DE69730425T2

DE69730425T2 - Methode zum nachweis von kontaminanten

Info

Publication number: DE69730425T2
Application number: DE69730425T
Authority: DE
Inventors: David C. Miller; Lawrence Loomis
Original assignee: New Horizons Diagnostics Corp
Current assignee: New Horizons Diagnostics Corp
Priority date: 1997-01-15
Filing date: 1997-03-25
Publication date: 2005-10-06
Anticipated expiration: 2017-03-26
Also published as: CA2249370A1; JP2002514916A; IL126192A0; CN1154847C; EP0901631B1; CN1218553A; WO1998032020A1; DE69730425D1; US5736351A; AU2533297A; PL329003A1; PL189724B1; EP0901631A4; EP0901631A1; ATE274700T1; IL126192A; EP1460427A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung befasst sich mit der Methode, das Vorhandensein und die Bestimmung der Menge von Verunreinigungen nachzuweisen. Im Besonderen befasst sich die Methode mit einer schnelleren Ermittlung der gesamten durch Mikroorganismen hervorgerufenen Verunreinigung oder dem Nachweis der Existenz und der Menge von bestimmten mikrobiellen oder chemischen Kontaminanten, die sich auf jeder Oberfläche befinden, einschließlich auf Oberflächen von Schlachtkörpern und anderen Lebensmitteln, Oberflächen von Geräten und solchen, auf denen Lebensmittel verarbeitet und zubereitet werden und Oberflächen auf medizinischen Geräten und Material wie auch Handschuhen. Kontaminanten in Luft und Flüssigkeiten sind ebenfalls nachweisbar. Außerdem umfasst die Erfindung eine Methode zum Nachweis der gesamten mikrobiellen und von spezifischen mikrobiellen oder chemischen Verunreinigungen mit Hilfe von Biolumineszenz und Chemolumineszenz.
Hintergrund der Erfindung
Mikrobielle Verunreinigung ist eine wichtige Ursache für Morbidität und Letalität. Schnelle Routineuntersuchungen für den Mengennachweis von Bakterien, besonders jenen, die sich auf Oberflächen befinden, sind oft lebenswichtig, ganz besonders bei der Lebensmittelverarbeitung und in Krankenhäusern. Lebensmittelvergiftungen sind oft das Resultat von mikrobieller Verunreinigung bei Fleisch und Lebensmitteln, was während der Zubereitung geschieht. Die Verunreinigung kann auch durch den Kontakt der Lebensmittel mit Oberflächen zustande kommen. Außerdem werden Krankheiten in Krankenhäusern und anderen Einrichtungen oft durch die Übertragung von ansteckenden Erregern auf den Oberflächen von Kleidung und Geräten, durch Luft, Wasser und andere Flüssigkeiten übertragen.
Ein Schlüsselmerkmal dieser Anwendungen beruht auf der Notwendigkeit, innerhalb von Minuten Testergebnisse zu erhalten, eine Methode, um einen möglichen Kontaminanten auf einer Anzahl von Oberflächen, Flüssigkeiten und der Luft auszuschalten; das ist die Voraussetzung, um eine Überschneidung bei den Ergebnissen von einem Test zum anderen und eine Notwendigkeit bei allgemeinen und spezifischen Untersuchungen auf Erreger zu vermeiden. Es sollte die Möglichkeit bestehen, die Untersuchung auf Verunreinigung durch Zählung der Erreger und durch die Möglichkeit der Untersuchung auf bestimmte Erreger durchzuführen.
Verschiedene Methoden zur Untersuchung von mikrobieller Verunreinigung auf Oberflächen sind angewandt worden. Bei der traditionellen Methode zur Untersuchung auf Bakterien auf Oberflächen wird die Oberfläche abgewischt; mit der gewonnenen Probe wird dann eine Kultur für 24 bis 48 Stunden auf Nährböden oder in Nährmedien angesetzt, die das Wachstum von Bakterien begünstigen. Diese Kulturen werden per Hand untersucht oder mit Hilfe von Geräten, um die Anzahl von Kolonien festzustellen, die ein Indikator für die Anzahl der Erreger auf der Oberfläche sind. Der Nachteil dieser Methoden liegt in der Dauer der Untersuchung, der dafür ausgebildeten Kräfte und einer möglicherweise nicht adäquaten Identifizierung von bestimmten potentiell pathogenen Keimen, deren Wachstum nicht von den spezifischen Medien oder der Umgebung unterstützt wird. Beispielsweise kann es bei dieser Methode schwierig werden, eine Verunreinigung durch einen Pilz zu erkennen. Außerdem gibt diese Methode bei vielen möglichen Anwendungen nicht die Ergebnisse in dem Zeitrahmen, der für eine wirksame Reaktion benötigt wird.
Lumineszenzreaktionen werden in unterschiedlicher Form verwendet, um Erreger in Fluiden und weiterverarbeiteten Substanzen nachzuweisen. Es würden besonders Bioluminiszenzreaktionen benutzt, die auf die Reaktion von Adenosintriphosphat (ATP) mit Luzeferin in Anwesenheit von Luziferase zurückgehen, das Licht freisetzt (die "firefly"-Reaktion). Da ATP in allen lebenden Zellen vorhanden ist, einschließlich von Erregerzellen, kann diese Methode in einer schnellen Untersuchung angewandt werden, um eine geschätzte Menge von lebenden Zellen in einer Probe zu erhalten. Eine frühe Studie über die Art der Reaktion, deren Entdeckungsgeschichte und das allgemeine Anwendungsgebiet finden wir bei E. N. Harvey (1957), "A History of Luminscence" (Die Geschichte der Luminiszenz). Aus früherer Zeit bis 1900 finden wir "Amer. Phil. Soc., Philadelphia PA and W. D. McElroy and B. L. Strehler (1949) Arch. Biochem. Biophys. 22: 420–433. Als eine andere Möglichkeit wurde mit Hilfe von Chemolumineszenz mittels Isoluminol oder ähnlichen Zusammensetzungen der Nachweis erbracht. Diese Methode beruht auf dem Nachweis von eisenhaltigen Substanzen in den Erregern.
Die Testvorgänge, die die Anwendung von Biolumineszenzreaktionen auf Nachweis von Bakterien und die dafür spezialisierten Geräten für die Messung der damit verbundenen Lichtemissionen belegen, sind bekannt und wurden offengelegt. Plakas (U.S. Pantent Nr. 4,013,418,4,144,134 und 4,283,490) zeigt eine Untersuchung mit Biolumineszenz zur Auffindung von Bakterien in einer Probe einschließlich der Schritte zur Lyse von nicht-bakteriellen Zellen. Es wird eine Filtrierung mittels Überdruck durchgeführt, die bakteriellen Zellen werden gewaschen, und lysiert und freigesetztes ATP mittels Luziferin/Luziferase/Mg2 Reagenz nachgewiesen. Das in diesem Patent beschrieben Verfahren befasst sich nicht mit den spezifischen Problemen der Sammlung von Proben auf Oberflächen oder dem Nachweis von bestimmten Bakterien. Die Dauer der Anwendung wird nicht erwähnt und die dargelegte Erfindung würde sehr viel Zeit beanspruchen.
Chappelle in dem U.S. Patent 4,385,112 beschreibt eine Methode für Nachweis von in Wasser lebenden Bakterien durch Biolumineszenz. Dieser Test benötigt mehrere Stunden zur Durchführung und ist vor allem für die Detektion des Gesamtkeimgehaltes in Wasser geeignet.
In seinem U.S. Patent 3,933,592 erörtert Clendenning eine Methode mittels Biolumineszenz zum Nachweis von mikrobieller Kontamination und bei den Beispielen bezieht er sich bei der Durchführung des Vorgangs auf eine Dauer von weniger als 2 Minuten.
Der Vorgang beinhaltet keine Vorbehandlungsphasen und das Entfernen von somatischen ATP-Zellen. Aegidius (U.S. Patent 5,258,285) beschreibt eine Methode zum Nachweis von bakterieller Konzentration in einer Probe, bei Filtrieren und Waschen zur Entfernung von Fremdbestandteilen eingesetzt wird, einschließlich von somatischen ATP-Zellen; es wird eine Extraktionskammer benutzt, in Luziferin/Luziferase/Mg2+ hinzugefügt und die Reaktion gemessen wird.
Bei dieser Methode wird keine Dauer erwähnt.
Außerdem werden getrennte Kammern für Waschen und Extraktion des bakteriellen ATP und der Messung der Reaktion benutzt. Das kann möglicherweise zu einer verminderten Sensitivität führen, die durch den Materialverlust beim Transport der Lösung von einer Kammer zu anderen hervorgerufen wird. Außerdem beschreibt die Methode nicht, wie das Sammeln von Proben auf einer Oberfläche durchgeführt wird.
Der Nachweis von Bakterien auf Oberflächen ist ein weiteres Problem, das in den oben beschriebenen Methoden nicht erwähnt wird. Vor allem muss die Methode zur Sammlung von Proben mit diesen Testgeräten und -materialien kompatibel sein. Die Methode muss die Bakterien von der Oberfläche auffangen und sie zu einer flüssigen Suspension führen.
Das zweite Problem ist, dass die Oberflächen oder andere zu untersuchende Flächen oft mit Materialen kontaminiert sind, die bei dem Nachweis von Bakterien interferieren könnten. Bei den interferierenden Materialien, die auf Oberflächen, in der Luft oder in Flüssigkeiten vorhanden sein können, handelt es sich um somatische Zellen, die von den Lebensmitteln direkt stammen oder auch tierische und pflanzliche Zellen mit einschließen, oder auch solche von den Händen einer Person, die im Kontakt mit der Oberfläche sind. Da alle lebenden Organismen, einschließlich somatischer Zellen, ATP beinhalten, kann das Vorhandensein dieser Zellen die Auswertung verschleiern oder verändern.
