DE3237382C2

DE3237382C2 -

Info

Publication number: DE3237382C2
Application number: DE3237382A
Authority: DE
Inventors: Ei Mochida; Takashi Tokio/Tokyo Jp Kudo; Toshiyuki Urawa Saitama Jp Sugawara; Minoru Tokio/Tokyo Jp Tsumura
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1981-10-08
Filing date: 1982-10-08
Publication date: 1990-02-01
Also published as: BR8205917A; FR2514510A1; FR2514510B1; CH662518A5; US4479720A; SE8207487D0; DE3237382A1; SE432890B; JPH0153423B2; GB2109550A; GB2109550B; JPS5861469A; CA1201113A; NL8300092A; AR230958A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Rotieren von Reaktionsgefäßen in Schrägstellung gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1. Insbe sondere betrifft sie eine Vorrichtung, welche zur effi zienten Umsetzung einer reaktionsfähigen Substanz, die an eine Festphase gebunden ist, und einer reaktionsfähigen Substanz in einer Flüssigphase angepaßt ist.

Bekannt ist eine immunologische Methode, die sich einer Antigen-Antikörper-Reaktion zur quantitativen Bestimmung einer sehr geringen Substanzmenge in Körperflüssigkeiten, oder zur Konzentrationsbestimmung eines verabreichten Me dikamentes im Blut oder Urin in einem Organismus bedient. Es sind mehrere Verfahren bekannt, die auf unterschiedli chen Bestimmungsprinzipien beruhen; diese werden in der Praxis angewendet. Sie umfassen Radioimmunioassay (RIA), Enzym-Immunoassay (EIA) und Fluoreszenz-Immunoassay (FIA); diese werden aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit und ih rer außerordentlichen Effektivität bei der quantitativen Bestimmung in großem Maße angewendet. Bei der Durchführung dieser Assays bedient man sich im allgemeinen der sog. Sandwich-Methode oder der kompetitiven Methode als Assay verfahren. Besonders die Sandwich-Methode hat große An wendung gefunden, da sie einen hohen Grad an analytischer Empfindlichkeit liefert und leicht durchzuführen ist.

Nach der Sandwichmethode wird das zu messende Antigen mit einem insolubilisierten entsprechenden Antikörper (erste Reaktion) umgesetzt, wodurch ein Antigen-Antikör perkomplex gebildet wird. Dieser Komplex wird mit einem Antikörper umgesetzt, der mit einem Markierungsagens markiert und in der Lage ist, mit dem zu bestimmenden Antigen zu binden (markierte Anitkörper) (2. Reaktion). Dann wird der markierte Antikörper in zwei Anteile aufgeteilt, wovon einer eine Bindung mit dem Antigen-Antikörperkomplex eingegangen ist, während der andere nicht gebunden ist, und es wird die Aktivität des Markierungsagens in beiden Anteilen gemessen. Ähnli che Verfahren werden für ein Antigen bei bekannten Konzen trationen wiederholt, um eine Kalibrierungskurve aufzu stellen. Die Menge des zu bestimmenden Antigens wird aus der Kalibrierungskurve erhalten. Das Markierungs agens kann z. B. ein Enzym oder eine radioaktive oder fluoreszierende Substanz darstellen.

Nach der kompetitiven Methode, die für den Radio-Immuno assay zuerst verwendet wurde, wurde die Messung wie folgt durchgeführt:
Wenn das zu bestimmende Antigen und eine gegebene (im voraus bestimmte) Menge des markierten Antigens mit dem insolubilisierten Antikörper, entsprechend dem zu be stimmenden Antigen, umgesetzt werden, binden beide Anti gene kompetitiv mit dem insolubilisierten Antikörper. Im folgenden wird das markierte Antigen in zwei Anteile auf geteilt, wobei der eine mit dem insolubilisierten Anti körper gebunden ist, während der andere nicht gebunden ist, und die Aktivität des Markierungsagens wird in beiden Anteilen bestimmt. Ähnliche Verfahren wiederholt man für ein Antigen bei bekannten Konzentrationen, um eine Kalibrierungskurve aufzustellen. Die Menge des zu bestimmenden Antigens wird aus der Kalibrierungskurve erhalten.

Bei der Durchführung dieser Reaktionen ist es vorteilhaft, die innere Wandoberfläche eines Gefäßes oder Behälters als Träger für eine aktive Substanz, wie z. B. einen Antikörper, zu verwenden, um diese zu insolubilisieren. So wird z. B. häufig ein Kunststoffreagenzglas verwendet, da dieses sowohl als ein Träger zum Insolubilisieren als auch als ein Reaktions gefäß dient, und einfach zu handhaben ist. Die innere Oberfläche eines Reaktionsgefäßes ist jedoch insofern nachteilig, da dessen Oberflächenbereich, an welchen ein Antikörper oder eine andere reaktionsfähige Substanz fixiert wird, kleiner ist als bei anderen Trägern, wie z. B. Kunststoff perlen, Filterpapier oder Cellulosepartikel, und deshalb nur eine kleinere Menge an aktiver Substanz tragen kann. Als Folge davon wird die Reaktionszeit entsprechend der konventionellen Methode länger, bei welcher ein Reagenz glas oder ein anderes Reaktionsgefäß, welches eine insolubilisierte aktive Substanz auf ihrer inneren Wand oberfläche trägt, im aufrechten Zustand und unbewegt ge halten wird oder dessen Inhalt intermittierend gerührt wird.

