DE3889581T2

DE3889581T2 - Monoklonale Antikörper gegen spezifische antigene Regionen des humanen Immundefizienzvirus und Methoden zur Verwendung.

Info

Publication number: DE3889581T2
Application number: DE3889581T
Authority: DE
Inventors: Alan Ray Seattle Wa 98133 Flesher; Mary Kathleen Bellevue Wa 98005 Shriver
Original assignee: Genetic Systems Corp
Current assignee: Genetic Systems Corp
Priority date: 1987-05-01
Filing date: 1988-04-29
Publication date: 1994-10-20
Anticipated expiration: 2008-04-30
Also published as: IE65408B1; DE3889581D1; NZ224385A; EP0290893B1; CA1339363C; JP3142126B2; EP0290893A1; KR880014376A; ES2056075T3; ATE105938T1; JPS6463392A; IE881282L

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige immunologische Materialien, die zur Diagnose und Überwachung von Infektionen geeignet sind, welche durch den Human Immunodeficiency Virus (HIV), dem ätiologischen Agens für AIDS, verursacht werden. Insbesondere betrifft die Erfindung Zellinien, welche monoklonale Antikörper gegen antigene Determinanten des HIV-Core-Proteins produzieren. Diese Antikörper eignen sich zur Diagnose der HIV-Infektion und zur Überwachung der Wirksamkeit pharmazeutischer Formulierungen und Vakzin-Zusammensetzungen.

Technischer Hintergrund der Erfindung

Das ätiologische Agens für das Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) ist ein neuartiger lymphotropher Retrovirus mit der Bezeichnung Human Immunodeficiency Virus (HIV), welcher in der Literatur auch als LAV, HTLV-III oder ARV bezeichnet wird. Da die Verbreitung von HIV pandemische Ausmaße erreicht hat, ist eine Vermeidung seiner Übertragung zum obersten Ziel geworden. Zur Verringerung des Risikos einer transfusionsbedingten HIV-Infektion werden nunmehr von Krankenhäusern, Blutbanken und anderen Anwendern oder Hersteilern von Blutprodukten Blutspender routinemäßig auf das Vorliegen von Antikörpern gegen HIV überprüft. Bei den Screening-Tests werden typischerweise aufgeschlossene Präparate von gereinigtem HIV verwendet, die auf einer festen Oberfläche, wie z. B. einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte oder Kügelchen, adsorbiert sind. Andere Screening-Tests verwenden rekombinant hergestellte HIV-Polypeptide oder chemisch synthetisierte Peptide, welche immundominante Antigenregionen von HIV enthalten. Mit Hilfe derartiger Screening-Tests wird der größte Teil potentiell infektiver Bluteinheiten im Donor-Pool identifiziert und entfernt.
Trotz der hohen Sensitivität und Spezifität der HIV- Antikörper-Screening-Tests gelangt eine kleine, aber signifikante Anzahl infizierter Blutprodukte noch immer unerkannt in Blutbanken. Besorgnis bereiten hier insbesondere Spender, welche zum Zeitpunkt ihrer Blut- oder Plasmaspende mit HIV infiziert sind, jedoch noch keine Antikörper gegen das Virus entwickelt haben. Bis zu einem Zeitraum von 3 bis 4 Wochen nach der Infektion oder sogar länger können noch keine detektierbaren Antikörper-Titer vorliegen. Neuere Hinweise sprechen für einen Zeitraum von 6 Wochen bis 6 Monaten zwischen Zeitpunkt der Infektion und Entwicklung nachweisbarer Antikörper. Wenn nun ein infiziertes Individuum Blut oder Plasma während dieser Phase spendet, besteht für eine öffentliche Blutbank die Gefahr einer undetektierten Kontamination.
Zur Überbrückung der Lücke zwischen dem Zeitpunkt der ersten Infektion und der anschließenden Serokonversion wäre ein empfindlicher und spezifischer Test für HIV-Antigene wünschenswert. Unter Anwendung konventioneller Enzym-Immunoassay- Techniken wurden HIV-Antigen-Nachweisverfahren entwickelt, bei denen polyklonale HIV-Antikörper zum Einfangen ("capture") von HIV-Antigen aus einer Patienten- oder Kulturprobe verwendet werden. Die polyklonalen Antikörper liegen in Form von Seren vor, die man aus Patienten mit hohem HIV-Antikörpertiter gewonnen hat oder die durch Immunisierung einer tierischen Spezies hergestellt wurden. Für diese auf polyklonalen Antikörpern basierenden Antigen-Capture-Tests wurde eine zufriedenstellende Korrelation mit dem Auftreten von Reverser Transkriptase (RT)-Aktivität in Zellkulturen festgestellt. Außerdem sind diese Tests schneller und leichter durchzuführen als der RT-Test. Die Verwendung von Antiseren bewirkt jedoch häufig eine mangelnde Spezifität des Tests, was zu einem hohen Background führen kann, erfordert relativ lange Inkubationszeiten und kann eine Reihe von Schwierigkeiten beim Herstellungsprozeß bewirken.
Monoklonale Antikörper hoher Affinität und Spezifität gegenüber bestimmten konservierten HIV-Epitopen könnten eine signifikante Verbesserung gegenüber Antigen-Capture-Assays auf polyklonaler Basis bewirken. Es wurden zwar von mehreren Arbeitsgruppen monoklonale Antikörper beschrieben, welche an HIV binden; die Eignung dieser Antikörper zur Verwendung in Antigen-Capture-Tests ist jedoch nicht bekannt.
Die WO 86/04336 offenbart monoklonale Antikörper, welche die LAV-Proteine p13, p18, p25 und p55 erkennen. Es besteht jedoch ein Bedarf an monoklonalen Antikörpern, welche spezifisch für konservierte Antigenregionen von HIV-Proteinen sind, wobei diese Antigene bald nach der HIV-Infektion eines Individuums vorliegen und wünschenswerterweise mit monoklonalen Antikörpern vor dem Zeitpunkt der Serokonversion nachweisbar sind. Mit Hilfe der vorliegenden Erfindung werden diese und andere Anforderungen erfüllt.

Kurzfassung der Erfindung

Es wurden immortalisierte Zellinien hergestellt, welche monoklonale Antikörper produzieren, die spezifisch für Epitope von antigenen Determinanten innerhalb einer durch das rekombinante Fusionsprotein pGAG3 def inierten Region der HIV- Kernproteine sind. Von besonderem Interesse sind monoklonale Antikörper, welche mit anigenen Determinanten reagieren, die innerhalb von DNA-Sequenzen codiert werden, welche etwa vom Basenpaar (bp) 1167 bis etwa bp 1292, etwa von bp 1278 bis etwa bp 1385 und innerhalb der letztgenannten Sequenz etwa von bp 1320 bis 1385 reichen. Diese Regionen entsprechen den Aminosäuresequenzen der Peptide 147, 88 bzw. 15. Außerdem werden monoklonale Antikörper bereitgestellt, welche an antigene Determinanten binden, die innerhalb der DNA-Sequenzen von pGAG1, pGAG2 und pGAG3 codiert sind. Insbesondere binden die Antikörper an antigene Determinanten, welche innerhalb von bp 691 bis etwa bp 961, von bp 927 bis etwa bp 1061 (Peptid 141), oder etwa von bp 927 bis etwa 961 codiert werden.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper ermöglichen ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung von HIV in einer biologischen Probe, von der vermutet wird, daß sie das Virus oder antigene Determinanten davon enthält. Das Antigennachweisverfahren umfaßt die Inkubation der Probe mit einem oder mehreren monoklonalen Capture-Antikörpern, wobei die Antikörper spezifisch sind für eine antigene HIV-Determinante innerhalb der oben genannten gag-Regionen. Die Probe und die Capture-Antikörper können gleichzeitig oder nacheinander mit einer Zusammensetzung inkubiert werden, welche einen zweiten Antikörper enthält, der markiert oder unmarkiert ist, wobei ein Reaktionsgemisch gebildet wird. Wenn die den zweiten Antikörper enthaltende Zusammensetzung markiert ist, wird das Reaktionsgemisch analysiert, um die an HIV gebundene Menge an Markierung zu bestimmen. Ist die den zweiten Antikörper enthaltende Zusammensetzung nicht markiert, so wird eine dritte, markierte Zusammensetzung für den Nachweis erforderlich. Die den zweiten Antikörper enthaltende Zusammensetzung ist ausgewählt unter Antikörpern, welche an die Capture-Antikörper binden, monoklonalen Antikörpern gemäß vorliegender Erfindung, monoklonalen Antikörpern gegen andere HIV-Determinanten und polyklonalem Antiserum, welches man von Menschen gewinnt, die zuvor HIV ausgesetzt waren und Antikörper gegen das Virus enthalten oder das man aus Tieren gewinnt, welche mit antigenen Teilen des Virus immunisiert wurden.

