgetrennt und ge­ schüttelt und daraufhin das Ausmaß der Agglutination mit Hilfe der Photosedimentation bestimmt. Nach einem weiteren wichtigen Gesichtspunkt der Erfindung werden diese Behand­ lungsschritte in einem Trennrohr ausgeführt, das zwei kommunizierende Gefäße in Form von wenigstens zwei Rohr­ abschnitten aufweist, die über einen Verbindungsabschnitt miteinander verbunden sind. Einer dieser Rohrabschnitte ist an einem Ende verschlossen, und dieser geschlossene Rohr­ abschnitt wird mit Waschflüssigkeit derart gefüllt, daß der Waschflüssigkeits-Meniskus den oberen Wandabschnitt des horizontalen Verbindungsabschnittes berührt. Das Abdekan­ tieren von Waschflüssigkeit erfolgt durch Absaugen derart, daß der Waschflüssigkeits-Meniskus ununterbrochen längs der Wand des geschlossenen Rohrabschnittes wandert. Die Bestim­ mung der Agglutination wird in diesem Trennrohr durchge­ führt, wobei das vorzugsweise senkrecht zur Rotationsachse des Zentrifugen-Rotors angeordnete Trennrohr in vorgegebener Richtung - vorzugsweise senkrecht zur Rohrabschnitt-Längs­ achse - durchleuchtet und die optische Dichte des Reaktions­ gemisches fortlaufend bestimmt wird. Sofern sich die ermit­ telten Werte der optischen Dichte ändern, werden die Meß­ werte dahingehend ausgewertet, ob an einer Meßwertkurve bzw. Funktion, welche die Durchlässigkeit (%) in Abhängigkeit von der Zeit wiedergibt, ein Wendepunkt auftritt. Sofern ein Wendepunkt auftritt, wird eine Referenzkurve gebildet, wel­ che diesen Wendepunkt geradlinig mit dem Ursprung der Meß­ wertkurve bzw. Funktion verbindet. Es wird der Meßwert mit der größten Abweichung von dieser Referenzkurve bestimmt. Sofern diese Abweichung mehr als 3% Durchlässigkeit be­ trägt, wird diese als Abwesenheit von Agglutination gewer­ tet.

Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung be­ trifft die Vorrichtung zur automatisierten Durchführung und Auswertung von Agglutinationsreaktionen, insbesondere zur Bestimmung einer leichten Agglutination. Zu dieser Vorrich­ tung gehört ein Zentrifugen-Rotor, der mit Trennrohren be­ stückt ist, und dessen Antriebsmotor mit einer Steuerein­ richtung versehen ist. Längs einer Seite wenigstens eines Trennrohres ist eine Lichtquelle angeordnet, und auf der anderen Seite dieses Trennrohres befindet sich ein Photo­ meter. Bei der Steuereinrichtung handelt es sich um eine Datenverarbeitungseinrichtung, die mit einer Anzeige (Dis­ play) versehen ist, und die wirksam mit dem Photometer ver­ bunden ist. Das Trennrohr weist zwei kommunizierende Ge­ fäße in Form von wenigstens zwei Rohrabschnitten auf, die über einen angenähert horizontal ausgerichteten Verbindungs­ abschnitt miteinander verbunden sind, wobei ein Rohrab­ schnitt an einem Ende verschlossen ist. Die Trennrohre wer­ den in radial ausgerichteten Aussparungen angeordnet, die benachbart zur Umfangswand des Rotors ausgebildet sind. Im einzelnen erfolgt die Anordnung der Trennrohre derart, daß bei stillstehendem Rotor der horizontal ausgerichtete Ver­ bindungsabschnitt der Trennrohre angenähert senkrecht zur Rotorachse ausgerichtet ist. Die Trennrohre sind in ihrer jeweiligen Aussparung verschieblich gehalten, und es ist eine oberhalb der Aussparungen angeordnete Halteeinrich­ tung vorhanden, welche die Verschiebungsbewegung der Trenn­ rohre begrenzt.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Trennrohren um gekrümmte Rohre, die vorzugsweise aus Glas bestehen, und transparente Wände aufweisen. Die beiden Rohrabschnitte verlaufen unter einem Winkel von etwa 90 bis 150° zueinander; vorzugsweise beträgt der von den beiden Rohrabschnitten eingeschlossene Winkel etwa 125 bis 135°.

Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Vorrichtung mit einer Zuführeinrichtung für Waschflüssigkeit und/oder für wenig­ stens ein Reagenz ausgerüstet. Diese Zuführeinrichtung(en) ist/sind ebenfalls an die Steuereinrichtung angeschlossen.

Nach einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfin­ dung kann die Vorrichtung vorzugsweise mit Saugrohren aus­ gerüstet sein, die oberhalb eines Teiles der Trennrohre oder oberhalb sämtlicher Trennrohre angeordnet sind; zusätzlich ist ein Eintauchmechanismus vorhanden, welcher das Saugrohr oder die Saugrohre in das zugeordnete Trennrohr eintaucht.

Nachstehend wird die Erfindung mehr im einzelnen anhand be­ vorzugter Ausführungsformen mit Bezugnahme auf die Zeich­ nungen erläutert; die letzteren zeigen:

Fig. 1 bis 3 anhand graphischer Darstellungen Sedi­ mentationskurven mit der Durchlässigkeit (%) längs der Ordinate in Abhängigkeit von der Zeit (längs der Abszisse) für verschieden stark agglutinierte Proben;

Fig. 4 anhand einer schematischen Darstellung die wesentlichen Bestandteile einer erfindungs­ gemäßen Vorrichtung;

Fig. 5 eine bevorzugte Anordnung eines Trennrohres innerhalb des Rotors; und

Fig. 6 eine bevorzugte Ausführungsform eines Trenn­ rohres und das Füllen dieses Trennrohres mit Waschflüssigkeit.

Die Figuren dienen zur Erläuterung der Erfindung ohne diese einzuschränken.

Fig. 4 zeigt schematisch eine Ausführungsform einer erfin­ dungsgemäßen Vorrichtung, wobei zwei Trennrohre 2 in einem Zentrifugen-Rotor 1 angeordnet sind, der einen Motor 3 auf­ weist, der seinerseits mit einer Steuereinrichtung 4 ausge­ rüstet ist. Längs der einen Seitenwand eines Trennrohres 2 ist eine Lichtquelle angeordnet, und längs der anderen Sei­ tenwand dieses Trennrohres 2 ist ein Photometer 6 angeord­ net, so daß dieses Trennrohr 2 im wesentlichen senkrecht zu seiner Längsachse durchleuchtet werden kann. Bei der Steuer­ einrichtung 4 handelt es sich um eine Datenverarbeitungsan­ lage, die ein mit einer Anzeige (Display) ausgerüstet ist. Das Photometer 6 ist wirksam an diese Steuereinrichtung 4 angeschlossen. Das Trennrohr 2 weist zwei kommunizierende Gefäße in Form von wenigstens zwei Rohrabschnitten A und B auf, die über einen angenähert horizontal ausgerichteten Verbindungsabschnitt C miteinander verbunden sind; ver­ gleiche Fig. 6. Der Rohrabschnitt A ist an einem Ende ver­ schlossen.

Wie weiterhin aus Fig. 4 ersichtlich ist, weist die erfin­ dungsgemäße Vorrichtung vorzugsweise eine Zuführeinrichtung 8 für Waschflüssigkeit und/oder eine Zuführeinrichtung 9 für wenigstens ein Reagenz auf. Beide Zuführeinrichtungen 8 und 9 sind wirksam mit der Steuereinrichtung 4 verknüpft. Bei der Zuführeinrichtung 8 für Waschflüssigkeit und/oder bei der Zuführeinrichtung 9 für ein Reagenz kann es sich um be­ kannte Einrichtungen handeln, beispielsweise um Pumpen; vor­ zugsweise sind peristaltische Mehrkanal-Pumpen vorgesehen, deren konstruktive Einzelheiten nicht Gegenstand der vor­ liegenden Erfindung sind.