US-PS 39 80 227 beschreibt eine Analysevorrichtung, die Träger umfaßt, die jeweils mit einer Vielzahl von Mikrobehältern aus gestattet sind, in denen Reaktionen zwischen der Probe und dem Analysereagens durchgeführt werden. Die Träger beinhalten eine Platte und die Mikrobehälter sind in Reihen auf diese Platte gruppiert. Die Platte, die die Mikrobehälter trägt, wird während des Transfers von einer Proben- und Reagensverteilstation zu einer Station mit Reaktionsbeobachtung um ihre Achse mit einer vorbestimmten Geschwindigkeit (0,5 bis 10 Upm) in einer Ebene mit einem Winkel zwischen 75 und 85° in bezug auf die Horizon talstellung rotiert.

US-PS 39 09 201 offenbart eine verstellbare Rotiervorrichtung für das Rühren oder Zentrifugieren von flüssigen Proben, die im Labor verarbeitet oder analysiert werden sollen, und die in kleinen Behältern oder Küvetten vorliegen. Eine Gruppe an Küvet ten ist in Trägern aufbewahrt, die dann um die Peripherie des Rotatorkopfes befestigt sind, der eine kreisförmige Scheibe, die konzentrisch auf einem Schaft befestigt ist, der um seine Achse mittels einer Motorantriebseinheit rotiert, umfaßt. Die Druck schrift umfaßt Mittel zur Einstellung der Motorantriebseinheit in zwei Positionen, in denen der Rotatorkopf horizontal oder nahezu vertikal steht.

DE-OS 21 20 686 umfaßt eine Vorrichtung zum aufeinanderfolgen den Einführen von flüssigen Proben in jedes einer Vielzahl von Gefäßen, die durch Träger gestützt werden, die an der Periphe rie einer kreisförmigen Scheibe befestigt sind, die um ihre senkrechte Achse rotiert. Vorrichtungen zur Rotation der Scheibe mit einer bestimmten Geschwindigkeit, zur Ablenkung der Träger aus ihrer vertikalen Position und zum Zentrifugieren des Inhal tes der Behälter sind miteingeschlossen.

DE-AS 18 01 671 beinhaltet eine Vorrichtung zur Überführung einer Flüssigkeitsprobe aus einem sie enthaltenden Behälter auf ein Probeaufnahmeelement, das senkrecht und linear gegenüber einer zur starren Halterung einer Anzahl von Probenbehältern dienenden drehbaren Tragvorrichtung vorwärts bewegt wird. Die Tragvorrichtung beinhaltet eine durch einen Motor angetriebene Scheibe.

DE-AS 21 43 664 beschreibt schließlich eine Telleranordnung mit einem drehbaren Zentrifugenteller, der mehrere Probenbehälter schwenkbar haltern kann. Die Platte mit den zu zentrifugierenden Proben ist als eine innere Platte in die äußere Zentrifugen platte eingelassen und beide Platten sind rotierbar.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Vorrichtung zum Rotieren von Reaktionsgefäßen in Schrägstellung bzw. in geneigter Lage zur Verfügung zu stellen, wobei die Vor richtung in effizienter Weise dazu geeignet ist, eine Reak tion zwischen einer aktiven Substanz, die an einer Fest phase fixiert ist, und einer aktiven Substanz in einer Flüssigphase zu bewirken.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß bei einer Vorrichtung gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 gekennzeichnet durch Einrichtungen zum Rotieren der Reaktionsgefäßhalter um deren Achsen bei einer vor gegebenen Geschwindigkeit gelöst.

Um eine Bestimmung eines Antigens oder Antikörpers in einer Flüssigphase durch einen Antikörper oder Antigen oder einen Komplex derselben, welche an eine Festphase fixiert sind, durchzuführen, wird die Rotationsgeschwin digkeit der Reaktionsgefäßhalter vorzugsweise auf 10 bis 100 Upm, insbesondere bevorzugt auf 25 bis 55 Upm, einge stellt; und der Neigungswinkel der Reaktionsgefäßhalter wird vorzugsweise auf unterhalb 45°, insbesondere bevor zugt auf 10° bis 20°, in bezug auf den Horizont, einge stellt.

Die Erfindung wird im folgenden anhand einer in den Figuren dargestellten Ausführungsbeispiels näher erläutert.

Fig. 1 stellt ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung dar;

Fig. 2 ist eine Querschnittsansicht der in Fig. 1 dargestellten Vorrichtung;

Fig. 2A und 2B sind Querschnittsansichten, die die Verbindung zwischen einer Rotations platte und einem Halter nach einer weiteren Ausfüh rungsform gemäß der Erfindung zeigen;

Fig. 3 ist eine teilweise Querschnittsansicht der Vorrichtung, wobei der Querschnitt entlang der Linie I-I in Fig. 2 genommen ist;

Fig. 4 stellt eine Abbildung dar, in welcher die Kalibrie rungskurve, wie sie unter Verwendung der erfindungs gemäßen Vorrichtung erhalten wird, verglichen wird mit einer Kalibrierungskurve, die mit einer konven tionellen Vorrichtung erhalten wurde;

Fig. 5 zeigt ein Diagramm, aus dem hervorgeht, daß es mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung möglich ist, die Reaktionszeit zu verkürzen; und

Fig. 6 zeigt die Darstellung einer Kalibrierungskurve für AFP-Assay im Beispiel 1.