Beschreibung der speziellen Ausführungsformen

Erfindungsgemäß werden neuartige monoklonale Antikörper bereitgestellt, welche an antigene Determinanten binden, die in bestimmten Abschnitten der Core(oder gag)-Proteine von HIV enthalten sind. Die monoklonalen Antikörper binden an Proteine und Protein-Präkursoren klinischer HIV-Isolate, welche die anvisierten (targeted) Regionen von antigenen Determinanten enthalten. Außerdem binden sie an rekombinante Proteine und synthetische Analoga dieser Proteine, welche die antigenen Determinanten enthalten. Die immortalisierten Zellen, welche die monoklonalen Antikörper produzieren, weisen identifizierbare Chromosomen auf, die für einen Antikörper oder ein Fragment davon kodieren, welche eine Bindungsstelle für ein Epitop einer antigenen Determinante aufweisen, die innerhalb der gag-Proteinregion enthalten ist und im folgenden näher beschrieben wird, wobei die antigene Determinante unter klinischen HIV-Isolaten konserviert ist. Die durch die immortalisierten Zellen produzierten monoklonalen Antikörper werden getrennt oder in Kombination in vielfältiger Weise, insbesondere bei diagnostischen Immunoassays, verwendet.
Die Herstellung monoklonaler Antikörper kann durch Immortalisierung der Expression solcher Nukleinsäuresequenzen erfolgen, welche für Antikörper oder Bindungsfragmente davon kodieren, die HIV-spezifisch sind, wobei man diese Sequenzen in einen Wirt einführt, der kultivierbar ist. Die immortalisierte Zellinie kann eine Säugerzellinie sein, welche durch Onkogenese, Transfektion, Mutation oder dergleichen transformiert wurde. Derartige Zellen umfassen Myelomzellinien, Lymphomzellinien oder andere Zellinien, welche die Expression und Sekretion des Antikörpers in vitro unterstützen. Der Antikörper kann ein natürlich vorkommendes Immunglobulin eines Säugers sein, kann durch Transformation eines Lymphozyten, insbesondere eines Milzlymphozyten, mit Hilfe eines Virus oder durch Fusion des Lymphozyten mit einer neoplastischen Zelle, wie z. B. einer Myelomzelle, unter Bildung einer Hybridzellinie, hergestellt worden sein. Typischerweise erhält man die Milzlymphozyten aus einem Tier, welches gegen das HIV- Virus oder ein Fragment davon, das eine antigene Determinante innerhalb einer von den erfindungsgemäßen Antikörpern erkannten Region der gag-Proteine enthält, immunisiert wurde.
Immunisierungsprotokolle sind allgemein bekannt und können voneinander beträchtlich abweichen und dennoch wirksam sein (vgl. Goding, 1983, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, N.Y., worauf hiermit vollinhaltlich bezug genommen wird, sowie DE-A-37 27 703).
Im allgemeinen injiziert man immunogene Mengen des Antigenpräparats in Konzentrationen im Bereich von 1 ug bis 20 mg/kg Wirt. Die Verabreichung der antigenen Präparate kann einoder mehrmals, üblicherweise in ein- bis vierwöchigen Intervallen, erfolgen. Die immunisierten Tiere überwacht man hinsichtlich der Produktion von Antikörpern gegen die gewünschten antigenen Determinanten oder gag-Proteine, welche die gewünschten Determinanten enthalten, entfernt die Lymphoblastoidzellen und isoliert B-Lymphozyten und transformiert oder fusioniert diese mit einer Myelomzellinie. Die Fusion oder Transformation kann in herkömmlicher Weise erfolgen, wobei die Fusionstechnik in einer großen Anzahl von Patenten beschrieben wird (vgl. U.S. Patente Nr. 4,172,124; 4,350,683; 4,363,799; 4,381,292; und 4,423,147; vgl. auch Kennett et al., 1980, Monoclonal Antibodies, Plenum, New York, und die darin beschriebenen Literaturstellen, sowie Goding, a.a.O.)
Durch Modifikation herkömmlicher Techniken können die immortalisierten Zellinien geklont und gescreent werden und Antikörper können in den Zellüberständen detektiert werden, welche zur Bindung an die gewünschten Regionen von antigenen HIV-Determinanten befähigt sind. Dies kann bestimmt werden durch Bindung an rekombinante Fusionsproteine oder synthetische Peptide, welche den Abschnitt der interessierenden antigenen Determinante enthalten. Geeignete immortalisierte Zellinien können dann in großem Maßstab in in vitro-Kulturen gezüchtet oder in den Peritonial-Raum eines geeigneten Wirts zur Produktion von Ascites-Flüssigkeit injiziert werden. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Antikörper kann ein kompetitives Screening von Überständen anderer Zellinien durchgeführt werden, wobei die vorliegenden Antikörper in einem kompetitiven Assay verwendet werden. Somit können auf Grundlage der Verfügbarkeit der vorliegenden monoklonalen Antikörper immortalisierte Zellinien unterschiedlichen Ursprungs in einfacher Weise hergestellt werden. Zellinien, welche monoklonale Antikörper produzieren, die zur Reaktion mit den hierin beschriebenen antigenen HIV-Regionen befähigt sind, sowie solche Antikörper, welche die Bindung der im folgenden beschriebenen Antikörper in einem kompetitiven Test blockieren, sind insbesondere vom Schutzumfang der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Die erfindungsgemäßen immortalisierten Zellinien können aber auch mit anderen neoplastischen B-Zellen fusioniert werden, wobei diese anderen B-Zellen als Rezipienten für genomische, für den Antikörper kodierende DNA dienen. Mit Hilfe rekombinanter DNA-Techniken können aber auch monoklonale Antikörper oder Fragmente davon dadurch hergestellt werden, daß man genomische DNA oder cDNA für eine oder beide schwere und leichte Ketten in einen Expressionsvektor zur endgültigen Kettenexpression insertiert. Es können chimäre Antikörper konstruiert werden, worin das antigenbindende Fragment eines Immunglobulinmoleküls (variable Region) über eine Peptid- Bindung an wenigstens einen Teil eines anderen Proteins, wie z.B. der konstanten Region eines menschlichen Immunglobulin- Moleküls, gebunden ist. Dies erreicht man durch Fusion der Gene der variablen Region mit den Genen der konstanten Region von gewünschter Spezies und Subtyp. Vgl., z.B. die Europäischen Patente mit den Veröffentlichungsnummern 171,496 und 173,494.
Neoplastische B-Zellen von Nagern, insbesondere von Mäusen, sind zwar bevorzugt, sie können aber auch von einer anderen Säuger-Spezies stammen, wie z.B. von Mensch, Hase, Rind, Schaf, Pferd, Schwein, Vogel oder dergleichen, solange diese Spezies diejenigen Regionen des gag-Proteins, das die Determinanten enthält, als Antigen erkennt und Lymphozyten, insbesondere Milzlymphozyten, für die Fusion oder Transformation daraus gewonnen werden können.
Der von den transformierten oder Hybrid-Zellinien ausgeschiedene monoklonale Antikörper kann jeder Immunglobulinklasse oder -unterklasse zugehören, wie z.B. den IgM-, IgD-, IgA-, oder IgG-Unterklassen, die für jede tierische Spezies bekannt sind. IgG ist als am häufigsten verwendeter Isotyp bei diagnostischen Tests im vorliegenden Fall bevorzugt. Die monoklonalen Antikörper können in intakter Form, oder als Fragment, wie z.B. als Fv, Fab, F(ab')2, verwendet werden. Üblicherweise werden sie jedoch in intakter Form verwendet.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper sind aufgrund ihrer Spezifität für antigene HIV-Determinanten von gag-Proteinen, wobei diese Determinanten in Proteinregionen liegen, welche durch immunologisch reaktive rekombinante Fusionsproteine und Peptidsequenzen definiert sind, besonders geeignet für diagnostische Tests. Unter Anwendung verschiedener rekombinanter Fusionsproteine und synthetisch konstruierter HIV-Peptide (vgl. US-Patent 4,629,783 und WO 86/06 099 und WO 86/06 414 der Patentinhaberin) können die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper identifiziert werden, indem sie an antigene Determinanten innerhalb von Regionen binden, welche durch gag-Sequenzen des HIV-Genoms kodiert werden.
Die rekombinanten Fusionsproteine und synthetischen Peptide, welche die interessierenden Antigenregionen definieren, werden innerhalb der gag-Region des HIV-Genoms kodiert. Von besonderem Interesse sind Regionen innerhalb des offenen Leserahmens von gag, der durch das rekombinante Fusionsprotein GAG3 definiert ist, durch die DNA-Sequenz pGAG3 kodiert wird und etwa vom Basenpaar (bp) 691 bis etwa 1642 des LAVBRU-Isolats von HIV reicht. Innerhalb der von pGAG3 kodierten Region sind auch antigene Determinanten von Interesse, welche von darin eingeschlossenen Nukleotidsequenzen und von pGAG1 und pGAG2 kodiert werden. Der Überlappungsbereich zwischen pGAG1 und pGAG3 reicht etwa von bp 691 bis etwa 961 und der Überlappungsbereich pGAG2 und pGAG3 reicht etwa von bp 691 bis etwa bp 1224. Die Numerierung erfolgt nach Wain-Hobson u.a., 1985, Cell 44:9, worauf hiermit voll inhaltlich bezug genommen wird. Die Produktion von rekombinantem gag-Fusionsprotein ist im Detail in der WO 86/06 099 beschrieben.
Außerdem sind monoklonale Antikörper von Interesse, welche an antigene Determinanten binden, die innerhalb einer DNA- Sequenz etwa von bp 691 bis etwa bp 1061 kodiert werden und die Region enthalten, welche etwa von bp 927 bis etwa bp 1061 kodiert wird. Außerdem sind von Interesse Antikörper, welche an antigene Determinanten binden, die durch die HIV-DNA Sequenz kodiert werden, die etwa von bp 1167 bis etwa bp 1385 reicht, insbesondere diejenigen Determinanten, die in dem etwa von bp 1167 bis etwa bp 1292 und von bp 1278 bis etwa bp 1385 reichenden Abschnitten kodiert werden.
Von den p25-Core-Proteinregionen, welche antigene Determinanten enthalten, an die die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper binden, wurden synthetische Peptide hergestellt. Diese umfassen das Peptid I, das auch als Peptid 141 bezeichnet wird und etwa von dem Aminosäurerest 198 bis etwa zum Rest 242 (bp 927 bis 1061) reicht und folgende Aminosäuresequenz besitzt, wobei Oligopeptide innerhalb der folgenden Sequenz lineare Epitope innerhalb dieser Sequenz umfassen:

I (141)

(Cys-Gly-Gly-Cys)-Met-Gln-Met-Leu-Lys-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu- Glu-Ala-Ala-Glu-Trp-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala-Gly- Pro-Ile-Ala-Pro-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-Ser- Asp-Ile-Ala-Gly-Thr-Thr-Ser-Thr-(Cys)
worin die in Klammern aufgeführten Aminosäuren hinzugefügt wurden, um die Synthese zu erleichtern oder um mögliche postsynthetische Verwendungszwecke, die dem Fachmann bekannt sind, zu fördern.
Peptid II, auch bezeichnet als Peptid 147, der p25-Region des offenen Leserahmens von gag umfaßt die Aminosäurereste, welche etwa von bp 1167 bis etwa bp 1292 kodiert werden. Es besitzt folgende Aminosäuresequenz, wobei in der folgenden Sequenz enthaltene Oligopeptide lineare Epitope innerhalb einer solchen Sequenz umfassen:

II (147)

(Cys-Gly-Gly-Cys)-Ser-Pro-Thr-Ile-Leu-Asp-Ile-Arg-Gln- Gly-Pro-Lys-Glu-Pro-Phe-Arg-Asp-Tyr-Val-Asp-Arg-Phe-Tyr-Lys- Thr-Leu-Arg-Ala-Glu-Gln-Ala-Ser-Gln-Glu-Val-Lys-Asn- Trp-Norleu-Thr-Glu-(Gly-Cys)
worin die in Klammern angegebenen Aminosäuren addiert wurden, um die Synthese oder mögliche postsynthetische Verwendungszwecke zu begünstigen. Peptid III, auch bezeichnet als Peptid 88, umfaßt eine antigene Determinante aus der p25- Region des offen Leserahmens von gag und enthält die Aminosäurereste, welche etwa von bp 1278 bis etwa bp 1385 kodiert werden. Es besitzt folgende Aminosäuresequenz und ist außerdem in der U.S.-Patentanmeldung 844,485, auf welche hiermit bezug genommen wird, beschrieben:

III (88)

(NH&sub2;-Cys)-Asn-Trp-Norleu-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn Ala-Asn-Pro-Asp-Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Glu- Pro-Ala-Ala-Thr-Leu-Glu-Glu-Norleu-Norleu-Thr-Ala-Cys
worin die in Klammern angegebenen Aminosäuren addiert wurden, um die Synthese oder mögliche postsynthetische Verwendungszwecke zu begünstigen. Außerdem wurden verkürzte Sequenzen von Peptid III hergestellt. Diesbezüglich kann die folgende, im U.S.-Patent 4,629,783 weiter beschriebene Sequenz besonders nützlich sein:

IV (15)