Der Fig. 4 kann weiterhin entnommen werden, daß bei einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrich­ tung Saugrohre 10 vorhanden sind, die über wenigstens einem Trennrohr 2 angeordnet sind; alternativ können derartige Saugrohre über einem Teil der Trennrohre 2 oder oberhalb sämtlicher Trennrohre 2 angeordnet sein. Die Vorrichtung ist zusätzlich mit einem Eintauchmechanismus ausgerüstet, mit welchem ein Saugrohr 10 in das zugeordnete Trennrohr 2 ein­ geführt werden kann, bis es in die darin enthaltene Flüssig­ keit eintaucht. Auch dieser Eintauchmechanismus 11 ist wirk­ sam an die Steuereinrichtung 4 angeschlossen und kann von dieser gesteuert werden.

Wie aus Fig. 5 ersichtlich, ist das Trennrohr 2 in einer radial ausgerichteten Aussparung 12 angeordnet, die am Um­ fang des Zentrifugen-Rotors 1 ausgebildet ist. Im einzel­ nen ist eine derartige Anordnung vorgesehene, daß bei still­ stehendem Zentrifugen-Rotor 1 der horizontale Verbindungs­ abschnitt C des Trennrohres 2 senkrecht zur Rotationsachse des Zentrifugen-Rotors 1 ausgerichtet ist. Das Trennrohr 2 ist in der Aussparung 12 verschieblich gehalten, und ober­ halb der Aussparung 12 befindet sich eine Halterung 13, wel­ che eine Verschiebungsbewegung des Trennrohres 2 begrenzt. Sobald der Zentrifugen-Rotor 1 in Drehung versetzt wird, verschiebt sich das Trennrohr 2 aus der anfänglichen Posi­ tion und nimmt die in Fig. 5 mit gestrichelten Linien ange­ deuteten Position ein. In dieser Stellung ist der die zu durchleuchtende Probe enthaltende Rohrabschnitt A im wesent­ lichen senkrecht zur Rotationsachse des Zentrifugen-Rotors 1 ausgerichtet. Die Durchleuchtung dieses Rohrabschnittes A erfolgt dann im wesentlichen parallel zu dieser Rotations­ achse. In dieser Stellung wird eine weitere Verschiebung des Trennrohres 2 durch die Halterung 13 verhindert.

Vorzugsweise bestehen die Trennrohre 2 aus gekrümmten Roh­ ren, die vorzugsweise aus Glas bestehen, und transparente Wände aufweisen. Die beiden Rohrabschnitte A und B schlie­ ßen vorzugsweise einen Winkel zwischen etwa 90 und 150° ein; besonders bevorzugt schließen diese Rohrabschnitte A und B einen Winkel zwischen etwa 125 und 135° ein, wie das in Fig. 6 dargestellt ist.

Nachstehend wird die Arbeitsweise der erfindungsgemäßen Vor­ richtung im einzelnen beschrieben.

Vorzugsweise wird außerhalb der Vorrichtung ein aus Suspen­ sion und Serum bestehendes Reaktionsgemisch in die Trenn­ rohre 2 eingefüllt; daraufhin wird eine Inkubation durchge­ führt, soweit diese notwendig ist. Nachdem die Trennrohre 2 das Reaktionsgemisch in geeigneter Form enthalten, werden sie in je einer Aussparung 12 des Zentrifugen-Rotors 1 ange­ ordnet. Sofern das erforderlich ist, wird das in den Trenn­ rohren 2 befindliche Reaktionsgemisch gewaschen, oder - nachdem ein Reagenz zugeführt worden ist - beispielsweise zur Durchführung eines Polypren-Testes wird überschüssige Flüssigkeit abdekantiert. Diese Tätigkeiten können von Hand ausgeführt werden. Alternativ können diese Tätigkeiten mit Hilfe der Zuführeinrichtung 8 für Waschflüssigkeit, der Zu­ führeinrichtung 9 für ein Reagenz, und mit Hilfe der Saug­ rohre 10 durchgeführt werden, die von dem Eintauchmechanis­ mus 11 geführt werden. Alle diese Tätigkeiten werden mit Hilfe der Steuereinrichtung 4 gesteuert.