Die Erfinder haben eine ausgedehnte Studie durchgeführt, um die vorstehend genannten Nachteile des konventionellen Verfahrens unter Verwendung eines Reaktionsgefäßes als Träger zur Insolubilisation zu eliminieren. Als Ergebnis dieser Studie haben sie gefunden, daß ein höherer Empfind lichkeitsgrad und eine Verringerung der Reaktionszeit er halten werden kann, wenn das Reaktionsgefäß in einem be stimmten Winkel geneigt ist und mit einer bestimmten Ge schwindigkeit während der Reaktion rotiert wird, statt daß es in aufrechter Stellung und unbewegt gehalten wird oder dessen Inhalt intermittierend gerührt wird. Dies hat zu der vorliegenden Erfindung geführt.

Die vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung zur Ver fügung, welche geeignet ist zur Verwendung bei einer Reak tion, bei welcher ein Reaktionsgefäß in Schrägstellung ro tiert wird. In der folgenden Beschreibung stellt das Reak tionsgefäß ein Reagensglas dar, die Substanz, welche von der Innenwandoberfläche des Reaktionsgefäßes getragen wird, ist ein Antikörper, und die Substanz in der Flüssigphase stellt ein Antigen dar. Diese Kombination wurde lediglich zur Vereinfachung der Beschreibung gewählt und bedeutet nicht, daß die Erfindung auf eine derartige Kombination beschränkt ist.

Substanzen in Körperflüssigkeiten liegen gewöhnlich in sehr geringen Mengen vor, und die Körperflüssigkeiten selbst, die diese Substanzen enthalten, sind häufig nur in geringem Volumen verfügbar. Deshalb wird notwendiger weise von jedem Verfahren zur Bestimmung dieser Substanzen gefordert, daß es bei einer Probe, die nur in einer sehr geringen Menge zur Verfügung steht, einen hohen Grad an analytischer Empfindlichkeit bestitz. Man hat deshalb in der Regel einen Antikörper nur in Bodennähe an die Innen wandoberfläche eines Reagensglases fixiert, z. B. in einem Bereich bis zu einer Höhe von 1 cm vom Boden des Reagens glases.

Im Gegensatz dazu ist es mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens möglich, den Antikörper auf einen größeren Be reich zu fixieren, einschließlich dem oberen Teil eines Reagensglases, da - auch wenn die Probe nur in geringer Menge zur Verfügung steht, diese in weitem Kontakt mit dem Antikörper gebracht werden kann, wenn das Reaktions gefäß in einer geneigten Stellung, wie hier beschrieben, rotiert wird. Darüber hinaus trägt die Rotation des Rea gensglases dazu bei den Inhalt zu verrühren und ermög licht damit eine Messung mit hoher Empfindlichkeit in einer kurzen Zeit.

Tabelle I zeigt die Beziehung zwischen dem Neigungswinkel des Reaktionsgefäßes und der relativen Probenmenge, die erforderlich ist, um den den Antikörper tragenden Teil des Reaktionsgefäßes zu benetzen, wenn der fixierte Bereich des Antikörpers im Gefäß konstant ist. Tabelle II zeigt die Beziehung zwischen dem Neigungswinkel des Reaktions gefäßes und dem Kontaktbereich zwischen der Probe und der Innenoberfläche des Gefäßes für den Fall, daß die Probenmenge konstant ist.

Neigungswinkel
Relatives Volumen der erforderlichen Probe
90° (aufrecht)
1
45°	ca. 1/2
30°	ca. 1/3
20°	ca. 1/5
10°	ca. 1/10

Neigungswinkel
Relative Größe des Kontaktbereiches
90° (aufrecht)
1
45°	ca. 1,5
30°	ca. 2
20°	ca. 3
10°	ca. 4

Im allgemeinen trifft es zu, daß je größer der Kontaktbe reich von zwei Reaktionspartnern ist, um so wirksamer kön nen dieselben umgesetzt werden. Wie deutlich aus Tabelle I hervorgeht, nimmt das erforderliche Probenvolumen zum Be netzen des konstanten Kontaktbereiches mit einer Reduktion des Neigungswinkels des Reaktionsgefäßes in Richtung hori zontaler Lage ab. Demzufolge ist es wünschenswert, das Reaktionsgefäß soweit wie möglich auf horizontale Lage zu neigen, vorausgesetzt, daß die umzusetzende Flüssig keit nicht herausfließt. Selbst wenn die Neigung des Reak tionsgefäßes sehr nahe an die horizontale Lage herankommt, z. B. auf bis zu 5° über der Waagerechten (Horizont), besteht keine Befürchtung, daß die Probe nicht in Kontakt mit dem Boden des Gefäßes kommt, es sei denn, das Proben volumen ist extrem klein. Obwohl keine spezielle obere Be schränkung im Hinblick auf den Neigungswinkel des Reak tionsgefäßes besteht, ist es vorteilhaft, diesen unter 45°, besonders bevorzugt auf 10 bis 20°, zu halten, um Probenvolumen einzusparen und die analytischen Empfindlichkeit zu stei gern.