(NH&sub2;-Cys-Gly)-Asp-Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu- Gly-Pro-Ala-Ala-Thr-Leu-Glu-Glu-Norleu-Norleu-Leu-Thr- Ala-Cys
Für diagnostische Zwecke werden typischerweise Verfahren, wie der Enzyme-Linked Immunoadsorbent Assay (ELISA), der Radioimmunopräzipitations-Assay und das Immunoblotting verwendet. Diese Verfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt; vgl. Immunological Methods, Band I und II, 1979 und 1981, Herausgeber: Lefkovits und Pernis, Academic Press, New York; Monoclonal Antibodies, 1982, Herausgeber: Kennett u.a., Plenum Preiss, New York; und Handbook of Experimental Immunology, 1978, Herausgeber: Weir, Blackwell Scientific Publications, St. Louis, MO; auf welche hiermit voll inhaltlich bezug genommen wird.
Der diagnostische Immunoassay umfaßt typischerweise den Nachweis von Immunkomplexen, welche zwischen dem monoklonalen Capture-Antikörper und dem HIV-Antigen ausgebildet werden, das ein Epitop oder eine antigene Determinante innerhalb einer durch die oben beschriebenen, bevorzugten Sequenzen definierten Region besitzt. Um nachgewiesen werden zu können, sind die Antikörper gegebenenfalls markiert. Eine große Vielzahl von Markierungen steht hierfür zur Verfügung, wie z.B. Radionuklide, fluoreszierende Moleküle, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzymcofaktoren, Enzyminhibitoren, Liganden (insbesondere Haptene) und dergleichen. Eine große Vielzahl von Immunoassays steht ebenfalls zur Verfügung. Beispiele hierfür sind Assays, die in den folgenden U.S.-Patentschriften beschrieben sind: 3,817,827; 3,850,752; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876 und 4,376,100. Unmarkierte Antikörper können mit Hilfe von Agglutinations-Assays nachgewiesen werden. Außerdem können Zusammensetzungen, welche unmarkierte Antikörper enthalten, in Kombination mit anderen markierten Antikörpern (Zweite Antikörper) verwendet werden, welche mit der Antikörper-Zusammensetzung reagieren. Beispiele sind hierfür Immunglobulin-spezifische Antikörper.
Im allgemeinen besteht die Notwendigkeit, den monoklonalen Antikörper zumindest teilweise von der Ascites-Flüssigkeit oder dem Kulturenüberstand abzutrennen, bevor man ihn markiert. Reinigungsverfahren sind allgemein bekannt (Mishell, u.a., a.a.O.) und können eine Ammoniumsulfat-Fraktionierung, eine Ionenaustauscher-Chromatographie, eine Gelfiltrations- Chormatographie, eine Affinitäts-Chromatographie oder eine Kombination davon umfassen.
Die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper finden insbesondere Anwendung bei Sandwich-Enzymimmunoassays, bei denen HIV oder antigene Fragmente davon abgefangen und nachgewiesen werden. Eine biologische Probe, von der man vermutet, daß sie HIV-Antigene enthält, wird mit den vorliegenden monoklonalen Antikörpern in Kontakt gebracht, die man zuvor an einen festen Träger binden kann. Die Probe läßt man anschließend mit dem oder den monoklonalen Antikörpern unter Bedingungen reagieren, welche die Ausbildung von Immunkomplexen fördern, wobei eine Bindung zwischen den Antikörpern und denjenigen Molekülen erfolgt, welche die ausgewählten antigenen HIV-Determinanten aufweisen. Die Immunkomplexe werden anschließend von nicht-komplexiertem Material abgetrennt und falls der Capture-Antikörper markiert ist, wird das Signal detektiert. Ist der Capture-Antikörper unmarkiert, so wird ein zweiter Antikörper zugegeben, welcher ein erfindungsgemäßer monoklonaler Antikörper, ein polyklonales HIV-Antiserum oder ein gegen den Capture-Antikörper gerichteter Antikörper sein kann und gegebenenfalls markiert ist. Liegt die zweite Antikörperzusammensetzung in markierter Form vor, so wird das Konjugat aus Antikörper und Markierung, das spezifisch an das Antigen gebunden ist, bestimmt. Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform ist die zweite Antikörperzusammensetzung markiert und wird gleichzeitig mit der Probe und den Capture- Antikörpern inkubiert. Ist die zweite Antikörperzusammensetzung unmarkiert, so wird eine dritte Antikörperzusammensetzung verwendet, welche mit einer Markierung konjugiert ist. Andere herkömmliche Techniken, die dem Fachmann wohl bekannt sind, können ebenfalls angewendet werden. Beispielsweise umfaßt eine weitere Ausführungsform ein Verfahren zur Bestimmung von HIV in einer biologischen Probe die Inkubation eines erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpers mit einer biologischen Probe und den Nachweis der Präsenz von Immunkomplexen, welche zwischen dem monoklonalen Antikörper und der antigenen HIV-Determinante gebildet wurden, und davon ausgehend die Bestimmung der Anwesenheit oder Abwesenheit von HIV.
Die auf HIV-Präsenz getestete biologische Probe kann eine physiologische Flüssigkeit umfassen, wie z.B. Humanserum, Speichel, Samen, Vaginalsekret oder Muttermilch, menschliches Gewebe, cerebrospinale Flüssigkeit oder Zellkulturüberstände oder dergleichen.
Die Capture-Antikörper können in unterschiedlicher, dem Fachmann bekannter Weise an feste Träger gebunden werden. Der Träger kann beispielsweise ein Träger auf Basis von Polystyrol, Polyacrylamiden, Latex, Kieselgel, Agarose, Eisenverbindungen, Nylon, Zelluloseacetat, Nitrozellulose und dergleichen sein. Diese Träger können in Form von Reagenzgläsern, Mikrotiterplatten, Glasplatten, Kügelchen oder Filtern vorliegen.
Als markierte Antikörperzusammensetzung kann ein polyklonales Antiserum verwendet werden, das man aus einem Tier (z.B. Kaninchen, Ziegen oder Mäusen) erhält, welches mit HIV oder Fragmenten davon mit Hilfe bekannter Techniken immunisiert wurde. Antiseren können auch aus Menschen gewonnen werden, welche mit HIV in Berührung gekommen sind und hohe Virus- Antikörpertiter aufweisen.
Biologische Flüssigkeiten oder Proben können auch auf direktem Weg auf die Präsenz von HIV-Antigenen getestet werden, indem man die Probe zunächst an einem festen Träger fixiert, was in unterschiedlicher Weise erfolgen kann. Polystyrol kann als fester Träger (z.B. in Form von Mikrotiterplatten) verwendet werden. Die Probe kann aber auch an andere feste Träger, wie z.B. Nylon, Zelluloseacetat, Nitrozellulose oder an andere Membranen, sowie an Glas, Polyacrylamid und dergleichen gebunden werden. Die fixierten Proben werden mit dem gewünschten monoklonalen Antikörper oder mit einer Zusammensetzung aus zwei oder mehreren monoklonalen Antikörpern, die spezifisch für HIV-Epitope sind, die innerhalb der verschiedenen antigenen Regionen enthalten sind, unter Bedingungen inkubiert, die zur Ausbildung von Immunkomplexen führen. Der Antigen-Antikörperkomplex wird anschließend gewaschen und das Signal wird im Falle der Verwendung eines markierten ersten Antikörpers detektiert. Ist der erste Antikörper unmarkiert, so wird ein zweiter, markierter, immunglobulinspezifischer Antikörper zugegeben. Anschließend analysiert man die spezifisch an den Antigen-Antikörperkomplex gebundene Markierung.
Außerdem können Testkits mit den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern zur Verwendung bei der Detektion einer HIV-Infektion oder zum Nachweis von HIV-Antigen bereitgestellt werden. Hierzu werden die erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörperzusammensetzungen üblicherweise adsorbiert auf einer Festphase oder in lyophilisierter Form, entweder alleine oder in Kombination mit weiteren Antikörpern bereitgestellt, welche für andere antigene HIV-Determinanten spezifisch sind. Die gegebenenfalls mit einer Markierung konjugierten Antikörper sind in den Testkits enthalten, zusammen mit Puffern, wie z.B. Tris-, Phosphat-, Carbonatpuffern und dergleichen, Stabilisatoren, Bioziden, inerten Proteinen, wie z.B. Rinderserumalbumin, oder dergleichen. Im allgemeinen liegen diese Materialien in einem Anteil von weniger als 5 Gew.%, bezogen auf die Menge des aktiven Antikörpers, und üblicherweise in einer Gesamtmenge von wenigstens etwa 0,001 Gew. %, basierend auf der Antikörperkonzentration vor. Häufig ist ein inertes Verdünnungsmittel oder ein Exzipient enthalten, um die aktiven Bestandteile zu verdünnen. Der Exzipient liegt dabei in Mengen von 1 bis 99 Gew. %, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung vor. Wird ein zweiter Antikörper verwendet, der an den monoklonalen Antikörper binden kann, so liegt dieser üblicherweise in einem getrennten Gefäß vor. Der zweite Antikörper ist üblicherweise mit einer Markierung verbunden und in analoger Weise wie die obigen Antikörperformulierungen formuliert. Die Testkits umfassen ihrerseits Kompartimente, welche Fläschchen oder andere Behälter für die oben beschriebenen Reagenzien enthalten, die zur Durchführung des jeweiligen diagnostischen Immunoassays erforderlich sind. Derartige Kits sind insbesondere von Nutzen bei der Überwachung der Virus-Präsenz oder -Replikation in vitro, insbesondere bei Untersuchungen, welche die Wirksamkeit von Anti-HIV-Wirkstoffen bewerten. Die Behandlung von Menschen oder tierischen Modellsystemen mit möglichen therapeutischen Wirkstoffen oder Vakzinen kann mit Hilfe der erfindungsgemäßen Methoden überwacht werden.
Andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus dem nun folgenden experimentellen Teil, der die Erfindung anhand von Beispielen beschreibt. Die Beispiele dienen der Veranschaulichung, ohne eine beschränkende Wirkung zu zeigen.