Sofern das Waschen des Reaktionsgemisches innerhalb der er­ findungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt wird, wird der ge­ schlossene Rohrabschnitt A des Trennrohres 2 ohne Blasen­ bildung derart mit Waschflüssigkeit gefüllt, daß der Wasch­ flüssigkeits-Meniskus den oberen Wandabschnitt des ange­ nähert horizontal ausgerichteten Verbindungsabschnittes C berührt. Sofern beim Einfüllen von Waschflüssigkeit diese Bedingung nicht eingehalten wird, kann im Verlauf des Ab­ dekantierens von Flüssigkeit ein Verlust an abgeschiedenen Teilchen auftreten. In einem solchen Falle bilden sich am geschlossenen Ende des Rohrabschnittes A Blasen, während der Flüssigkeits-Meniskus 14 auf dieses geschlossene Ende zu­ wandert. Diese Blasenbildung stört das Sediment, bevor Flüs­ sigkeit abdekantiert wird.

Wird andererseits so viel Flüssigkeit eingefüllt, daß der Flüssigkeits-Meniskus 14 über den Verbindungsabschnitt C hinaus in den Rohrabschnitt B hineinwandert, dann wird ein Teil der Partikel an der Wand des Rohrabschnittes B abge­ schieden, und bei der nachfolgenden Durchführung von Wasch­ vorgängen oder Abdekantierung von Flüssigkeit werden diese Partikel mit entfernt, so daß zu starke Partikelverluste auftreten.

Nachdem eine Trennung von Reaktionsgemisch und überstehender Flüssigkeit erfolgt ist, ist es sehr wichtig, die Abdekan­ tierung dieser überstehenden Flüssigkeit in der Weise durch­ zuführen, daß der Flüssigkeits-Meniskus 14 ununterbrochen längs der Wand des geschlossenen Rohrabschnittes A wandert.

Sofern diese erfindungsgemäß vorgesehenen Bedingungen einge­ halten werden, kann mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung eine Abdekantierung mit hoher Volumenausbeute durchgeführt werden. Erfolgt andererseits das Absaugen von Flüssigkeit zu langsam, so können sich Blasen bilden, die das geschlossene Ende des Rohrabschnittes A erreichen. Jeglicher Kontakt zwischen dem abgeschiedenen Material mit einer Flüssigkeits/ Luft-Grenzfläche ist jedoch unerwünscht, weil die abgeschie­ denen Teilchen wie etwa Erythrozyten gestört werden. Das Ab­ dekantieren von Flüssigkeit soll mit einem solchen Volumen­ durchsatz durchgeführt werden, daß eine Bildung von Blasen vermieden wird; das heißt, ein Abreißen oder Unterbrechen des Flüssigkeits-Meniskus 14 soll verhindert werden.

Nach Durchführung dieser Arbeitsschritte kann mit der erfin­ dungsgemäßen Vorrichtung - soweit dies erwünscht ist - das Reaktionsgemisch geschüttelt werden; daraufhin kann gegebe­ nenfalls zusätzliches Reagenz zugesetzt werden. Daraufhin wird das Ausmaß der Agglutination mit Hilfe der Photosedi­ mentation bestimmt.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung ohne diese einzuschränken.

