DE3889104T2

DE3889104T2 - Zellenzuchtvorrichtung.

Info

Publication number: DE3889104T2
Application number: DE3889104T
Authority: DE
Inventors: Akira Nishimura; Yutaka Shibata; Fumihiko Yonemori
Original assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Current assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Priority date: 1987-10-01
Filing date: 1988-09-30
Publication date: 1994-09-08
Anticipated expiration: 2008-10-01
Also published as: WO1989002913A1; EP0336974A4; DE3889104D1; EP0336974B1; JPH0191771A; EP0336974A1

Description

BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zellproliferationsvorrichtung, die eine oder mehr Gruppen von zu erfassenden lebenden Zellen trennt, und die die Zellgruppe vermehrt, um so eine spezielle Funktion der besagten Zellen zu verstärken und zu aktivieren, gemäß dem Oberbegriff von Patentanspruch 1. Eine ähnliche Vorrichtung ist aus der DE 2 633 095 bekannt.
Eine Kultivierung tierischer Zellen in vitro wird nicht nur verwendet, um bioaktive Substanzen, wie beispielsweise monoklonale Antikörper, Lymphokin und Hormon zu erhalten, welche die tierischen Zellen erzeugen, sondern wird auch zu Untersuchungszwecken zur Aufklärung des Mechanismus der Krebsentstehung und zur Untersuchung einer DNA-Klonierung, Aktivierung und Differentiation der Zellen verwendet. Auch wird die Technik der Zellkultivierung derart verwendet, daß durch Kultivieren in Gegenwart von Lymphokin oder in Gegenwart eines Stücks Tumorgewebe vermehrte und aktivierte Lymphzellen, d. h. Lymphokin-aktivierte Killerzellen (nachfolgend als LAK bezeichnet) bzw. cytotoxische T-Lymphocyten (nachfolgend als CTL bezeichnet) infundiert werden, so daß die Tumorzellen abgetötet werden können (vgl. "The New England Journal Vol. 313, Nr. 23, Seiten 1485 bis 1492).
Wie oben beschrieben, deckt die Kultivierung von tierischen Zellen in vitro einen breiten Bereich von Anwendungsgebieten ab.
Im Stand der Technik gibt es als Kultivierung von tierischen Zellen z. B. eine Kultivierung von LAK-Zellen (Gruppe) wie sie unten beschrieben werden soll.
Entnommenes peripheres Blut wird unter Verwendung von Unterschieden im spezifischen Gewicht mit Hilfe eines Agens, wie beispielsweise Ficoll-Paque in zwei Gruppen, eine Lymphocyten-Fraktion und andere Fraktionen getrennt (Dichtegradienten-Zentrifugierung).
Die Lymphocyten-Fraktion wird von einer Pipette aufgenommen, auf einer Pufferlösung, beispielsweise HANK'S BBS noch einmal resuspendiert, und die Lymphocyten werden durch zweimalige Wiederholung eine Trennung durch Zentrifugieren, einer teilweisen Aufnahme und Resuspension (Zellwasch-Schritt) gereinigt. Anschließend werden die gereinigten Lymphocyten auf einem Lymphokin, beispielsweise Interleukin 2 enthaltenden Kulturmedium, wie beispielsweise RPMI-1640 (Serum enthaltend) resuspendiert.
Das Kulturmedium, auf welchem die oben erwähnten Lymphocyten suspendiert sind, wird in eine zu verschließende Rotationsflasche geschüttet, und es wird eine rotierende Kultivierung, eine stationäre Kultivierung in der Kulturflasche oder eine Kultivierung in einem hohle Fasern verwendenden Kulturreaktor durchgeführt.
Das Kulturmedium wird in geeigneter Weise gegen neues Kulturmedium ausgetauscht. Auch wird die Temperatur des Kulturgefäßes bei 37ºC gehalten und der pH-Wert des Kulturmediums wird konstant gehalten, indem in geeigneter Weise mit CO&sub2; belüftet wird.
Durch den oben erwähnten Vorgang wird die Anzahl der Lymphocyten erhöht, und daneben wird die Form der Lymphocyten undeutlich, so daß Zellen mit Killer-Aktivität erscheinen.
In dem Fall, wo die oben genannten aktivierten Zellen zur Therapie verwendet werden, wird das Medium mit den suspendierten Zellen aus dem Kulturgefäß aufgenommen, und es werden die Vorgänge einer Zentrifugierung, Aufnahme der Zellfraktion und Resuspendierung auf der Pufferlösung ausgeführt, und dieselben Vorgänge, wie oben erwähnt, werden zweimal wiederholt, so daß die aktivierten Zellen gereinigt werden. Nach einmaligem weiteren Zentrifugieren werden die aufgenommenen Zellfraktionen auf physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert. Außerdem wird in vielen Fällen nach einer Beprobung die Anzahl der Zellen, ihr äußeres Erscheinungsbild und die Killer-Aktivität der Zellen gemessen.