BEISPIEL I

Beispiel I veranschaulicht Methoden zur Produktion von Hybridzellinien, welche monoklonale Antikörper produzieren, die mit Proteinen und antigenen Fragmenten von HIV reagieren, das die gewünschten antigenen Determinanten enthält. Diese monoklonalen Antikörper werden anhand ihrer Befähigung zur Reaktion mit HIV-Antigenen in ELISA-Tests, Immunoblots, Radioimmunopräzipitationstests und in indirekten Immunofluoreszenztests charakterisiert. Die antigenen Determinanten, mit denen die Antikörper reagieren, werden mit Hilfe von ELISA-Tests unter Verwendung bakterieller exprimierter Fusionsproteine und synthetischer Peptide identifiziert, welche Abschnitte von antigenen Determinanten der HIV-Core-Proteine umfassen.
Hybridzellinien produziert man durch Fusion von Myelomzellen mit Lymphoblastoidzellen aus Tieren, die mit HIV- Antigenen immunisiert wurden. Ursprünglich wurden gereinigte und in Detergens aufgeschlossene Viren zur Immunisierung der Wirtstiere verwendet. Dies führte zur Produktion von Antikörpern mit Spezifität gegenüber Core(gag)-Proteinen und deren Präkursoren. Der LAV-1 Stamm von HIV wurde ausgehend von infizierten CEM-Zellen auf einem diskontinuierlichen 30-40%igen Sucrosegradienten gereinigt und pelletiert. Das gereinigte Virus wurde in 0,5 % Triton X-100 (Triton ist ein registrierter Handelsnahme der Firma Rohm & Haas Co. für Octylphenoxypolyethoxyethanol) aufgeschlossen und mit 1% Formalin fixiert. Die Suspension wurde in einem 1:1 Verhältnis mit inkomplettem Freund'schen Adjuvans vermischt und 100 ul davon wurden zur Immunisierung der Mäuse verwendet. Booster-Injektionen wurden während der Wochen 2 und 3 verabreicht und die Seren wurden auf die Produktion von Antikörpern durch die immunisierten Mäuse überwacht. Konnten zirkulierende Anti-HIV-Antikörper im ELISA, durch Immunoblotting und RIP nachgewiesen werden, wurde die Milz der Tiere entfernt, und die Milzlymphozyten wurden zur Zellfusionierung in der später beschriebenen Weise verwendet.
Ein bakteriell-exprimiertes Fusionsprotein für die HIV gag-Region wurde ebenfalls als Immunogen verwendet. Das pGAG3- Konstrukt, welches etwa vom Basenpaar (bp) 691 bis bp 1642 reicht (Numerierung gemäß Wain-Hobson et al., 1985, Cell 40:9), wurde in das β-Galactosidase-Gen insertiert und in E. coli exprimiert. Das exprimierte Protein wurde aus dem Expressionssystem isoliert und als Immunogen im Gemisch mit inkomplettem Freund'schen Adjuvans verwendet. Booster-Injektionen wurden in etwa zweiwöchigem Abstand verabreicht. Eine Woche nach der zweiten Booster-Injektion wurde den Mäusen Blut entnommen, um auf zirkulierende Antikörper gegen das aufgeschlossene Virus und andere gewünschte Moleküle unter Anwendung von ELISA, Radioimmunopräzipitation (RIP) und Immunoblotting getestet. Milzlymphozyten von Tieren mit geeigneter Immunantwort wurden zur Zellfusion verwendet.
Die zur Erzeugung der Zellinien verwendeten Versuchsprotokolle entsprachen im allgemeinen denen von Köhler und Milstein (Nature 256:495 (1975)) mit Modifikationen gemäß Goldstein, et al., 1982, Infect. Immun. 38:273. Milz-B- Lymphozyten aus den immunisierten Mäusen wurden mit NS-1- Myelomzellen unter Verwendung von 40% (w/v) Polyethylenglykol fusioniert. Im Anschluß an die Fusion wurde das Zellgemisch in HAT-Medium (RPMI-1640 Medium, supplementiert mit 15%igem fötalem Kälberserum, 1x10&supmin;&sup4; M Hypoxanthin, 4x10&supmin;&sup7; M Aminopterin und 1,6x10&supmin;&sup5; M Tymidin) resuspendiert, so daß ein selektives Wachstum der Hybridzellen erfolgte. Anschließend erfolgte eine Verteilung auf Mikrokulturplatten mit 96 Vertiefungen in einer Konzentration von 1 bis 3x10&sup6;-Zellen/ml mit annähernd gleicher Anzahl von Maus-Thymozyten. Daraufhin wurde bei 37ºC in angefeuchteter Atmosphäre bei 6 % CO&sub2; inkubiert. Eine Fütterung der Kulturen erfolgte dadurch, daß man die Hälfte des Kulturmediums durch frisches HAT-Medium ersetzte. Mit Hilfe eines invertierten Mikroskops wurden die Zellen auf Proliferation überwacht. Hatten die Zellen eine ausreichende Dichte in einer Vertiefung erreicht, so wurde das Medium auf Anti-HIV-Antikörper und auf Reaktivität mit verschiedenen HIV- Antigenen getestet.
Vertiefungen, welche Hybridzellen enthielten, die Antikörper gegen HIV oder rekombinante HIV-Proteine produzierten, wurden durch ELISA-Tests identifiziert, wobei die Bindung an gereinigte, vollständige, aufgeschlossene Viren oder an biologisch exprimierte gag- oder env-Fusionsproteine bestimmt wurde (vgl. die WO 86/06 099 und EP-A-201 716).
ELISA-Tests unter Verwendung aufgeschlossener Viren wurden auf LAV EIA-Platten (Genetic System, Seattle, WA) durchgeführt. ELISA-Platten mit rekombinanten Fusionsproteinen wurden hergestellt, indem man das rekombinante Protein in 0,05 M Carbonat/Bicarbonatpuffer in einer Endkonzentration von etwa 2 ug/ml löste. Die Suspension wurde auf die Plattenvertiefungen verteilt und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Anschließend wurden die Platten mit Blockierungsreagens blockiert, welches 5% Magermilch, 0,01% Thimerosol, 0,01% Antifoam A in PBS enthielt. Die Platten wurden mit verbrauchtem Zellkulturmedium 45 Minuten bei 37ºC inkubiert und anschließend dreimal mit 0,05% Tween 20 in PBS (PBS-Tween) gewaschen. Peroxidase-Ziegen-Antimaus-IgG (1:2,000 Verdünnung in PBS-Tween ; Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, CA) wurde hinzugegeben (100 ul pro Vertiefung) und die Platten wurden daraufhin 45 Minuten bei 37ºC inkubiert und, wie oben beschrieben, gewaschen. Substrat (0,025 M Zitronensäure, 0,05 M dibasisches Natriumphosphat, pH 5,0 enthaltend 14 mg o-Phenylendiamin und 10 ul 30%iges Wasserstoffperoxid pro 50 ml) wurde zu den Platten hinzugegeben. Anschließend wurde 30 Minuten bei Zimmertemperatur im Dunkeln inkubiert. Die Reaktion wurde mit 3N Schwefelsäure abgestoppt und die kolorimetrischen Reaktionen wurden mit Hilfe eines automatisierten Mikroplatten-Ablesegeräts quantifiziert. Vertiefungen mit positivem Ergebnis wurden durch limitierende Verdünnung subkloniert, erneut auf Spezifität getestet und anschließend vermehrt.
Die Zellinien wurden hinsichtlich ihrer Spezifität und Reaktivität weiter charakterisiert. Als Techniken wurden hierzu Immunoblotting, Immunopräzipitation und ELISA unter Verwendung von aufgeschlossenem HIV-Virus, rekombinanten HIV-Virusproteinen und synthetischen HIV-Peptiden eingesetzt. Die Bezeichnungen für die im rekombinanten Fusionsprotein und in den synthetischen Peptiden umfaßten Regionen sind in den Tabellen I und II zusammengefaßt. Tabelle I: Rekombinante Fusionsproteine aus der GAG-Region Name Basenpaar-Nummer* ATCC-Hinterlegungsnummer * Numerierung entsprechend Wain-Hobson et al., 1985, Cell 44:9. Die Herstellung der rekombinanten Fusionsproteine ist detalliert in der WO 86/06 099 beschrieben. Tabelle II: Synthetische Peptide der GAG-Region Name Rest-Nummer Basenpaar-Nummer
Die verschiedenen Methoden zur weiteren Charakterisierung der Spezifität der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper werden im folgenden beschrieben. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse ist in Tabelle III zu finden.
Die Charakterisierung durch Immunoblotting wurde mit Klonüberständen oder Ascitesflüssigkeit unter Verwendung von gereinigtem, Detergens-gespaltenem LAV-Virus und rekombinanten Fusionsproteinen als Antigenen durchgeführt. Die rekombinanten Proteine waren von der gag-Region abgeleitet und umfaßten Gag-1 (bp375-961), Gag-2 (bp631-1224) und Gag-3 (bp691-1642). Die Antigene wurden zunächst durch Polyacrylamid-Gradientengelelektrophorese (7,0-15,0%) aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran (NCM) durch Elektrophorese über einen Zeitraum von 4 Stunden bei 25 V in 25 mM Natriumphospat (pH 7,0) übertragen. Nach dem Transfer wurde NCM blockiert, um unspezifische Wechselwirkungen durch Inkubation in Blockierungsreagens (5% Magermilch, 0,01% Thimerosol, 0,01 % Antifoam A in PBS) über einen Zeitraum von einer Stunde bei Zimmertemperatur zu verhindern. Die NCM wurde mit Zellkulturüberstand oder Ascitesflüssigkeit, verdünnt in PBS-Tween , über einen Zeitraum von einer Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert und anschließend bei dreimaligem Wechsel mit pBS-Tween gespült. In der zweiten Stufe wurde die NCM mit Ziegen-Anti-Maus-IgG- Meerrettichperoxidase, verdünnt in PBS-Tween , eine Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach der Inkubation folgte ein Waschschritt mit PBS-Tween und anschließendem Eintauchen in Meerrettichperoxidase-Farbentwicklungs lösung (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) über einen Zeitraum von 20 Minuten. Die Reaktion wurde durch Eintauchen in entionisiertes Wasser abgestoppt. Die Reaktivität der monoklonalen Antikörper wurde mit einem positiven Kontrollserum verglichen, das mit gereinigtem, gespaltetem Virus oder exprimiertem Fusionsprotein reagierte.
Virusextrakte aus der Radioimmunopräzipitation wurden aus CEM-Zellen hergestellt, welche mit dem LAV-1-Isolat von HIV infiziert und durch kontinuierliche Passagen an lytisches Wachstum adaptiert worden waren. War ein früher cytopathischer Effekt evident, so wurden die Zellen auf Markierungsmedium übertragen, welches ³&sup5;[S]-Methionin (0,05 mCi/ml) oder ³[H]- Glucosamin (0, 025 mCi/ml) enthielt. Anschließend erfolgte eine 24-stündige Inkubation, bis die meisten Zellen lysiert waren und Virus in den Kulturüberstand freigesetzt hatten. Das Virus wurde aus dem zellfreien Überstand zu einem Pellet abzentrifugiert (eine Stunde bei 100.000 xg) und die Detergensextrakte wurden in P-RIPA-Puffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, enthaltend 1,0% Triton X-100, 1,0% Deoxycholat, 0,1% SDS und 1% Aprotinin) hergestellt. Ähnliche Extrakte wurden aus uninfizierten CEM-Zellen hergestellt.
Immunopräzipitationstests wurden mit 100 ul Virusextrakt durchgeführt, die man mit 100 ul Kulturüberstand der Hybridzellinien eine Stunde in Eis inkubierte. Vier Mikroliter Kaninchen-Anti-Maus-Ig (Zymed Laboratories, So. San Francisco, CA) wurde zu jeder Probe hinzugegeben. Anschließend wurde 30 Minuten inkubiert. Anschließend wurde zu jeder Probe Immunopräzipitin (100 ul; Bethesda Research Laboratory, Bethesda, MD), resuspendiert in P-RIPA-Puffer, enthaltend 1,0% Ovalbumin, hinzugegeben und weitere 30 Minuten inkubiert. Die gebundenen Komplexe wurden gewaschen und durch SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese (15,0% Acrylamid:DATD-Gel) getrennt. Im Anschluß an die Elektrophorese wurden die Gele fixiert, in EnHance (New England Nuclear, Boston, MA) eingeweicht, getrocknet und auf einen Kodak XR-5-Film aufgelegt. Ein positives Referenzserum, welches sämtliche viralen HIV-Proteine immunopräzipitierte, wurde mit virusinfizierten und scheininfizierten CEM-Zellüberstanden als positive und negative Kontrolle umgesetzt.
Die in Tabelle 111 zusammengefaßten Ergebnisse zeigen, daß vier monoklonale Antikörper p25 und die gag-Prekursorproteine p55 und p40 spezifisch immunopräzipitieren. Jeder der monoklonalen Antikörper wies den IgG1-Isotyp auf.
Die Charakterisierung durch indirekte Immunofluoreszenz erfolgte durch vorsichtiges Pelletieren der infizierten CEM- Zellen (etwa 1x10&sup6; Zellen/ml) bei niedriger Geschwindigkeit und zweimaligem Waschen der Zellen mit kalter PBS und Resuspendieren im gleichen Volumen. Zwanzig Mikroliter der Zellsuspension tropfte man in die Vertiefungen von Multiwell- Platten (Carlson) und ließ diese zwei Stunden an der Luft trocknen. Anschließend wurden die Zellen an die Platten fixiert, indem man sie in 100 % Aceton oder Methanol-Aceton (1:1) 10 Minuten bei Zimmertemperatur eintauchte. Die Platten ließ man anschließend trocknen und färbte diese unmittelbar anschließend oder bewahrte sie bei -20ºC mit einem Trockner auf.
Antikörper-Ascitesflüssigkeit wurde 1:100 in PBS verdünnt und 20 ul wurden in jede Vertiefung getropft. Die Platten wurden 45 Minuten bei 37ºC in einer feuchten Kammer inkubiert. Anschließend wurde die Antikörperlösung abgesaugt und es wurde zweimal mit PBS gewaschen. Überschüssiges PBS wurde aus dem Bereich um jede Vertiefung abgesaugt, ohne die Zellen trocken werden zu lassen. FITC-Ziegen-Anti-Maus F(ab') (Zymed Laboratories) wurde 1:50 bzw. 1:100 verdünnt und 20 ul wurden in jede Vertiefung hinzugegeben. Diese Lösungen inkubierte man 30 Minuten bei 37ºC in einer feuchten Kammer mit den Zellen. Die Platten wurden erneut mit PBS und anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Zellen wurden mit Evan's Blue (0.05 % in PBS) eine Minute gefärbt und mit destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend wurden die Platten unter einem Fluoreszenzmikroskop auf positive Reaktionen überprüft.
Bei einer alternativen Verfahrensweise wurden die infizierten Zellen direkt mit dem monoklonalen Antikörper (45 Minuten bei 37ºC) inkubiert, bevor sie auf Multiwell-Platten aufgetropft und an der Luft getrocknet wurden. Die Platten konnten dann mit Aceton oder Methanol:Aceton, wie oben beschrieben, fixiert werden. Die anderen Schritte des Verfahrens entsprachen den oben beschriebenen. Sämtliche monoklonalen Antikörper reagierten mit HIV-infizierten Zellen, wie durch den Immunofluoreszenz-Test gezeigt wurde.
Zur Kartierung der Regionen, welche die antigenen Determinanten enthielten, die von den erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörpern erkannt wurden, wurden Kulturüberstände der Hybridzellinien oder Ascitesflüssigkeit aufgrund ihrer Reaktivität in ELISA-Tests mit synthetischen Peptiden weiter charakterisiert. Die ELISA-Prozedur entsprach obigen Angaben, mit Ausnahme davon, daß synthetische Peptide anstelle der aufgeschlossenen Viren oder Fusionsproteine als Antigene in adsorbierter Form auf der Oberfläche der Mikro-Vertiefungen verwendet wurden. Bei Verwendung von Peptiden wurde folgendes Plattierungs-Protokoll angewendet. Lyophylisiertes Peptid wurde in 6 M Guanidin-HCl gelöst. Vor der Plattierung in Platten mit 96 Vertiefungen wurde die Guanidinlösung in 0,05 M Carbonat/Bicarbonat-Puffer (pH 9,6) auf eine Peptidendkonzentration von bis zu 100 ug/ml verdünnt. Ein 50 ul-Volumen der verdünnten Peptidlösung wurde zu jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte hinzugegeben. Die Platten wurden über Nacht bei 4ºC inkubiert. Überschüssige Peptidlösung wurde ausgeschüttelt. Die Platten wurden mit Blockierungsreagens blockiert und die oben für den ELISA mit aufgeschlossenen Viren beschriebene Prozedur wurde befolgt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt. Die von Zellinien produzierten monoklonalen Antikörper mit Spezifität für Core-Proteine reagierten mit rekombinanten Fusionsproteinen der gag-Region. Monoklonale Antikörper der Zellinien HIV p25-2 und HIV p25-3 reagierten mit jedem der drei getesteten gag-Fusionsproteine. Die monoklonalen Antikörper aus den Zellinien HIV p25-6 und HIV p25-7 reagierten lediglich mit GAG3. Die antigenen Determinanten, welche die Epitope enthielten, mit denen die monoklonalen Antikörper reagierten, wurden mit Ausnahme von Antikörper 25-2 aufgrund ihrer Reaktivität mit synthetischen Peptiden auf engere Bereiche eingeschränkt. Die Peptide, mit denen jeder der monoklonalen Antikörper reagierte, sind in Tabelle III angegeben.
Zur weiteren Veranschaulichung der Brauchbarkeit der Erfindung wurden die monoklonalen Antikörper in folgenden Beispielen dazu verwendet, um die Präsenz von HIV in verschiedenen Proben und unter verschiedenen Testbedingungen nachzuweisen. Antikörper LAV Proteine Rekombinante Proteine Peptide Test-Methoden Blot Immunogen* * Immunogen: A. Ganze inaktiverte Viren, B. Rekombinantes gag Fusionsprotein. ¹ND - Nicht bestimmt

