DE3889505T2 - Verfahren zur Bestimmung von Bakterienkonzentrationen mit einer Abtrennung von nichtmikrobiellen Zellen sowie ein Apparat und Reagenzmittel hierfür. - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung von Bakterienkonzentrationen mit einer Abtrennung von nichtmikrobiellen Zellen sowie ein Apparat und Reagenzmittel hierfür.

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Description

    Erfindungsgebiet
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweisen von Mikrobenzellen in einer Probe. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Bestimmen der Anzahl von Bakterien durch einen Biolumineszenz- oder Chemilumineszenzassay.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Beim Bestimmen der mikrobiologischen Qualität von biologischen Materialien, z.B. dem Bestimmen der Anzahl von Bakterien in für den menschlichen Verzehr bestimmtem Fleisch sind verschiedene Versuche unternommen worden, von Biolumineszenzreaktionen, insbesondere der sogenannten "Glühwürmchen"- Reaktion oder Luciferin/Luciferase-Reaktion Gebrauch zu machen. In dieser Reaktion reagiert Adenosintriphosphat (ATP) mit Luciferin in Gegenwart des Enzyms Luciferase, wobei Licht erzeugt wird, und dieses Verfahren ist ein schnelles und empfindliches Verfahren zum Bestimmen von ATP in einer Probe. Da ATP in praktisch allen lebenden Zellen vorhanden ist, kann das Verfahren verwendet werden, um die Anwesenheit von somatischen (eukaryotischen), bakteriellen und Pilzzellen in einer Probe nachzuweisen. Wenn, wie im vorliegenden Fall, der Zweck speziell ist, die Anzahl von Bakterien zu bestimmen, wird es wichtig, sicherzustellen, daß nicht-bakterielle Zellen in der Probe, insbesondere somatische Zellen (wie etwa Gewebezellen aus einer Fleischprobe) nicht die Messung dadurch stören, daß sie mit ihrem eigenen ATP zu der Biolumineszenzreaktion beitragen. Mit anderen Worten wird es wichtig, sicherzustellen, daß nur ATP aus Bakterienzellen an der Biolumineszenzreaktion beteiligt ist, wogegen es verhindert werden sollte, daß ATP aus somatischen Zellen an der Reaktion teilnimmt.
  • Ein Weg, um dies zu erreichen, wäre, selektiv die somatischen Zellen zu lysieren, ohne die Mikrobenzellen zu beeinträchtigen, aber die bisher verwendeten Verfahren beschreiben stets die Verwendung einer Art von aktivem lysierenden Mittel, welches gewöhnlich eine Art von oberflächenaktivem Mittel ist. So beschreibt das U.S. Patent Nr. 4,303,752 die selektive Entfernung von ATP aus somatischen Zellen in einem Gemisch aus somatischen und Mikrobenzellen durch Behandeln der Probe mit einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel, z.B. einem ethoxylierten Alkylphenol. Jedoch ist auch bekannt, daß eine Anzahl von nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln die Hemmung des Luciferaseenzyms in dem nachfolgenden Biolumineszenzassay verursachen kann, was bedeutet, daß jeder Überrest des nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels, der nicht entfernt worden ist, signifikant die ausgegebene Lichtmenge und folglich die Empfindlichkeit des Assays verringert.
  • Was den nachfolgenden Biolumineszenzassay angeht, haben verschiedene im Handel erhältliche Verfahren zur Durchführung dieses Assays Glasbehälter (Küvetten) eingesetzt, in denen sowohl das Aufbrechen der somatischen Zellen, die Inaktivierung des freigesetzten somatischen ATPs, die Freisetzung des bakteriellen ATPs und die Reaktion mit Luciferin/Luciferase in dem gleichen Behälter stattfindet. Ein solches System hat eine Anzahl von Nachteilen. Erstens ist es erforderlich, ein Enzym (Somase) zu verwenden, um das somatische ATP inaktiv zu machen, da das somatische ATP nicht physikalisch aus dem Medium entfernt werden kann, was seinerseits die nachfolgende Inaktivierung des Enzyms vor der Freisetzung des bakteriellen ATPs erfordert. Zweitens verringert die Anwesenheit von Zellfragmenten und Überresten in dem Medium die Empfindlichkeit der Lumineszenzreaktion aufgrund der Streuung des während der Reaktion emittierten Lichts. Folglich ist dieses Verfahren nicht gut geeignet, um die niedrigen Konzentrationen von Bakterien zu bestimmen, die auf dem Gebiet der Qualitätskontrolle von Nahrungsmitteln vorgefunden werden, ganz abgesehen von den zahlreichen zusätzlich erforderlichen Inaktivierungsschritten.