Es ist auch vorteilhaft, daß geneigte Reaktionsgefäß bei einer Geschwindigkeit von 10 bis 100 Upm, besonders be vorzugt bei 25 bis 55 Upm, zu rotieren. Wenn die Reak tionsgeschwindigkeit 100 Upm übersteigt, so fließt die Probe nicht entlang der Reagensglaswandung, sondern ro tiert mit dem Gefäß, wobei der volle Kontakt der Probe mit dem Antikörper verschlechtert wird. Eine Rotations geschwindigkeit unterhalb 10 Ump führt im Gegensatz dazu zu einer deutlichen Reduzierung des Rühreffektes, der durch Rotation des Gefäßes hervorgerufen wird.

Die Vorrichtung umfaßt eine Platte, vorzugsweise eine kreisförmige Platte (Kreis platte), Mittel zum rotierbaren Tragen der Kreis platte, Einrichtungen zum Rotieren der Kreisplatte bei einer gegebenen (vorherbestimmten) Geschwindigkeit, eine Mehrzahl von rotierbaren Reaktionsgefäßhaltern, die am Randbereich der Kreisplatte vorgesehen sind, Mittel zum Rotieren der Reaktionsgefäßhalter um ihre Achsen bei einer gegebenen Geschwindigkeit, und Einrich tungen zum Fixieren der gesamten Kreisplatte in einer Weise, daß die Reaktionsgefäßhalter in einem gegebenen Winkel zur Horizontalen geneigt werden können. Um die Bestimmung eines Antigens oder Antikörpers in einer Flüs sigphase durch einen Antikörper oder Antigen oder einen Komplex derselben, die an eine Festphase fixiert sind, gut auszuführen, wird die Reaktionsgeschwindigkeit der Reaktionsgefäßhalter auf 10 bis 100 Upm, vorzugsweise 25 bis 55 Upm gesetzt; und der Neigungswinkel der Reak tionsgefäßhalter wird auf unterhalb 45°, vorzugsweise 10 bis 20° in bezug auf die Horizontale eingestellt.

Bezugszeichen 2 bedeutet eine Kreisplatte, die durch die Rotationswelle 8 rotierbar getragen wird. Die Platte 2 ist nicht auf die kreisförmige Gestalt beschränkt. Die Platte kann vielmehr in jeder beliebigen Gestalt ausge führt sein, solange als sie dieselbe Funktion wie die Kreisplatte erfüllt. Im Randbereich der Kreisplatte 2 ist eine Mehrzahl von durchgehenden Öffnungen in vorzugs weise gleichem räumlichen Abstand vorgesehen, in welche Reagensgefäßhalter 1 in rotierbarer Weise ein gepaßt werden. Die gleiche Abstandhaltung der durchgehenden Öffnungen gibt der Vorrichtung eine ausgezeichnete Anwendbarkeit, jedoch ist die Erfindung nicht auf diese Anordnung beschränkt. Der Reaktionsgefäßhalter umfaßt zwei Teile bzw. Bereiche: eine Mehr zahl von schienenartigen vorspringenden Teilen 1-a, die so über der Kreisplatte 2 angeordnet sind, daß sie ein Reaktionsgefäß halten, und einen zylindrischen Teil 1-b, welcher in der durchgehenden Öffnung der Kreisplatte eingesetzt ist. In Fig. 1 beträgt die Anzahl der schienenartigen vorspringenden Teile vier, doch ist jede Anzahl derselben geeignet, solange diese die Reaktions gefäße stabil halten können. Außerdem ist die schienenartige Konfiguration der vorspringenden Teile nicht unverzichtbar. Sie können in Form einer integralen zylindrischen Wand oder dgl. ausgeführt sein, solange sie die Reak tionsgefäße in einer Weise halten, daß die letzteren mit der Rotation der Halter rotieren. In Fig. 1 und 2 wird das Reaktionsgefäß durch die vorspringenden Teile über der Kreisplatte 2 gehalten, doch können die Halter so konstruiert sein, daß das Reaktionsgefäß in dem Hal ter gehalten wird, während ein Teil des Halters unter der Kreisplatte sein kann. Der zylindrische Bereich 1-b umfaßt einen Paßbereich 1-c, welcher den Halter in die Kreisplatte einpaßt; eine Gleitfläche 1-d, an welcher der Halter in bezug auf die durchgehende Öff nung der Kreisplatte 2 rotiert wird; und einen Preß-Kon taktbereich 1-e, der in Kontakt mit einer Rotationsplatte 3 gebracht wird.

Fig. 2A und 2B zeigen die trieblichen Verbindungen zwi schen dem Halter 1 und der Rotationsplatte 3 nach anderen Ausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung. In Fig. 2A ist ein Zahnrad einstückig am Boden des Halters angeformt und greift in eine am Umfang der Kreisplatte 3 vorgesehenen Verzahnung ein. In Fig. 2B ist ein Zahnrad am unteren Teil des Halters 1 aus gebildet, welches in die am Umfang der Kreisplatte 3 vor gesehene Verzahnung eingreift.