Beispiel 1:

Zur Durchführung einer Agglutinationsreaktion werden ein Tropfen 3%-ige Erythrozyten-Suspension und zwei Tropfen Serum verwendet. Nach Durchführung der verschiedenen Ar­ beitsschritte, wie sie anhand der Erläuterung der erfin­ dungsgemäßen Vorrichtung beschrieben worden sind, wurden durch Auswertung der Signale am Photometer 6 die in Fig. 1 dargestellten Meßwerte erhalten. Die Fig. 1 zeigt die Durchlässigkeit der Probe in Prozent gegen die Zeit in Se­ kunden, wobei die Zeit mit "t" und die Durchlässigkeit (%) mit "T" bezeichnet ist. Es ist gut zu erkennen, daß die Meßkurve einen ausgeprägten Wendepunkt etwa bei t = 25 s aufweist. Es wird eine Referenzkurve gebildet, welche diesen Wendepunkt mit dem Ursprung der Meßwertkurve in einer ge­ raden Linie verbindet; diese Referenzkurve ist in Fig. 1 ge­ strichelt dargestellt. Daraufhin wird der Meßwert bestimmt, welcher die größte Abweichung zu dieser Referenzkurve auf­ weist; aus der Fig. 1 ist ersichtlich, daß diese Abweichung etwa 20% Durchlässigkeit (T) beträgt. Dieser Wert ist deut­ lich größer als der erfindungsgemäß vorgesehene Wert von 3% Durchlässigkeit. Daher wird geschlossen, daß in dieser Probe keine Agglutination vorliegt.

Beispiel 2:

Mit einem anderen Reaktionsgemisch, das analog zu Beispiel 1 erhalten und ausgewertet worden ist, wird die in Fig. 2 wie­ dergegebene Sedimentationskurve erhalten. Bei dieser Meß­ wertkurve liegt der Wendepunkt nahe t = 20 s. Die größte Ab­ weichung zwischen einem Meßwert und der Referenzkurve be­ trägt nicht mehr als 2% Durchlässigkeit. Daher wird ge­ schlossen, daß in dieser Probe eine leichte Agglutination vorliegt.

Beispiel 3:

Unter den bereits in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen wird ein drittes Reaktionsgemisch zubereitet und ausgewertet; hierbei wird die in Fig. 3 wiedergegebene Meßwertkurve er­ halten. Ersichtlich weist diese Sedimentationskurve keinen Wendepunkt auf. Daraus wird geschlossen, daß in dieser Kurve starke Agglutination vorliegt.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung der obigen Beispiele weist einen Separator 1 auf mit einem Durchmesser von 140 mm. In diesem Separator 1 befinden sich Trennrohre 2 mit einem Innendurchmesser von 8 mm. Das schließlich zur Messung benutzte Probenvolumen betrug 400 µl. Der Abstand des Lichtpfades zwischen der Oberfläche des Reaktionsge­ misches und dem Photometer 6 betrug 3 mm. Die Umdrehungs­ geschwindigkeit des Separators betrug 240 U/min.

Die oben wiedergegebenen Meßergebnisse wurden auch durch mikroskopische Untersuchungen bestätigt.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und mit der erfindungs­ gemäßen Vorrichtung ist es möglich, automatisiert eine leichte Agglutination in dem Trennrohr 2 festzustellen, selbst wenn als Meßgerät nur ein einfaches Photometer 6 verwendet wird. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es möglich, das Reaktionsgemisch zwischen den verschiedenen Be­ handlungsschritten zu waschen. Weil auch diese Waschvorgänge im gleichen Trennrohr 2 erfolgen, kann ein möglicher Verlust an abgeschiedenen Teilchen, insbesondere Erythrozyten mit­ tels des Photometers 6 im Laufe der Untersuchung überwacht und festgestellt werden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung schützt die Untersuchungsperson vor einer Infektion und vermeidet eine Verunreinigung der Innenwände und Bestand­ teile des Separators. Das erfindungsgemäße Verfahren ist für eine Standardisierung der Agglutinationsreaktionen geeignet.

