DE69128425T2

DE69128425T2 - Methoden und material für die trennung, konzentrierung und analyse von zellen

Info

Publication number: DE69128425T2
Application number: DE69128425T
Authority: DE
Inventors: Randall Dimond; Lisa Martin; Leopoldo Mendoza; Edward Pahuski; John Priest; Kathleen Stebnitz
Original assignee: Promega Corp
Current assignee: Promega Corp
Priority date: 1990-07-02
Filing date: 1991-07-02
Publication date: 1998-04-09
Anticipated expiration: 2011-07-03
Also published as: WO1992000317A1; DE69128425D1; ES2110446T3; JP2867181B2; EP0542790B1; AU8296691A; EP0542790A4; EP0542790A1; ATE161015T1; US5700645A; US5587286A; JPH06500462A; JPH04228097A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist allgemein auf die Trennung und Konzentrierung von Zellen von nicht-zellulären Bestandteilen in einer Milchprobe, wie Rohmilch, pasteurisierter Milch oder rekonstituiertem Milchpulver, oder in Kulturen von Mikroorganismen aus anderen Arten von Lebensmitteln, wie Fleisch, oder anderen Quellen, wie Stuhl oder Blut, und die anschließende Analyse der abgetrennten Zellen im Hinblick auf das Vorhandensein von unerwünschten Mikroorganismen gerichtet.