  • Andere vorgeschlagene Verfahren, die jedoch nicht zu im Handel erhältlichen Instrumenten geführt haben, haben davon Gebrauch gemacht, daß das nun gereinigte bakterielle Material auf der Oberfläche eines Substrats wie einer Filteroberfläche vorhanden ist und einen Behälterteil auf das Substrat herabgelassen, um eine geschlossene Meßkammer zu bilden, wobei der Behälterteil Mittel zum Nachweisen von Licht, wie etwa einen Photomultiplier, umfaßt. Jedoch macht die Tatsache, daß eine der Wände der Meßkammer durch die Filteroberfläche gebildet wird, auf welcher die zu zählenden Bakterien sich befinden, es schwierig, sicherzustellen, daß die Meßkammer vollständig lichtundurchlässig ist; die poröse und/oder durchscheinende Eigenschaft der meisten Filtermaterialien verursacht Schwierigkeiten beim Versuch, eine vollkommen lichtundurchlässige Abdichtung zwischen dem Behälterteil und der Oberfläche des Filtermaterials bereitzustellen.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der Anzahl von Bakterien auf der Oberfläche des Substrats, wobei das Verfahren umfaßt:
  • a) Bilden einer geschlossenen Kammer mit einer inneren Wand, die teilweise durch die Bakterien tragende Oberfläche des Substrats definiert ist;
  • b) in Kontakt bringen der Bakterien tragenden Oberfläche mit einem wässerigen Extraktionsmedium, welches in der Lage ist, die Zellwände der Bakterien zu durchlöchern und im wesentlichen das gesamte in den Bakterien vorhandene ATP zu extrahieren;
  • c) Überführen des Extraktionsmediums in eine getrennte Meßkammer;
  • d) Zugeben von Luciferin und Luciferase zu dem Extraktionsmedium, um das ATP in dem Extraktionsmedium einer Luciferin/Luciferase-Reaktion zu unterwerfen; und
  • e) Bestimmen der Menge des ATP durch Messen des als Folge der Reaktion emittierten Lichts in der Meßkammer und Ausdrücken der Menge des ATP als Anzahl der auf dem Substrat vorhandenen Bakterien.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird vor dem Schritt a) Adenosintriphosphat (ATP) aus somatischen Zellen in einer Probe, die somatische Zellen und Bakterien enthält, im wesentlichen selektiv durch ein Verfahren entfernt, welches das Behandeln der Probe mit Wasser, um die Membranen der somatischen Zellen aufzubrechen, und im wesentlichen das Entfernen oder Inaktivieren des freigesetzten ATPs umfaßt.
  • Die Fähigkeit von Wasser, als das einzige Behandlungsmaterial zu dienen, um die somatischen Zellen dazu zu bringen, ihr ATP freizusetzen, ist auf die Tatsache zurückzuführen, daß die somatischen Zellen, anders als die Mehrzahl der Bakterien, nicht von einer Zellwand als äußerster Grenze umgeben sind, sondern nur von einer fragilen Zellmembran. Deshalb führt das Behandeln der somatischen Zellen mit einem Medium, welches nicht mit dem Medium im Innern der Zellen im osmotischen Gleichgewicht ist, im Fall von Wasser mit einem hypotonen Medium dazu, daß die Zellen anschwellen und aufbrechen, wodurch sie ihren ATP-Gehalt freisetzen. Im Hinblick auf die intensiven Anstrengungen von früheren Arbeitsgruppen, die selektive Entfernung nur des somatischen ATPs durch die Verwendung von verschiedenen Behandlungsmitteln herbeizuführen, ist es überraschend, daß eine einfache Behandlung mit Wasser in der Lage ist, im wesentlichen selektiv das ATP aus den somatischen Zellen in der Probe zu entfernen.
  • Es ist vorteilhaft, daß die somatischen Zellen in der Probe als einzelne Zellen oder sehr kleine Zellaggregate vorliegen, da dies darüber hinaus die osmolytische Wirkung der Wasserbehandlung verstärkt. Z.B. kann die Probe, welche somatische Zellen und Bakterien enthält, aus einer Fleischprobe erhalten werden, deren mikrobielle Qualität bestimmt werden soll. Als Beispiel für die Vorbehandlung der Probe kann eine abgemessene Menge Fleisch mit einer abgemessenen Menge einer Vorbehandlungsflüssigkeit oder eines Verdünnungsmittels (wie physiologischer Kochsalzlösung, die gegebenenfalls Pepton enthält) vermischt und mechanisch behandelt werden, z.B. durch Kneten, gefolgt von Abtrennung des flüssigen Teils der Probe und dem Abtrennen von größeren Zellaggregaten von der erhaltenen Flüssigkeit z.B. durch Filtration oder Zentrifugation. Die Probe (ohne die größeren Zellaggregate) wird dann einerseits Bakterien umfassen, die aus der Probe freigesetzt wurden, und andererseits einzelne somatische Zellen oder kleine Aggregate von somatischen Zellen. Das Verdünnungsmittel trägt dazu bei, die somatischen Zellen für die nachfolgende Wasserbehandlung vorzubereiten, insofern, als das Verdünnungsmittel "entfettet", d.h., es entfernt Fett von der Oberfläche der somatischen Zellen. Das Verdünnungsmittel kann ferner einen Puffer wie einen Citrat/Phosphat-Puffer bei einem pH um 5,5 herum enthalten.
  • In der bevorzugten Ausführungsform wird die Behandlung der Probe mit Wasser in einer Wasserschicht oberhalb der Oberfläche eines Substratmaterials ausgeführt, wobei das Substrat vorzugsweise ein Filtermaterial, insbesondere ein Membranfilter, ist. Um die Freisetzung von somatischem ATP zu beschleunigen, kann die Wasserphase überdies bewegt oder gerührt werden, damit die so erzeugte mechanische Beanspruchung beim Aufbrechen der Zellen hilft. Ebenso kann eine thermische Beanspruchung durch Erwärmen der Wasserphase auf eine Temperatur im Bereich von 35-45ºC angewandt werden. Schließlich führt auch das Filterverfahren zu einer mechanischen Beanspruchung der somatischen Zellen, was weiter das Aufbrechen der Zellen erleichtert.
  • Um das freigesetzte somatische ATP zu entfernen, können die Bakterien und Zellfragmente von der Wasserphase abgetrennt werden und mit einer weiteren Wassermenge gewaschen werden. Im Fall, daß die Behandlung mit Wasser oberhalb der Oberfläche eines Filtermaterials ausgeführt wird, kann die Abtrennung der Überreste der somatischen Zellen und der ganzen Bakterien von der Wasserphase zweckmäßigerweise durch Filtration ausgeführt werden, gefolgt von Waschen mit einer weiteren Menge Wasser, wie oben beschrieben, um die vollständige Entfernung des freigesetzten somatischen ATPs zu gewährleisten.