BEISPIEL 2

Single Wash HIV Antigen Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Beispiel II beschreibt einen Antigen Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (EIA), der einen einzelnen Waschschritt umfaßt, worin monoklonale Antikörper, die von den Hybridzelllinien HIV p25-2 und HIV p25-3 abgeleitet waren, zum Antigen- Einfang verwendet wurden und gereinigtes Immunglobulin aus Humanserum mit hohem Titer, konjugiert an Meerrettichperoxidase, zur Detektierung des eingefangenen Antigens verwendet wurde. Prozeduren mit zweistündiger Inkubation und Inkubation über Nacht (16-18 Stunden) mit der antigenhaltigen Probe werden beschrieben.

a. Konjugation von gereinigtem Immunglobulin und Meerrettichperoxidase

Immunglobulin aus AIDS-positivem Humanserum mit hohem Titer wurde durch Präzipitation in 40%igem Ammoniumsulfat gereinigt. Anschließend erfolgte eine ausgiebige Dialyse und Elution von einer DE-52 Cellulose-Säule (Whatman ). Gereinigtes Immunglobulin wurde an Merrettichperoxidase (Calbiochem) unter Verwendung des Verfahrens von Nakane et al. (J. Histochem. Cytochem., 1974 22:1084) mit folgenden Modifikationen gekoppelt. Gereinigtes Immunglobulin wurde auf eine Konzentration von 4,0 mg/ml eingestellt und gegen 0,2 M Natriumcarbonat/1 M NaCl pH 9,5 dialysiert. Gereinigte Meerrettichperoxidase (HRP) wurde mit 0,07 M Natriumperiodat oxidiert und an Immunglobulin in einem molaren Verhältnis von 1:5 (Antikörper:HRP) 30 Minuten konjugiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit Natriumborhydrid abgestoppt. Das resultierende Produkt wurde mit 50%iger gesättigter Ammoniumsulfatlösung ausgefällt und der Niederschlag wurde gegen 100 mM TRIS/1 M NaCl-Puffer dialysiert. Das Konjugat wurde anschließend auf 4 mg/ml eingestellt und auf 2 mg/ml mit Glycerin verdünnt.