Für den Fall, daß die wie oben beschrieben erhaltenen aktivierten Lymphocyten zur Therapie verwendet werden, werden die Lymphocyten dem Patienten infundiert.
Im Stand der Technik, wie oben beschrieben, sind die Blutentnahme, die Zellkultur und die Rückgewinnung der aktivierten Lymphocyten, einschließlich einer Aktivierung und Proliferation von Lymphocyten manuell durchgeführt worden. Die Anzahl der für eine Therapie benötigten aktivierten Lymphocyten muß größer als die Anzahl der Tumorzellen sein, und man sagt, daß eine Menge von mehr als 1011 aktivierten Lymphocyten erforderlich ist, damit Tumorzellen von ungefähr 1 um Durchmesser abgetötet werden.
Jedoch liegt die Anzahl der Lymphocyten, die einem Patienten bei einer einmaligen Entnahme abgenommen werden können, bei einer Menge von 10&sup8;, und je nach manueller Kultivierung, wie beispielsweise einer Kultivierung in einer Rotationsflasche, wird die Zahl der erhältlichen Lymphocyten nur ungefähr doppelt so groß wie 10&sup8;.
Um eine ausreichende Anzahl aktivierter Lymphocyten für eine Therapie zu erhalten, müssen die Blutentnahmen und Kultivierungsvorgänge monatelang viele Male wiederholt werden, weshalb der Arbeitsanfall enorm groß wird.
Obwohl die Kultivierung extern durchgeführt wird, bestehen viele Risiken einer Kontaminierung mit verschiedenen Bakterien, da es viele manuelle Tätigkeiten gibt; der manuelle Kulturvorgang leidet daher unter einem Sicherheitsmangel, und die oben erwähnten Vorgänge werden in vielen Fällen von einem Arzt durchgeführt. Deswegen ist die Zahl der Patienten, die ein Arzt betreuen kann, nur eins oder wenige, so daß von einem Arzt nicht viele Patienten behandelt werden können.
Da der Kulturvorgang manuell durchgeführt wird, ist überdies die Möglichkeit einer Kontamination der Zellen beim Kulturvorgang durch verschiedene Bakterien groß, und da sich ein Arzt mit Patientenblut befaßt, bestand die Befürchtung, daß der Arzt selbst mit pathogenen Bakterien infiziert wird. Außerdem unterscheiden sich die Lymphocyten-Kulturbedingungen je nach Patienten, und je nach Ärzten gibt es Arbeitsunterschiede, und die Eigenschaften der kultivierten Zellen sind jedesmal verschieden, weshalb man die Lymphocyt- Zellen nicht gleichbleibend erhalten kann.
Für den Fall, daß kultivierte Zellen zur Untersuchung verwendet werden, ist in ähnlicher Weise der Arbeitsanfall groß, und die Vorgänge sind gefährlich, und man kann keine stabile Zellmenge erhalten, worin ein Grund dafür liegt, warum der Fortschritt der Untersuchung behindert wird. Auch können bei der manuellen Proliferation der Zustand der Proliferation und der Zustand der Aktivierung nicht zum richtigen Zeitpunkt gemessen werden. Der optimale Zustand der Kultur kann daher nicht entdeckt werden, so daß man die Zellen mit hoher Aktivierung nicht ohne weiteres erhalten kann.
Die Schriften DE 2 813 389 und JP 61-88872 aus dem Stand der Technik offenbaren das Prinzip eines Kombinierens der Funktionen einer Trennung, einer Kultur, eines Transfers und einer Überwachung in einem automatisch gesteuerten System.
Die Schriften JP 61-152273, DE 3 139 310, EP 0 195 088 und JP 61-202684 lehren die Kombination einer Überwachung von Wachstum oder einer Wachstumskennlinie mit einer Steuerung der Kultur.
Schließlich zeigt die US 4 440 638 die Verwendung von elektrischer Ladung, um Zellen in einer Zellkultur zu trennen.
Es ist eine der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe, eine Zellproliferationsvorrichtung gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 bereitzustellen, die imstande ist, automatisch Zellen zu vermehren und zu aktivieren.
Die Lösung dieser Aufgabe wird durch eine Zellproliferationsvorrichtung erreicht, umfassend:
eine Trenneinrichtung zum Trennen von Zellen;