Eine zusätzliche Quelle von interferierenden Substanzen sind solche, die bei der hervorgerufenen Lichtreaktion interferieren. Diese Substanzen umfassen eine große Zahl von Chemikalien wie Chlor, oxidierende Agens, freies ATP, Schwermetalle und andere Chemikalien. Da alle diese Chemikalien zur Desinfizierung von Oberflächen eingesetzt werden, liegt es auf der Hand, dass eine zuverlässige Methode für die Analyse der mikrobiellen Kontamination ein Mittel zum Ausschluss dieser Substanzen von der Probe beinhalten muss.
Bei der Verarbeitung von Lebensmitteln und bei der Anwendung in Krankenhäusern ist es in vielen Fällen eine Vorbedingung, dass die Methode zur Auffindung von mikrobieller Kontamination der Oberflächen schnell durchgeführt werden kann. Zum Beispiel bei der Verarbeitung von Schlachtkörpern von Rindern werden diese auf einem Fließband verarbeitet und jede Untersuchung des Materials auf mikrobielle Kontamination muss innerhalb der vorgegebenen Zeit durchgeführt werden, die zur Verfügung steht, bis der Körper zur Weiterverarbeitung transportiert wird.
Vorher erfasste Methodologien, die auf der Lumineszenz beruhen, um den mikrobiellen Nachweis zu erbringen, umfassen nicht die Mittel, um eine Probe von einer Oberfläche, einem festen Stoff oder aus einem Gas, direkt zu verarbeiten und eine flüssige Suspension für den Test herzustellen oder direkt aus der Luft oder von einer flüssigen Probe zu entnehmen.
Außerdem benötigt das Verfahren verschiedene Geräte oder Kammern zur Aufbewahrung, Filtration und Messung der Reaktion. Schließlich enthalten die Verfahren noch kein Ein-Weg-Testgerät, das für eine Minimierung vom Übergreifen von Kontaminationen steht. Letztendlich benötigen all diese Untersuchungen gerade zum Nachweis von mikrobiellen ATP und anderen spezifischen Kontaminanten die im Vorfeld erwähnten Erfindungen einen ziemlich großen Zeitraum, der nicht bei einer Fließbandverarbeitung, Qualitätskontrolle und sofortiger Überprüfung der Ergebnisse gegeben ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Bei der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine Methode und eine Vorrichtung, um die Präsenz bzw. die mikrobiellen Gesamtkonzentration oder die Konzentration von einer spezifisch gezielten Probe zu ermitteln. In einer Ausführung der Erfindung umfasst die Methode die Sammlung einer Oberflächenprobe durch Wischen eines festgelegten Bereiches der Oberfläche auf eine vorgeschrieben Art; es wird eine Sammelvorrichtung zur Probensammlung eingesetzt, die aus einem Absorptionsmittel oder einem absorbierenden Material besteht. Die Sammelvorrichtung wird in ein Gefäß gesetzt, das ein Fluid enthält und wird geschüttelt, um die auf der Oberfläche gefundenen Kontaminanten von der Sammelvorrichtung an die Flüssigkeit abzugeben. Die Sammelvorrichtung kann ein Schwamm oder ein Wattebausch und der Behälter kann ein Beutel, ein Rohr oder eine kleine Tasse sein. Das Fluid kann direkt gesammelt werden, indem eine flüssige Suspension von der festen Probe angefertigt wird; dabei wird ein Gas durch die Sammelflüssigkeit geleitet oder es wird direkt die Luft auf dem zu testenden Gerät gesammelt.
Ein Aliquot der flüssigen Phase wird dann in ein Ein-Weg-Gefäß weitergeleitet, das aus einem durchsichtigen, hohlen Zylinder besteht, der oben offen ist und bei dem sich unten ein durchlässiger Filter befindet. Die flüssige Phase wird durch ein Ein-Weg Testgerät gefiltert; dabei wird entweder ein Über- oder Unterdruck ausgeübt, wodurch die Erreger oder die zu analysierenden Proben auf der Oberfläche des Filters zurückgehalten werden.
Der Filtriervorgang führt zu einer Konzentrierung der zu analysierenden Probe und zur Eliminierung aller störenden Substanzen von der gesammelten Probe, bevor sie getestet wird; dazu gehören Hemmstoffe oder jedes andere nicht spezifische Material, damit die Sensitivität und Spezifität maximiert wird. Das Filterkonzentrat kann durch Hinzufügen von geeigneter Waschlösung gewaschen und mit entsprechendem Druck kann die flüssige Phase wieder durch den Filter passiert werden. Ein weiteres Kennzeichen der vorliegenden Erfindung ist, dass das auf dem Filter des Ein-Weg-Gerätes gewonnene Konzentrat durch einen Chemolumineszenz-Test oder Biolumineszenz-Test untersucht werden kann. Bei dem letzten Schritt der Testmethode wird ein lumineszentes Substrat zu dem Konzentrat hinzugefügt, das zu einer chemilumineszenten Reaktion und der Messung der Lichtemission durch ein Fotometer führt, die durch die besagte chemolunimeszente Reaktion entsteht. Dieses Fotometer ist der Ein-Weg-Vorrichtung angepasst.
Eine andere Ausführung der Erfindung erlaubt die Untersuchung von Flüssigkeits- und Luftproben, um das Niveau der Kontamination zu bestimmen. Die Anwendung von flüssigen Proben macht die Notwendigkeit des Wischens von Oberflächen, bzw. das Waschen der Proben in einem Fluid überflüssig.
In ähnlicher Weise kann eine Luftprobe getestet werden, wobei das Aufsammeln mit konventionellen Mitteln ohne die Notwendigkeit von Abwischen der Oberflächen vonstatten geht.
Die vorliegende Erfindung bewirkt, dass ein Kontaminant identifiziert werden kann, bzw. dass die Konzentration in weniger als einer Stunde, und im allgemeinen in weniger als 5 Minuten, vom Aufsammeln der Probe an bis zum Endresultat bestimmt werden kann.
Die vorliegende Erfindung umfasst ganz besonders die Methode der Untersuchung durch Chemolumineszenz sowohl als auch Biolumineszenz für ATP, chemolumineszente Immunoassays oder DNA-Untersuchungen. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beruht auf der Methode zur Bestimmung der gesamten mikrobiellen Kontamination, bei der folgende Schritte ausgeführt werden:

a) Sammeln von Proben mit einer Sammelvorrichtung
b) Schütteln der Sammelvorrichtung mit einer flüssigen Phase, damit die Kontaminanten in die flüssige Phase weitergeleitet werden, die damit zur Sammelflüssigkeit wird. Ein Aliquot der Sammelflüssigkeit in ein Ein-Weg-Testgerät geben.
c) Ein Aliquot der Sammelflüssigkeit in ein Ein-Weg-Testgerät geben.
d) Hinzufügen von Wasch- bzw. Lysierungsreagenzien, die alle im Aliquot vorhandenen somatischen Zellen lysieren.
e) Ein Überdruck wird oben auf das Ein-Weg-Testgerät oder ein Unterdruck wird von unten auf das Ein-Weg-Testgerätes ausgeübt, um die flüssige Phase, die freies ATP und anderen chemischen Hemmstoffen enthält, zu entfernen und die Bakterien auf der Zwischenschicht zu konzentrieren.
f) Hinzufügen von bakteriellem Lysierungsreagenz, das die Zellwände perforiert und das mikrobielle ATP freisetzt.
g) Hinzufügen von ATP-freiem Luziferin und Luziferase Reagenz und
h) Ermittlung der vorhandenen Menge von ATP mittels der Messung der Lichtemission, die die durchsichtige Wand des genannten Ein-Weg-Testgerätes passiert.

Die Wahl der Sammelflüssigkeit ist Fachleuten wohl bekannt. Im Allgemeinen enthält das Fluid ein Detergens, Salz oder einen Puffer oder eine Kombination von allem, die die mikrobiellen Zellwände nicht angreift. Ein Fluid mit 0,15 M Natriumchlorid, das 0,5% von dem Detergens Tween 20 enthält, ist dafür zu verwenden. Es können auch andere Zusammensetzungen benutzt werden, die Phosphat oder Phosphat- oder HEPES-gepufferte Salzlösung oder andere Detergenzien einschließlich zwitterionische- und nicht ionische Detergenzien.
Für einen Fachmann ist es selbstverständlich, dass das Mischen von Reagenzien immer mit Hilfe von Mikropipetten durchgeführt werden kann. Die Nachweismethode dieser Erfindung ermöglicht es vor allem, dass sowohl die Konzentration des zu untersuchenden Stoffes als auch die resultierende Chemolumineszenzreaktion, die durch den untersuchten Stoff ausgelöst wird, innerhalb der Kammer des Ein-Weg-Testgerätes vor sich geht. Ein zusätzliches Merkmal des Ein-Weg-Testgerätes besteht darin, dass der Durchmesser des Filters zwischen 0,5 und 2,0 cm liegt, möglichst ca. 1,0 cm, so dass die Menge der Biolumineszenz- oder Chemolumineszenzsubstratlösung gering gehalten wird, um das an den Fotodetektors gegebene Signal zu maximieren.