Hintergrund der Erfindung

Verfahren zur Zählung oder quantitativen Bestimmung von Zellen in Milchproben fallen in eine von zwei Kategorien. In der ersten Kategorie werden somatische Rinderzellen in Rohmilchproben auf verschiedene Weise gezählt, um milchgebende Tiere zu identifizieren, die Rindermastitis haben, ein unerwünschter Zustand, der die Qualität und Menge der Milchbildung bei infizierten Tieren begrenzt. Mastitis-Testverfahren umfassen die direkte Zellzählung unter Verwendung von automatisierten Instrumenten und Biolumineszenz-Somazellen-ATP-Bestimmungen nach der Zellyse mit Mitteln, wie Detergentien, die zelluläres Adenosintriphosphat (ATP) freisetzen. Die Anzahl der Somazellen, die ursprünglich in der Probe vorhanden war, wird aus der Messung des freigesetzten ATP bestimmt.
In der zweiten Kategorie werden Zellen von einfachen, üblicherweise einzelligen Mikroorganismen, wie Pilzen und Bakterien, die nachstehend zusammenfassend als "Mikroorganismenzellen" bezeichnet werden, in Milchproben unter Anwendung verschiedener Zähltechniken gezählt. Diese Verfahren werden allgemein bei der Bewertung der Milchqualität herangezogen, insbesondere um stark kontaminierte Milchproben auszusondern.
Von den Verfahren, die zum Mikroorganismusnachweis verwendet werden, ist der Breed-Ausstrich (R. S. Breed, Zbl. Bakt. Ilte. Abr., Bd. 30 (1911), S. 337) im allgemeinen das rascheste Verfahren. Bei dieser Technik wird eine Milchprobe auf einem Objektträger ausgestrichen, getrocknet, angefärbt, und die Bakterien werden durch mikroskopische Untersuchung gezählt. Die Nachteile dieses Verfahrens bestehen darin, daß sowohl lebensfähige als auch nicht lebensfähige Organismen gezählt werden und daß, wenn Milchproben weniger als 10&sup5; Organismen/ml enthalten, viele Felder unter dem Mikroskop gezählt werden müssen, um statistisch gültige Ergebnisse zu erhalten. Mikroskopische Bewertungen sind arbeitsaufwendig und führen zur Ermüdung des Bedieners.
Das am weitesten verbreitete Milchmikroorganismen-Nachweisverfahren ist das Standard-Plattenverfahren, bei dem die direkte Koloniezählung nach Plattieren in oder auf einem Züchtungsmedium genutzt wird. Standardverfahren (Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 15. Auflg., 1985, G. H. Richardson, (Hrsg.), American Public Health Org., Washington, D. C.) sind für Milchproben entwickelt worden, und viele Laboratorien bewerten Milchproben unter Anwendung manueller oder automatischer Plattierverfahren. Diese Verfahren werden zwar weltweit genutzt; ihre Nutzung ist jedoch mit bestimmten Nachteilen verbunden. Zunächst müssen bei manuellen Plattierverfahren zwei oder mehr Verdünnungen der Milchprobe plattiert werden, so daß statistisch signifikante Plattenzahlen erhalten werden. Zweitens werden Platten sowohl bei manuellen als auch bei automatischen Plattierverfahren üblicherweise bei erhöhten Temperaturen (z. B. 35ºC in den USA und 32ºC in Japan) inkubiert; bei diesen Temperaturen wird das Wachstum von psychrophilen Organismen unterdrückt, was zu künstlich niedrigen Zahlen bei der Plattenzählung führt. Schließlich sind Inkubationszeiten von etwa 48 Stunden erforderlich, bevor Bakterienplatten gezählt werden können, und noch längere Plattierzeitspannen sind für Pilze erforderlich. Während dieser Inkubationszeit nehmen die Bakterienzahlen in der Hauptmenge der Milch, aus der die Probe entnommen wurde, zu, so daß das erhaltene Ergebnis die tatsächliche Anzahl an koloniebildenden Organismen in der Milch nach dem Test unterschätzt. Die Verzögerung bei der Verarbeitung der Rohmilch, um dieser Inkubationszeitspanne selbst Rechnung zu tragen, verringert die Qualität der Rohmilch und kann zu einer kürzeren Haltbarkeit des Endprodukts beitragen.
Die Plattier- oder Koloniezählverfahren können manuell oder automatisch sein. Manuelle Verfahren umfassen das Plattenschleifenverfahren (D. I. Thompson, Journal of Milk and Food Technology, Bd. 30 (1967), S. 273) und die Standard-Plattenzählung (a.a.O.).
Halbautomatische oder automatische Koloniezählverfahren umfassen das Spiralplattierverfahren (J. E. Gilchrist, Appl. Micro., Bd. 25 (1973), S. 244) und Verfahren, die mit elektronischen Koloniezählgeräten durchgeführt werden (M. G. Fleming, Ir. J. Agric. Res., Bd. 14 (1975), S. 21). Die direkte Epi-Fluoreszenztechnik (DEFT) ist eine Fluoreszenz-Markierungstechnik, die manuell oder mit automatischen Instrumenten durchgeführt werden kann. Andere Techniken umfassen Impedanzmessungen nach dem Wachstum von Milchorganismen und radiometrische Verfahren unter Anwendung von radioaktiver Glucose.
Ein weiterer Ansatz zur Bestimmung von Mikroben besteht in der Ausnutzung der Biolumineszenzmessung von ATP aus lebenden Zellen in Milch unter Verwendung von Leuchtkäfer-Luciferase (Lumax bv, Niederlande). Bei diesem Verfahren werden Rindersomazellen in Rohmilch mit einem Detergens lysiert, das Somazellen-ATP freisetzt. Dieses ATP aus Rinderzellen und jegliches sonstiges nicht-mikrobielles Milch-ATP wird mit einer Atpase, üblicherweise Kartoffel-Apyrase, abgebaut. Schließlich wird ein Bakterienlysemittel zugegeben, und bakterielles ATP wird in einem Biolumineszenzassay unter Verwendung von Leuchtkäfer-Luciferase gemessen. In der Literatur sind zwar viele Daten hinsichtlich dieser Verfahren gesammelt worden; die Empfindlichkeit ist jedoch nicht ausreichend für Routine- Milchuntersuchungen aufgrund einer Inhibition der Luciferasereaktion durch Milch und Extraktionsmittel, unvollständige Entfernung von nichtbakteriellem ATP, ungünstigen Wirkungen von Apyrase auf den bakteriellen ATP-Nachweis (D. N. Theron, J. Food Prod., Bd. 49 (1986), S. 4-7) sowohl vor als auch nach der bakteriellen Zellyse und unzureichender Extraktion von bakteriellem ATP. Literaturdaten (J. A. J. Webster, M. S. Hall, C. N. Rich, S. E. Gilliliar, S. R. For, F. R. Leach, J. Food Prod., Bd. 51 (1988), S. 949-954) für diese Art von Assay deuten auf eine Zellempfindlichkeit von ungefähr 1x10&sup6; Zellen/ml, was in den Vereinigten Staaten nicht genutzt werden kann, wo ein Grenzwert von 1x10&sup5; Zellen/ml für Rohmilch mit der Qualität A erforderlich ist.
Eine logische Verbesserung dieses Verfahrens, die versucht worden ist, besteht im Konzentrieren der Milchbakterien vor dem ATP-Assay. Verschiedene Techniken sind in der Literatur genannt worden, die die Zellfiltrationskonzentration nutzen (P. I. Peterkin, A. N. Sharpe, Appl. Environ. Microbiol., Bd. 39 (1980), S. 1138-1143), wobei diese Techniken jedoch recht mühsam und langsam sind und immer noch die meisten der technischen Schwierigkeiten, die vorstehend erörtert wurden, aufweisen.
Während bei allen vorstehend genannten Techniken ein gewisses Maß an Erfolg gezeigt worden ist, hat sich keine der Techniken als billig, einfach, genau, schnell und empfindlich genug erwiesen, um der Milchindustrie die Art von Test zur Verfügung zu stellen, die zufriedenstellend für Routineuntersuchungen verwendet werden kann.
Es sind Verfahren zum Assay von bakteriellen Kulturen, die ausgehend von Lebensmittelproben (unter Einschluß von Milch und Fleisch) gezüchtet wurden, auf eine Salmonellenkontamination unter Anwendung einer Immunoassaytechnik, Anwendung von Antikörpern gegen ein Antigen, das Salmonella spp. gemeinsam ist, und Anwendung einer Nucleinsäure-Sondenhybridisierungstechnik unter Einsatz von DNA-Sonden für Salmonellen-DNA verfügbar. Diese Verfahren erfordern jedoch das mühsame und zeitaufwendige Züchten von Bakterienkulturen aus dem Lebensmittelmaterial, das analysiert wird, bevor die Assays auf Salmonellen durchgeführt werden können.
Die Notwendigkeit eines derartigen Züchtens vor der Anwendung von Nucleinsäure-Sondenhybridisierungstechniken zum Nachweis der Kontamination durch unerwünschte Mikroorganismen aus Lebensmittelmaterialien unter Einschluß von Milch, Fleisch (z. B. Huhn, Truthahn, Rind, Schwein, Pferd, Ziege, Wal und dergl.), Eiern, Fisch, Muscheln, Mollusken, Krustentieren, Gemüsen, Früchten, Körnern und dergl. kann vermieden werden oder die Zeit für die Züchtung kann wesentlich verringert werden, wenn Nucleinsäure- Amplifikationstechniken, wie die bekannte Polymerasekettenreaktionstechnik (PCR-Technik), angewandt werden, um die Konzentration an Nucleinsäuresegmenten, die für die Mikroorganismus-Kontaminierungen charakteristisch sind, auf Konzentrationen zu erhöhen, die ohne weiteres durch Nucleinsäure-Sondenhybridisierung oder Nucleinsäure-Anfärbeverfahren nachgewiesen werden können. Zielnucleinsäure-Amplifikationstechniken sind jedoch noch nicht erfolgreich für diesen Zweck bei Kulturen oder Extrakten von Proben von Lebensmittelmaterialien oder anderen Materialien biologischen Ursprungs, wie Blut, Urin oder Stuhl, angewandt worden, sofern nicht vor der Anwendung der Verfahren zur Amplifikation Mikroorganismen aus den Proben aufwendigen, kostspieligen oder auf andere Weise ungünstigen Spezialbehandlungen, wie mit proteolytischen Enzymen, hohen Konzentrationen an Guanidiniumsalzen und Detergentien oder Kochen, unterzogen worden sind und die DNA aus den Mikroorganismen nach ähnlich ungünstigen Verfahren, wie Ethanol-Fällung oder chromatographische Trennung mit oder ohne Phenol/Chloroform-Extraktion, verarbeitet worden ist. Diese Behandlungen sind als notwendig zur Abtrennung der Nucleinsäure, die der Amplifikation unterzogen werden soll, von Verunreinigungen, die die enzymatischen Reaktionen, die für die Amplifikation erforderlich sind, stören und von denen angenommen wird, daß sie von den Mikroorganismen selbst stammen oder auf andere Weise aus den Proben in die daraus abgetrennten Mikroorganismen gelangen, angesehen worden; vgl. z. B. Hill et al., Appl. Environ. Miorobiol., Bd. 57 (1991), S. 707-711; Keasler und Hill, Abstracts of the 91st General Meeting of the American Society for Microbiology, Abstract Nr. P-12, S. 269 (1991); Olive, J. Clin. Microbiol., Bd. 27 (1989), S. 261-265.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Trennung und Konzentrierung von Zellen aus einem Anteil einer Kultur oder eines Extrakts eines Materials biologischen Ursprungs folgende Stufen:
(a) Kombination des Anteils mit einer wäßrigen Suspension eines mikroteilchenartigen Trägers unter Bildung einer Klärlösung; und
(b) Abtrennung der Zellen aus der Klärlösung.
Ein derartiges Verfahren kann auf einfache und zuverlässige Weise durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung kann herangezogen werden, um verschiedene Arten von flüssigen Milchprodukten unter Einschluß von Rohmilch, pasteurisierter Milch, rekonstituierter Trockenmilch, Sahne, Eiscreme und anderen Milchprodukten und Derivaten zu analysieren.
Gemäß einer Ausführungsform umfaßt ein derartiges Verfahren die Zugabe eines chelatisierenden Mittels zu einer Milchprobe und die anschließende Trennung der zellulären Bestandteile von anderen Milchbestandteilen, z. B. durch Zentrifugation der Probe, die mit dem chelatisierenden Mittel gemischt ist, für eine kurze Zeitspanne und Trennen oder Dekantieren nicht-zellulärer Milchbestandteile von dem abgetrennten zellulären Pellet. Ein Mittel, wie ein Detergens, zur Lyse von tierischen Zellen, nicht jedoch der fraglichen Mikroorganismuszellen, kann der Probe während der Zentrifugation einverleibt werden.
Die Bestandteile des zellulären Pellets, das sich bei einer derartigen Trennung ergibt, sind einer Vielzahl von Analysen zugänglich, wobei bei derartigen Analysen keine Störungen auftreten, die durch kontaminierende Milchbestandteile hervorgerufen würden. Das zelluläre Pellet kann sowohl somatische Zellen (d. h. Säugerzellen aus dem Säuger, der die Quelle für die Milch ist) als auch Mikroorganismuszellen, die dann mikroskopisch untersucht werden können, um jeweils die relative Konzentration zu bestimmen, enthalten. Die somatischen Zellen können auch durch Zugabe eines lysierenden Mittels, wie eines Detergens, zu der Probe zusammen mit dem chelatisierenden Mittel in der Klärlösung entfernt werden, wobei ein Mittel gewählt wird, das nur die somatischen Zellen lysiert. Das nach der Zentrifugation zurückbleibende Pellet enthält also fast ausschließlich mikrobielle Zellen (d. h. Mikroorganismuszellen), die auf verschiedene Weise analysiert werden können, unter Einschluß der Analyse der ATP-Konzentration nach Extraktion von ATP, wie durch Lyse der Mikroorganismen. Eine Filtration kann ebenfalls genutzt werden, um zelluläre Bestandteile von anderen Milchbestandteilen in der Milchprobe zu trennen, zu der die Klärlösung gegeben worden ist.
Das Vorhandensein von tierischen Zellen, wie Rindersomazellen, in einer Rohmilchprobe kann ebenfalls auf eine rasche und einfache Weise bestimmt werden. Die Erfindung eignet sich ferner für die Analyse der Kontamination von Milchproben durch eine Reihe von Mikroorganismen, wie Bakterien, Hefen und Schimmelpilzen, sowie Sporen von Bakterien, Hefen und Schimmelpilzen.
Die konzentrierten zellulären Materialien, die aus der Milch mittels der vorliegenden Erfindung isoliert worden sind, können für verschiedene Arten weiterer Analysen verwendet werden, und zwar unter Einschluß der mikroskopischen Untersuchung mit Farbstoffen oder Anfärbemitteln oder mit chromogenen, fluoreszierenden, chemolumineszierenden oder anderen nachweisbaren Reportermolekülen. Die isolierten, konzentrierten zellulären Materialien können auch zum Plattieren, und zwar für ein breites Spektrum oder eine spezifische Plattierung von Mikroorganismen, oder für die Herstellung von Proben für beliebige der Milchuntersuchungsverfahren, die routinemäßig angewandt werden, verwendet werden.
Das Käfer-Luciferase-ATP-Bestimmungsverfahren (M. A. Deluca, Advances in Enzymology, A. Meister (Hrsg.), Bd. 44 (1976), S. 37-68) kann in der vorliegenden Erfindung zur quantitativen Bestimmung der zellulären Zahlen in der ursprünglichen flüssigen Milchprobe herangezogen werden. Dieses ATP-Bestimmungsverfahren ist für die quantitative Bestimmung der Anzahl von tierischen Zellen oder Mikroorganismuszellen anwendbar. Das abgetrennte isolierte zelluläre Material kann bei einer beliebigen Art von enzymatischem, immunologischem oder molekularbiologischem Testverfahren verwendet werden, bei dem spezifische Organismustypen in einer flüssigen Milchprobe quantitativ bestimmt oder identifiziert werden. Zu diesen Verfahren gehören Nucleinsäure-Sondenhybridisierungsassays unter Einschluß derartiger Assays nach Zielnucleinsäure-Amplifikation durch PCR oder andere Techniken.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch als ein Vorbehandlungsverfahren für eine Vielzahl von Proben für Zentrifugation oder Filtration über verschiedene Arten von Filtrationsmatrices, wie Membranen, Hohlfasern oder Filtern vom Zentrifugationstyp, verwendet werden.
Während chelatisierendes Mittel, Detergens (lysierendes Mittel) und mikroteilchenartiger Träger jeweils für wichtige unabhängige Vorteile bei der Abtrennung von Zellen aus Milchproben sorgen, ist im Fall anderer Lebensmittelproben die Kombination aus mikroteilchenartigem Träger mit Zentrifugation oder Filtration ausreichend.
Überraschenderweise sind Mikroorganismenzellen aus Milchproben oder aus Kulturen oder Extrakten, die aus Proben von anderen Lebensmittelmatenahen, wie es vorstehend angegeben wurde, oder Nichtlebensmittelmatenahen biologischen Ursprungs, wie Blut, Urin und Stuhl, hergestellt wurden, nach der Abtrennung von nicht-zellulären Bestandteilen unter Anwendung von chelatisierendem Mittel, mikroteilchenartigem Träger/Klärlösung (im Fall von Milch) oder mikroteilchenartigem Träger/Klärlösung (im Fall anderer Materialien) und des erfindungsgemäßen Trennverfahrens frei von Verunreinigungen, soweit diese nicht in den abgetrennten Zellen selbst vorhanden sind, die enzymatische Reaktionen hemmen, die für die Zielnucleinsäure-Amplifikation erforderlich sind Auf diese Weise können die abgetrennten Zellen in vorteilhafter Weise direkt ohne Notwendigkeit der Isolierung der Nucleinsäure aus anderen zellulären Bestandteilen verwendet werden, um Nucleinsäure für die Amplifikation bereitzustellen. Die Zellen müssen einfach behandelt werden (wie durch kurzes Halten bei einer erhöhten Temperatur), so daß bewirkt wird, daß sie Nucleinsäure freisetzen und Enzyme oder andere Bestandteile, die die amplifizierte Nucleinsäure abbauen oder enzymatische Reaktionen, die für das angewandte Amplifikationsverfahren erforderlich sind, hemmen würden, denaturiert werden. Wenn das Amplifikationsverfahren auf einem Enzym beruht, das bei der erhöhten Temperatur irreversibel inaktiviert würde, dann können die Zellen direkt zu einer Lösung von Reagenzien, die für die Amplifikation erforderlich sind, soweit es sich nicht um das/die temperaturempfindliche(n) Enzym(e) handelt, gegeben werden, kann die Lösung auf eine erhöhte Temperatur erwärmt und dann abgekühlt werden und können die Enzyme zur Einleitung der Amplifikation zugegeben werden (wobei angenommen wird, daß die Zielnucleinsäure vorhanden ist). Gemäß einem bevorzugten Verfahren werden nur thermisch stabile Enzyme bei dem Amplifikationsverfahren (vorzugsweise PCR) verwendet. Dann werden abgetrennte Zellen direkt zu einer Lösung mit allen Reagenzien unter Einschluß von Enzymen, die für die Amplifikation erforderlich sind, gegeben, und die Lösung wird auf eine erhöhte Temperatur (niedrig genug, so daß die Enzyme für die Amplifikation aktiv bleiben) erwärmt und anschließend, wenn die Temperatur ausreichend verringert wird, so daß die Primer mit der Matrize hybridisieren, beginnt die Amplifikation. Das Zielnucleinsäuresegment aus den Mikroorganismen, die nachgewiesen werden sollen, wird, wenn es vorhanden ist&sub1; bei dem Amplifikationsverfahren amplifiziert. Die Nucleinsäure, die sich bei dem Amplifikationsverfahren ergibt, kann dann z. B. unter Anwendung eines beliebigen Nucleinsäure-Sondenhybridisierungsassays für das Zielnucleinsäuresegment untersucht werden.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt also ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von Zellen mit Nucleinsäure, die ein festgelegtes Zielsegment umfaßt, in einer Kultur oder in einem Extrakt eines Materials mit biologischem Ursprung das Erhalten eines Pellets von Zellen aus der Kultur oder dem Extrakt unter Anwendung des Verfahrens entsprechend dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung (gelegentlich als Zellwaschverfahren bezeichnet) und dabei die Anwendung der Zentrifugation, mit der Maßgabe, daß, wenn die Kultur eines Materials mit biologischem Ursprung eine Flüssigmilchprobe ist, die Klärlösung ferner ein chelatisierendes Mittel enthält; das Suspendieren von Zellen aus dem so erhaltenen Pellet in einer ersten Lösung und die Behandlung der ersten Lösung, um eine zweite Lösung von Nucleinsäure aus den Zellen im wesentlichen ohne Isolierung der Nucleinsäuren aus den Zellen von anderen Bestandteilen der Zellen bereitzustellen; das Unterwerfen der Nucleinsäure der zweiten Lösung einem Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren, um ein festgelegtes amplifiziertes Nucleinsäuresegment bereitzustellen, nur wenn das festgelegte Zielsegment in den Zellen, die aus dem Pellet suspendiert wurden, vorhanden ist; und die Untersuchung von Nucleinsäure nach dem Amplifikationsverfahren auf das Vorhandensein des festgelegten amplifizierten Segments.
Die Zellen des Pellets, das nach den Zellwaschverfahren erhalten wird, können einfach gewaschen werden, bevor sie in der Lösung zur Behandlung suspendiert werden, um Nucleinsäure für die Amplifikation bereitzustellen. Vorzugsweise handelt es sich bei der Untersuchung, die die letzte Stufe des Verfahrens ist, um einen Nucleinsäure-Sondenhybridisierungsassay, bei dem, wie der Fachmann versteht, eine Sonde (vorzugsweise ein Oligonucleotid und nachweisbar markiert), die zur Hybridisierung mit dem amplifizierten Zielsegment imstande ist, eingesetzt wird. Wie der Fachmann versteht, kann das Verfahren, indem es parallel mit geeigneten Standards durchgeführt wird, nicht nur zum Nachweis des Vorhandenseins von festgelegten kontaminierenden Mikroorganismen (falls diese in einer Konzentration über der Empfindlichkeit des Verfahrens vorhanden sind) in dem untersuchten Material, sondern auch zur quantitativen Bestimmung des Ausmaßes der Kontamination des Materials mit derartigen Mikroorganismen herangezogen werden.
Eine erhöhte Temperatur, die angewandt werden kann, um Nucleinsäure aus Zellen freizusetzen und die Amplifikation inhibierende Substanzen aus den Zellen zu denaturieren oder zu inaktivieren, liegt über etwa 70ºC und insbesondere über etwa 90ºC für die Analyse von Proben von Zellen aus Milch oder Kulturen, die aus Fleisch, Eiern oder im Wasser lebenden Spezies, die als Nahrungsquellen verwendet werden, hergestellt werden.
Bei bevorzugten Amplifikationsverfahren müssen Anteile der Lösung mit Reagenzien (z. B. Enzymen) nicht im Verlauf des Amplifikationsverfahrens zugegeben werden. Ein besonders bevorzugtes Amplifikationsverfahren ist das PCR-Verfahren unter Anwendung einer thermisch stabilen DNA-Polymerase aus einem Bakterium, wie Thermus aquaticus, das bei hohen Temperaturen lebt; gemäß einem besonders bevorzugten Verfahren treten thermische Zyklen auf; die thermisch stabile Polymerase behält jedoch ausreichend Aktivität ungeachtet der hohen Temperaturen, die während der Zyklen erreicht werden, so daß Enzym während des Amplifikationsverfahrens nicht erneut zugegeben werden muß.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch als weitere Aspekte eine Klärlösung gemäß Definition in Anspruch 25 und neue Testpackungen gemäß Definition in den Ansprüchen 28, 30, 32 und 34 für die Ausführung der erfindungsgemäßen Verfahren. Derartige Testpackungen enthalten eine Klärlösung, die mindestens ein chelatisierendes Mittel, einen mikroteilchenartigen Träger und ein Somazellen-Lysemittel enthält. Die Testpackungen können auch eine Lösung zum Waschen des Zellpellets und zum ATP-Nachweis, ein Mikrobenzell-ATP-Extraktionsmittel oder Lysemittel, eine Pufferlösung und ein ATP-Nachweisreagenz, wie Luciferase-Luciferin, enthalten. Testpackungen können auch Bestandteile zur Herstellung einer Probe für den Breed-Ausstrichtest oder andere Arten von direkten mikrobiologischen Untersuchungsverfahren enthalten. Erfindungsgemäße Testpackungen können auch Enzyme, Puffer und andere Reagenzien für die Nucleinsäure- Amplifikation oder den Nachweis von amplifizierter Nucleinsäure in einem Nucleinsäure-Sondenhybridisierungsassay oder durch Anfärbung umfassen.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind aus der nachstehenden ausführlichen Beschreibung ersichtlich, wenn sie zusammen mit der beigefügten Zeichnung betrachtet wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