Die Rotationsplatte 3 ist an der Rotationswelle 8, welche die Kreisplatte 2 trägt, montiert und wird von dieser rotierbar getragen. Auf einer Seite der Rotationsplatte 3 ist integral ein Zahnrad 4 befestigt, welches mit einem Getriebe 4′ eingreift, welches wiederum über ein Untersetzungsgetriebe 5 mit dem Motor 6 verbunden ist, wodurch die Rotationsbewegung des Motors 6 über die Rotationsplatte 3 auf den Halter 1 übertragen wird. Die Rotationsplatte 3 ist in Kreisform konstruiert. Am Um fang der Rotationsplatte ist in Rotationsrichtung eine Verzahnung angebracht, während ein entsprechendes Zahnrad am Halter gebildet wird, welches mit der Verzahnung an der Rotationsplatte kämmt. An der seitlichen Oberfläche der Rotations platte 3 können zwei ringförmige bandförmige Vorsprünge gebildet werden, wobei in diesem Falle die Rotations platte 3 selbst nicht kreisförmig zu sein braucht. An den Seitenflächen der Halter können entsprechende Nuten ge bildet werden, die mit den Vorsprüngen auf der Rotations platte eingreifen. Die Anzahl von bandförmigen Vorsprüngen auf der Rotationsplatte (Rillen auf dem Halter) ist nicht beschränkt, obwohl diese in Fig. 1 und 2 als zwei angegeben ist. Die bandförmigen Vorsprünge können integral bzw. in einem Stück mit dem Plattenbereich der Rotationsplatte 3 gebil det werden, oder sie können gebildet werden durch Befe stigen von Bändern an der Seitenfläche des Plattenbereiches der Rotationsplatte. Mindestens einer des Kontaktbereiches 1-e und der bandförmigen Vor sprünge wird vorzugsweise aus einem elastischen Material gefertigt, um einen engen Kontakt zwischen den Haltern und der Rotationsplatte zu halten. Die Geschwindigkeit des Halters 1 wird mit Hilfe eines Einstellers 7 so eingestellt, daß die von den Haltern gehaltenen Reaktionsgefäße im Bereich von 10 bis 100 Upm rotieren kön nen. Der Einsteller, welcher so angepaßt ist, daß er die Rotationsgeschwindigkeit des Motors 6 steuert, kann einen konventionellen darstellen. Zum Beispiel kann er einen veränder lichen Widerstand darstellen, der den Stromfluß in den Mo tor 6 steuert.

Die Kreisplatte 2 ist an einem Endbereich des Schaftes 8 befestigt und wird durch einen Motor 12 (getrennt von Mo tor 6) über ein Zahnrad 9 rotiert, welches im Mit telbereich der Welle 8 angebracht ist, wobei ein Zahnrad 9′ mit dem Zahnrad 9 in Eingriff steht, ein Schneckengetriebe 10 mit dem Zahnrad 9′ verbunden ist, und ein Untersetzungsgetriebe 11 mit dem Schneckengetriebe 10 ver bunden ist, wodurch die Reaktionsgefäßhalter konsekutiv in eine Kreisrichtung überführt werden. Der Zeitinter vall, während dessen ein Reaktionsgefäßhalter von einer be stimmten Stelle auf eine Stelle überführt wird, die der benachbarte Halter eingenommen hat, wird mit Hilfe des Ein stellers 13 auf eine willkürliche Zeitdauer eingestellt, z. B. zwischen 0,5 und 5 min.

Das Einstellteil 13, welches die Rotationsgeschwindigkeit der Kreisplatte 2 steuert, kann ein konventionelles dar stellen. Zum Beispiel kann es einen Zeitmesser darstellen, wel cher den Motor 12 steuert. Die Steuerung mit Hilfe der Einstellteile 7 und 13 kann elektrisch oder elektro nisch erfolgen. Selbstverständlich können derartige Ein steller bei der Vorrichtung vom fixierten Zustandstyp weggelassen werden, bei welcher die Rotationsgeschwin digkeiten der Halter 1 und der Kreisplatte 2 im voraus auf konstante Geschwindigkeit fixiert wurden.

Die vorstehenden Teile werden von geeigneten Träger einrichtungen unterstützt, wie einem Gehäuse 15, welches in Fig. 1 bis 3 wiedergegeben ist.

Die vorstehende Vorrichtung wird, wenn sie in Gebrauch ist, durch die Stützplatten 14 getragen. Die Stützplatten 14 sind so konstruiert, daß die Reaktionsgefäße, welche von den Haltern 1 gehalten werden, 0 bis 90° von der Ho rizontalen aufwärts geneigt werden können. Bei der Aus führungsform gemäß den Zeichnungen stellen die Stütz platten 14 die Neigungseinrichtungen dar, aber es können auch einstellbare Einrichtungen verwendet werden, mit welchen man das Reaktionsgefäß in bezug auf die Horizon tale in einem willkürlichen Winkel einstellen kann.

Zum Beispiel können diese Einstelleinrichtungen so konstruiert sein, daß die gehäuseartige Trägereinrichtung 15, die hinsichtlich des Neigungswinkels eingestellt werden kann, getragen wird von den Stützplatten 14 mit Hilfe einer Schraube oder dgl. Die Stützplatten (Trägereinrichtungen) 14 dienen dazu, die Teile 1 bid 13 und die gehäuseartige Trägereinrichtung 15 zu stützen. Die Platten 14 sind nicht auf ein spezifisches Profil, wie dies in Fig. 1 und 2 gezeigt ist, beschränkt.

Außerdem wird bei der in den Zeichnungen dargestellten Ausführungsform der gehäuseartigen Träger 15 von den Stütz platten 14 getrennt ausgebildet und an den Platten 14 mit Hilfe geeigneter Mittel, wie z. B. einem Haftmittel oder Bolzen befestigt. Der Träger 15 und die Stützplatten 14 können jedoch auch integral bzw. ein stückig ausgebildet werden.