Das Endvolumen des Substrats sollte zwischen 20 μl und 1000 μl liegen; optimal wären ca. 60 bis 100 μl. Das Ein-Weg-Testgerät kann in ein weiteres Gerät gestellt werden, das über eine flüssigkeitsdichte Kammer verfügt und mindestens aus zwei Bauteile besteht, die das Ein-Weg-Testgerät aufnehmen kann; durch dieses kann dann Sammelflüssigkeitsvolumen von über 500 μl den Filter unter Über- oder Unterdruck passieren; die Bakterien oder der zu untersuchende Stoff wird auf der Oberfläche des Filters zurückgehalten. Zum Beispiel kann das Ein-Weg-Testgerät in die unteren Kammer der beiden Elemente gestellt werden; die untere Kammer hat eine Überlaufmöglichkeit für das Filtrat, an der eine obere, abnehmbare Kammer mit einer Vorrichtung mit zwei Elementen hängt. Die obere Kammer ist am unteren Teil flüssigkeitsdicht verschlossen und hat eine Aufnahmevorrichtung. Die Aufnahmevorrichtung kann für eine zusätzliche Luer-Anschlussvorrichtung eingerichtet werden, um eine aufgesetzte Luerspritze zu befestigen. Die Spritze kann mindestens eine Serie von Vorfiltern haben, um zu verhindern, dass größere Abfälle auf den Filter des Ein-Weg-Gerätes gelangen. Nach beendetem Durchgang der Sammelflüssigkeit durch den Filter des Ein-Weg-Testgerätes können beide Elemente geöffnet werden und das Ein-Weg-Testgerät kann als solches entfernt werden.
Das Ein-Weg-Testgerät enthält dann das Konzentrat einer großen Menge an Sammelflüssigkeit (z. B. 50 ml). Das Filtrieren einer großen Menge von Sammelflüssigkeit verstärkt die Sensitivität für die Untersuchung des gesammelten Fluids. Das Ein-Weg-Testgerät arbeitet dann nach der schon erwähnten Methode.
Die Luziferin-Luziferase Chemolumineszenzreaktion für ATP ist gut bekannt.
Andere Chemolumineszenzreaktionen, die bakterielle Luziferasereaktion verwenden oder Luminole für eine komplette mikrobielle Bestimmung können leicht an diese Methode und Geräte der vorliegenden Erfindung angepasst werden.
Die Erfindung betrifft außerdem die Methode zum Nachweis von spezifischen Erregern und deren Anzahl auf Oberflächen; diese können in weniger als einer Stunde nachgewiesen werden. Die Methode umfasst die folgenden Schritte:

a) Es wird ein sauberes Ein-Weg-Testgerät benötigt, das oben offen ist, durchsichtige Seitenflächen und einen durchlässigen Filter besitzt, der an der Unterseite befestigt ist.
b) Ein Aliquot der Sammelflüssigkeit hinzufügen, die weiter oben beschrieben wurde.
c) Eine geeignete Waschlösung hinzufügen, die einen Detergens oder gepuffertes Salz oder eine Kombination von allein enthält.
d) Ein Überdruck wird oben auf das Ein-Weg-Testgerät oder ein Unterdruck auf den Boden des Ein-Weg-Testgerätes ausgeübt, um das Fluid aus dem Gerät zu entfernen und die Erreger oder die zu analysierenden Proben direkt oder indirekt auf die Oberfläche des durchlässigen Filters zu bringen.
e) Einen spezifisch markierten Antikörper hinzufügen, der gegen die spezifischen, nachzuweisenden Erreger eingesetzt wird und für eine bestimmte Zeit inkubiert.
f) Ein Überdruck wird auf das Ein-Weg-Testgerät oder ein Unterdruck auf den Boden des Testgerätes ausgeübt, um das Fluid aus dem Gerät zu entfernen, das ungebundene enzymmarkierte Antikörper enthält.
g) Eine geeignete Waschlösung hinzufügen, die ein Detergens oder gepuffertes Salz enthält.
h) Ein Überdruck wird auf das Ein-Weg-Testgerät oder ein Unterdruck auf den Boden des Testgerätes ausgeübt, um das Fluid aus dem Gerät zu entfernen, das ungebundene enzymmarkierte Antikörper enthält und
i) ein Chemolumineszenzsubstrat hinzufügen und die Lichtemission aus dem Chemolumineszenssubstrat mit Hilfe eines Fotometers bestimmen, das dem Ein-Weg-Testgerät so angepasst ist, dass es präzise auf die Oberfläche des Fotosensors positioniert werden kann und so jeder mögliche Verlust von der endgültigen Reagenzmischung während oder nach dem Messungszyklus verhindert wird.

Die oben beschriebene Methode kann auch verändert werden; es werden Einfangpartikel wie mit einem Bindemittel überzogene Latexkugeln, wie spezifische Antikörper zu Antigenen oder Antigene zu Antikörpern des Zielerregers in das Ein-Weg-Testgerät hinzugegeben, bevor der Schritt (d) ausgeführt wird. Die Methode kann so verändert werden, dass die Einfangpartikel und die enzymmarkierten Antikörper und die Sammelflüssigkeit gleichzeitig innerhalb des Ein-Weg-Testgerätes zu einer Reaktion gebracht werden. Die Partikel können ebenfalls mit einem spezifischen Antigen beschichtet sein, das einen für einen Virus spezifischen Antikörper bindet. Die Partikel werden mit der Sammelflüssigkeit in das erwähnte Ein-Weg-Testgerät bei Schritt (c) hinzugegeben.
Das Nachweisreagenz kann ein mit einem Bindungspartner verbundenes Enzym sein, bei dem der Bindungspartner ein mit ATP verstärkter Antikörper ist oder im Liposom gebundenes ATP, das an einen Bindungspartner geheftet ist und wo dieser Bindungspartner ein Antikörper sein kann:
Antigene, Lektine, DNA-Fragmente, Viren und Kombinationen derselben. Das Enzym kann Peroxidase, Phosphatase, Oxidase, Luziferase oder eine Kombination von allen sein.
In einer anderen Ausführung der Erfindung befinden sich alle Chemikalien und Lösungen in der Ein-Weg-Membranvorrichtung. Solch eine Vorrichtung ist einfacher zu handhaben, besonders in situ, als ein Ein-Weg-Testgerät oder eine Sammelvorrichtung für große Mengen. Die Anwendung des Membrangerätes führt zu einer verminderten Anwendung von zusätzlichen Reaktionsreagenzien, so dass eine genaueres und mobiles Testsystems erzielt wird.
Mit der Membranvorrichtung können Flüssigkeits- und Luftproben direkt auf der Membran durchgeführt werden.
Praktisch sind alle zur Erfindung gehörenden Elemente in dem Ein-Weg-Testgerät vorhanden. Die Membranvorrichtung umfasst ein zweiseitiges aufklappbares Plastik-, Karton- oder Papiervorlage, die einen oberen und einen unteren Teil hat und mit einem saugfähigen Kissen oder Platte versehen ist, die oben auf der Innenseite des oberen Teils liegt. Oben auf dem Saugkissen liegt eine Glasfiltermembran, die mit einer festen Plastik- oder Kartonscheibe festgehalten wird. Bei dieser Ausführung kann die Membranvorrichtung als ein Auffanggerät wie auch als ein Reaktionssystem verwendet werden.
Um z. B. die Konzentration von Bakterien in einer bestimmten Menge einer Luftprobe nachzuweisen, wird der Teil der Glasfiltermembran des Teststreifens in die Kammer eingeführt, durch die eine abgemessene Luftmenge geleitet wird; dadurch wird ermöglicht, das die Luft auf die Oberfläche der Glasmembran trifft.
Die Vorlage wird entfernt und, nach Zusetzen von einem bakterien-lösenden Agens, das das zellulöse ATP freigibt, zusammengefaltet, um die Reaktion auszulösen. In einer anderen Ausführung der Erfindung wird das bakterien-lösende Agens an die Glasfiltermembran gebunden oder an andere Membranen des Gerätes.
Der untere Teil der Membranvorrichtung sollte ein Sichtfenster haben, an dem eine halbdurchsichtige Membran (in nassem Zustand) befestigt ist, auf der Luzeferin-Luziferase immobilisiert ist.
Unterschiedliche Puffer zum Extrahieren von Antigenen und zum Waschen von Immunkomplexen sind für Fachleute gut bekannt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Seitenansicht der Sammelvorrichtung mit Schaft, Saugtupfer und Behälter mit einem Fluid;
2 ist eine Schrägansicht der Sammelvorrichtung mit Schwamm und Beutel mit Fluid;
3 ist die Vorderansicht einer großvolumigen Sammelvorrichtung.
4 zeigt eine auseinandergezogene, perspektivische Darstellung einer großvolumigen Sammelvorrichtung.
5 ist eine seitliche Querschnittsansicht eines Unterdruckgerätes.
6 zeigt eine auseinandergezogene, perspektivische Zeichnung eines 35 Überdruckgerätes, eines Ein-Weg-Gerätes und den Halter mit der Saugplatte.
7 zeigt eine Zeichnung des Ein-Weg-Testgerätes, das Einsetzen in eine komplementäre Schiebevorrichtung und die Verbindung zum Fotosensorgerät.
8 ist eine Grafik der Auswertung der Lebendkeimzahlbestimmung nach 48 Stunden Inkubationszeit und die damit verbunden Lichteinheiten, die durch den fünfminütigen Biolumineszenzvorgang erhalten wurden, der bei der entsprechenden Ausführung mit jedem Datenpunkt skizziert wird und sich auf ein einziges Schlachtrind bezieht.
9 ist eine seitliche Querschnittsansicht der Membranvorrichtung.