  • Der Vorteil des Verfahrens der Erfindung ist der, daß die Extraktion des ATPs aus den Bakterien und die Messung des während der Luciferin/Luciferase-Reaktion emittierten Lichts in zwei getrennten Kammern stattfindet, wodurch die oben erwähnten Probleme eliminiert werden, die mit dem Durchführen der Extraktion und der Messung der Lichtemission in der gleichen Kammer zusammenhängen. Indem die Lichtmessung in eine getrennte Meßkammer verlegt wird, wird es möglich, einerseits den Einfall von falschem Licht aufgrund einer nicht vollständig lichtundurchlässigen Verbindung zwischen der Substratoberfläche und der Kammer, von der das Substrat eine der Wände bildet, zu vermeiden, und andererseits die Photonenausbeute der Lichtmessung zu erhöhen, z.B. durch Versehen der Meßkammer mit reflektierenden Wänden.
  • Es ist für Fachleute offensichtlich, daß die obigen Schritte a) bis e) nicht notwendigerweise in der angegebenen Reihenfolge ausgeführt werden müssen. So kann die Zugabe von Luciferin und Luciferase zu dem Extraktionsmedium in Schritt d) ebensogut gleichzeitig mit der Extraktionsreaktion in Schritt b) oder unmittelbar vor oder gleichzeitig mit der Überführung des Extraktionsmediums in Schritt c) ausgeführt werden.
  • Da es bevorzugt ist, daß die Überführung des Extraktionsmediums aus der geschlossenen Kammer in die Meßkammer in Schritt c) durch Pumpen ausgeführt wird, ist klar, daß der Schritt d) durch Zugabe von Luciferin und Luciferase zu der Extraktionskammer während der Extraktionsreaktion in Schritt b) oder unmittelbar vor der Überführung des Extraktionsmediums in die Meßkammer; während der Überführung des Extraktionsmediums aus der geschlossenen Kammer in die Meßkammer (z.B. durch eine T-Verbindung); ebenso wie durch Zugeben des Luciferins und der Luciferase zu dem Extraktionsmedium, nachdem es in die getrennte Meßkammer überführt worden ist, ausgeführt werden kann. Mit anderen Worten hat, obwohl einige Beschränkungen der Reihenfolge der Schritte a) bis e) auferlegt sind [z.B., daß der Schritt a) fast immer zuerst und der Schritt e) zuletzt ausgeführt wird], der Fachmann eine erhebliche Freiheit im Hinblick auf die exakte Abfolge der Extraktions-, Überführungs- und Luciferin/Luciferase-Zugabe-Vorgänge, und das Verfahren der Erfindung umfaßt folglich in seinem Umfang jede sequentielle Kombination der Schritte a) - e) oben.
  • Die Verwendung von zwei getrennten Kammern, nämlich einer Extraktionskammer und einer Meßkammer, macht es auch möglich, eine gute Homogenität der Medien sowohl während des Extraktionsvorgangs als auch während des Meßvorgangs zu gewährleisten.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Homogenität während des Extraktionsvorgangs in Schritt b) durch wiederholtes Pumpen des Extraktionsmediums aus der Extraktionskammer heraus und wieder zurück, um das freigesetzte ATP homogen in dem Extraktionsmedium zu verteilen, gewährleistet werden. Um die Notwendigkeit eines dritten Reservoirs zu vermeiden, kann das Extraktionsmedium in geeigneter Weise aus der Extraktionskammer in die Meßkammer und zurück gepumpt werden, um die Homogenität zu erreichen.
  • Auch kann die Homogenität des Mediums nach der Zugabe von Luciferin und Luciferase in Schritt d) durch wiederholtes Pumpen des Extraktionsmediums aus der Meßkammer heraus und zurück vor Schritt e), um das zugegebene Luciferin und die Luciferase homogen in dem Medium zu verteilen, gewährleistet werden, wodurch die Möglichkeit einer maximalen Ausnutzung der lumineszierenden Komponenten und der bestmöglichen Photonenausbeute bereitgestellt wird.
  • Es ist bevorzugt, daß das wässerige Extraktionsmedium ein oder mehrere kationische oberflächenaktive Mittel enthält, insbesondere ausgewählt unter quaternären Ammoniumverbindungen wie N-Cetyl-N,N,N-trimethylammoniumbromid, Dodecyltrimethylammoniumbromid, Dimethyldioctadecylammoniumbromid, Didodecyldimethylammoniumbromid, Benzyltriethylammoniumchlorid, Benzyldimethylhexadecylammoniumchlorid, Tetradecyltrimethylammoniumbromid, Ethylhexadecyldimethylammoniumbromid, Dodecyltrimethylammoniumchlorid, Benzalkoniumchlorid und Gemischen davon. Das Extraktionsmedium kann ferner Chlorhexidindigluconat, Chlorhexidinacetat oder 2-Phenylethanol enthalten.
  • Das Substrat, auf dem sich die Bakterien anfänglich befinden, ist vorzugsweise ein Filtermaterial, insbesondere ein Membranfilter. So kann das Substrat vorzugsweise mit dem Filtermaterial identisch sein, das in dem oben beschriebenen Verfahren verwendet wurde, um im wesentlichen selektiv ATP aus somatischen Zellen in einer Probe, die somatische Zellen und Bakterien enthält, zu entfernen.