In den Ausführungsformen, wie sie vorstehend speziell beschrieben werden, sind zwei Motoren 6 und 12 vorge sehen, um jeweils die Kreisplatte 2 und den Halter 1 in Rotation zu versetzen. Natürlich ist auch nur ein Motor ausreichend, um die Kreisplatte auf die Rotations platte in Rotation zu bringen, wenn geeignete Kraft übertragungseinrichtungen angewendet werden.

Das Reaktionsverfahren gemäß der Erfindung hat die fol genden Vorteile:

(i) Kontinuierliche Rotation des Reaktionsgefäßes gewähr leistet ein ausreichendes Rühren des Reaktionsge misches, eine verbesserte Reaktionseffizienz und eine hohe Empfindlichkeit sowie eine verbesserte Genauigkeit des Assays.
(ii) Um ein Assaysystem von hoher Empfindlichkeit zu er halten, war es bisher üblich, ein erhöhtes Probenvolu men einzusetzen. Gemäß der Erfindung ist es jedoch ausreichend, ein Probenvolumen von nur 1/2 bis 1/10 desselben zu verwenden, wie es bisher erforderlich war. Dies geht aus Tabelle I hervor. Dies bewirkt denselben Effekt, als wenn das konventionelle Verfah ren mit dem doppelten bis zehnfachen Probenvolumen, wie es üblicherweise verwendet wird, durchgeführt wird.
(iii) Bei dem konventionellen Verfahren wird - wenn das Probenvolumen klein ist - der Gradient der Kali brierungskurve niedriger, wobei die Genauigkeit der Messungen, die nach dieser Methode erhalten wer den, reduziert wird. Bei Verwendung der Vorrichtung gemäß der Erfindung kann jedoch der Kontaktbereich zwischen der Probe und der Innenoberfläche des Reak tionsgefäßes auf das 1,5- bis 4-fache dessen erhöht werden, was man bisher erhalten hat, selbst wenn man dasselbe kleine Probenvolumen einsetzt, wie dies in Tabelle II gezeigt wird. Da der Antikörper an einem vergrößerten Bereich gebunden werden kann, ist es möglich, ein Assaysystem mit hoher Empfind lichkeit und Genauigkeit zu erhalten. Tabelle III zeigt die Ergebnisse eines Assays für α-Fetopro tein (AFP), welches unter Verwendung des gleichen Reagens und des gleichen Probenvolumens durchgeführt wurde. Die Tests wurden fünfmal bei jeder Konzentra tion wiederholt, wobei man sich der erfindungsge mäßen Vorrichtung und einer konventionellen Vor richtung bediente. Fig. 4 zeigt Kalibrierungskurven auf der Basis der in Tabelle III angegebenen Ergebnis se. Es wird darauf hingewiesen, daß die Kalibrie rungskurve gemäß der Erfindung einen höheren Gradien ten als die der konventionellen Methode aufweist, und daß somit die erfindungsgemäße Vorrichtung eine höhere Genauigkeit gewährleistet. Diese Assays für AFP gemäß der Erfindung wurden in einem Reaktions gefäß durchgeführt, welches mit einem Winkel von 10° geneigt war und bei einer Geschwindigkeit von 30 Upm rotierte.
Tabelle III
(iv) Die Reaktionszeit kann weitgehend reduziert werden. Zum Beispiel zeigt Tabelle IV durch einen Vergleichsversuch die notwendigen Zeiten, die erforderlich sind, um ähnliche analytische Empfindlichkeiten und Genauigkeiten zu erhalten, d. h. Kalibrierungskurven mit einem ähnlichen Gradienten, wobei das gleiche Reagens in einem AFP-Assay verwendet wurden. Es wurde festge stellt, daß die Vorrichtung gemäß der Erfindung ein stündige Messungen ermöglicht, wodurch die Reaktions zeit in großem Maße reduziert wird. Das Reaktionsge fäß wurde mit einem Winkel von 20° geneigt, während es bei einer Geschwindigkeit von 50 Upm rotiert wurden. Die auf diese Weise erhaltenen Standardkurven sind in Fig. 5 wiedergegeben. Es wird darauf hingewiesen, daß die Reduzierung der Assayzeit so groß war, daß die Reaktionen, die nach der konventionellen Methode insgesamt 12 Stunden erfordet haben, mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung in 1 Stunde durch geführt werden konnten.
Tabelle IV

Die Vorrichtung kann verwendet werden zum automatischen Transferieren der Reaktionsgefäße, eines nach dem ande ren, während sie kontinuierlich rotiert und ihr Inhalt kontinuierlich gerührt wird. Dementsprechend ist es z. B. möglich, eine Vielzahl von Reaktionsgefäßen, wovon jedes eine Probenflüssigkeit enthält, nacheinander in die Reak tionsgefäßhalter in Startposition einzusetzen, die Reaktion in den Reaktionsgefäßen zu Ende zu führen, wäh rend diese rotiert und automatisch vorwärts transfe riert werden, und die Ergebnisse der Reaktion in einer gegebenen Stellung automatisch, z. B. mit Hilfe eines Spektralphotometers, zu bestimmen. Somit ist die Vorrich tung gemäß der Erfindung besonders für die Automation des Assaysystems geeignet. Es ist offensichtlich, daß die beispielhaft angeführte Vorrichtung, wie sie hier beschrieben wird, verändert werden kann, ohne dabei vom Gedanken der Erfindung abzuweichen.