10 ist eine schräge Draufsicht auf die Membranvorrichtung, und
11 ist eine seitliche Querschnittsansicht der Membranvorrichtung, die über dem Fotomultiplier positioniert ist.
Detaillierte Beschreibung des erwähnten Gerätes
Die 1 zeigt die Zeichnung der Sammelvorrichtung, die aus einem Schaft (1) und dem Saugtupfer (2) besteht. Der Saugtupfer (2) wird mit der Sammelflüssigkeit angefeuchtet und mit ihm wird ein abgegrenzter der zu untersuchenden Oberfläche abgewischt.
Nach Abwischen der Fläche wird der Saugtupfer (2) in den Behälter (4) gesteckt und geschüttelt, damit alle aufgesaugten Erreger in die Sammelflüssigkeit (3) weitergegeben werden.
Bezüglich der 2 wird gezeigt, dass die Sammelvorrichtung aus einem Schwamm (5) bestehen kann. Der Schwamm wird mit der Sammelflüssigkeit (3) befeuchtet, um damit über einen markierten Bereich zu wischen, der untersucht werden soll. Nach Abwischen der Fläche wird der Schwamm (5) in einen Plastikbeutel (6) gelegt, in dem sich ein Fluid befindet und wird mehrmals ausgedrückt, damit die Erreger in die Sammelflüssigkeit (3) gelangen. Die Menge der gesammelten Flüssigkeit ist variabel und hängt von der Größe des Saugmaterials und der abgewischten Fläche ab. Die Sammelflüssigkeit (3) ist so ausgesucht, dass die mikrobiellen Kontaminanten von der Testoberfläche bis zur Sammelvorrichtung und danach bis zum Ein-Weg-Testgerät weitergeleitet werden.
Ganz allgemein liegt der pH der Sammelflüssigkeit (3) zwischen 5 und 8, vorzugsweise zwischen 6,0 und 7,0. Die Sammelflüssigkeit enthält Salz wie Natriumchlorid zwischen 0,1 M und 0,3 M, vorzugsweise ca. 0,25 NaCl, damit die Erreger überleben. Die Sammelflüssigkeit (3) sollte ein Detergens enthalten, wie 0,05% Tween 20, so dass die Erreger leicht von der Testoberfläche und der Sammelvorrichtung entfernt werden können.
Bezüglich der 3–6, einem Gerät zum Konzentrieren von großen Volumen (7), wird eine konzentrierte Menge der Sammelflüssigkeit in ein Ein-Weg-Testgerät gegeben. Eine geeignete Spritze mit Luer-Spitze wird auf die Zuführung (8) eines großvolumigen Gerät zur Konzentrierung der Proben befestigt; dann wird ein Überdruck auf den Kolben der Spritze ausgeübt, was dazu führt, dass die Sammelflüssigkeit durch den Ablauf (9) fließt.
Die Sammelflüssigkeit fließt durch den Filterboden (11) des Ein-Weg-Testgerätes (10). Die Dichtungsringe (14) und (15) verschließen den Apparat hermetisch. Nach Abschluss des Konzentrierungsprozesses der Sammelflüssigkeit wird Teil 13 vom unteren Teil 16 entfernt, um den Rand des Ein-Weg-Testgerätes 10 freizulegen. Das Ein-Weg-Testgerät wird per Hand vom unteren Teil (16) getrennt.
Der Boden des Ein-Weg-Testgerätes wird in die Löcher (18) eingefügt. Jetzt kann die adäquate Menge an Waschlösung oder die zum Lysieren von somatische Zellen benötigte Lösung hinzugefügt werden; ebenso wird ein Unterdruck auf den Ausfluss (19) ausgeübt, um das Fluid aus dem Ein-Weg-Testgerät (10) abzusaugen.
Das Überdruckgerät (20) umfasst einen Kolben (19) und einen Zylinder (21), ein Ein-Weg-Testgerät (10), und die Haltevorrichtung (25) umfasst ein Saugkissen oder -platte (26), um das überflüssige Fluid aufzusaugen. Das Ein-Weg-Testgerät wird in die Haltevorrichtung (24) eingesetzt. Eine Probe der Sammelflüssigkeit (z. B. 50 bis 100 μl) wird hinzugefügt ebenso wie eine adäquate Menge von Waschlösung oder eine Lösung zum Lysieren der somatischen Zellen.
Der Gummiverschluss (23) des Überdruckgerätes wird oben auf das Ein-Weg-Testgerät (10) gesetzt. Beim Anwenden des Drucks auf den Kolben (19) wird die Luft durch den Zylinder (20) gedrückt und durch den Ablauf (22) entfernt, so dass das Fluid in die Aufsaugscheibe (26) dringt. Es kann eine zusätzliche Waschlösung hinzugegeben und der Vorgang kann wiederholt werden.
7 zeigt das Ein-Weg-Testgerät (10), das Einsetzen (28) in Schiebevorrichtung (27) und die Verbindung zum Fotosensor (30). Das Ein-Weg-Testgerät (10) besteht aus optisch klarem Plastikmaterial, wie Polystyrol (Styropor), welches das Licht mit einer Wellenlänge innerhalb 500–600 nm fast vollständig durchlässt.
Auf der unteren Fläche des Gerätes ist eine halb-durchlässige Membran (11) befestigt, die sich durch Festigkeit und Nicht-Deformierbarkeit unter Druck und durch Porengrößenverteilung auszeichnet, so dass Bakterienzellen auf der Oberfläche zurückgehalten werden, während beim Ausüben von Druck der Durchtritt jede Art von Flüssigkeit erleichtert wird.
Diese Membran muss über eine entsprechende Oberflächenspannung verfügen, um die Messlösung selbst nach Nasswerden noch zurückzuhalten.
Die Schiebevorrichtung ist dem Luminometer integriert. Die Schiebevorrichtung wird herausgezogen und das Ein-Weg-Testgerät wird in das Loch (28) eingesetzt, so dass das Sichtfenster zur durchsichtigen Wand des Ein-Weg-Testgerätes zum Fotosensor ausgerichtet ist, wenn die Schiebevorrichtung zu einer zusätzlicher Dunkelkammer des Luminometers zurückgezogen wird.
In einer bakteriellen Untersuchung durch Biolumineszenz wird, nachdem eine mikrobielle Probe in dem Ein-Weg-Testgerät konzentriert wurde, ein bakteriolytisches Reagenz hinzugesetzt, um die Bakterien zu lysieren und und ATP freizusetzen. Eine entsprechende Menge eines Lumineszenzsubstrats (z. B. Luziferin-Luziferase) wird in das Ein-Weg-Testgerät hinzugefügt und die Schiebevorrichtung zur Dunkelkammer des Luminometers zurückgeschoben. Die Messung der Lichtemission wird digital festgestellt oder durch Konvertieren des elektrischen Signals des Fotosensors in die entsprechende Anzahl von Lichteinheiten. Wenn die Methode zum Nachweis von spezifischen Bakterien genutzt wird, wird ein spezifischer Antikörper hinzugesetzt, der an eine Chemolumineszenz- oder Enzymprobe gekoppelt ist. Bei der schon erwähnten Ausführung wird ein Antikörper in das Ein-Weg-Testgerät eingeführt und wird 10 Minuten inkubiert. Zusätzliche Waschungen können durchgeführt werden, indem eine Waschlösung hinzugefügt und dieselbe dann entfernt wird.
Danach wird die Lösung mit dem lumineszenten Substrat hinzugefügt. In der erwähnten Ausführung besteht dieses Substrat aus einer Mischung von Wasserstoffperoxid und Luminol. Die Schiebevorrichtung wird in die Dunkelkammer des Luminometers zurückgeschoben. Die Messung der Lichtemission erfolgt digitalisiert oder die elektrischen Signale vom Fotosensor werden in eine Anzahl von Lichteinheiten umgewandelt.
Bei einer weiteren Ausführung der Erfindung befinden sich alle Chemikalien und Lösungen in einem Ein-Weg-Membrangerät (100). So wie in den oben beschriebenen Systemen, beinhalten alle weiter unten beschriebenen Systeme und Vorgänge den Nachweis und die Quantifizierung der Bakterien in Proben, in denen sich auch somatische Zellen, freies ATP und Komponenten wie Chloridionen befinden, die dafür bekannt sind, dass sie Luziferin-Luziferase-Enzymreaktionen hemmen.
Die Membranvorrichtung (100) umfasst ein zweiseitiges aufklappbares Plastik, Karton- oder Papiergestell (101), das aus einem oberen (102) und einen unteren (103) Teil besteht. Ein aufsaugfähiges (104) Kissen liegt oben auf der Innenseite (105) des oberen Teils. Das aufsaugfähige Kissen (104) besteht aus einem aus Zellulose angefertigten Material.
Das Material kann Baumwolle, Fasern des Maiskolbens, möglicherweise Glasfasern oder ein anderes absorbierendes Material sein. Über der absorbierenden Platte (104) liegt eine Glasfiltermembran (106), die durch eine feste Plastik- oder feste Papierschicht (107) gehalten wird. Der untere Teil (103) der Membranvorrichtung (100) sollte ein Sichtfenster (108) an der Außenseite (109) des unteren Teils haben und auf der Membranscheibe (111) sollte sich eine immobilisierte Luziferin-Luziferaselösung befinden. Die Membranscheibe passt in ein Loch (113) im unteren Teil (103) des Gerätes (100).
In einer Ausführung der Erfindung kann ein Agens zur Freisetzung von somatischen oder bakteriellen Zellen in die Glasmembran (106) eingefügt werden, so ähnlich wie eine Luziferin-Luziferase Lösung sich auf den Membranscheiben (111) befindet.