b. Standardkurve mit gereinigtem Virus in Humanplasma und Zellkulturmedien

Ascitesflüssigkeit, abgeleitet von den Hybridomzellinien HIV-p25-2 (ATCC No. HB9407) und HIV-p25-3 (ATCC No. HB9408) wurde 1:5.000 in 25 mM Trispuffer, pH 8,5 verdünnt. 200 ul davon wurden in jede Vertiefung eines Nunc-Mikrotiterstreifens gefüllt. Die Streifen wurden verschlossen und 16-18 Stunden bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Antkörperlösung wurde aus der Vertiefung abgesaugt, bevor Blockierungslösung aus 0,3% BSA, 5% Sucrose in PBS zugegeben und 60 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert wurde. Die Blockierungslösung wurde abgesaugt und die Streifen wurden an der Luft bei Zimmertemperatur getrocknet. Die Streifen konnten dann unmittelbar verwendet werden oder konnten bis zu acht Monate bei 4ºC ohne signifikantem Reaktivitätsverlust aufbewahrt werden.
Es wurden Proben aus 0-500 pg/ml gereinigtem, inaktiviertein Virus (LAV), verdünnt, entweder in normalem menschlichem Plasma oder in Zellkulturmedium, hergestellt. Zweihundert Mikroliter einer jeden Viruskonzentration wurden zu jeder von drei Vertiefungen zusammen mit 50 ul Triton X-100 in Wasser hinzugegeben. Bei der Testvariante mit 2-stündiger Inkubationsperiode wurden 50 ul Immunglobulin/HRP Konjugat (etwa 100 ug/ml) in 1%igem normalem Ziegenserum, Zitratpuffer, pH 7,0 zu den Vertiefungen hinzugegeben. Anschließend wurde 2 Stunden bei 37ºC unter leichtem Schütteln inkubiert. Bei der Variante mit Inkubation über Nacht (16-18 Stunden) wurden die Proben in Triton X-100/Wasser in den Vertiefungen über Nacht bei 37ºC inkubiert und anschließend wurde das Konjugat hinzugegeben. Daraufhin wurde weitere 2 Stunden bei 37ºC inkubiert, die Lösung aus den Vertiefungen abgesaugt und die Vertiefungen mit 0,05% Tween 20 in 0,15 M NaCl sechsmal gewaschen. Zweihundert Mikroliter Substrat (80 ug/ml Tetramethylbenzidin, 0,0015% Wasserstoffperoxid, Zitrat/Phosphatpuffer, pH 6,0) wurden zu jeder Vertiefung hinzugegeben, und es wurde 30 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert, bevor die Reaktion durch Zugabe von 1 N H&sub2;SO&sub4; abgestoppt wurde. Die Farbreaktion wurde durch Bestimmung des optischen Dichteverhältnisses von 450:630 nm quantifiziert.
Die Ergebnisse für die 2-Stunden- und 24-Stunden-Variante des Single-Wash-HIV-Antigen-EIA in normalem Humanserum und Zellkulturmedium sind in Tabelle IV zusammengefaßt. Die Sensitivität für jede Variante wurde aus den erzielten Resultaten extrapoliert. Demnach können etwa 59 pg/ml Virus in normalem Humanplasma und etwa 70 pg/ml Virus in Zellkulturmedium unter Verwendung der 2-Stunden-Variante nachgewiesen werden, während 32 pg/ml Virus in normalem Humanplasma und Zellkulturmedium unter Anwendung des 16- bis 18-stündigen, längeren Inkubationsschrittes nachweisbar sind. Tabelle IV: Standardkurven für Virus-Detektion in normalen Humanplasma und Zellkulturmedium Plasma Zellkulturmedium HIV Antigen Inkubation 1, S.D. - Standard-Abweichung c. Spezifität des Single-Wash-HIV-Antigen-Capture EIA
Die Spezifität des HIV-Antigen-Capture-EIA zur ausschließlichen Detektion von Antigen aus HIV-1-Isolaten wurde anhand von Tests mit HIV-Isolaten, einschließlich LAV-1, -4, -5, -6, LAI, ELI (Pasteur Instutite, Montagnier) sowie ARV-2 (Levy, et al.), CF-65 und CF-70 (Genetic Systems Corp., Seattle, WA) und heterologem Virus, einschließlich humanem T- Zell-Leukämievirus I (HTLV-1), Affen-T-Zell-Lymphotrophen Virus III (STLV-III), Epstein-Barr-Virus (EBV) und Cytomegalovirus (CMV) sowie den HUT- und CEM-transformierten menschlichen Zellinien gezeigt. Die Viren wurden unter Anwendung der oben beschriebenen Verfahren gezüchtet. Nach einem Zeitraum von etwa 3-7 Tagen wurden die Zellkulturüberstände entfernt und 200 ul davon wurden in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten gegeben und mit Hilfe des in Beispiel IIb beschriebenen HIV-Antigen- Capture EIA getestet. Sämtliche HIV-1-Isolate waren in dem HIV- Antigen-Capture-EIA positiv und keines der heterologen Viren zeigte eine Kreuzreaktion.

d. HIV-Antigen-Capture-EIA mit normalen Donorserum- und Plasmaproben.

Der HIV-Antigen-Capture-EIA zum Nachweis von Antigen im Serum oder Plasmaproben einer normalen Donorpopulation wurde ebenfalls untersucht. Insgesamt wurden 500 Serum- oder Plasmaproben unter Anwendung der Über-Nacht-Variante des HIV- Antigen EIA gemäß Beispiel IIb getestet. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse für die untersuchte Donorpopulation zeigt, daß 488 (97,6%) der Population nicht reaktiv waren und daß 12 (2,4%) eine erste Reaktion zeigten. Von den zwölf anfänglich reaktiven Proben war keine wiederholt reaktiv.

e. HIV-Antigen-Capture-EIA mit zwei Waschschritten unter Verwendung monoklonaler Antikörper für Einfang und Nachweis von Antigen

Beispiel IIe veranschaulicht eine andere Variante für den HIV-Antigen-Capture EIA, wobei ein Waschschritt zwischen der Zugabe der Capture- und der Nachweisantikörper erfolgte. Auch bei diesem Beispiel wurden von den Hybridzellinien HIV-p25-6 (ATCC No. HB9409) und HIV-p25-7 (ATCC No. HB9410) abgeleitete monoklonale Antikörper mit Meerrettichperoxidase konjugiert und im Detektionsschritt verwendet. Eine Reihe von klinischen Seren verschiedener diagnostischer Gruppen wurde mit Hilfe dieser Testvariante getestet.
Die Vertiefungen der Mikrotiterstreifen wurden mit den monoklonalen Antikörpern 25-2 und 25-3 beschichtet. Die Probenvorbereitung und die Inkubation wurden wie in Beispiel IIe durchgeführt. Die Serum- und Plasmaproben wurden ausgewählt unter AIDS-, ARC-, LAS-, gesunden Homosexuellen und einer normalen Donorpopulation. Im Anschluß an die Inkubation der Probe mit dem adsorbierten monoklonalen Antikörper, wurde die Probe aus der Vertiefung abgesaugt und die Vertiefungen wurden mit 0,05% Tween 20 in 0,15 M NaCl gewaschen.
Die monoklonalen Antikörper 25-6 und 25-7, welche aus Ascitesflüssigkeit gewonnen wurden, wurden mit Meerrettichperoxidase wie in Beispiel IIa beschrieben konjugiert und 1:3,000 in einem Verdünnungsmittel verdünnt, welches 20% Immunglobulin-freie Maus-Ascitesflüssigkeit, 5% nichtverwandten isotypischen monoklonalen Antikörper, 5 % Rinderserumalbumin, 0,01% Thimerosal und 0,005% Gentamicin in 150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7,2, enthielt. Verdünntes Konjugat (200 ul) wurde zu jeder Vertiefung hinzugegeben und 1 Stunde bei 37ºC inkubiert, bevor die Vertiefungen, wie oben beschrieben, gewaschen wurden. Der restliche Test wurde durchgeführt, wie für die Variante mit einem Waschschritt beschrieben.
Die mit der Doppelwaschschritt-Variante eines HIV-Antigen- Capture-EIA (monoklonaler Caputure-Antikörper/monoklonaler Detektionsantikörper) mit einem klinisch relevanten Probenspektrum erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengefaßt. Innerhalb der verschiedenen diagnostischen Gruppen waren 75% der AIDS-Patienten Antigen-positiv; 57% der ARC-, 17% der LAS-Patienten, 12% der gesunden Homosexuellen und keine der normalen Humanserum-Proben waren Antigen-positiv. Tabelle V: Klinisch relevantes Probenspektrum, Two Wash Monoclonal/Monoclonal HIV Antigen Capture EIA Variante Diagnostische Gruppe AIDS Gesunde Homosexuelle Normales Humanserum Negative Kontrolle ¹ Die Werte für die optischen Dichten unter der Linie sind größer als der "cutoff"-Wert, den man dadurch bestimmt, daß man den Mittelwert der negativen Kontrolle nimmt und 0,050 optische Dichteeinheiten hinzuaddiert. In diesem Fall ist der "cutoff"-Wert 0,123.BEISPIEL III