  • Im folgenden wird eine Vorrichtung, welche das Verfahren der Erfindung in bevorzugten Ausführungsformen durchführt, im Detail unter Bezugnahme auf die Abbildung erläutert.
  • Durch eine Probenzufuhrleitung 10 wird eine flüssige Probe, die Bakterien und somatische Zellen enthält, in einen thermostatierten Trichter 11 abgegeben. Die Probe kann mit einem Verdünnungsmittel verdünnt werden, welches auch dazu dienen kann, alle in der Probenzufuhrleitung 10 vorhandenen Bakterien in den Trichter 11 zu überführen. Der Trichter 11 ruht auf einem Filterblock 13 mit einem Filterpapierstreifen 12 zwischen dem Trichter 11 und dem Filterblock 13. Der Filterblock 13 enthält einen Hohlraum 44, welcher auf die untere Öffnung des Trichters 11 ausgerichtet ist und auch mit einer Vakuumleitung 14 verbunden ist, die zu einem Vakuumbehälter 16 über ein Ventil 15 führt. Durch Anlegen von Vakuum an den Hohlraum 44 wird die in dem Trichter 11 vorhandene Probe durch den Filterstreifen 12 filtriert, wobei die Bakterien und die somatischen Zellen auf der Oberfläche des Filterstreifens zurückbleiben. Um ATP aus den somatischen Zellen in der Probe zu entfernen, wird die Probe, die aus Bakterien und somatischen Zellen besteht, mit Wasser behandelt. Das Wasser wird aus einem Wasserbehälter 37 mittels einer peristaltischen Pumpe 38 durch eine Wasserzufuhrleitung 39 abgegeben und durch ein Ventil 40 geregelt. Um die somatischen Zellen einer thermischen Beanspruchung auszusetzen, wird das Wasser in einer Thermostatenschlange 41 thermostatisiert, bevor es in den Trichter 11 abgegeben wird. Das Wasser in dem Trichter 11, welches die Bakterien und die somatischen Zellen enthält, wird auch mittels eines Rührers 18 gerührt, der von einem Motor 17 angetrieben wird, und um die somatischen Zellen auch einer mechanischen Beanspruchung auszusetzen. Als Folge der Behandlung mit Wasser, der thermischen Beanspruchung und der mechanischen Beanspruchung bricht die Membran der somatischen Zellen auf, und die somatischen Zellen entleeren ihren Gehalt an ATP in das Wassermedium. Das Wasser wird dann durch Filtrieren durch den Filterstreifen 12 durch Anlegen von Vakuum an den Hohlraum 44 entfernt. Das Wasserbehandlungsverfahren kann mehrmals wiederholt werden.
  • Mittels der Rückzugsvorrichtung 46 wird der Trichter 11 von dem Filterstreifen 12 abgehoben, und der Filterstreifen 12 wird mittels eines Zugmotors 45 um die Kante des Filterblocks 13 in eine Position unterhalb einer offenen Kammer 19 gezogen, welche dann mittels einer Schließeinrichtung 47 auf den Teil der Oberfläche des Filterstreifens 12 herabgelassen wird, welcher die Bakterien und die aufgebrochenen somatischen Zellen umfaßt, um eine geschlossene Kammer zu bilden. Die Kammer ist mit einer Leitung 43 und den Leitungen 22 und 23 verbunden, wobei die Leitungen 22 und 23 an dem Punkt aufeinandertreffen, an dem sie mit der Kammer 19 verbunden sind. Aus einem Tank 20 wird ein wässeriges Extraktionsmedium mittels einer peristaltischen Pumpe 21 durch die Leitung 22 und in die Leitung 23 (aber nicht in die Kammer 19, die mit Luft gefüllt ist), in und durch eine Meßkammer 24, durch eine Leitung 26 und in einen Trichter 27 gepumpt. In dem Trichter 27 wird überschüssiges Extraktionsmedium mittels einer Vakuumleitung 28 abgesaugt, die mit dem Vakuumtank 16 über ein Ventil 29 verbunden ist. Auf diese Weise wird ein festgelegtes Volumen des Extraktionsmediums in das System abgegeben, wobei das Volumen durch das Gesamtvolumen der Leitung 23, der Meßkammer 24, der Leitung 26 und des Trichters 27 bis zu der Höhe, in der die Öffnung der Vakuumleitung 28 in dem Trichter 27 angebracht ist, definiert wird.
  • Die Leitung 43, die mit Luft gefüllt ist, verbindet die Kammer 19 mit einer Kolbenpumpe 34, die auch mit dem Vakuumkreislauf über ein Ventil 35 verbunden ist. Im Anschluß an die Abgabe der richtigen Menge an wässerigem Extraktionsmedium in das System wird die Pumpe 34 in Betrieb gesetzt, um das Extraktionsmedium aus der Leitung 26 und der Meßkammer 24 in die Kammer 19 zu pumpen, wo es mit den Bakterien in Kontakt gebracht wird, welche auf der Oberfläche des Filterstreifens 12 vorhanden sind. Das Extraktionsmedium durchlöchert die Zellwand der Bakterien und extrahiert im wesentlichen das gesamte in den Bakterien vorhandene ATP. Um eine homogene Verteilung des extrahierten ATPs in dem wässerigen Extraktionsmedium zu gewährleisten, wird die Pumpe 34 in hin- und her bewegender Weise betrieben, um das wässerige Extraktionsmedium mehrmals in die Kammer 19, aus der Kammer 19 heraus und in die Meßkammer 24 zu pumpen, wobei die Pumpe angehalten wird, wenn ein größerer Teil des Extraktionsmediums sich in der Meßkammer 24 befindet. Während der hin und her bewegenden Überführung des Extraktionsmediums, welches nun das aus den Bakterien extrahierte ATP enthält, wird eine abgemessene Menge an Lumineszenzreagens, welches Luciferin und Luciferase enthält, aus einem Tank 31 mittels einer peristaltischen Pumpe 32 durch eine Leitung 33 in die Meßkammer 24 abgegeben. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die hin- und her bewegende Überführung des Extraktionsmediums zwischen der Kammer 19 und der Meßkammer 24 während eines kurzen Zeitraums nach der Abgabe des Lumineszenzreagenses fortgesetzt, um dieses homogen in dem gesamten Volumen des Extraktionsmediums zu verteilen. Wenn die Pumpe 34 angehalten wird, befindet sich das Extraktionsmedium, welches nun bakterielles ATP ebenso wie Luciferin und Luciferase enthält, in der Meßkammer 24, wo das durch die Lumineszenzreaktion zwischen Luciferin, Luciferase und ATP erzeugte Licht mittels des Photomultipliers 25 gemessen wird. Der Photomultiplier 25 ist mit einem Zählsystem 48 verbunden, welches die Anzahl der von dem Photomultiplier infolge der Lumineszenzreaktion emittierten Signale zählt.