Bei der Benutzung der Membranvorrichtung (100) wird eine entnommene Probe von 25 μl durch das Loch (110) in der festen Schicht (107) auf die Oberfläche der Glasfiltermembran (106) gegeben. Die Glasfiltermembran behält bakterielle und somatische Zellen auf ihrer (106) Oberfläche zurück, während das Fluid von der absorbierenden Platte (104) aufgenommen wird.
In einer Ausführung der Erfindung wird ein Agens zur Freisetzung von somatischen Zellen auf die Oberfläche der Glasfiltermembran (106) hinzugefügt. Dieser Agens wird tropfenweise auf die Oberfläche der Glasfiltermembran (106) hinzugefügt, so dass eine Überflutung der Membranvorrichtung und ein Auswaschen der Zellen aus der Glasfiltermembran (106) vermieden wird.
Nachdem ein Agens zur Freisetzung der somatischen Zellen hinzugefügt wurde, werden die somatischen Zellen lysiert, und das von den somatischen Zellen freigesetzte ATP sowie das freie ATP und Hemmstoffe, die die Ergebnisse verunreinigen könnten, werden in dem aufsaugfähigen Schwamm gesammelt. In diesem Stadium bleiben die bakteriellen Zellen intakt auf der Oberfläche der Glasfiltermembranplatte (106) zurück.
Bei einer anderen Ausführung kann ein somatisches Freisetzungsagens auf einen Wattebausch aufgetragen werden, mit dem eine zu testende Oberfläche abgewischt wird. Bei noch einer anderen Ausführung der Erfindung kann es vermieden werden, einen Agens zur Freisetzung von somatischen Zellen der Probe beizumischen, wenn der Agens zur Freisetzung schon an der Glasmembran (106) gebunden ist, bevor diese benutzt wird. Daraufhin werden 10 μl des Agens zur Freisetzung der bakteriellen Zellen auf die Glasfiltermembran (106) oder auf die Membran (111), aufgetragen, die sich auf der Innenseite (112) des unteren Teils (103) der Membranvorrichtung (100) befindet. Die Membran (111) enthält immobilisierte Luziferin-Luziferase, die entweder die ganze Membran (111) sättigt oder sich auf der Oberfläche der Membran (111) befindet.
Bei einer weiteren Ausführung kann der Agens zur Freisetzung der bakteriellen Zellen auf der Glasfiltermembran (106) oder auf der Membran (111) immobilisiert sein. Der obere Teil (102) und der untere Teil (103) der Membranvorrichtung werden dann zusammengedrückt, und zwar möglichst beim Einfügen der Ein-Weg-Membranvorrichtung in die Schiebevorrichtung des Luminometers. Wenn der obere Teil (102) und der untere Teil (103) der Membranvorrichtung (100) in Kontakt kommen, wird eine lichtproduzierende Reaktion ausgelöst:
Das ergibt ein Resultat in RLU (relative Lichteinheiten) oder eine Integrationsperiode von 10 Sekunden, was dem Gehalt an Bakterien in der Probe entspricht.
Wie die 11 zeigt, sollte die Membranvorrichtung (100) in die Schiebevorrichtung (200) des Luminometers mit der Luziferin-Luziferase-Membran nach unten und direkt über einer Leseöffnung (201) gesteckt werden.
Der Zylinder des Fotomultipliers sitzt direkt unter dem Loch (201).
Bei eine andere Ausführung dieser Erfindung werden mit einem spezifischen Antigen überzogene Partikel zur Probe in das Ein-Weg-Testgerät hinzugefügt; das Antigen bindet dann einen spezifischen Virusantikörper.
Die oben beschrieben Methode wird nicht so sehr zur Untersuchung von Oberflächen benutzt, aber zum Analysieren aller Art von Fluiden, einschließlich Luft und Flüssigkeiten. Um die Anzahl von Bakterien in einer Luftprobe zu untersuchen, wird die Membranvorrichtung oder das Ein-Weg-Testgerät über einen Impinger oder irgendein Unterdruckgerät positioniert, das die Luft durch die Aufsammel- oder Membranvorrichtung absaugt. Die bakteriellen Verunreinigungen aus der Luft werden auf der Oberfläche der Membranvorrichtung zur Analyse festgehalten.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiel 1. – Bakterielle Untersuchung auf harten Oberflächen
Dieses Beispiel umfasst die Untersuchung von Edelstahloberflächen auf mikrobielle Verunreinigung.
Es wurde eine Kultur von Escherichia coli auf tryptischem Soja-Agar für 18 Stunden bei 30°C angesetzt. Eine Probe der Bakterien wurde mit 10 ml peptischer Soja-Kulturlösung versetzt und für weitere 18 Stunden inkubiert. Die Bakterien wurden mit einer Zentrifuge geerntet und dreimal mit 0,9% NaCl gewaschen, das vorher steril gefiltert worden war. Die optische Dichte der Lösung wurde bei 650 nm gemessen und die Konzentration wurde so angepasst, dass die optische Dichte 0,300 betrug. Es wurde eine Serie von zehnfach verdünnter Lösung hergestellt, um eine Konzentration von 10⁵ Erregern/ml zu erhalten. 100 ml dieser Lösung wurden über eine Fläche von 10 × 10 cm getropft, die auf der Oberfläche eines Edelstahlblattes markiert war, welches vorher mit Bleichmittel, Alkohol und steril destilliertem Wasser gereinigt worden war. Die mit Bakterien versetze Lösung konnte während 5 Stunden bei Raumtemperatur trocknen.
Eine markierte Kontrollfläche ohne Bakterien wurde prepariert.
Einzelne Schwämme von 10 × 10 cm wurden mit 750 μl einer Sammelflüssigkeit angefeuchtet, die 0,15 M NaCl enthielt und mit 0,05% Tween 20 in einem Beutel versetzt war. Diese Lösung reicht gerade aus, um den Schwamm vollkommen nass zu machen. Jeder Schwamm wurde aus dem Beutel entnommen und zehnmal in jeder Richtung über den markierten Teil der Oberfläche geführt. Daraufhin wurde er wieder in den Beutel gesteckt und mit der Hand zehnmal ausgequetscht, um die aufgesammelte Flüssigkeit abzugeben. Es wurde ein Aliquot (25 μl) der Sammelflüssigkeit aus dem Beutel entnommen und in das Ein-Weg-Testgerät eingeführt. Es wurden 25 μl eines Agens zur Freisetzung von Bakterien und 50 μl einer Mischung von Luziferin-Luziferase und Magnesium hinzugesetzt. Die Schiebevorrichtung wurde geschlossen und die relativen Lichteinheiten wurden bestimmt.
In einem zweiten Experiment wurden Wattebäusche mit ca. 300 μl der Sammelflüssigkeit im Beutel angefeuchtet, wie schon oben beschrieben wurde. Mit diesen Wattebäuschen wurden ähnlich markierte Flächen von Edelstahl abgewischt; wie es schon oben beschrieben wurde.
In allen Fällen wurden auch Kontrollflächen untersucht, die nicht mit Bakterien verunreinigt waren. Zusätzlich wurde die mit Bakterien versetzte Lösung einer Oberfläche direkt in die Sammelflüssigkeit als positive Kontrolle gegeben. Jeder dokumentierte Punkt zeigt das Durchschnittsergebnis von drei Proben. Die Tabelle 1 zeigt, dass ca. 80% der versetzten Bakterien entweder mit dem Schwamm oder dem Wattebausch nachgewiesen werden konnten.
Tabelle 1
Beispiel 2: Chemolumineszentes Salmonellen-Assay
Dieses Beispiel befasst sich mit der Untersuchung auf Salmonellen.
Von Bakterien wie Salmonella typhmurium, ATCC 14028 oder Aeromonas hydrophila, ATCC 7966, wurden von eingefrorenen Proben auf tryptischen Soya-Agar Böden ausgestrichen und für 18 Stunden bei 26°C inkubiert. Die Bakterienkolonien wurden geerntet und in eine sterile 0,9% NaCl Lösung gegeben. Die optische Dichte der Lösung wurde bei 650 nm gemessen und die Konzentration wurde so angepasst, dass die optische Dichte 0,300 betrug. Dazu wurden die Erreger in 0,05 M Tris, 0,05 M EDTA, 0,15 M NaCl, pH 8,2 verdünnt. Ein Aliquot (10 μl) der 0,5%igen Lösung von Latex Mikrokugeln, die mit Antikörpern gegen Salmonellen behaftet sind, wurde in das Ein-Weg-Testgerät gegeben. Ein Aliquot von 100 μl der verdünnten Erregerlösung wurde in das Ein-Weg-Testgerät mit einem Filter auf der Bodenfläche gegeben, die aus 1,2 Micron Biodyn C bestand. Nach Hinzufügen der Erreger ruhte die Lösung für 10 Minuten.
Ein Überdruck wurde ausgeübt und das Fluid floss auf ein Aufsaugkissen. Die gewonnen Antigene wurden durch Hinzufügen von 200 μl Waschlösung mit 0,01 M PBS, pH 7,2, die 0,05% Tween 20 enthielt, gewaschen. Nochmals wurde ein Überdruck ausgeübt und das Fluid floss auf eine Aufsaugplatte. Ein an Meerettichperoxidase markierter Antikörper gegen Salmonellen wurde in das Ein-Weg-Testgerät gegeben und für 10 Minuten stehen gelassen. Nochmals wurde ein Überdruck ausgeübt und das Fluid aus dem Ein-Weg-Testgerät herausgepumpt. Eine Waschlösung würde hinzugefügt und unter Überdruck zweimal wieder hergepumpt. Das Ein-Weg-Testgerät würde in ein Luminometer gestellt. 100 μl Lumiglo-Chemolumineszsubstrat (Kirkegaard and Perry Laboratory Gaithersburg, MD) wurde hinzugefügt; die Schiebevorrichtung sofort geschlossen und die Lichtemission bestimmt.