Ein beispielhaftes Reaktionsverfahren wird im folgenden beschrieben.

Beispiel 1 AFP-Assay (a) Herstellung von Reaktion-Reagensgläsern

2 ml monoklonaler Anti-AFP-Antikörper [A] (1 mg/ml) wurden in jedes Polystyrol-Reagensglas gegeben, welches mit 0,05 m Phosphorsäure-physiologischer Kochsalzlösung (pH 6,4) (im folgenden als PBS bezeichnet) gewaschen wor den war. Es wurde eine Inkubation bei 56°C für 20 min durchgeführt, um ein mit dem Antikörper [A] sensitiviertes Reagensglas zu erhalten. Ein zweiter monoklonaler Anti körper [B] von einem von [A] unterschiedlichen Klon, wurde mit Meerrettich-Peroxidase (Boehringer Mannheim, Qualität I, im folgenden der Einfachheit halber als HRPO bezeichnet) nach dem Verfahren von Nakane et al., beschrieben in J. Histochem. Cytochem. 22, 1084 (1974) markiert. Der zweite Antikörper wurde auf ein Fünfzigstel mit PBS verdünnt, und 1 ml des verdünnten Antikörpers in jedes Polystyrol-Reagensglas, welches mit Antikörper [A] sensitiviert war, gegeben. Nach dem Lyophilisieren der Reagensgläser wurden diese dicht verschlossen und er gaben die Reaktionsgefäße für das AFP-Assay.

(b) AFP-Assay

Die Reagensgläser für das AFP-Assay, die wie vorstehend unter (a) beschrieben hergestellt worden waren, wurden mit 0,9 ml PBS gefüllt. In jedes Reagensglas wurde 0,1 ml Standard-AFP-Lösung gegeben, welche durch Verdünnen von AFP mit normalem Humanserum hergestellt wurde und 1, 10, 100 oder 1000 ng AFP pro Milliliter enthielt. Die Rea gensgläser wurden in die Halter in der Vorrichtung ge mäß der Erfindung eingesetzt, wobei sie aufwärts mit einem Winkel von 20°C zum Horizont (Horizontalen) geneigt waren. Die Reaktion wurde 30 Minuten lang ausgeführt, wobei die Reagensgläser mit einer Geschwindigkeit von 50 Upm rotiert wurden. Nach der Reaktion wurden die Rea gensgläser mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, die 0,005% Tween 20 (im folgenden als Waschagens bezeich net) enthielt. Jedes Reagensglas wurde dann mit 2 ml einer Enzymsubstratlösung gefüllt, die 50 ng/ml 5-Amino-salicyl- säure und 0,01% Wasserstoffperoxid enthielt. Die Reagens gläser wurden wiederum in die Halter eingesetzt; sie waren aufwärts in einem Winkel von 20° zur Horizontalen (horizon) geneigt, und die Reaktion wurde 30 Minuten lang durchge führt, wobei die Reagensgläser mit einer Geschwindigkeit von 50 Upm rotiert wurden.

Dann wurden 50 µl 2%iges Natriumazid zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die Extinktion des Reaktionsgemi sches wurde bei einer Wellenlänge von 500 nm mit Hilfe eines Spektralphotometers bestimmt. Die dabei erhaltene Kalibrierungskurve ist in Fig. 6 wiedergegeben.

Claims

1. Vorrichtung zum Rotieren von Reaktionsgefäßen in Schrägstellung, die Mittel zum rotierbaren Tragen einer ersten Platte und Einrichtungen zum Rotieren der ersten Platte bei einer vorgegebenen Geschwin digkeit, wobei eine Mehrzahl von Reaktionsgefäß haltern im Randbereich der ersten Platte befestigt und zum Einsetzen der Reaktionsgefäße geeignet ist, sowie Mittel zum Fixieren der Trägereinrichtung der ersten Platte in einer Weise, daß die Reaktions gefäßhalter in einem vorbestimmten Winkel zur Horizontalen geneigt werden können, umfaßt, gekenn zeichnet durch Einrichtungen zum Rotieren der Reaktionsgefäßhalter um deren Achsen bei einer vor gegebenen Geschwindigkeit.

2. Vorrichtung zum Rotieren von Reaktionsgefäßen in Schrägstellung gemäß Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß die Rotationsgeschwindigkeit der Reaktionsgefäßhalter auf 10 bis 100 Upm eingestellt ist.

3. Vorrichtung zum Rotieren von Reaktionsgefäßen in Schrägstellung gemäß Anspruch 2, dadurch gekenn zeichnet, daß die Rotationsgeschwindigkeit der Reaktionsgefäßhalter auf 25 bis 55 Upm eingestellt ist.

4. Vorrichtung zum Rotieren von Reaktionsgefäßen in Schrägstellung gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Neigungswinkel der Reak tionsgefäßhalter auf unterhalb 45° eingestellt ist.

5. Vorrichtung zum Rotieren von Reaktionsgefäßen in Schräg stellung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Neigungswinkel der Reaktionsgefäßhalter auf 10° bis 20° eingestellt ist.