In der Zeichnung:
erläutert Fig. 1 die Stufen bei dem allgemeinen erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung einer flüssigen Milchprobe;
ist Fig. 2 ein Graph, der die Korrelation zwischen CFU und RLU für die Trennung von Mikrobenzellen aus Milch gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 zeigt;
ist Fig. 3 ein Graph, der die Korrelation zwischen CFU und RLU für die Trennung von Mikrobenzellen aus Milch gemäß der Beschreibung in Beispiel 2 zeigt.
Definitionen:
Der Ausdruck "Bakterien" soll einzellige Prokaryonten umfassen. Es gehört auch zum Umfang der vorliegenden Erfindung, die Ausdrücke "Mikrobe" oder "Mikroorganismuszelle" auszutauschen.
Der Ausdruck "eukaryontische Zellen" soll Organismen bezeichnen, bei denen genetisches Material von einem Kern eingeschlossen ist.
Der Ausdruck "flüssige Milchprobe" soll alle flüssigen Lösungen, die ihren Ursprung in Molkerei-Rohmaterialien oder Produkten haben, und zwar unter Einschluß von Rohmilch, bei ultrahoher Temperatur pasteurisierter Milch, bei niedriger Temperatur für lange Zeit pasteurisierter Milch, rekonstituierter pulverförmiger Milch, Sahne, Magermilch, verflüssigter Eiscreme oder Eismilch oder verwandten Produkten, und Suspensionen von Milch oder Molkereiprodukten in flüssigen Proben umfassen. Während Kuhmilch das bevorzugte Material für die Anwendung der vorliegenden Erfindung ist, kann die Erfindung genausogut auf Milch von einem beliebigen Säuger angewandt werden.
Der Ausdruck "Chelatbildner" oder "chelatisierendes Mittel" soll alle Moleküle oder Makromoleküle umfassen, die an Calciumionen binden oder damit eine Kombination eingehen und die möglicherweise auch andere zweiwertige Metallionen unter Einschluß von Magnesiumionen, Eisenionen, Zinkionen, Cadmiumionen, Berylliumionen, Cobaltionen, Nickelionen, Kupferionen, Bleiionen und andere Metallionen binden. Der Ausdruck "Chelatbildner" oder "chelatisierendes Mittel" umfaßt alle synthetischen und natürlichen organischen Verbindungen, von denen bekannt ist, daß sie diese Ionen binden, sowie beliebige Moleküle biologischen Ursprungs oder Nebenprodukte oder modifizierte Produkte eines Moleküls mit biologischem Ursprung, wie Proteine, Zucker oder Kohlenhydrate, Lipide und Nucleinsäuren und beliebige Kombinationen daraus, die die vorstehend genannten Arten von Ionen binden können. Der Ausdruck "Chelatbildner" oder "chelatisierendes Mittel" umfaßt auch beliebige feste Materialien natürlichen oder synthetischen Ursprungs, die Calcium und in einem geringeren Maß Magnesium und vielleicht eines oder mehrere der anderen vorstehend genannten Ionen binden.
Während verschiedene Verfahren, die in der gesamten Erfindung genutzt werden, auf diesem Gebiet allgemein bekannt sind, ist die Kombination dieser Verfahren gemäß der Erfindung nicht in Betracht gezogen worden. Allgemeine Verfahren, die auf diesem Gebiet bekannt sind und die eine Rolle bei den gesamten erfindungsgemäßen Assaytechniken spielen, umfassen Standardplattiertechniken von Mikroorganismen aus Molkereiprodukten, Anfärbe- und Identifikationsverfahren für Mikroorganismen, bakterielle Extraktionsverfahren, die Verwendung von abgetrennten, konzentrierten zellulären Materialien bei anderen Verfahren und allgemein die Chelatchemie. Eine Erörterung einer oder mehrerer der vorstehend genannten Techniken findet sich in den folgenden Druckschriften, die durch Verweis zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht werden: Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 15. Auflg., 1985, G. H. Richardson, (Hrsg.), American Public Health Assoc., Washington, D. C.; Bacteriological Analytical Manual, 6. Auflg., USDA, 1984, Marcel Dekker Inc., New York; J. Sambrok, E. F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular Cloning, 2. Auflg., M. Ferguson (Hrsg.), Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989; F. O'Connor, Australian J. Dairy Tech., Juni 1984, S. 61-65 (diese Druckschrift umfaßt Beschreibungen von mikrobiellen Milchtestverfahren und relevante Druckschriften für die einzelnen Verfahren); D. M. Karl, Microbiological Reviews, Bd. 44 (1980), S. 739-769; A. E. Martell, Chemistry of the Metal Chelate Compounds, Prentice-Hall, New York, 1952; Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 2 Bände (mit Nachträgen), 1987-1991.
Wie in den zitierten Werken Molecular doning and Current Protocols in Molecular Biology angegeben ist, sind Nucleinsäure-Amplifikationstechniken und insbesondere die mit thermisch stabilen Enzymen, wie die PCR- Amplifikation unter Einsatz von DNA-Polymerasen aus Thermus aquaticus, bekannt, was auch für Nucleinsäure-Sondenhybridisierungsassayverfahren und Anfärbeverfahren zum Nachweis von Nucleinsäuresegmenten gilt. Weitere Informationen hinsichtlich dieser Techniken finden sich in den US- Patenten 4 693 195 und 4 693 202 (PCR und ihre Anwendung bei Nucleinsäure-Sondenhybridisierungsassays für die Diagnose); in der internationalen Patentanmeldung WO 88/10315 (Transkriptions-basierte Nucleinsäure- Amplifikations/Nachweisverfahren); im US-Patent 4 889 818 und der internationalen Patentanmeldung PCT/U590/04169 (veröffentlicht Februar 1991) (thermostabile DNA-Polymerasen aus Thermus aquaticus (Taq-DNA-Polymerasen) und ihre Verwendung bei der PCR-Amplifikation); in der europäischen Patentveröffentlichung 0 329 822 (isothermes Transkriptions-basiertes Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren); im US-Patent 4 957 858 (Q-Beta-Replikase-katalysierte autokatalytische Replikation von replizierbarer RNA, gebunden an Sonden, die komplementär zum Zielsegment sind).
Die vorliegende Erfindung umfaßt eine Trenn- und Konzentrationstechnik zur Entfernung von zellulären Materialien aus flüssigen Milchproben und anderen Kulturen. Die Technik wird nun ausführlich mit Bezug auf eine flüssige Milchprobe beschrieben; es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß sie in gleicher Weise auf Kulturen angewandt werden kann, die aus anderen Materialien hergestellt werden.
Bei der Ausführung der Technik wird eine Milchprobe in ein Zentrifugationsgefäß geeigneter Größe, wie es bei 10 in Fig. 1 gezeigt ist, gegeben, und ein chelatisierendes Mittel und ein mikroteilchenartiger Träger und wahlweise ein lysierendes Mittel werden zugegeben. Bei dem chelatisierenden Mittel kann es sich um eines unter verschiedenen Arten, wie sie vorstehend beschrieben wurden, handeln, die, lediglich zur Erläuterung, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, VerseneR), Bis-(o-aminophenoxy)-ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäure (BAPTA), Ethylenglykol-bis-(β- aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA), Nitrilotriessigsäure (Triglycin, Ammoniaktriacetat, Triton A), trans-1,2-Diaminocyclohexantetraessigsäure (CDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), Citrat, Arginin, Hypoxanthin, 4,5-Dihydroxybenzol-1,3-disulfonsäure, Natriumphosphatglas oder beliebige der Moleküle der "Glas-" oder Polyphosphatfamilie, Verbindungen vom Kronenethertyp und alle Derivate und Vorstufen derartiger Moleküle umfassen. Das chelatisierende Mittel, z. B. EDTA, und der Träger oder das lysierende Mittel, falls vorhanden, werden vorzugsweise zu der Milchprobe zusammen mit einer Lösung, die als "Klärlösung" bezeichnet wird, gegeben; und das Gefäß mit dem Gemisch aus chelatisierendem Mittel und Träger oder lysierendem Mittel und Milchprobe wird verschlossen und zum Mischen umgedreht oder einer Vortex-Behandlung unterzogen. Die Probe wird dann in eine Zentrifuge geeigneter Größe gegeben, und die Probe wird bei 10 000 x g (minimale relative Zentrifugalkraft) für mindestens 5 Minuten zentrifugiert. Nach der Zentrifugation trennt sich die Probe in drei unterschiedliche Phasen. Die oberste Phase ist ein Sahne- und Milchprotein-"Kissen", das bei 15 in Fig. 1 gezeigt ist, und dieses Kissen schwimmt ganz oben auf der flüssigen Probe. Unterhalb des Kissens befindet sich die zweite "klare" flüssige Zone, die bei 16 in Fig. 1 gezeigt ist und die, im Gegensatz zu einer Milchprobe, nicht opak und durchscheinend ist. Schließlich ist am Boden des Zentrifugenröhrchens das zelluläre Pellet 17, dessen Größe von der Anzahl der Zellen in der ursprünglichen Milchprobe und der Art des/der chelatisierenden Mittel(s) und/oder des mikroteilchenartigen Trägers und/oder des Detergens/der Detergentien, die bei der Behandlung verwendet wurden, abhängig ist. Das Pellet kann auch eine kleine Anzahl an anderen Milchbestandteilen enthalten, die mit den Zellen assoziiert sind. Nach Klären einer typischen Rohmilchprobe von 1,0 ml hat das Pellet ein Volumen von ungefähr 10 bis 40 µl und ist weiß oder schmutzig-weiß im Erscheinungsbild.
Die vorgeschlagene Wirkung des chelatisierenden Mittels in der vorliegenden Erfindung besteht in der Dissoziation von Caseinmicellen in der Milchprobe in "Submicellen" (L. C. Chaplin, J. Dairy Res., Bd. 51 (1984), 251-257). Nach der Chelatisierungsbehandlung steigt micellenartiges Milchproteinmaterial nach oben im Zentrifugenröhrchen oder verbleibt in Lösung, im Gegensatz zur Pelletierung in Abwesenheit des Chelatbildners. Der Chelatbildner bindet Calciumionen, die ein Hauptbestandteil sind, der zur Micellenstruktur beiträgt (S. H. C. Lia, Biochemistry, Bd. 11 (1972), S. 1818-1821). Chelatisierende Mittel, die Calciumionen besonders gut binden, sind also in der vorliegenden Erfindung bevorzugt.
Bei dem erfindungsgemäßen Trennverfahren ist es von großer Wichtigkeit, daß das chelatisierende Mittel auf die Milchmicellen einwirkt, während es die zu untersuchenden Zellen nicht beeinträchtigt. Ein chelatisierendes Mittel, das Milch klären kann, jedoch außerdem mikrobielles Zell-ATP oder Lebensfähigkeit entfernt, verringert oder vermindert wäre z. B. ein schlechter Kandidat für ein Assayverfahren, wie ein Verfahren unter Verwendung von Käfer-Luciferase, bei dem mikrobielles ATP gemessen wird. Aus diesem Grund sind für bestimmte Arten von Anwendungen bestimmte chelatisierende Mittel anderen überlegen. Chelatisierende Mittel, von denen festgestellt wurde, daß sie besonders geeignet sind, sind Nitrilotriessigsäure und Ethylendiamintetraessigsäure.
Bei der vorliegenden Erfindung wird mikroteilchenartiger Träger zum Sammeln der Zellen, insbesondere mikrobiellen Zellen, während der Zentrifugationsstufen des Zelltrennverfahrens eingesetzt. Der mikroteilchenartige Träger dient dazu, das Pelletisierungsverfahren zu unterstützen. Die physikalische Beschaffenheit des mikroteilchenartigen Trägers ist so, daß der Träger geringfügig langsamer als die mikrobiellen Zellen sedimentiert oder pelletiert wird und so die Zellsammlung vollständiger macht.
Eine Anzahl von Materialien können als mikroteilchenartige Träger verwendet werden, unter Einschluß von "Kügelchen" aus Polystyrol, Latex, Kunststoff, Glas, Diatomeenerde, Metalloxiden und kolloidalen Materialien unter Einschluß von Polyacrylamid, Dextranen, vernetzten Dextranen und Stärken. Die Eigenschaften des mikroteilchenartigen Trägers, die erwünscht sind, sind dreifach: 1) Der Träger sollte so schnell wie die fraglichen Zellen, die gesammelt werden, oder vorzugsweise geringfügig langsamer sedimentieren. Diese charakteristische Eigenschaft ist im wesentlichen eine Funktion von Dichte, Größe und Ladung der Teilchen. 2) Der Träger sollte einer erneuten Suspension nach der Zentrifugation zugänglich sein, um die Behandlung oder Bewertung des Zellpellets zu erleichtern. 3) Der Träger muß inert im Hinblick auf die Untersuchung oder Bewertung sein, die mit dem Zellpellet durchgeführt wird. Zum Beispiel sollte der Träger bei Zellanfärbetechniken unsichtbar sein, wenn eine mikroskopische Untersuchung durchgeführt werden soll, oder der Träger sollte nicht an einen Analyten binden, der gemessen wird, wie ATP für die Messung oder Bestimmung von mikrobiellen Zellen. Kügelchen aus den vorstehend genannten Materialien mit Durchmessern zwischen etwa 0,25 µm und 2,5 µm sind als mikroteilchenartige Träger geeignet. Von oberflächenaktiven Mitteln freie Polystyrolkügelchen mit einem Durchmesser von etwa 1 µm sind die bevorzugten Mikroteilchenträger.