Die auf der Tabelle 2 eingetragenen Ergebnisse zeigen, dass die Konzentrationen von so wenigen wie 10⁵ Organismen bei Anwendung dieses Systems leicht von einer Negativkontrolle unterschieden werden.
Tabelle 2: Ergebnisse der Untersuchung auf Salmonellen
Ein zweiter Vorgang, ähnlich dem schon oben erwähnten, wurde durchgeführt; mit der Ausnahme, dass vor dem Hinzufügen der Erregerprobe keine Latexperlen in das Ein-Weg-Testgerät gegeben wurden. In diesem Fall war das Signal-Stör-Verhältnis für eine Lösung von S. typhimurium (10⁸ Organismen) wie folgt: A. hydrophila (10⁸ Organismen) war 5,91.
Es würde auch ein dritter Vorgang untersucht. Bei dieser Methode (40) werden 40 μl der Probe und 40 μl von an Meerettichperoxidase markierten Antikörpern gegen Salmonellen in das Ein-Weg-Testgerät gegeben. Die Mischung wird für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Ein Überdruck wurde ausgeübt, um das Fluid aus dem Testgerät zu evakuieren. Das gewonnene Material wurde dreimal gewaschen, wobei 200 μl von 0,01 M mit phosphatgepufferter Salzlösung pH 7,2 mit 0,05% Tween 20 hinzugefügt wurde. Das Fluid wurde mittel Überdruck aus dem Ein-Weg-Testgerät herausgepumpt. Das Ein-Weg-Testgerät würde in das Luminometer gestellt und 100 μl Lumiglo-Chemolumineszenz-Substrat hinzugefügt (Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Die Schiebevorrichtung wurde geschlossen und die Lichtemission bestimmt. Das Signal-Stör-Verhältnis für eine Lösung von S. typhimurium (10⁶ Organismen) war wie folgt: A. Hydrophila (106 Organismen) war 1,83.
Beispiel 3: Nachweis von bakteriellem ATP von einer pulverisierten Lebensmittelprobe
Eine Lösung mit pulverisierter Lebensmittelprobe wird durch Mischen von 25 g Lebensmittelprobe in 225 ml SRA Lösung in einem Becherglas vorbereitet. 50 μl der Lösung werden in eine Filtravette gegeben. Vier Tropfen SRA würden der Lösung hinzugefügt. Die Filtravette^TM wird in ein Plastikgestell gestellt und mit Löschpapier unterlegt. Die Lösung wird mittels eines Überdruckgerätes filtriert, wobei das ganze ATP der somatischen Zellen extrahiert und vom Löschpapier aufgesaugt wird, während die bakteriellen Zellen auf dem Filterpapier zurückbleiben. Weitere sechs Tropfen SRA werden in die Filtravette^TM gegeben und die Filtrierung wird mittels eines Überdruckgerätes wiederholt.
Die Filtravette^TM wird dann in ein Mikroluminometer gestellt und 50 μl BRA-Lösung werden hinzugefügt, um die ATP Bakterien freizusetzen. Mittels der Pipettenspitze wird das BRA mit der Lösung vermischt.
Es werden 50 μl von rekonstituierter Luziferin/Luziferase hinzugefügt und zwei- bis dreimal mittels der Pipettenspitze vermischt. Die Schiebevorrichtung wird sofort für 10 Sekunden geschlossen. Das Ablesen der relativen Lichteinheiten erfolgt digital vom Mikroluminometer.
Beispiel 4: Methode zur Bestimmung der ATP-Menge in Hefe unter Anwendung verschiedener Membranen
Kulturen von Escherischia coli und Streptococcus pyogenes wurden auf tryptischem Soja-Agar und Saccharomycescerevisiae auf Rose-Bengal-Agar gezüchtet. Frisch gewachsene Kolonien wurden jedem Testorganismus entnommen und mit 0,01 M PBS versetzt. Die Lösung wurde auf einen OD⁶⁵⁰ Wert von 0,3 gebracht, was ungefähr 3 × 10⁸ bakterielle Zellen/ml und 3 × 10⁶ Hefezellen/ml entspricht. Es wurden zwei zehnfach Verdünnungen in 0,01 M PBS von jeder Lösung durchgeführt. Die Filtravette^TM wurde in einen Plastikgestell gestellt und mit Löschpapier unterlegt. Je eine 50 μl Probe von jeder Lösung (ca. 10⁶ bakterielle Zellen/ml und 10⁴ Hefezellen/ml) wurde in die Filtravette^TM gegeben. Vier Tropfen SRA wurden hinzugefügt. Die Lösung würde mittels eines Überdruckgerätes gefiltert. Dieser Vorgang wurde mit 6 Tropfen SRA wiederholt. Die Filtravette würde dann in den Einschub des Mikroluminometers gegeben. Fünzig μl BRA wurde in die Filtravette hinzugesetzt. Fünfzig μl von wiederaufbereiteter Luziferin/Luziferase wurde hinzugesetzt und drei- bis viermal mittel Pipettierung gemischt. Der Probeneinschub würde sofort geschlossen; danach begann eine zehn sekundenlange Integrationszeit; das Ablesen der relativen Lichteinheiten wurde digital durchgeführt. Diese Lichteinheiten wurden als absolut betrachtet, um ein 100%iges Konzentrat zu erhalten. Die Ergebnisse wurden wie folgt zusammengefasst: TABELLE: WIRKUNGSGRAD (%) VON VERSCHIEDENEN MEMBRANEEN BEI DER FILTRIERUNG/ZURÜCKHALTEN VON BAKTERIEN UND HEFE

ND: Nicht durchgeführt

Beispiel 5: Nachweis von bakteriellem ATP aus einer Benzinschlammprobe
Bevor eine Probe vom Benzinschlamm genommen wird, lässt man diesen ruhen bis sich klare Zonen von einzelnen Phasen zeigen. Insgesamt können bis zu drei Phasen mit zwei Zwischenphasen in der Benzinschlammprobe auftreten. Die Proben werden mittels einer Pasteur-Pipette von jeder Phase entnommen und in ein Eppendorf-Gefäß gegeben.
50 μl der Probe aus jedem Eppendorf-Gefäß, die aus den einzelnen Phasen des Benzinschlamms stammen, werden in die Filtravette^TM gegeben. Vier Tropfen SRA werden hinzugefügt. Die Filtravette^TM wird in den Plastikhalter gestellt und mit Löschpapier untergelegt. Dadurch wird das ganze ATP aus den somatischen Zellen extrahiert und folglich von dem Löschpapier absorbiert. Alle bakteriellen Zellen bleiben auf dem Filterpapier zurück. Weitere sechs Tropfen SRA werden in die Filtravette^TM gegeben und die Filtrierung wird mittels eines Überdruckgerätes wiederholt. Die Filtravette^TM wird in ein Mikroluminometer gestellt und 50 μl of BRA werden hinzugefügt, um das bakterielle ATP freizusetzen und die Flüssigkeiten werden sorgfältig mittels Pipettierung vermischt.
Es werden 50 μl von der rekonstriuierten Luziferin-Luziferase hinzugefügt und zwei- bis dreimal mittels der Pipettenspitze vermischt. Der Probeneinschub wird für eine Integrierungsperiode von zehn Sekunden geschlossen und das Ablesen der relativen Lichteinheiten vom Mikroluminometer erfolgt digital.
Bei der oben beschriebenen Methode wurde eine Benzinschlammprobe mit drei unterschiedliche Phasen getestet (1. eine obere durchsichtige Ölphase, 2. eine mittlere braune Phase und 3. eine untere tiefbraune zähflüssige Phase). Eine jeder der oben genannten Phasen wurde untersucht, einschließlich der zwei "Zwischenphase", die sich zwischen den drei ursprünglichen Phasen befanden.
Die Ergebnisse wurden wie folgt zusammengefasst:
Von der Probe aus jeder Phase wurde eine Portion auf das Tryptic-Soja-Agar aufgetragen. Die Platten wurden dann für 24–48 Stunden bei 37°C inkubiert. Bakterielle Kolonien wurden auf der Platte beobachtet, die eine Probe von der Phase 2 enthielt; die Zählung ergab 5,5 × 10³ Kolonie-Einheiten/ml.
In den anderen Phasen wurden auf den jeweiligen Platten keine sichtbaren Kolonien gefunden.
Beispiel 6: Vergleichende Untersuchungen von Leitungswasser
Eine Leitungswasserprobe wurde mit der konventionellen heterotrophischen Lebendkeimzahlbestimmung (HPC) untersucht, die allgemein zur Untersuchung des Trinkwassers benutzt wird. Die Ergebnisse wurden mit denen der Methode der Erfindung verglichen, die einen Apparat (3, #7) zum Sammeln und Konzentrieren von großen Mengen benutzt, Das von zwei verschiedenen Orten stammte. Die Wasserprobe wurde in Plastikgefäßen gesammelt. Vier Tropfen SRA-Lösung wurden dem Plastikgefäß gegeben und gemäß der Anwendung von Beispiel 2 verarbeitet.