  • Als letzter Betriebsvorgang wird das System entleert und gereinigt, um es für die nächste Probe vorzubereiten. Für Reinigungszwecke kann Wasser aus dem Behälter 37 oder das oben erwähnte Verdünnungsmittel, welches zum Reinigen der Pipette verwendet wurde, durch ein Ventil 42 in die Leitung 30 abgegeben und durch das System durch Anlegen von Vakuum an das System entweder über das Ventil 35 oder ein Ventil 36 hindurchgeleitet werden, wobei das System, das aus den Leitungen 22, 23, 26 und 43, der Kammer 19, der Meßkammer 24 und der Pumpe 34 besteht, am Ende frei von Flüssigkeit und trocken ist. Auf diese Weise wird das System für einen neuen Meßzyklus vorbereitet.
  • Da die Luciferin/Luciferase/ATP-Reaktion ihren maximalen Reaktionswirkungsgrad bei etwa 22ºC hat, ist es bevorzugt, daß die Leitung 23, welche die Extraktionskammer und die Meßkammer 24 verbindet, auch Mittel zum präzisen Thermostatisieren des durch die Leitung 23 fließenden Mediums umfaßt, wobei das thermostatisierende Mittel insbesondere von einer Art ist, die das Medium sowohl erwärmen als auch kühlen kann, wie etwa ein Peltier-Element.
  • Um die Thermostatisierbedingungen in der Leitung 23 zu verbessern, ist es bevorzugt, daß die Leitung 23 ein relativ hohes Länge/Durchmesser-Verhältnis hat, wie etwa von 50 bis 300, vorzugsweise 100 bis 200, wie etwa um 150.
  • Ein Probenverdünnungsmittel, dessen Zweck ist, die vollständige Überführung aller Bakterien, die sich in einer probenhaltigen Vorrichtung wie der Probenzufuhrleitung 10 in der Abbildung befinden, in eine Probenaufnahmevorrichtung wie den Trichter 11 zu gewährleisten, kann verwendet werden. Es ist bevorzugt, daß das Probenverdünnungsmittel einen pH von 4 bis 8, insbesondere 5 bis 7, besonders um 5,7 hat. Das Verdünnungsmittel kann einen Citrat/Phosphat-Puffer umfassen, insbesondere einen solchen, der Citronensäure und Na&sub2;HPO&sub4; oder ein Hydrat davon, insbesondere Na&sub2;HPO&sub4; 2H&sub2;O enthält. Die Mengen der Pufferkomponenten können z.B. von 6,45 bis 0,29 g/l Citronensäure, insbesondere 5,1 bis 1,8, ganz besonders um 4,55 g/l Citronensäure ebenso wie 6,9 bis 17,3 g/l Na&sub2;HPO&sub4; 2H&sub2;O, insbesondere 9,0 bis 14,6 g/l, ganz besonders um 10,56 g/1 Na&sub2;HPO&sub4; 2H&sub2;O liegen. In Proben, die signifikante Mengen an Fett enthalten (z.B. Milchproben), kann das Verdünnungsmittel auch kleine Mengen eines oberflächenaktiven Mittels enthalten, um die Filtration der Probe dadurch zu erleichtern, daß es den Fettkügelchen der fetthaltigen Probe dabei behilflich ist, durch das Filtermaterial hindurchzugehen. Das oberflächenaktive Mittel kann aus einer großen Vielzahl von solchen Materialien ausgewählt werden, aber ist vorzugsweise ein nichtionisches Detergens wie z.B. Triton X-100 (Polyethylenglykol-p-isooctylphenylether, von Rohm & Haas, Westdeutschland), wobei das oberflächenaktive Mittel in Mengen von bis zu 0,01% vorhanden ist. Jedoch ist das Vorhandensein des oberflächenaktiven Mittels in fetthaltigen Proben wahlfrei, da gefunden wurde, daß verläßliche Ergebnisse auch ohne die Verwendung eines oberflächenaktiven Mittels erhalten werden können.