Die Verwendung der Mikroträgerteilchen bei dem erfindungsgemäßen Zelltrennverfahren verstärkt die Einfachheit, mit der ein Bediener in der Lage ist, unerwünschte Überstände von Zellpellets nach einer Zentrifugation zu entfernen. Der Träger dient als ein visueller Indikator, der wesentlich größer als das mikrobielle Zellpellet ist, und macht als solches die Entfernung der Überstände wesentlich bequemer. Außerdem wird die Möglichkeit, irrtümlich einen Teil oder die Gesamtmenge des Zellpellets abzusaugen, stark verringert, wenn der Mikroteilchenträger verwendet wird.
Wenn somatische Zellen aus einer Rohmilchprobe entfernt und nur mikrobielle Zellen abgetrennt und konzentriert werden sollen, dann kann ein nicht-ionisches Detergens, wie Triton X-100 oder Nonidet P-40 (NP-40), zu der Milchprobe in Kombination mit dem chelatisierenden Mittel gegeben werden. Ein derartiges Detergens lysiert spezifisch Rindersomazellen (tierische Zellen), ohne mikrobielle Zellen zu lysieren. Da die Somazellen in der Behandlung vor der Zentrifugation lysiert werden, gibt es im wesentlichen keine intakten Somazellen im Pellet nach der Zentrifugation. Anschließende ATP-Bestimmungen, die mit diesen Pellets durchgeführt werden, zeigen daher nur die bakteriellen Zellen oder andere Mikrobenzellen.
Wenn man andererseits die Anzahl der somatischen Zellen in einer Milchprobe messen oder quantitativ bestimmen will, dann kann ein Detergens identisch zu dem, das vorstehend genannt wurde, zu dem zellulären Pellet gegeben werden, und nur Somazellen werden lysiert. Ein zellulärer Metabolit, wie ATP, der in den Somazellen enthalten war, kann dann einfach ohne Erhöhung des Ergebnisses durch mikrobielles ATP gemessen werden, das mit dem Detergens nicht extrahiert werden kann. Die Anzahl der Somazellen, die in der Probe vorhanden waren, kann dann unter Anwendung der bekannten Menge an ATP, die gemessen wurde, und der mittleren Menge an ATP, von der bekannt ist, daß sie in Somazellen vorhanden ist, berechnet werden. Dieses Verfahren stellt eine Verbesserung gegenüber bisher veröffentlichten Verfahren dar (R. Bossuyt, Milchwissenschaft, Bd. 33 (1978), S. 11-13).
Das vorliegende Verfahren stellt ein wirksames Verfahren zur Konzentrierung von Zellen und zur Ausschaltung von Hintergrundmilchkontaminationen, wie Casein und Caseinmicellen, lipophilen Komponenten und Salzen dar. Um diese Konzentrierung durchzuführen, wird Milch, z. B. 1 ml, durch Zentrifugation mit einem chelatisierenden Mittel geklärt, und das erhaltene Pellet wird in einem sehr kleinen Volumen (z. B. 10 µl) eines geeigneten Puffers oder einer Flüssigkeit resuspendiert. In diesem Beispiel werden alle Zellbestandteile von den Milchkontaminationen entfernt und 100-fach konzentriert. Diese konzentrierte Probe kann dann auf Wunsch bei anderen Analysen verwendet werden.
Ein Beispiel für die Zweckmäßigkeit dieses Verfahrens ist das Anfärben und Zählen von Mikroorganismen aus Rohmilch. Wenn eine Milchprobe weniger als 1x10&sup5; Organismen pro ml enthält und 10 µl Milch auf einen mikroskopischen Objektträger gebracht und angefärbt werden, dann müssen viele Felder der angefärbten Probe beobachtet werden, um statistisch signifikante Zähldaten zu sammeln. Die Felder sind aufgrund der Hintergrundanfärbung anderer Milchbestandteile schwierig zu bewerten. Dieses Verfahren, das Breed-Ausstrichverfahren, wird allgemein, und zwar insbesondere in Japan, für die Bewertung der Rohmilchqualität angewandt. Durch Anwendung der vorstehenden Konzentrationsstufe (100-fache Konzentration) müssen viel weniger Felder gezählt werden, und die Felder sind wesentlich einfacher zu bewerten, da der Hintergrund wesentlich klarer ist. Dies erhöht den Probendurchsatz und verringert Ermüdung und Fehler des Bedieners.
Alternativ dazu kann die Anzahl somatischer Zellen in einer Probe quantitativ durch Abtrennung aller Zellen von den verschiedenen anderen Bestandteilen der Milch und Konzentrierung der Zellen entsprechend der vorliegenden Erfindung bestimmt werden.
Mikrobielle Zellen in einem Pellet, das frei von kontaminierenden Somazellen ist, können mit einem mikrobiellen Extraktionsmittel lysiert und auf ATP untersucht werden. Die Anzahl der mikrobiellen Zellen wird dann bestimmt, indem die ATP-Messung und die mittlere Menge an ATP, von der bekannt ist, daß sie in mikrobiellen Zellen oder spezieller in mikrobiellen Zellen aus Milch vorliegt, herangezogen werden. Diese Art von Verfahren bietet eine Anzahl von Vorteilen gegenüber anderen Verfahren, wie der Standardplattierung und der Spiralplattierung. Zunächst ist es wesentlich schneller, da ein Ergebnis in einer recht geringen Zeit von 1 Stunde im Gegensatz zu einem Zeitraum von 48 Stunden für die anderen beiden Verfahren verfügbar ist. Zweitens ergibt die ATP-Messung Ergebnisse, die nicht durch Zellverklumpung beeinflußt werden, d. h. ATP wird aus allen Zellen gemessen; bei Plattierverfahren werden Zellpaare oder Gruppen von Zellen als eine einzelne Zelle gezählt, da eine Kolonie gebildet wird. Drittens wird bei dem ATP-Verfahren ATP aus psychrophilen Organismen gemessen, die bei Plattenzählverfahren unberücksichtigt bleiben, bei denen bei Temperaturen über 30ºC gezüchtet wird.
Wie vorstehend erwähnt wurde, können Zellen, die unter Anwendung der vorliegenden Erfindung getrennt und konzentriert worden sind, verschiedenen anderen Methoden unterzogen werden, wobei der Hintergrund stark verringert ist und die Zellanzahl (und das damit verbundene Signal) aufgrund der Konzentration stark erhöht ist. Dies ergibt die Möglichkeit einer größeren Empfindlichkeit und zuverlässigerer, besser reproduzierbarer Ergebnisse aufgrund der Ausschaltung des Hintergrunds.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann auch Zellanreicherungs- oder Verstärkungstechniken vor oder nach der klärenden Zentrifugation umfassen, so daß Empfindlichkeit, Zellanzahl und Zellausdauer verbessert werden können. Zum Beispiel kann durch Behandlung von Zellen mit Behandlungen (D. P. Theron, J. Food Prot., Bd. 46 (1983), S. 196-198) oder Komponenten (K. M. Oxley, Bioluminescence and Chemiluminescence, J. Scholmerich (Hrsg.), John Wiley & Sons, N.Y., J. 495-198, 1986), die zelluläres ATP erhöhen, die Empfindlichkeit des Verfahrens verbessert werden. Diese Art von Verfahren kann auch auf den Nachweis spezieller Arten von Zellen in einer speziellen Probe unter Verwendung selektiver Medien oder sogar polyklonaler oder monoklonaler Antikörper angewandt werden.
Der Fachmann auf diesem Gebiet ist sich der Notwendigkeit und Beschaffenheit geeigneter Kontrollen bei Assayverfahren des in der vorliegenden Erfindung angewandten Typs und entsprechender Standards, so daß quantitative Informationen über die Analytkonzentration oder Menge aus derartigen Assayverfahren bestimmt werden können, bewußt. Derartige Kontrollen und Standards sind in den nachstehenden Beispielen erläutert.
Es wird nun Bezug auf Fig. 1 genommen, in der das erfindungsgemäße Klärwaschverfahren mit Bezug auf eine Milchprobe erläutert wird. Bei diesem Verfahren wird eine Milchprobe zunächst in ein Zentrifugationsgefäß 10 gegeben. Sodann werden ein chelatisierendes Mittel plus oder minus Mikroteilchenträger und plus oder minus ein Detergens unter Verwendung einer Klärlösung zugegeben, wie es angegeben ist. Der Inhalt des Gefäßes wird gemischt, das Gefäß wird dann zentrifugiert, und die erhaltene Probe wird als "geklärt" bezeichnet. Wenn eine Milchprobe ohne ein chelatisierendes Mittel auf die gleiche Weise zentrifugiert wird, dann gibt es keine "Klärung", sondern ein großes diffuses Milchprotein- und Zellpellet am Boden des Röhrchens. Schließlich wird das Zellpellet vom größten Teil der anderen Materialien in dem Gefäß durch Absaugen des Überstands nach der Zentrifugation befreit.
Testpackungen für die Analyse zellulärer Bestandteile aus flüssigen Milchproben können aus den folgenden Bestandteilen gebildet werden:
Eine mikrobielle Testpackung unter Anwendung des ATP-Nachweises umfaßt:
(a) Eine Klärlösung, die ein chelatisierendes Mittel, ein Somazellen-Lysedetergens, wie die chelatisierenden Mittel und Detergentien gemäß der vorstehenden Beschreibung, und einen Mikroteilchenträger enthält.
(b) Wahlweise eine Lösung zum Waschen des Zellpellets.
(c) Ein ATP-Extraktionsmittel, wie eine Zellyselösung gemäß der vorstehenden Beschreibung, zur Freisetzung von mikrobiellem Zell-ATP.
(d) Wahlweise eine Pufferlösung
(e) Ein ATP-Nachweisreagenz, wie Luciferase (z. B. aus P. pyralis)- Luciferin zur Messung des ATP durch Biolumineszenz.
Eine mikrobielle Testpackung unter Anwendung des Breed-Ausstriches umfaßt:
(a) Eine Klärlösung, wie sie für die mikrobielle Testpackung unter Anwendung des ATP-Nachweises beschrieben wurde.
(b) Wahlweise eine Lösung zum Waschen des Zellpellets.
(c) Eine Lösung zum Anfärben von Zellen.
Eine Rindersomazellen-Testpackung unter Anwendung des ATP-Nachweises umfaßt:
(a) Eine Klärlösung, wie sie für die mikrobielle Testpackung unter Anwendung des ATP-Nachweises beschrieben wurde, unter Ausschluß des Somazellen-Lysedetergens.
(b) Eine Somazellen-Lyselösung, die mikrobielle Zellen nicht lysiert.
(c) Ein ATP-Nachweisreagenz, wie Luciferase-Luciferin.
Eine mikrobielle Testpackung zum Nachweis von Mikroorganismen über Nucleinsäure-Amplifikation und Nucleinsäure-Sondenhybridisierung umfaßt:
(a) Eine Klärlösung, die einen mikroteilchenartigen Träger und im Fall einer Milchprobe auch ein chelatisierendes Mittel umfaßt.
(b) Wahlweise eine Lösung zum Waschen des Zellpellets aus dem Zellwaschverfahren unter Anwendung der Klärlösung.
(c) Enzyme und Primer, die für die Amplifikation eines Zielnucleinsäuresegments erforderlich sind, das für die Mikroorganismen, die nachgewiesen werden sollen, charakteristisch ist. Wahlweise können weitere leichter erhältliche Komponenten, die bei der Amplifikation verwendet werden, wie Nucleosidtriphosphate (2'-Desoxyribonucleosidtriphosphate für den Fall, daß nur DNA bei dem Amplifikationsverfahren synthetisiert wird), Puffer und dergl., bereitgestellt werden.
(d) Nucleinsäuresonde für das Zielsegment, das mit den Komponenten unter (c) amplifiziert wurde, zusammen mit Reagenzien, die zum Nachweis der Sonde, die an das Zielsegment hybridisiert ist, erforderlich sind, wenn die Sonde nicht als solche nachweisbar ist, (z. B. markiert mit ³²P). Wenn z. B. die Sonde kovalent (d. h. direkt) mit einem Enzym, wie alkalischer Phosphatase oder nicht-kovalent (d. h. indirekt) über Biotin, das kovalent mit der Sonde verknüpft ist, mit einem Avidin-Enzym (z. B. alkalische Phosphatase)-Komplex markiert ist, wobei das Enzym die Bildung eines Chromophoren katalysiert, das für ein nachweisbares Signal sorgt, dann werden Reagenzien für die Herstellung des Chromophoren, und zur indirekten Markierung des Avidin-Enzym-Komplexes bereitgestellt. Es können wiederum auch Puffer, feste Träger für die Hybridisierung und dergl. bereitgestellt werden.
(e) Alternativ oder wahlweise zusätzlich zu Nucleinsäuresonde und damit in Zusammenhang stehenden Reagenzien gemäß (d) ein Anfärbereagenz, wie Ethidiumbromid, um amplifiziertes Ziel bekannter Größe nachzuweisen, z. B. auf einem Gel. Reagenzien zur Herstellung eines geeigneten Gels bei parallelem Einsatz eines Größenmarkergels und dergl. können ebenfalls bereitgestellt werden, was der Fachmann versteht.
Jede der vorstehenden Testpackungen kann wahlweise einen Filter, z. B. gemäß der Beschreibung im nachstehenden Beispiel 6, und Reagenzien, um geeignete Kontrollen oder, für die Quantifizierung, Standards bereitzustellen, umfassen.
Die Erfindung wird weiter durch die nachstehenden nicht-bechränkenden Beispiele erläutert.

Referenzbeispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt die Abtrennung von mikrobiellen Zellen aus einer künstlich angeimpften Milchprobe. Außerdem wird der Assay mit einem im Handel erhältlichen Milch-ATP-Assay verglichen, um die relativen Empfindlichkeiten der beiden Verfahren zu vergleichen.
Rohmilchproben wurden von einer örtlichen Molkerei erhalten, und die Rohmilch wurde auf Standardagar (Standard Methods for the Examination of Dairy Products, a.a.O.) ausgestrichen, um einzelne Kolonien zu isolieren. 11 sichtbar verschiedene Kolonietypen wurden aufgenommen und in Standardbrühe gezüchtet, um zu versuchen, eine repräsentative Probe der verschiedenen Spezies, die sich möglicherweise in Rohmilch befinden, zu erhalten. Von diesen Isolierungen wurde eine Zellart (Serratia liquefaciens) für das Experiment gewählt.
Eine pasteurisierte Milchprobe wurde als eine negative Kontrolle für das Verfahren verwendet. Zu 1 ml dieser pasteurisierten Milch wurden 10 µl von über Nacht gezüchteten (23ºC), aus Milch isolierten Bakterien (S. liquefaciens) gegeben. Unter Verwendung dieser künstlich angeimpften Milchprobe und nicht angeimpfter pasteurisierter Milch wurde eine Anzahl von angeimpften Milchproben hergestellt, wie es in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben ist. Tabelle 1
Um die Anzahl der Organismen zu berechnen, die in die angeimpfte Milchprobe gegeben wurden, wurden 100 µl einer Verdünnungsreihe (10&supmin;³, 10&supmin;&sup4;, 10&supmin;&sup5;, 10&supmin;&sup6;, 10&supmin;&sup7; und 10&supmin;&sup8;) der über Nacht gezüchteten Zellsuspension auf Standardagar plattiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Die erhaltenen Koloniezahldaten wurden herangezogen, um die Anzahl der Bakterien in den Röhrchen 2 - 11 zu berechnen.
Eine Reihe von acht 1,5 ml fassenden Mikrozentrifugenröhrchen wurde in ein Teströhrchengestell gegeben und numeriert, und 1,0 ml jeder der Proben 1 - 8 in Tabelle 1 wurde in die einzelnen Röhrchen gegeben. Die Milch wurde bei Raumtemperatur (22ºC) für 10 Minuten inkubiert, und 500 µl einer Lösung mit 0,25 M EDTA, pH-Wert: 8,0, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40) wurden in jedes Röhrchen gegeben. Die Röhrchen wurden verschlossen, zum Mischen zehnmal umgedreht und in einen Rotor einer Winkelkopfmikrozentrifuge (Wheaton) gestellt, wobei sorgfältig darauf geachtet wurde, daß die Röhrchenscharniere nach außen zeigten. Die Röhrchen wurden bei 12000 x g für 10 min zentrifugiert, und der Überstand wurde dann vorsichtig unter Verwendung einer 1000 µl-Einmalpipettenspitze, die mit einer Absaugvorrichtung verbunden war, entfernt. Das Röhrchen wurde leicht gekippt, um den letzten verbleibenden Überstand in die Absaugvorrichtung zu gießen, so daß das erhaltene Pellet nicht abgesaugt oder auf andere Weise aufgebrochen wurde.
Zu jedem Pellet wurden 500 µl einer 0,1 M MgCl&sub2;, 0,2% NP-40-Lösung gegeben. Die Röhrchen wurden verschlossen und einer Vortex-Behandlung unterzogen, um die Zellen des Pellets zu resuspendieren, und anschließend wurden die Röhrchen wie zuvor zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden die Überstände erneut abgesaugt, und weitere 500 µl 0,1 M MgCl&sub2;, 0,2% NP-40-Lösung wurden in die einzelnen Röhrchen gegeben. Die Röhrchen wurden verschlossen, zentrifugiert und wie zuvor abgesaugt.
In jedes Röhrchen wurden 50 µl einer 1% Trichloressigsäure (TCA), 1 Irin EDTA, 0,0005% Xylenolblau-Lösung gegeben, um das zelluläre ATP zu extrahieren. Die Röhrchen wurden einer Vortex-Behandlung unterzogen und für 10 Minuten bei Raumtemperatur zur Inkubation belassen.
Unter Verwendung von Einmalkunststoffpipettenspitzen wurden die TCA- Extrakte in Luminometer-Kuvetten (Sarstedt) übertragen und mit 400 µl 0,1 M Tris-Acetat-Puffer, pH-Wert: 7,75, neutralisiert. Um die Luciferase- Reaktion einzuleiten, wurden 100 µl eines P. pyralis-Luciferase- Luciferin-Reagenzes (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA) zugegeben, und die Lichtabgabe wurde unter Verwendung eines Luminometers Berthold 9501 (Berthold Analytical, München, Deutschland) unter Anwendung einer Integrationszeit von 10 Sekunden gemessen. Die Lichtabgabeergebnisse werden als relative Lichteinheiten (RLU) ausgedruckt.
Unter Verwendung von äquivalent hergestellten kontaminierten Milchproben (Röhrchen 1 - 11 gemäß der Liste in der vorstehenden Tabelle 1) wurden Proben von 50 µl der einzelnen Milchproben unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Milchbakterien-Nachweiskits (LumacR bv, Niederlande) unter Anwendung des Protokolls des Herstellers analysiert.
Die Ergebnisse dieser Assays sind in Fig. 2 zusammengefaßt. Der log- Wert von RLU (Y-Achse) ist gegen den log-Wert der Bakterienzahl (X-Achse) in Kolonie-bildenden Einheiten (CFU) pro Milliliter für die vorliegende Erfindung und den im Handel erhältlichen Milchassaykit dargestellt. Es wurde festgestellt, daß die Empfindlichkeit für die vorliegende Erfindung weniger als 1 x 10&sup4; Zellen/ml beträgt, während die Empfindlichkeit für den Lumac-Assay ungefähr 1 x 10&sup6; Zellen/ml beträgt. Referenzbeispiel 2
Dieses Beispiel beschreibt die Abtrennung von mikrobiellen Zellen aus 11 Rohmilchproben und einer pasteurisierten Milchprobe.
Rohmilchproben wurden von einer örtlichen Molkerei erhalten und bei 4ºC gelagert. Eine pasteurisierte Milchprobe wurde ebenfalls in diese Untersuchung aufgenommen. 1 ml jeder Milchprobe wurde doppelt in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen pipettiert. Die Milchproben wurden bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 0,5 ml 0,5% NP-40, 3% Nitrilotriessigsäure (Natriumsalz) in jedes Röhrchen. Die Röhrchen wurden dann verschlossen und durch 10-maliges Umdrehen gemischt.
Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur für 5 min bei 12 000 x g zentrifugiert, und die Überstände wurden wie in Referenzbeispiel 1 abgesaugt. Zu jedem Pellet wurden 0,5 ml einer 0,05 mM MgCl&sub2;, 0,2% NP-40-Lösung gegeben. Die Röhrchen wurden verschlossen und einer Vortex-Behandlung unterzogen und für 5 Minuten wie vorstehend zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden die Überstände erneut abgesaugt, und Waschen, Zentrifugation und Absaugen wurden nochmals wiederholt.
Die erhaltenen Pellets wurden mit TCA-Lösung behandelt und in einem Luminometer gemäß der Beschreibung im vorstehenden Referenzbeispiel 1 abgelesen. Für jede Probe wird das Ergebnis als Mittelwert der doppelten Messungen bestimmt.
Jede Milchprobe wurde mit sterilem 0,8%-igem NaCl verdünnt, und 1, ml der 10-fachen Verdünnungen wurden doppelt in Petri-Schalen pipettiert. Ungefähr 20 ml steriler Standarumethoden-Agar wurden in jede Schale gegeben und gemischt. Die Platten wurden bei 23ºC für 48 Stunden inkubiert, und Kolonien wurden dann gezählt. Die Ergebnisse sind die Mittelwerte von doppelten Plattenzählungen.