Claims (9)

1. Verfahren zur automatisierten Durchführung und Auswer­ tung von Agglutinationsreaktionen, insbesondere zur Be­ stimmung leichter Agglutination,
wobei ein aus Suspension und Serum bestehendes Reak­ tionsgemisch bereitgestellt wird,
das inkubierte Gemisch abgetrennt und geschüttelt wird, und das Ausmaß der Agglutination mit Hilfe der Photo­ sedimentation bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß
das Abtrennen und Schütteln des Gemisches sowie die Be­ stimmung der Agglutination in wenigstens einem Trennrohr einer Zentrifuge durchgeführt wird,
wobei das Trennrohr in vorgegebener Richtung - vorzugs­ weise senkrecht zur Rohrlängsachse - durchleuchtet und die optische Dichte des Reaktionsgemisches fortlaufend bestimmt wird;
sofern sich die ermittelten Werte der optischen Dichte ändern, werden die Meßwerte dahingehend ausgewertet, ob an einer Meßwertkurve, welche die Durchlässigkeit (%) in Abhängigkeit von der Zeit wiedergibt, ein Wendepunkt auftritt;
sofern ein Wendepunkt auftritt, wird eine Referenzkurve gebildet, welche diesen Wendepunkt geradlinig mit dem Ursprung der Meßwertkurve verbindet;
es wird der Meßwert mit der größten Abweichung von die­ ser Referenzkurve bestimmt; und
sofern diese Abweichung mehr als 3% Durchlässigkeit be­ trägt, wird dies als Abwesenheit von Agglutination ge­ wertet.

2. Verfahren zur automatisierten Durchführung und Auswer­ tung von Agglutinationsreaktionen, insbesondere zur Be­ stimmung leichter Agglutination,
wobei ein aus Suspension und Serum bestehendes Reak­ tionsgemisch bereitgestellt wird, das inkubierte Gemisch gewaschen wird, wobei die Zuführung, die Trennung und das Abdekantieren der Waschflüssigkeit vorzugsweise mit Hilfe eines Saugrohres erfolgt - alternativ kann die Waschflüssigkeit nach Zuführung eines Reagenzes abdekan­ tiert werden -,
es wird wenigstens ein Reagenz zugeführt, geschüttelt und daraufhin das Ausmaß der Agglutination mit Hilfe der Photosedimentation bestimmt, dadurch gekennzeichnet, daß
die Behandlung des Gemisches in wenigstens einem Trenn­ rohr einer Zentrifuge durchgeführt wird, das zwei kommu­ nizierende Gefäße in Form von wenigstens zwei Rohrab­ schnitten aufweist, die über einen im wesentlichen hori­ zontal angeordneten Verbindungsabschnitt miteinander verbunden sind, wobei ein Rohrabschnitt an einem Ende geschlossen ist;
dieser geschlossene Rohrabschnitt mit Waschflüssigkeit derart gefüllt wird, daß der Waschflüssigkeit-Meniskus den oberen Wandabschnitt des horizontalen Verbindungs­ abschnittes berührt,
das Abdekantieren von Flüssigkeit derart durchgeführt wird, daß der Waschflüssigkeits-Meniskus ununterbrochen längs der Wand des geschlossenen Rohrabschnittes wan­ dert, und
die Bestimmung der Agglutination in diesem Trennrohr durchführt wird, wobei das Trennrohr in vorgegebener Richtung - vorzugsweise senkrecht zur Rohrabschnitt­ längsachse - durchleuchtet und die optische Dichte des Reaktionsgemisches fortlaufend bestimmt wird,
sofern sich die ermittelten Werte der optischen Dichte ändern, werden die Meßwerte dahingehend ausgewertet, ob an einer Meßwertkurve, welche die Durchlässigkeit (%) in Abhängigkeit von der Zeit wiedergibt, ein Wendepunkt auftritt;
sofern ein Wendepunkt auftritt, wird eine Referenzkurve gebildet, welche diesen Wendepunkt geradlinig mit dem Ursprung der Meßwertkurve verbindet;
es wird der Meßwert mit der größten Abweichung von dieser Referenzkurve bestimmt; und
sofern diese Abweichung mehr als 3% Durchlässigkeit be­ trägt, wird dies als Abwesenheit von Agglutination ge­ wertet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sofern die größte Abweichung zwischen Referenzkurve und Meßwert Δ T max der nachstehenden Bedingung genügt 0 < Δ Tmax < 2% Durchlässigkeitwird dies als Anzeichen für eine leichte Agglutination gewertet.

4. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausmaß der Agglutination aus der anfänglichen Stei­ gung der Meßwertkurve bzw. der Funktion bestimmt wird, sofern kein Wendepunkt auftritt.

5. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sofern sich die optische Dichte des Reaktionsgemisches nicht ändert, sondern konstant bleibt, wird dies als Anzeichen für eine sehr hohe Agglutination gewertet, in der Größenordnung von 95% Durchlässigkeit mit Fehler­ abweichungen nach oben und unten.

6. Vorrichtung zur automatisierten Durchführung und Auswer­ tung von Agglutinationsreaktionen, insbesondere zur Be­ stimmung leichter Agglutination,
mit einem Zentrifugen-Rotor, der mit Hilfe einer Steuer­ einrichtung steuerbar ist,
ferner mit in diesem Rotor angeordneten Trennrohren, wo­ bei sich auf einer Seite wenigstens eines Trennrohres eine Lichtquelle befindet, und auf der anderen Seite des Trennrohres ein Photometer angeordnet ist, das die durch das Trennrohr hindurchgetretene Strahlung erfaßt,
wobei das Photometer an die Steuereinrichtung ange­ schlossen ist, die eine Datenverarbeitungseinrichtung mit einer Anzeige aufweist,
dadurch gekennzeichnet, daß
das Trennrohr (2) zwei kommunizierende Gefäße in Form von wenigstens zwei Rohrabschnitten (A, B) aufweist, die über einen im wesentlichen horizontal angeordneten Ver­ bindungsabschnitt (C) miteinander verbunden sind, wobei ein Rohrabschnitt (A) an einem Ende geschlossen ist;
dieses Trennrohr (2) in einer radialen Aussparung (12) am Umfang des Zentrifugen-Rotors (1) in der Weise ge­ halten ist, daß bei stillstehendem Zentrifugen-Rotor (1) der horizontale Verbindungsabschnitt (C) des Trenn­ rohres (2) angenähert senkrecht zur Rotationsachse des Zentrifugen-Rotors (1) ausgerichtet ist;
das Trennrohr (2) in seiner Aussparung (12) verschieb­ lich gehalten ist; und
eine oberhalb der Aussparung (12) angeordnete Halterung (13) die Verschiebungsbewegung des Trennrohres (2) be­ grenzt.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Trennrohr (2) ein gekrümmtes Rohr ist, das vorzugs­ weise aus Glas besteht und transparente Wände aufweist, wobei die beiden Rohrabschnitte (A, B) miteinander einen Winkel von 90 bis 150°, vorzugsweise einen Winkel von 125 bis 135° einschließen.

8. Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß Zuführeinrichtungen (8) für Waschflüssigkeit und/oder Zuführeinrichtungen (9) für ein Reagenz vorhanden sind, und diese Zuführeinrichtungen (8, 9) wirksam mit der Steuereinrichtung (4) verknüpft sind.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß
zusätzlich Saugrohre (10) vorhanden sind, die oberhalb eines Teiles oder oberhalb sämtlicher Trennrohre (2) an­ geordnet sind;
ferner wenigstens ein, wirksam mit der Steuereinrichtung (4) verbundener Eintauchmechanismus (11) vorhanden ist, welcher ein Saugrohr (10) in ein Trennrohr (2) einführt und in die darin befindliche Flüssigkeit eintaucht.