  • Ein Extraktionsmedium zur Verwendung beim Extrahieren des ATPs, welches in den Bakterien vorhanden ist, kann verwendet werden. Wie oben beschrieben, wird diese Extraktion im Anschluß an die Entfernung von ATP aus somatischen Zellen durchgeführt. Das Extraktionsmedium enthält vorzugsweise ein kationisches oberflächenaktives Mittel, insbesondere ein oberflächenaktives Mittel mit quaternärem Ammonium, ausgewählt aus den oben erwähnten, wie etwa N-Cetyl-N,N,N-trimethylammoniumbromid (CTAB), ebenso wie Chlorhexidindigluconat. Aufgrund der besonderen Art und Weise, in der die Lumineszenzreaktion durchgeführt wird, nämlich in einer getrennten Kammer, ist es wichtig, die Zusammensetzung des Extraktionsmediums an das zeitliche Profil der Reaktion anzupassen. So kann eine Luciferin/Luciferase-Reaktion in Abhängigkeit von den Eigenschaften des Extraktionsmediums im Hinblick auf das Beschleunigen/Verzögern der lichtemittierenden Reaktion so durchgeführt werden, daß das Licht als ziemlich kurzes Signal oder als länger dauernde Emission emittiert wird. Dies ist z.T. auf die Tatsache zurückzuführen, daß das während der Reaktion freigesetzte Produkt, nämlich Oxyluciferin, eine hemmende Wirkung auf das Enzym Luciferase ausübt. Somit tritt nur eine sehr kleine Menge des in der Probe vorhandenen ATPs tatsächlich in die Reaktion, welche Licht freisetzt, ein, bevor das Enzym gehemmt wird oder die Reaktion aus zeitlichen Gründen beendet werden muß. Folglich wird stattdessen die Eigenschaft ausgenutzt, daß die Intensität der Lichtemission der Konzentration von ATP proportional ist. Im vorliegenden Fall wird die tatsächliche Lichtmessung einige Sekunden nach der Zumischung von Luciferin/Luciferase zu der extrahierten Probe durchgeführt, und ein Extraktionsmedium, das in dem Verfahren der Erfindung brauchbar ist, sollte deshalb in einer solchen Weise angepaßt sein, daß die maximale Lichtemission stattfindet, wenn die Probe die Meßkammer erreicht hat.
  • Deshalb ist es bevorzugt, daß das Extraktionsmedium 0,02 bis 1,0 g/l CTAB und 0,1 bis 16,0 g/1 Chlorhexidindigluconat, insbesondere 0,1 g/l CTAB und 0,5 g/l Chlorhexidindigluconat enthält.
  • Die Erfindung wird weiter mittels der folgenden Beispiele veranschaulicht.
    • BEISPIEL 1
  • Die Experimente wurden in einer Vorrichtung von der Art, wie sie in der Abbildung veranschaulicht ist, durchgeführt, in welcher die Extraktionskammer zylindrisch mit einem Durchmesser von 10 mm und einer Tiefe von 1 mm war, die Meßkammer ebenfalls zylindrisch mit einem Durchmesser von 10 mm und einer Tiefe von 1 mm war und das Rohr (Leitung 23), welches die beiden Kammern verbindet, eine Länge von 70 mm und einen Innendurchmesser von 0,5 mm hatte. Die Pumpe 34 war eine Hubkolbenpumpe mit einem Verdrängungsvolumen von 100 ul.
  • Das zum Spülen der Pipette 10 verwendete Verdünnungsmittel war ein Citrat/Phosphat-Puffer, welcher 4,55 g/l Citronensäure und 10,56 g/l Na&sub2;HPO&sub4; 2H&sub2;O enthielt, mit einem pH von ca. 5,7. Das Extraktionsmedium war eine Lösung aus 0,1 g/l N-Cetyl-N,N,N-trimethylammoniumbromid und 0,50 g/l Chlorhexidindigluconat.
  • Das Luciferin/Luciferase-Reagens wurde aus einem im Handel erhältlichen Reagens von Lumac/3M, Niederlande, hergestellt. Die im Handel erhältliche Packung besteht aus einem gefriergetrockneten Präparat, welches D-Luciferin, gereinigte Glühwürmchenluciferase, Rinderserumalbumin und Dithiothreitol enthält, und wurde in einem speziellen Puffer von der gleichen Firma hergestellt, welcher 0,025 M Hepes (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure), 0,0075 M Magnesiumsulfat, 0,001 M EDTA und 0,02% Natriumazid enthielt.
  • 100 ul einer Probe wurden mittels der Pipette 10 in den Trichter 11 eingegeben und mit 3 x 1,3 ml Verdünnungsmittel unter Rühren gewaschen, wonach die Probe mit 1,3 ml Wasser bei 37ºC unter Rühren behandelt wurde. Der Filter wurde dann in die Position unter der offenen Kammer 19 transportiert, welche dann auf den Filter aufgesetzt wurde, wonach 500 ul Extraktionsmedium durch die Leitungen 22 und 23 (aber nicht in die Kammer 19), durch die Meßkammer 24 und in den Trichter 27 gepumpt wurden, wo die überschüssige Menge durch Vakuum entfernt wurde, was ein Volumen von 120 ul Extraktionsmedium in dem System zurückließ. Mittels der Pumpe 34 wurde das Extraktionsmedium insgesamt 15 Mal in die Extraktionskammer und wieder heraus gepumpt.
  • Während einem der aktiven Pumpenhübe wurden 20 ul Luciferin/Luciferase-Reagens durch die Leitung 33 zugegeben, wonach die Pumpe 34 weitere zwei Pumpenzyklen zwischen der Extraktionskammer und der Meßkammer 24 ausführte, was die Flüssigkeit in der Meßkammer zum Nachweis durch den Photomultiplier zurückließ, dessen Signal elektronisch in einer üblichen Weise quantifiziert wurde.