Referenzbeispiel 3

Dieses Beispiel beschreibt die Abtrennung von mikrobiellen Zellen aus 65 Rohmilchproben unter Anwendung einer Modifikation des in Referenzbeispiel 2 dargelegten Verfahrens.
Die Milchproben wurden wie in Referenzbeispiel 2 behandelt, und zwar mit einer zusätzlichen Stufe der Zugabe einer Proteasebehandlung zur Behandlung des mikrobiellen Pellets.
Nach der ersten Zentrifugationsstufe wurde das erhaltene Pellet in 500 µl 0,05 mM MgCl&sub2;, 0,2% NP-40 und 30 µg/ml α-Chymotrypsin (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA, Katalog-Nr. C7762) gelöst. Das Pellet wurde 3 mal für 2 Sekunden einer Vortex-Behandlung unterzogen, und die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur für 20 Minuten inkubiert. Der Rest des Verfahrens ist identisch zu dem in Referenzbeispiel 2 beschriebenen Verfahren.

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt die Abtrennung von mikrobiellen Zellen aus 88 Rohmilchproben unter Anwendung einer Modifikation des in Referenzbeispiel 3 dargelegten Verfahrens.
Zu 1,0 ml jeder Rohmilchprobe wurden 500 µl einer Lösung von 3% Nitrilotriessigsäure (Natriumsalz), 0,5% Triton X-100 gegeben, und die Proben wurden dann wie in Referenzbeispiel 3 behandelt. Nach Absaugen der Überstände aus der ersten Zentrifugationsstufe wurden eine Lösung von 0,05 mM MgCl&sub2;, 0,2% Triton x-100 mit einem Gehalt an 0,01% von oberflächenaktiven Mitteln freien Polystyrolkügelchen (0,984 µm, Bangs Labs, Carmel, Indiana, USA) und 60 µg/ml α-Chymotrypsin zugegeben. Die Polystyrolkügelchen wurden mit den Zellen nach unten zentrifugiert. Die Proben wurden wie in Referenzbeispiel 3 inkubiert, zentrifugiert und abgesaugt, und die Pellets wurden in 0,05 mM MgCl&sub2;, 0,2% Triton X-100 resuspendiert, einer Vortex-Behandlung unterzogen und erneut zentrifugiert. Der Rest des Verfahrens wurde durchgeführt, wie es in Referenzbeispiel 3 beschrieben ist. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Fig. 2 gezeigt. Bei dieser Untersuchung wurde eine positive Korrelation zwischen den beiden Verfahren erhalten.