6. Vorrichtung zum Rotieren von Reaktionsgefäßen in Schräg stellung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktionsgefäßhalter umfaßt:
einen ersten Bereich zum Halten eines Reaktionsgefäßes,
einen zweiten Bereich zum gleitbaren Einpassen des Reak tionsgefäßhalters in die erste Platte und
einen dritten Bereich, der in Kontakt mit den Reaktionsgefäß halter-Rotationseinrichtungen gebracht wird,
wobei erster und dritter Bereich an einander gegenüber liegenden Seiten der entsprechenden ersten Platte zu liegen kommen; und die Reaktionsgefäßhalter-Rotations einrichtung eine Einrichtung zur Krafterzeugung und eine zweite Platte umfaßt, die mittels der Kraft-erzeugenden Einrichtung rotiert wird und welche in Kontakt mit dem dritten Bereich des Halters zum Rotieren des Hal ters steht.

7. Vorrichtung zum Rotieren von Reaktionsgefäßen in Schrägstellung gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsgefäßhalter-Rotationseinrichtung im weite ren ein Untersetzungsgetriebe umfaßt, welches sich zwischen der Kraft-erzeugenden Einrichtung und der zweiten Platte befindet.

8. Vorrichtung zum Rotieren von Reaktionsgefäßen in Schräg stellung gemäß Anspruch 1, 6 oder 7, dadurch gekenn zeichnet, daß die Trägereinrichtung der ersten Platte umfaßt:
eine Einrichtung zur Krafterzeugung, ein Getriebe bzw. Zahnrad und eine Welle, auf welche über das Getriebe bzw. das Zahnrad die Kraft zur Rotation der ersten Platte übertragen wird und der Endbereich derselben zur Befestigung der ersten Platte dient.

9. Vorrichtung zum Rotieren von Reaktionsgefäßen in Schräg stellung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Trägereinrichtung der ersten Platte im weiteren eine Untersetzungseinrichtung umfaßt.

10. Vorrichtung zum Rotieren von Reaktionsgefäßen in Schrägstellung gemäß einem oder mehreren der vor hergehenden Ansprüche 1, 6 bis 9, dadurch gekenn zeichnet, daß sie im weiteren ein Einstellteil zur Steuerung der Rotationsgeschwindigkeit der Reak tionsgefäßhalter in der Reaktionsgefäßhalter- Rotationseinrichtung umfaßt.

11. Vorrichtung zum Rotieren von Reaktionsgefäßen in Schrägstellung gemäß einem oder mehreren der vor hergehenden Ansprüche 1, 6 bis 10, dadurch gekenn zeichnet, daß sie im weiteren ein Einstellteil zur Steuerung der Rotationsgeschwindigkeit der ersten Platte in der Rotationseinrichtung der ersten Platte umfaßt.

12. Vorrichtung zum Rotieren von Reaktionsgefäßen in Schrägstellung gemäß einem oder mehreren der vor hergehenden Ansprüche 1, 6 bis 11, dadurch gekenn zeichnet, daß die Einrichtung zum Fixieren der ersten Platte-Trägereinrichtung einen Satz von Grundplatten darstellt zum Neigen der ersten Platte in einem bestimmten Winkel zur Horizontalen in einer Weise, daß die Reaktionsgefäß halter in einem vorgegebenen Winkel zur Horizon talen geneigt werden können.

13. Vorrichtung zum Rotieren von Reaktionsgefäßen in Schräg stellung gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch:
eine Welle, durch die die erste Platte rotierbar getragen wird, wobei die Welle über ein Untersetzungsgetriebe durch einen elektrischen Motor bei vorgegebener Geschwindigkeit rotiert wird;
eine Mehrzahl von Reaktionsgefäßhaltern, welche in die Öffnung eingepaßt sind, wobei die genannten Rekationsge fäßhalter einen ersten Bereich aufweisen, der so über der ersten Platte angebracht ist, daß er ein Reaktionsgefäß hält, sowie einen Paßbereich, durch welchen der Reaktionsgefäßhalter in die Öffnung ein gepaßt wird, und einen Kontaktbereich, der sich unter der ersten Platte befindet;
eine zweite Platte, die rotierbar von einer Welle ge tragen wird, wobei eine Seitenfläche derselben mit einem ersten Getriebe bzw. Zahnrad ausgestattet ist, welches mit einem entsprechenden zweiten Getriebe bzw. Zahnrad, welches an der Seitenfläche des Kontaktberei ches eines jeden Reaktionsgefäßhalters eingreift;
ein drittes Zahnrad bzw. Getriebe, welches an der Rück seite der zweiten Platte montiert ist, wobei die zweite Platte über ein Untersetzungsgetriebe mittels eines Motors in Rotation versetzt wird, ein viertes Zahnrad bzw. Getriebe, welches mit dem dritten Zahnrad und einem Untersetzungsgetriebe ineinander greift, und das dritte Zahnrad zum Rotieren der Reaktionsgefäßhalter über die zweite Platte bei einer vorbestimmten Geschwindigkeit; und
eine Basis, welche die Welle in einer Weise befestigt, daß die Reaktionsgefäßhalter in einem vorbestimmten Winkel zur Horizontalen geneigt werden können.

14. Vorrichtung zum Rotieren von Reaktionsgefäßen in Schrägstellung gemäß Anspruch 1, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zum Fixieren der ersten Platte-Trägereinrichtung eingestellt werden kann zum Neigen der ersten Platte in einem bestimmten Winkel zur Horizontalen in einer Weise, daß die Reaktionsge fäßhalter in einer Anzahl von Winkeln zur Horizontalen geneigt werden können.