Das Ergebnis dieser beiden Perioden von Proben zeigt, dass die Erfindung es er ermöglicht, Bakterien unter 100 CFU/ml, wahrscheinlich auch unter 10 CFU/ml nachzuweisen.
Beispiel 7: Bestimmung der Effektivität wie gut Luzeferin-Luziferase auf der Membran gebunden wurde
Es wurde ein Plastikgerät ähnlich dem auf der 10 mit Luziferin-Luziferase auf eine Glasmembran benutzt. Eine 10 μl Probe von einem Standard-ATP wurde hinzugefügt. Der Wert der relativen Lichteinheit des Standard-ATP bezieht sich auf eine flüssige Phase des Luziferin-Luziferase-Systems. Die Ergebnisse zeigen eine Korrelation zwischen immobilisierter Luziferin-Luziferase auf dem Plastikgerät und der flüssigen Phase des Luziferin-Luziferase-Systems.
Die Information auf drei Membranvorrichtungen wurde untersucht, um nachzuweisen, ob es eine direkte Korrelation zwischen der vorhandenen ATP-Menge und der Lichtemission gibt; es wurde ein Mikroluminometer benutzt.
Tabelle 1. Zählung von drei Luziferin-Luziferase-Geräten, die eine Kontrolllösung mit mittlerem ATP-Wert anwenden. (ATP-Lösung-Zählung – 10000)
Zählung von drei Membranvorrichtungen, die eine Kontrolllösung mit hohem ATP-Wert anwenden. (Zählung aus ATP-Lösung 20000)
Beispiel 8: Nachweis von Bakterien in Wasser während aufeinanderfolgender Reinigungsstufen
Dieses Beispiel umfasst einen Vorgang zur Untersuchung des Bakteriengehaltes von extra-reinen Wasserproben, die zur Herstellung von Silikonchips während mehrerer Reinigungsstadien angewandt wurden. Die Proben wurden der Sammelflüssigkeit einer jeden Reinigungsstufe entnommen Für jede Untersuchung wurde eine Membranvorrichtung in das Gerät gestellt, das zur Komprimierung des Glasfiltermembranteils zwischen zwei O-Ringen dient. Damit können relativ große Proben bei Anwendung eines Unterdrucks durch den Filter gepumpt werden.
Die Membranvorrichtung wurde entfernt, 10 μl Agens zur Freisetzung von Bakterien wurden der Luziferin-Luziferase-Membran hinzugefügt und das Gerät wurde geschlossen und in die Schiebevorrichtung des Luminometers gesetzt. Die Ergebnisse erscheinen in der folgenden Tabelle und zeigen deutlich eine fortschreitende Verminderung des Bakterienanteils in jeder folgenden Reinigungsstufe.
Alle oben angegebenen Beispiele und Untersuchungen können mit der Membranvorrichtungsversion der Erfindung durchgeführt werden.
Viele Änderungen und Variationen von der vorliegenden Erfindung sind möglich, wie aus den oben erwähnten Ausführungen hervorgeht. Deshalb versteht es sich von selbst, dass im Rahmen der beiliegenden Patentanforderungen die Erfindung anders geschützt werden muss als nur ausdrücklich beschrieben.

Claims

Ein Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit und der Menge eines Analyts, umfassend die Schritte von: (a) Aufsammeln einer Probe des Analyts; (b) Platzieren der Probe auf eine wegwerfbare Testvorrichtung mit durchlässigem Filter, wobei die wegwerfbare Testvorrichtung eine Membranvorrichtung ist, die Membranvorrichtung umfassend: eine aufklappbare, zweiseitige Haltevorrichtung mit einem oberen Teil und einem unteren Teil, ein Saugkissen, welches oben auf einer Innenseite des oberen Teils angebracht ist, eine Filtermembran oben auf dem Saugkissen, eine feste Schicht, welche die Filtermembran festhält; wobei die feste Schicht über der Filtermembran angebracht ist; ein Loch in der festen Schicht, welche über der Filtermembran angebracht ist; ein Loch im unteren Teil der Membranvorrichtung; eine Membranscheibe, welche in das Loch der Membranvorrichtung eingepasst ist; eine Belichtungslösung, welche auf der Membranscheibe immobilisiert ist; ein Sichtfenster an einer Außenseite des unteren Teils unterhalb der Membranscheibe; wobei die Probe durch das Loch in der festen Schicht auf die Oberfläche der Filtermembran aufgetragen wird; (c) Auftragen des Freisetzungsmittels für somatische Zellen auf die Oberfläche der Filtermembran; (d) Auftragen des Freisetzungsmittels für Bakterien auf die Oberfläche der Membranscheibe, welche auf der Innenseite des unteren Teils der Membranvorrichtung angebracht ist; (e) Zusammendrücken des oberen Teils und des unteren Teils der Membranvorrichtung; (f) Schieben der Membranvorrichtung in ein Photometer mittels eines Ziehstößels; und (g) Messen der Lichtemission, welche aus der Lumineszenzreaktion entsteht, mit einem Photometer umfassend einen Photodetektor und eine helle, festsitzende Kammer für die wegwerfbare Testvorrichtung und ein Mittel zur Messung des Lichts, welches die durchsichtige Wand der Membranvorrichtung passiert; und (h) Veranlassen des Photometers ein Signal welches die Anwesenheit und die Menge des Analyts anzeigt, auszugeben.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei Schritte (c) bis (g) innerhalb von 5 Minuten, insbesondere innerhalb von 2 Minuten durchgeführt werden.
Ein Verfahren gemäß Anspruch l oder 2, wobei das wegwerfbare Aufsammelgerät ein weiches Aufsaugmittel, ein schwammiges Aufsaugmittel oder ein weiches Aufsaugmittel und einen Stiel umfasst.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–3, wobei die Aufsammelflüssigkeit ein Detergens, ein Salz und/oder einen Puffer enthält.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–4, wobei der Analyt Adenosintriphosphat (ATP) enthält und die Lichtemission mit der Konzentration des ATP korreliert.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–5, bei dem ein Gerät zum Einengen großer Volumina verwendet wird, um die Flüssigkeit in der wegwerfbaren Testvorrichtung als Teil von Schritt (a) einzuengen.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–6, bei dem der Filter eine hydrophile, durchlässige Membran ist.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–7, bei dem alle lichtemittierenden Substanzen während des Durchführens von Schritt (f) innerhalb der wegwerfbaren Testvorrichtung zurück gehalten werden.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–8, wobei die Membranvorrichtung ein Material ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Plastik, Pappe oder Papier umfasst.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–9, wobei das Saugkissen Zellulose umfasst oder ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Baumwolle, Getreideseide und Glaswolle.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–10, wobei die Filtermembran einen Glasfilter umfasst.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–11, wobei die Belichtungslösung eine Luziferin-Luziferase-Lösung ist, insbesondere umfassend Luziferin, Luziferase und Magnesium.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Luziferin-Luziferase-Lösung weiterhin die chemischen Stoffe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trehalose, Dithiothreitol, HEPES-Puffer und Kombinationen davon umfasst.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–13, wobei das Freisetzungsmittel für somatische Zellen tropfenweise auf die Oberfläche der Filtermembran aufgetragen wird, um ein Überfluten der Membranvorrichtung und ein Auswaschen der Zellen aus der Filtermembran zu vermeiden.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–14, wobei der Photodetektor direkt unter der Membranscheibe angebracht ist, wobei sich die Membranscheibe mit der Vorderseite nach unten über dem Luminometer befindet.
Ein Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit und der Menge eines Analyts, umfassend die Schritte von: (a) Aufsammeln einer Probe des Analyts; (b) Platzieren der Probe auf eine wegwerfbare Testvorrichtung mit durchlässigem Filter, wobei die wegwerfbare Testvorrichtung eine Membranvorrichtung ist, die Membranvorrichtung umfassend: eine aufklappbare, zweiseitige Haltevorrichtung mit einem oberen Teil und einem unteren Teil, ein Saugkissen, welches oben auf einer Innenseite des oberen Teils angebracht ist, eine Filtermembran oben auf dem Saugkissen, ein Freisetzungsmittel für somatische Zellen aufgetragen auf die Oberfläche der Filtermembran; eine feste Schicht, welche die Filtermembran festhält; ein Loch in der festen Schicht, welche über der Filtermembran angebracht ist; ein Loch im unteren Teil der Membranvorrichtung; eine Membranscheibe, welche in das Loch der Membranvorrichtung eingepasst ist; eine Belichtungslösung, welche auf der Membranscheibe immobilisiert ist; ein Sichtfenster in dem unteren Teil unterhalb der Membranscheibe; wobei die Probe durch das Loch in der festen Schicht auf die Oberfläche der Filtermembran aufgetragen wird; (c) Auftragen des Freisetzungsmittels für Bakterien auf die Oberfläche der Membranscheibe, welche auf der Innenseite des unteren Teils der Membranvorrichtung angebracht ist; (d) Zusammendrücken des oberen Teils und des unteren Teils der Membranvorrichtung; (e) Schieben der Membranvorrichtung in ein Photometer mittels eines Ziehstößels; und (f) Messen der Lichtemission, welche aus der Lumineszenzreaktion entsteht, mit einem Photometer umfassend einen Photodetektor und eine helle, festsitzende Kammer für die wegwerfbare Testvorrichtung und ein Mittel zur Messung des Lichts, welches die durchsichtige Wand der Membranvorrichtung passiert; und (g) Veranlassen des Photometers, ein Signal, welches die Anwesenheit und die Menge des Analyts anzeigt, auszugeben.