Beispiel 2

Dieses Beispiel beschreibt die Abtrennung von mikrobiellen Zellen aus 18 Rohmilchproben unter Anwendung einer Modifikation des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens.
Bei dieser Untersuchung wurde eine äquivalente Menge an Trägerpolystyrolkügelchen (beschrieben in Beispiel 1) zu 3% Nitrilotriessigsäure (Natriumsalz), 0,5% Triton X-100-Lösung für die erste Milchbehandlungsstufe gegeben. Es wurde kein Träger in den nachfolgenden Stufen zugegeben. Außerdem wurde α-Chymotrypsin mit einer Endkonzentration von 150 µm/ml in der ersten Waschlösung verwendet. Der Rest des Verfahrens entspricht der Beschreibung in Beispiel 1.
Die Ergebnisse dieser Korrelationsuntersuchung sind in Fig. 3 gezeigt, die eine Korrelation zwischen den beiden Verfahren zeigt.

Beispiel 3

Salmonella typhimurium Stamm PB637, erhalten von einem Krankenhaus in New England, wurde über Nacht in reicher Brühe gezüchtet. Über Nacht erhaltene Kultur wurde auf einen OD&sub6;&sub0;&sub0;-Wert von 0,1 verdünnt und dann bis zu einem OD&sub6;&sub0;&sub0;-Wert von 0,9 gezüchtet. Die Kultur wurde dann in einer Verdünnungsreihe 10-fach in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt. Ein Anteil jeder Verdünnung wurde plattiert, um den Titer an lebensfähigen Bakterien zu bestimmen. 5 µl jeder Verdünnung wurden zu 0,995 ml Rohmilch in Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Es gab 7 Verdünnungen plus eine Blindprobe von PBS ohne Bakterien. Sodann wurden 500 µl der Klärlösung (0,25 M EDTA, 0,5% Triton x-100, 0,01% mikroteilchenartiger Träger (von oberflächenaktiven Mitteln freie Polystyrolkügelchen, vgl. Beispiel 1)) in jedes Röhrchen gegeben. Die Röhrchen wurden 10 mal umgedreht, um ein gründliches Mischen zu erreichen. Die Röhrchen wurden für 5 Minuten in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert. Die Sahneschicht wurde entfernt, und der Überstand wurde abgesaugt. Die Zellen des Pellets wurden dann durch Resuspendieren des Pellets in 1 ml PBS unter Verwendung eines Vortex-Mischers, gefolgt von der Zugabe von 500 µl der erhaltenen Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifugieren für 5 Minuten, gewaschen. Der Überstand wurde durch Absaugen entfernt, und das erhaltene Pellet wurde in 25 µl destilliertem Wasser resuspendiert.
Die Amplifikation eines Segments des Salmonellen-Genoms wurde zum Nachweis von Salmonellen, die in Rohmilchproben vorhanden waren, herangezogen. Als A86 (eine DNA mit 28 Basen) und B83 (ebenfalls eine DNA mit 28 Basen) bezeichnete Oligonudeotide wurden als Primer verwendet. Die Primer wurden gemischt, so daß jeder Primer bei einer Konzentration von 50 µM in sterilem destilliertem Wasser vorlag.
Ein PCR-Reagenzgemisch wurde durch Mischen von 180 µl 10X Taq-DNA- Polymerase-Puffer (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH-Wert: 8,8 bei 25ºC), 15 mM MgCl&sub2;, 1% Triton X-100) (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA), 10,8 µl (45 Einheiten) Taq-DNA-Polymerase (Promega Corp.), 180 µl dNTP- Lösung (2 mM jeweils an dATP, dGTP, dCTP und dTTP), so daß eine Anfangskonzentration von 200 µM jedes der dNTPS in der PCR-Reaktion bereitgestellt wurde, plus destilliertem Wasser auf ein Endvolumen von 1,8 ml hergestellt. In ein neues Mikrozentrifugenröhrchen wurden 93 µl des PCR- Reagenzgemisches und 2 µl des Primergemisches (100 pMol der einzelnen Primer) gegeben. Sodann wurden 5 µl der einzelnen Bakteriensuspensionen in das Röhrchen gegeben, und die Flüssigkeit wurde mit 2 Tropfen Mineralöl überschichtet. Die Röhrchen wurden in ein Gerät Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Connecticut, USA) gegeben. Es wurden keine Schritte unternommen, um die Bakterien zu lysieren oder die DNA zu extrahieren. Dies erfolgte während der PCR-Reaktionen. Die Bedingungen des Thermal Cycler wurden auf 1 min bei 94ºC, anschließend 1 min bei 65ºC und schließlich 2,5 min bei 72ºC mit Sekunden "autoextend" eingestellt. Es wurden insgesamt 35 Zyklen der PCR durchgeführt.
Die PCR-Produkte wurden durch Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Ein 1,5%iges Agarosegel in TAE-Puffer wurde mit 5 µl der einzelnen PCR- Reaktionsprodukte beladen. Das Gel wurde einer Elektrophorese für 1,5 h bei 70 V unterzogen. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid angefärbt. Die Spur aus der Milchprobe mit 250 Zellen/ml Rohmilch zeigte eine sichtbare Bande mit der erwarteten Fragmentlänge. Verdünnungen mit weniger Zellen und das PBS-Kontrollröhrchen (PBS ohne Zellen, zugegeben zu Milch) zeigten keine Banden auf dem Gel.
Das Gel wurde in 0,5 M NaOH für 30 min bei Raumtemperatur denaturiert. Anschließend wurde es 2 mal in 1 M Tris-HCl für 15 Minuten bei jedem Waschvorgang gewaschen. Das Gel wurde dann durch Überschichten des Gels mit einer Nylonmembran, gefolgt von 0,5 Zoll Whatman 3MM-Papier und Saran-Einwickelmaterial, beschwert mit zwei großen Büchern, übertragen. Nach 2 Stunden wurde das Nylon für 10 min in 2 X SSC gewaschen und in einem Gerät UV-Stratalinker 1800 (Stratagene, La Jolla, Kalifornien, USA) in der automatischen Betriebsart UV-vernetzt. Das Gel wurde mit einer ³²P-Kinase-markierten DNA von 24 Basen, die als P47 bezeichnet wurde und die die Sequenz eines Segments aus dem Salmonellengenom zwischen den beiden Primern hatte, über Nacht bei 62ºC in 2 x SSC, 20 mM Natriumphosphat, 0,1% SDS, 10X Denhardt-Lösung, 10% Dextransulfat und 0,1 mg/ml Heringsperma-DNA hybridisiert. Das Nylon wurde 2 mal für 15 min jeweils bei 62ºC in 2 X SSC mit 0,1% SDS gewaschen. Das Nylon wurde einem Kodak XAR- Film bei 70ºC für 5,5 Stunden exponiert. Alle Verdünnungen von Bakterien in Rohmilch ergaben eine PCR-Produktbande, die mit PM407 hybridisierte, während dies bei der PBS-Kontrolle nicht der Fall war. Die höchste Verdünnung wies ungefähr 2,5 lebensfähige Zellen, zugegeben zu 1 ml Rohmilch, auf. Nur 1/10 dieses Materials wurde zu der PCR-Reaktion gegeben, was zeigt, daß die für die PCR-Reaktion entnommene Probe zufällig eine Zelle enthielt oder daß in der Kultur einige nicht lebensfähige Zellen vorhanden waren. In jedem Fall ist klar, daß das Verfahren zum Nachweis von Salmonellen in Rohmilch hochgradig empfindlich ist.

Beispiel 4

Es wurde ein Versuch durchgeführt, um Salmonella typhimurium in Beefsteak nachzuweisen. 5 Proben (25 g) von Beefsteak wurden jeweils zu 225 ml Tetrathionatbrühe gegeben und in einem Stomacher Lab-Blender 400 (Tekmar Co., Cincinnati, Ohio, USA) mit 0; 0,02; 2; 200 und 20 000 Salmonellen/ml gemäß Bestimmung durch eine Anfangs-Standardplattenzählung (SPC) des Inokulums, die auf Bismutsulfit-Agarplatten erfolgte, behandelt. Die Proben wurden bei 37ºC unter Schütteln (150 U/min) inkubiert. Nach 0, 3 und 24 Stunden wurden eine Plattenzählung und ein "Klärwasch- PCR-Assay" (ein Assay ähnlich dem, der in Beispiel 3 beschrieben wurde, beginnend mit dem Klärwaschverfahren, um das anfängliche Zellpellet zu erhalten) für jede der 5 Brühen durchgeführt. Die Plattenzählungen wurden auch auf Bismutsulfit-Agar (selektiv und anzeigend für das Wachstum der Salmonellen) durchgeführt, da angenommen wurde, daß das Fleisch mit einer bakteriellen Flora vorkontaminiert war. Tabelle 2 gibt Ergebnisse der Zählungen auf Bismutsulfit-Agar wieder. Tabelle 2 Bismutsulfit-Plattenzahlen in Zellen/ml Anzahl der pro ml zugegebenen Salmonellen
Die Klärlösung entsprach der in Beispiel 3 (0,25 M EDTA, pH-Wert: 8,0/0,5% Triton x-100/0,01% Träger). Die Pellets wurden in 100 µl PBS resuspendiert und dann rasch bei -70ºC eingefroren. Nachdem alle Proben genommen und vorbereitet worden waren, wurden sie aufgetaut und einer Vortex-Behandlung unterzogen. 5 µl wurden jeweils entnommen und zu 95 µl PCR-Reaktionsgemisch (vgl. Beispiel 7) gegeben. Die PCR-Amplifikation wurde unter Verwendung eines Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler mit Oligonudeotiden, die als C84 (eine DNA mit 27 Basen) und A86 bezeichnet wurden, als Primern durchgeführt. Die Primer umklammern ein genomisches Segment aus Salmonellen, das ein Subsegment mit der Sequenz der DNA P47 (24 Basen) umfaßt. Der PCR-Zyklus bestand aus 1 min bei 95ºC, 1 min bei 65ºC und 2 min 30 sec bei 72ºC mit einem "autoextend" von 5 sec. Ein 1,5%iges Agarosegel wurde für die PCR-Produkte eingesetzt. Das Gel wurde dann mit NaOH behandelt, neutralisiert und unter Drücken auf eine Nylonmembran übertragen. Die Membran wurde gespült und UV-vernetzt, bevor sie mit ³²P-Kinase-markiertem P47 als Sonde untersucht wurde. Eine anschließende Autoradiographie bestätigte, daß die Produkte amplifizierte genomische DNA-Segmente aus Salmonellen waren, die ein Subfragment mit der Sequenz von P47 umfaßten. Es wurde ein positives Signal für die Proben mit 20 000 Zellen pro ml nach 0 und 3 Stunden Inkubation und bei allen Animpfkonzentrationen nach 24 Stunden Inkubationszeit festgestellt. Das Klärwaschverfahren zur Konzentrierung von Zellen, gefolgt von einer über Nacht durchgeführten Kultur aus Fleischproben ist ein zufriedenstellendes Verfahren der Probenvorbereitung für die PCR-Analyse von Mikroorganismuskontaminationen.