Serokonversion bei Schimpansen, bestimmt durch HIV-Antigen-Detektion und Antikörper-Detektion

Es besteht ein Bedarf an Verfahren zur Überwachung der Wirksamkeit verschiedener Vakzine und therapeutischer Präparate, wenn sie an Tieren und Menschen getestet werden. In Beispiel III wird die erfindungsgemäße HIV-Antigen-Nachweismethode mit einem käuflich erhältlichen HIV-Antikörper- Screening-Kit verglichen.
Einem Schimpansen wurde zunächst Blut entnommen, dann wurde er mit HIV inokuliert. In zweiwöchigen Abständen wurde dem Tier Blut entnommen und auf Antigen und Antikörper-Gehalt mit dem erfindungsgemäßen HIV-Antigen-Nachweisverfahren (ein Waschschritt, Inkubation über Nacht) gemäß Beispiel IIb und dem Genetic Systems LAV EIA Kit (Genetic Systems Corporation, Seattle, WA) getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII angegeben und können wie folgt zusammengefaßt werden. Antigen konnte im Verlauf der zweiten Woche noch vor den Antikörpern nachgewiesen werden. Antikörpertiter waren ab der vierten Woche nach Inokulation nachweisbar und nahmen bis zur zwölften Woche zu. Der Antigengehalt nahm von der vierten Woche mit zunehmendem Antikörpergehalt ab. Die Daten weisen darauf hin, daß eine Phase existiert, in deren Verlauf ein Lebewesen potentiell infektiös ist, bevor Antikörper nachweisbar sind. Die mit Hilfe der erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper nachgewiesene Antigenämie kann ein früherer Indikator einer HIV-Infektion bei Lebewesen sein als die Antikörperserokonversion. Tabelle VII: Vergleich von HIV-Antigen-Detektion und von Antikörper-EIA bei der Austestung der Serokonversion in einem Schimpansen Serumprobe Antigen Detektion Antikörper Detektion Vorentnahme Woche Pl. NT = Nicht getestet.

Claims

Patentansprüche für alle Vertragsstaaten außer Spanien

1. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von HIV- Core-Antigen in einer biologischen Probe, wobei man:

a) die biologische Probe mit einem monoklonalen Antikörper, der in der Lage ist, mit dem HIV p25 Core-Protein zu reagieren, inkubiert,

b) die Anwesenheit von Immunkomplexen, die zwischen dem monoklonalen Antikörper und der antigenen Determinante in der biologischen Probe gebildet werden, feststellt und daraus die Anwesenheit oder Abwesenheit des HIV bestimmt,

dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem monoklonalen Antikörper um den Antikörper 25-3 (HB9408), 25-6(HB9409) oder 25-7(HB94l0) handelt.

2. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von HIV- Cpre-Antigen in einer biologischen Probe, wobei man:

a) die biologische Probe mit einem monoklonalen Antikörper inkubiert, der in der Lage ist, an das HIV p25-Core- Protein zu binden,

b) die Anwesenheit von Immunkomplexen, die zwischen dem monoklonalen Antikörper und der antigenen Determinante in der biologischen Probe gebildet werden, feststellt, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem monoklonalen Antikörper um den Antikörper 25-2(HB9407) handelt.

3. Verfahren zur Detektion und/oder zur Quantifizierung von HIV-Core-Antigen in einer biologischen Probe, wobei man:

a) die biologische Probe mit einem oder mehreren monoklonalen Capture-Antikörper(n), welche(r) an das p25 Core- Protein bindet(n), inkubiert;

b) die biologische Probe entweder gleichzeitig mit oder folgend auf Schritt (a) mit einer markierten Antikörperzusammensetzung, die so an das HIV-Kernantigen bindet, daß eine spezifische Bindung entsteht, inkubiert, wobei sich ein Reaktionsgemisch bildet; und

c) das in Schritt (b) gebildete Reaktionsgemisch untersucht, um die Menge der mit der antigenen Determinante assoziierten Markierung zu bestimmen, und um dabei in der Probe vorhandenes HIV oder dessen Core-Antigene zu detektieren und/oder zu quantifizieren, dadurch gekennzeichnet, daß die monoklonalen Capture-Antikörper ausgewählt sind unter den Antikörpern 25-3(HB9408), 25-6(HB9409) oder 25-7(HB9410).

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die monoklonalen Capture-Antikörper an einer festen Phase immobilisiert werden.

5. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die markierte Antikörper-Zusammensetzung ein polyklonales Antiserum umfaßt, das Antikörper gegen HIV-Core-Proteine enthält.

6. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Detektion mittels einer enzymatischen Reaktion, Fluorenszenz, Radioaktivität, Zell-Lyse oder Lumineszenz-Emission erfolgt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die markierte Antikörper-Zusammensetzung einen oder mehrere monoklonale(n) Antikörper umfaßt, welche(r) an HIV-Kernproteine binden (bindet).

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei der markierte monoklonale Antikörper an ein Epitop innerhalb einer Aminosäuresequenz der folgenden Peptidsequenzen bindet:

I (141)

Met-Gln-Met-Leu-Lys-Glu-Thr-Ile-Asn-Glu-Glu-Ala-Ala- Glu-Trp-Asp-Arg-Val-His-Pro-Val-His-Ala-Gly-Pro-Ile- Ala-Pro-Gly-Gln-Met-Arg-Glu-Pro-Arg-Gly-Ser-Asp-Ile- Ala-Gly-Thr-Thr-Ser-Thr;

II (147)

Ser-Pro-Thr-Ser-Ile-Leu-Asp-Ile-Arg-Gln-Gly-Pro-Lys- Glu-Pro-Phe-Arg-Asp-Tyr-Val-Asp-Arg-Phe-Tyr-Lys-Thr- Leu-Arg-Ala-Glu-Gln-Ala-Ser-Gln-Glu-Val-Lys-Asn-Trp- Norleu-Thr-Glu;

III (88)

Asn-Trp-Norleu-Thr-Glu-Thr-Leu-Leu-Val-Gln-Asn-Ala-Asn- Pro-Asp-Cys-Lys-Thr-Ile-Leu-Lys-Ala-Leu-Glu-Pro-Ala- Ala-Thr-Leu-Glu-Glu-Norleu-Norleu-Thr-Ala-Cys

9. Immortalisierte Zellinie, ausgewählt aus der Gruppe von Zellinien, die mit den ATCC-Bezeichnungen HB 9407, HB 9408, HB 9409 und HB 9410 hinterlegt worden sind.

10. Monoklonaler Antikörper, der von einer Zellinie gemäß Anspruch 9 produziert wird.

11. Monoklonaler Antikörper, der in der Lage ist, an eine antigene Determinante des HIV p25 Core-Poteins zu binden, wobei der monoklonale Antikörper immunologisch mit der Bindung eines von einer Zellinie gemäß Anspruch 9 produzierten monoklonalen Antikörpers kompetiert.

12. Kit zur Detektion der Anwesenheit von HIV-Core- Antigen ,wobei der Kit Kompartimente umfaßt, enthaltend eine erste Antikörper-Zusammensetzung, wobei die Antikörperzusammensetzung einen ersten monoklonalen Antikörper umfaßt; und eine zweite Antikörper-Zusammensetzung, die an HIV-Core- Proteine bindet; und Markierungen, die ein detektierbares Signal liefern und kovalent an die zweite Antikörperzusammensetzung gebunden sind oder an Antikörper gebunden sind, die mit der zweiten Antikörper-Zusammensetzung reagieren, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem ersten monoklonalen Antikörper um den Antikörper 25-3(HB9408), 25-6(HB9409) oder 25-7(HB9410) handelt.