  • Zehn Proben von rohem gemahlenen Rindfleisch wurden analysiert, welche 3 x 10&sup4; bis 10&sup8; Bakterien pro Gramm enthielten, wie durch das Standardplattenauszählverfahren bestimmt wurde. Zur Analyse wurde eine 10 g-Probe in eine sterile Kunststofftüte gegeben, mit 90 g einer 0,9%-Kochsalzlösung, die Pepton enthielt, vermischt und 30 s lang in einem sogenannten "Stomacher" geknetet. Ca. 7 ml der homogenisierten Probe wurden bei 1000 Upm 30 s lang zentrifugiert, und der Überstand wurde in der Vorrichtung in der oben beschriebenen Weise analysiert. Jede Fleischprobe wurde 3 Mal hergestellt und analysiert.
  • Die Ergebnisse wurden statistisch mit den Ergebnissen der Plattenauszählung durch eine lineare Regressionsanalyse verglichen, welche eine Standardabweichung um die Regressionsgerade von 7% relativ zeigte, was besser ist als die normalerweise erreichbare Wiederholbarkeit mit dem Plattenauszählverfahren. Der Beitrag des somatischen ATPs war konstant und konnte durch Eichung abgezogen werden, ohne die Standardabweichung der Genauigkeit zu beeinträchtigen.
    • BEISPIEL 2
  • In dem vorliegenden Beispiel wurde das gleiche Instrument, das in Beispiel 1 eingesetzt worden war, zur Messung von Rohmilchproben verwendet. Alle Proben waren Rohmilch aus anliefernden Tankfahrzeugen, und die Milch wurde auf 40ºC vorgewärmt und leicht (durch Umwenden) vor der Eingabe in das Instrument vermischt. Das Ergebnis wurde mit der Zählung der gesamten Lebendzellzahl (TVC) verglichen, die durch die spiralförmige Ausplattierungsmethode auf Bacto-Plattenauszählagar (Bacto Plate Count Agar (Difo)), welche bei 21ºC vier Tage lang inkubiert wurden, bestimmt wurde. Die notwendigen Verdünnungen wurden in wässeriger NaCl/Pepton- Lösung vorgenommen (8,5 g NaCl und 1,0 g Pepton in einem Liter destillierten Wasser).
  • Die verschiedenen Verdünnungsmittel und Reagenzien waren identisch mit den im Beispiel 1 eingesetzten, mit der Ausnahme des Verdünnungsmittels, welches zum Spülen der Pipette verwendet wurde (d.h., während der anfänglichen Filtrationsphase), wo 0,01 Gew.-% Triton X-100 zu dem Verdünnungsmittel zugegeben wurde, um die Filtration dadurch zu erleichtern, daß es den Fettkügelchen in der Milch dabei behilflich war, durch das Filtermaterial hindurchzugehen. Jedoch ist die Zugabe des nicht ionischen Detergents Triton X- 100 keineswegs unverzichtbar; Experimente, die ohne die Zugabe von Triton X-100 durchgeführt wurden, ergaben ausgezeichnete Ergebnisse, wobei der einzige Unterschied darin lag, daß die Wiederholbarkeit der Ergebnisse im Fall der Zugabe von Triton X-100 etwas besser war. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Mittelwerten der Ergebnisse.
    • Ergebnisse
  • In einer ersten Gruppe von Experimenten wurden Messungen an 185 Rohmilchproben aus einzelnen Tankfahrzeugen in einer dänischen Molkerei durchgeführt, und Vergleiche wurden zwischen der gesamten Lichtzählung und der gesamten Lebendzellzahl angestellt. Um den dynamischen Bereich von 10&sup4; bis 10&sup6; auf 10&sup4; bis 10&sup8; CFU/ml zu erweitern, wurden zehn der Proben 24 Std. lang bei 6ºC vor der Analyse gelagert. Die lineare Regression zwischen log (Lichtzählung) und log (TVC) ergab einen Korrelationskoeffizienten von 0,92, eine Steigung der Regressionsgeraden von 1,17 und eine Standardabweichung von 0,28 bei logarithmischer Auftragung.
  • In einer zweiten Gruppe von Experimenten wurden Messungen in einer westdeutschen Molkerei durchgeführt, um zu untersuchen, wie Abweichungen und die Zusammensetzung der Milch und der Flora das Ergebnis beeinflussen würden. 119 einzelne Rohmilchproben aus ankommenden Tankfahrzeugen wurden in der gleichen Weise wie die erste Gruppe von Experimenten analysiert. Die Regression von log (Lichtzählung) gegen log (TVC) ergab eine Regressionsgerade mit einer Steigung von 0,95, einen Korrelationskoeffizient von 0,88 und eine Standardabweichung von 0,21 bei logarithmischer Auftragung.
  • Auf der Basis der obigen zwei Gruppen von Ergebnissen wurde eine gemeinsame statistische Analyse aller Daten von allen 304 Proben durchgeführt, um die Leistung des Instruments in Bezug auf Milchmengen zu ermitteln. Die Analyse ergab einen Korrelationskoeffizienten von 0,92, eine Steigung von 1,17 und eine Standardabweichung von 0,27 bei logarithmischer Auftragung.
    • Diskussion
  • In diesem Experiment wurden alle Ergebnisse des Instruments in willkürlichen Lichteinheiten ohne jede Art von am Instrument durchgeführter Eichung angegeben. Das Instrument lieferte die Ergebnisse als Angabe von CFU/g.