Claims

1. Verfahren zur Abtrennung und Konzentrierung von Zellen aus einem Anteil einer Kultur oder eines Extrakts eines Materials mit biologischem Ursprung, das folgende Stufen umfaßt:

(a) Kombination des Anteils mit einer wäßrigen Suspension eines mikroteilchenartigen Trägers unter Bildung einer Klärlösung; und

(b) Abtrennung der Zellen aus der Klärlösung.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem mikroteilchenartigen Träger um Polystyrolkügelchen mit einem Durchmesser von 0,5 bis 1,5 µm handelt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Trennstufe das Zentrifugieren der Probe unter Bildung eines Zellpellets umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, das die zusätzliche Stufe der Entfernung des Überstands von dem Zelipellet, z. B. durch Absaugen der Flüssigkeit über dem Pellet, umfaßt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, das die zusätzlichen Stufen der Zugabe eines lysierenden Mittels zu dem Zellpellet, um die Zellen zu lysieren; und des Tests der lysierten Probe zur Bestimmung der relativen Menge an ATP, die in der Probe vorhanden ist, z. B. durch Zugabe eines Luciferase-Luciferin-Reagenzes und Messung der emittierten relativen Lichtabgabe, umfaßt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, das vor dem Zentrifugieren die zusätzliche Stufe des Mischens eines nicht-ionischen Detergens oder eines anderen Mittels, das somatische Zellen in der Probe, nicht jedoch mikrobielle Zellen lysiert, mit dem Anteil umfaßt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, das die zusätzliche Stufe der Resuspendierung des Pellets in einer Flüssigkeit und gegebenenfalls des Tests der Suspension zur Bestimmung der Konzentration an mikrobiellen Zellen darin umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, das die zusätzliche Stufe der Durchführung eines Breed-Ausstriches oder eines anderen Tests mit dem resuspendierten Pellet zur Bestimmung des Zelltiters umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Flüssigkeit eine Protease enthält.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei die Flüssigkeit ein Mittel enthält, das somatische Zellen, nicht jedoch mikrobielle Zellen lysiert.

11. Verfahren nach Anspruch 10, das die zusätzlichen Stufen der Zentrifugation der Suspension und der Abtrennung des erhaltenen zweiten Überstands von dem erhaltenen zweiten Pellet, das hauptsächlich mikrobielle Zellen enthält, umfaßt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, das die zusätzliche Stufe des Tests des zweiten Überstands auf die Konzentration an ATP, z. B. durch Zugabe eines Luciferase-Luciferin-Reagenzes und Messung des relativen emittierten Lichts, umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, das die zusätzlichen Stufen der Resuspendierung des zweiten Pellets in einer Flüssigkeit, wobei man eine zweite Suspension erhält und wobei die Flüssigkeit ein Mittel enthält, das mikrobielle Zellen lysiert oder auf andere Weise ATP aus mikrobiellen Zellen extrahiert; und den quantitativen Test der zweiten Suspension auf ATP, z. B. durch Zugabe eines Luciferase-Luciferin-Reagenzes und Messung der relativen Menge an emittiertem Licht, umfaßt.

14. Verfahren nach Anspruch 11, das die zusätzlichen Stufen der Resuspendierung des zweiten Pellets in einer Flüssigkeit, wobei man eine zweite Suspension erhält und wobei die Flüssigkeit ein Mittel enthält, das somatische Zellen, nicht jedoch mikrobielle Zellen lysiert; der Zentrifugation der zweiten Suspension; der Entfernung des Überstands; und des Tests des erhaltenen dritten Pellets auf die relative Konzentration an mikrobiellen Zellen umfaßt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, das die zusätzliche Stufe der Resuspendierung des dritten Pellets in einer Lösung umfaßt, die die bakteriellen Zellen stabilisiert und einen Verlust an zellulären Metaboliten verhindert.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Stabilisierungslösung Magnesiumionen und/oder eine Protease enthält.

17. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Material um Milch handelt und die Kultur des Materials eine flüssige Milchprobe ist und das Verfahren in Stufe (a) ferner das Mischen eines chelatisierenden Mittels mit der Milchprobe umfaßt.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das chelatisierende Mittel unter Bis-(o-aminophenoxy)-ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäure, Ethylenglykol-bis-(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure, trans-1,2-Diaminocyclohexantetraessigsäure, Diethylentriaminpentaessigsäure, Citronensäure, Arginin, Hypoxanthin, 4,5-Dihydroxybenzol-1,3-disulfonsäure, Natriumphosphatglas, Verbindungen vom Kronenethertyp sowie Derivaten und Vorstufen davon und insbesondere unter Ethylendiamintetraessigsäure oder Nitrilotriessigsäure ausgewählt ist.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei die Trennstufe das Filtrieren der Klärlösung mit einem Filter, der Zellen zurückhält und andere Muchkomponenten, die von dem chelatisierenden Mittel gebunden sind, durchläßt, umfaßt.

20. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von Zellen mit Nucleinsäure, die ein ausgewähltes Zielsegment umfaßt, in einer Kultur oder einem Extrakt eines Materials mit biologischem Ursprung, wobei das Verfahren es umfaßt, ein Pellet von Zellen aus der Kultur oder dem Extrakt unter Anwendung des Verfahrens von Anspruch 1 und unter Anwendung einer Zentrifugation bei diesem Verfahren zu erhalten, mit der Maßgabe, daß, wenn die Kultur eines Materials mit biologischem Ursprung eine flüssige Milchprobe ist, die Klärlösung ferner ein chelatisierendes Mittel, z. B. gemäß der Definition in Anspruch 18, enthält; die Zellen aus dem auf diese Weise erhaltenen Pellet in einer ersten Lösung zu suspendieren und die erste Lösung zur Bereitstellung einer zweiten Lösung von Nucleinsäure aus den Zellen im wesentlichen ohne Isolierung der Nucleinsäuren der Zellen von anderen Bestandteilen der Zellen zu behandeln; die Nucleinsäure der zweiten Lösung einem Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren zur Bereitstellung eines festgelegten amplifizierten Nucleinsäuresegments, nur wenn das ausgewählte Zielsegment in den Zellen, die aus dem Pellet suspendiert wurden, enthalten ist, zu unterwerfen; und Nucleinsäure nach dem Amplifikationsverfahren auf das Vorhandensein des festgelegten amplifizierten Segments zu untersuchen.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Amplifikationsverfahren ein PCR-Verfahren ist, z. B. unter Verwendung einer Taq-DNA-Polymerase als Katalysator.

22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, wobei es sich bei den nachzuweisenden Zellen um Salmonella spp. handelt.

23. Verfahren nach Anspruch nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei es sich bei dem Material um Milch handelt und die Kultur des Materials eine flüssige Milchprobe ist.

24. Verfahren nach Anspruch nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Material um ein Lebensmittelmaterial, das von Milch verschieden ist, z. B. Fleisch, handelt.

25. Klärlösung, die einen Anteil einer Kultur oder eines Extrakts eines Materials mit biologischem Ursprung, z.B. gemäß der Definition in Anspruch 23 oder 24, und in Suspension einen mikroteilchenartigen Träger, z. B. gemäß der Definition in Anspruch 2, enthält.

26. Lösung nach Anspruch 25, die ferner ein chelatisierendes Mittel, z. B. gemäß der Definition in Anspruch 17, und ein Somazellen-Lysemittel enthält.

27. Lösung nach Anspruch 26, wobei es sich bei dem Somazellen-Lysemittel um ein nicht-ionisches Detergens handelt.

28. Mikrobielle Testpackung für die Verwendung beim Testen von Milchproben, enthaltend:

(i) die Klärlösung nach Anspruch 26 oder 27;

(ii) eine Lösung, die ein ATP-Extraktionsmittel enthält, das mikrobielles Zell-ATP freisetzt, z. B. ein Mittel, das mikrobielle Zellen lysiert; und

(iii) ein ATP-Nachweisreagenz, z. B. Luciferin-Luciferase.

29. Testpackung nach Anspruch 28, wobei es sich bei dem ATP-Extraktionsmittel um eine Trichloressigsäurelösung, die wahlweise auch Ethylendiamintetraessigsäure und Xylenolblau enthält, handelt.

30. Mikrobielle Testpackung zum Testen von Milchproben im Zusammenhang mit einem Zellzähltest, wie dem Breed-Ausstrich, umfassend:

(i) die Klärlösung nach Anspruch 26 oder 27; und

(ii) eine Lösung zum Anfärben von Zellen.

31. Testpackung nach einem der Ansprüche 28 bis 30, die zusätzlich eine Lösung zum Waschen eines Zellpellets, das bei der Zentrifugation erhalten wird, und wahlweise eine Pufferlösung enthält.

32. Testpackung zur Verwendung beim Testen von Milchproben auf somatische Zellen, umfassend:

(i) eine Klärlösung, die ein chelatisierendes Mittel, z. B. gemäß der Definition in Anspruch 18, und in Suspension einen mikroteilchenartigen Träger, z. B. gemäß der Definition in Anspruch 2, enthält;

(ii) eine Lösung, die ein Mittel enthält, das somatische Zellen, nicht jedoch mikrobielle Zellen lysiert, z. B. gemäß der Definition in Anspruch 27; und

(iii) ein ATP-Nachweisreagenz, z. B. Luciferin-Luciferase.

33. Testpackung nach einem der Ansprüche 28 bis 32, die ferner einen Filter zum Abfiltrieren von Zellen von Milchbestandteilen umfaßt.

34. Testpackung zum Nachweis von Zellen, z. B. Salmonella spp., mit Nucleinsäure, die ein ausgewähltes Zielsegment umfaßt, wobei die Testpackung einen mikroteilchenartigen Träger, z. B. gemäß der Definition in Anspruch 2; Enzym, z. B. Taq-DNA-Polymerase, und Primer oder Sonden, die für ein Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren zur Bereitstellung eines festgelegten amplifizierten Nucleinsäuresegments, nur wenn das ausgewählte Zielsegment in den Zellen vorhanden ist; und Reagenzien, die für eine Untersuchung der amplifizierten Nucleinsäure erforderlich sind, um-

35. Testpackung nach Anspruch 34 zum Nachweis von Zellen in flüssigen Milchproben, die zusätzlich ein chelatisierendes Mittel, z. B. gemäß der Definition in Anspruch 18, umfaßt.