Eine Membranvorrichtung zum Platzieren einer Probe in einem Luminometer zum Erhalten einer Bakterienzahl, die Membranvorrichtung umfassend: eine aufklappbare, zweiseitige Haltevorrichtung mit einem oberen Teil und einem unteren Teil, ein Saugkissen, welches oben auf einer Innenseite des oberen Teils angebracht ist, eine Filtermembran oben auf dem Saugkissen, eine feste Schicht, welche die Filtermembran festhält; wobei die feste Schicht über der Filtermembran angebracht ist; ein Loch in der festen Schicht, welche über der Filtermembran angebracht ist; ein Loch im unteren Teil der Membranvorrichtung; eine Membranscheibe, welche in das Loch der Membranvorrichtung eingepasst ist; eine Belichtungslösung, welche auf der Membranscheibe immobilisiert ist; ein Sichtfenster in dem unteren Teil unterhalb der Membranscheibe; wobei die Probe durch das Loch in der festen Schicht auf die Oberfläche der Filtermembran aufgetragen wird.
Die Membranvorrichtung gemäß Anspruch 17, weiterhin umfassend, dass das Freisetzungsmittel für somatische Zellen in der Oberfläche der Filtermembran enthalten ist.
Ein Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit und der Menge eines Analyts, umfassend die Schritte von: (a) Aufsammeln des Analyts mit einem wegwerfbaren Aufsammelgerät; (b) Zufügen von Aufsammelflüssigkeit zu dem Aufsammelgerät; (c) Platzieren der Aufsammelflüssigkeit in eine wegwerfbare Testvorrichtung mit durchlässigem Filter an ihrem unteren Ende, einem offenen oberen Ende und durchsichtigen Seitenwänden; (d) Aufbringen von Druck auf die wegwerfbare Testvorrichtung, damit die Flüssigkeit den durchlässigen Filter passiert und der Analyt auf dem durchlässigen Filter zurückgehalten wird; (e) Zufügen eines Reagens in die wegwerfbare Testvorrichtung, wodurch eine Lumineszenzreaktion in der Testvorrichtung ausgelöst wird; (f) Messen der Lichtemission, welche aus der Lumineszenzreaktion entsteht, mit einem Photometer umfassend einen Photodetektor und eine helle, festsitzende Kammer für die wegwerfbare Testvorrichtung und ein Mittel zur Messung des Lichts, welches die durchsichtige Wand der Membranvorrichtung passiert; und (g) Veranlassen des Photometers, ein Signal, welches die Anwesenheit und die Menge des Analyts anzeigt, auszugeben.
Das Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei die Schritte (c) bis (g) innerhalb von 5 Minuten durchgeführt werden.
Das Verfahren gemäß Anspruch 19 oder 20, wobei das wegwerfbare Aufsammelgerät ein weiches Aufsaugmittel, ein schwammiges Aufsaugmittel oder ein weiches Aufsaugmittel und einen Stiel umfasst.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19–21, wobei die Aufsammelflüssigkeit ein Detergens, ein Salz und/oder einen Puffer enthält.
Das Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei eine Waschflüssigkeit zur salzhaltigen Aufsammelflüssigkeit in der wegwerfbaren Testvorrichtung in Schritt (c) hinzugefügt wird und die Waschlösung eine Salzlösung enthaltend Detergentien umfasst, und die Waschlösung somatische Zellen lysiert und Mikroorganismen nicht lysiert.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19–23, wobei nach Durchführen von Schritt (d) die zusätzlichen Schritte des Zufügens einer Waschlösung und Aufbringens von Druck auf die wegwerfbare Testvorrichtung, damit die Waschlösung den Filter passiert, durchgeführt werden.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19–24, wobei ein bakteriolytisches Reagens zur wegwerfbaren Testvorrichtung in Schritt (e) hinzugefügt wird.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19–24, wobei der Analyt Adenosintriphosphat (ATP) enthält und die Lichtemission mit der Konzentration des ATP korreliert.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19–26, wobei die Lumineszenzreaktion des Schrittes (e) durch das Hinzufügen von Luziferin-Luziferase oder durch das Hinzufügen von Isoluminol ausgelöst wird.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19–26, bei dem ein Gerät zum Einengen großer Volumina verwendet wird, um die Flüssigkeit in der wegwerfbaren Testvorrichtung einzuengen.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19–26, bei dem der Filter eine hydrophile durchlässige Membran ist.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 19–29, bei dem alle lichtemittierenden Substanzen während des Durchführens von Schritt (f) innerhalb der wegwerfbaren Testvorrichtung zurück gehalten werden.
Das Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit und der Menge eines Analyts umfassend: (a) Aufsammeln des Analyts mit einem wegwerfbaren Aufsammelgerät; (b) Zufügen von Aufsammelflüssigkeit zu dem Aufsammelgerät; (c) Platzieren der Aufsammelflüssigkeit in eine wegwerfbare Testvorrichtung mit durchlässigem Filter an ihrem unteren Ende, einem offenen oberen Ende und durchsichtigen Seitenwänden; (d) Aufbringen von Druck auf die wegwerfbare Testvorrichtung, damit die Flüssigkeit den durchlässigen Filter passiert und der Analyt auf dem durchlässigen Filter zurückgehalten wird; (e) Zufügen eines Nachweisreagens in die wegwerfbare Testvorrichtung, wobei das Nachweisreagens an den Analyt bindet; (f) Zufügen einer Waschlösung zu der wegwerfbaren Testvorrichtung und Aufbringen von Druck auf die wegwerfbare Testvorrichtung, damit die Flüssigkeit den durchlässigen Filter passiert; (g) Auslösen einer Lumineszenzreaktion in der Testvorrichtung; (h) Messen der Lichtemission, welche aus der Lumineszenzreaktion entsteht, mit einem Photometer umfassend einen Photodetektor und eine helle, festsitzende Kammer für die wegwerfbare Testvorrichtung und ein Mittel zur Messung des Lichts, welches die durchsichtige Wand der Membranvorrichtung passiert; und (i) Veranlassen des Photometers, ein Signal, welches die Anwesenheit und die Menge des Analyts anzeigt, auszugeben.
Das Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei die Schritte (c) bis (i) innerhalb von 30 Minuten durchgeführt werden.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 31 oder 32, wobei das wegwerfbare Aufsammelgerät ein weiches Aufsaugmittel, ein schwammiges Aufsaugmittel oder ein weiches Aufsaugmittel und einen Stiel umfasst.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 31–33, wobei die Aufsammelflüssigkeit ein Detergens, ein Salz und/oder einen Puffer enthält.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 31–34, wobei eine Waschflüssigkeit zur Aufsammelflüssigkeit in der wegwerfbaren Testvorrichtung in Schritt (c) hinzugefügt wird und die Waschflüssigkeit eine Salzlösung enthaltend Detergentien umfasst.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 31–35, wobei Partikel, welche mit einem spezifischen Antigen oder Antikörper, der an den Analyten bindet, beschichtet sind, zusammen mit der Aufsammelflüssigkeit zur wegwerfbaren Testvorrichtung in Schritt (c) hinzugefügt werden.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 31–36, wobei nach Durchführen von Schritt (d) die zusätzlichen Schritte des Zufügens einer Waschlösung und Aufbringens von Druck auf die wegwerfbare Testvorrichtung, damit die Waschlösung den Filter passiert, durchgeführt werden.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 31–37, weiterhin umfassend das Hinzufügen von Bindepartikeln, die mit einem Bindungsmittel beschichtet sind, so dass das Bindungsmittel an den Analyt oder Analytfragment bindet, wobei das Bindungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, ATP-angereicherte Antikörper, Antigene, Lektine, DNA-Fragmente, Viren und Kombinationen davon.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 31–38, wobei die Lumineszenzreaktion des Schrittes (f) durch Hinzufügen eines chemilumineszenten Substrats ausgelöst wird.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 31–39, wobei Schritt (d) weggelassen wird, so dass die Aufsammelflüssigkeit und das Nachweisreagens gemeinsam in der wegwerfbaren Testvorrichtung platziert werden.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 31–40, bei dem ein Gerät zum Einengen großer Volumina verwendet wird, um die Flüssigkeit in der wegwerfbaren Testvorrichtung als Teil von Schritt (c) einzuengen.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 31–41, wobei Partikel, welche mit einem spezifischen Antigen beschichtet sind, zusammen mit der Aufsammelflüssigkeit zur wegwerfbaren Testvorrichtung in Schritt (c) hinzugefügt werden, wobei das Antigen einen Virus-spezifischen Antikörper bindet.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–16 und 19–42, wobei eine Probe von Luft auf bakterielle Erreger getestet werden kann, indem das Aufsammelgerät über einem Impinger oder Vakuum platziert wird, dabei zulassend, dass Luft durch die Membranvorrichtung gezogen wird.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–16 und 19–43, wobei Partikel, welche mit einem spezifischen Antigen beschichtet sind, zusammen mit der Aufsammelflüssigkeit zur wegwerfbaren Testvorrichtung hinzugefügt werden, wobei das Antigen einen Virus-spezifischen Antikörper bindet.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1–16 und 19–44, weiterhin umfassend, dass das Freisetzungsmittel für Bakterien in der Oberfläche der Filtermembran enthalten ist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 38, weiterhin umfassend das Hinzufügen von Enzymmarkierten Antikörpern zu den Bindepartikeln und dem Kollektat, so dass alle gleichzeitig eine Reaktion innerhalb der Testvorrichtung eingehen, und die Enzyme der Enzymmarkierten Antikörpern ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Peroxidase, einer Phosphatase, einer Oxidase, einer Luziferase und Kombinationen davon.