  • Die zehn am stärksten kontaminierten Proben in der ersten Gruppe von Experimenten wurden, wie angegeben, 24 Std. lang bei 6ºC inkubiert. Diese Proben wurden mit aufgenommen, um den Bereich der Kontaminationswerte so zu erweitern, daß er sich über vier Zehnerpotenzen erstreckte, und die Leistung und den dynamischen Bereich des erfindungsgemäßen Verfahrens zu überprüfen. Die lineare Beziehung zwischen der Lumineszenz und TVC bei Milchmengen bis herab zu 10&sup4; CFU/ml, eine Regressionsgerade mit einer Steigung in der Nähe von 1 und eine kleine Standardabweichung bedeuten, daß kein übriggebliebenes somatisches ATP auf dem Filter vorhanden ist, wenn das mikrobielle ATP extrahiert wird, wodurch die Leistungsfähigkeit des Schritts der Extraktion des somatischen ATPs unter Beweis gestellt wird. Frühere Untersuchungen an Milch haben Schwierigkeiten bei der Entfernung von somatischem ATP aufgewiesen und waren folglich nicht in der Lage, Kontaminationswerte unterhalb von 10&sup5; CFU/ml nachzuweisen (Bossuyt, R. "Determination of Bacteriological Quality of Raw Milk by an ATP Assay Technique", Milchwissenschaft 36(5), 1981, S. 257-260; Theron, D.P., Prior, B.A. und Latagan, P.M. "Determination of Bacterial ATP Levels in Raw Milk: Selectivity of Non-bacterial ATP Hydrolysis", Journal of Food Protection 49 (1), 1986, S. 4-7). Eine Steigung nahe bei 1 bedeutet, daß das Lumineszenzsignal direkt mit TVC in Beziehung steht. Dieser einfache Zusammenhang ist viele Male in Wachstumskurven-Untersuchungen, die ATP-Messungen und herkömmliche TVC-Bestimmungen einbezogen, bestätigt worden, welche anzeigen, daß die ATP-Werte parallel mit der TVC in der logarithmischen Wachstumsphase ansteigen.

Claims (10)

1. Verfahren zum Bestimmen der Anzahl von Bakterien auf der Oberfläche eines Substrats, wobei das Verfahren umfaßt:
a) Bilden einer geschlossenen Kammer mit einer inneren Wand, die teilweise durch die bakterientragende Oberfläche des Substrats definiert ist;
b) Inkontaktbringen der bakterientragenden Oberfläche mit einem wässrigen Extraktionsmedium, welches in der Lage ist, die Zellwände der Bakterien zu durchlöchern und im wesentlichen das gesamte in den Bakterien vorhandene ATP zu extrahieren;
c) Überführen des Extraktionsmediums in eine getrennte Meßkammer;
d) Zugeben von Luciferin und Luciferase zu dem Extraktionsmedium, um das ATP in dem Extraktionsmedium einer Luciferin/-Luciferase-Reaktion zu unterwerfen; und
e) Bestimmen der Menge des ATP durch Messen des als Folge der Reaktion emittierten Lichts in der Meßkammer und Ausdrücken der Menge des ATP als Anzahl der auf dem Substrat vorhandenen Bakterien.
2. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem die Überführung des Extraktionsmediums in Schritt c) aus der geschlossenen Kammer in die Meßkammer durch Pumpen durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, in welchem das Extraktionsmedium während des Schritts b) wiederholt aus der Extraktionskammer in die Meßkammer und zurück gepumpt wird, um das ATP homogen in dem Extraktionsmedium zu verteilen.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 3, in welchem das Extraktionsmedium nach der Zugabe von Luciferin und Luciferase in Schritt d), aber vor Schritt e), wiederholt aus der Meßkammer in die Extraktionskammer und zurück gepumpt wird, um das Luciferin und die Luciferase homogen in dem Medium zu verteilen.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 4, in welchem das wässrige Extraktionsmedium ein oder mehrere kationische oberflächenaktive Mittel enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 5, in welchem das kationische oberflächenaktive Mittel ausgewählt wird aus N-Cetyl- N,N,N-trimethylammoniumbromid, Dodecyltrimethylammoniumbromid, Dimethyldioctadecylammoniumbromid, Didodecyldimethylammoniumbromid, Benzyltriethylammoniumchlorid, Benzyldimethylhexadecylammoniumbromid, Tetradecyltrimethylammoniumbromid, Ethylhexadecyldimethylammoniumbromid, Dodecyltrimethylammoniumbromid, Benzalkoniumchlorid, und Gemischen davon.
7. Verfahren nach Anspruch 1, in welchem das Substrat ein Filtermateriai ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, in welchem das Filtermaterial ein Membranfilter ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 8, in welchem vor Schritt a) jegliches ATP aus somatischen Zellen auf der Oberfläche auf dem Substrat durch die Behandlung der somatischen Zellen mit Wasser, um die Membranen der somatischen Zellen aufzubrechen und im wesentlichen das freigesetzte ATP zu entfernen oder zu inaktivieren, im wesentlichen selektiv entfernt worden ist, wobei die Behandlung in einer Wasserschicht über der Oberfläche des Substrats durchgeführt wird.
10. Vorrichtung zum Bestimmen der Anzahl von Bakterien auf der Oberfläche eines Substrats, wobei die Vorrichtung umfaßt: einen Behälterteil, der eine offene Kammer (19) darin definiert, Verschlußmittel (47) zum Verschließen des Behälterteils mittels des Substrats, um eine geschlossene Kammer zu bilden, Mittel (34, 35, 43) zum Einbringen eines wässrigen Extraktionsmediums in die geschlossene Kammer, eine getrennte Meßkammer (24), Mittel (23) zum Überführen des Extraktionsmediums aus der geschlossenen Kammer in die Meßkammer, Mittel (31, 32, 33) zum Einbringen eines Reaktanten-Mediums in das Extraktionsmedium in die geschlossene Kammer, die Meßkammer und/oder dazwischen, und Mittel (25, 48) zum Nachweisen von in der Meßkammer emittiertem Licht.
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