eine Kultureinrichtung mit einem Kulturtank zum
Kultivieren der Zellen, eine Transfereinrichtung zum Überführen der Zellen zwischen der besagten Trenneinrichtung und der besagten Kultureinrichtung; und
eine Steuereinrichtung zum Steuern des Betriebs der Trenneinrichtung und der Transfereinrichtung, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte Trenneinrichtung eine zum Zentrifugieren einer Lösung geeignete Zentrifugeneinrichtung, eine zum Aufnehmen und Abgeben der Lösung geeignete Pipettiereinrichtung, einen Manipulator zum Manipulieren der besagten Pipettiereinrichtung, und einen Sensor zum Abtasten der Position jeder der Zelldifferentiationen nach einem Zentrifugieren umfaßt, so daß der Pipettiervorgang auf der Grundlage des Abtastergebnisses von jeder der Differentiationspositionen gesteuert wird,
daß eine Kulturüberwachungseinrichtung vorgesehen ist, um die Eigenschaften der in der besagten Kultureinrichtung gelagerten Zellen zu messen, und
daß die besagte Steuereinrichtung die mittels der besagten Kulturüberwachungseinrichtung erhaltenen Eigenschaften der Zelle berechnet, sowie zum Steuern der Kulturbedingung des Kulturtanks und zum Steuern des Betriebs der besagten Trenneinrichtung, der besagten Transfereinrichtung und der besagten Kulturüberwachungseinrichtung.
Das Zentrifugieren in der Trenneinrichtung kann ein kontinuierliches Zentrifugieren sein.
Die Trennung der Zellen kann unter Verwendung eines Dichtegradienten-Zentrifugierens erfolgen.
Die Trenneinrichtung kann aus einer Membran zum Trennen der Zellen, einem Gerät zum Halten der besagten Membran und einem Lösungspfad bestehen, in welchen die Zellen durch Filtration getrennt werden.
Die oben erwähnte Membran, das Gerät zum Halten der Membran und der Lösungspfad können für ein Gegenstromwaschen geeignet ausgeführt sein.
Die Trenneinrichtung kann eine Trenneinrichtung sein, welche die Zellen unter Ausnutzung eines Unterschieds an elektrischer Ladung auf den Zellen trennt.
Die Trenneinrichtung kann aus einer Kammer mit Elektroden zum Anlegen einer Spannung an die Lösung und aus einem Lösungspfad bestehen.
Die Kultureinheit kann eine solche Zusammensetzung besitzen, daß das Kulturmedium in den Kulturtank geschüttet und aus dem Tank abgegeben werden kann.
Der Kulturtank kann abnehmbar an der Kultureinheit vorgesehen sein, und die Transfereinrichtung kann so ausgebildet sein, daß sie den Kulturtank zwischen der Kultureinheit und der Trenneinrichtung umsetzt.
Jeder Betrieb, d. h. derjenige der Trenneinrichtung, der Kultureinheit und der Transfereinrichtung kann kontaminationsfrei durchgeführt werden.
Die Zellproliferationsvorrichtung ermöglicht es, daß eine Gruppe benötigter Zellen aus einer Gruppe von in die Trenneinheit eingegebenen Zellen getrennt und unter Überwachung des Zustands der Zellen in der Kultur mittels der Kulturüberwachungseinheit in der Kultureinheit kultiviert wird, und daß die Veränderung des Zustands der Kultur und der Zeitpunkt einer Rückgewinnung der Zellen von der Steuerung auf der Grundlage des Überwachungsergebnisses des Zustands der Zellkultur beurteilt werden, und daß die Verabreichung der bioaktiven Substanz in der Kultureinheit auf ein von der Steuerung übermitteltes Signal hin gesteuert wird, und die Rückgewinnung der Zellen in der Trenneinheit auf ein von der Steuerung übermitteltes Signal hin durchgeführt wird.
Außerdem kann im Betrieb der Trenneinrichtung eine Dichtegradienten-Zentrifugierung verwendet werden. Zusätzlich kann in der Trenneinrichtung ein Trennverfahren mit einer Membran verwendet werden. Zusätzlich kann in der Trenneinrichtung eine Elektrophorese verwendet werden. Überdies kann in der Kultureinheit ein kontinuierliches Kulturverfahren verwendet werden. Außerdem können in der Kulturüberwachungseinheit cytotoxische Analysen zur Überwachung der Aktivität der Zellen in der Kultur benutzt werden. Zusätzlich kann in der Kulturüberwachungseinheit ein Monitor zum Überwachen der Aktivität der Zellen in der Kultur oder ein Bildverarbeitungsverfahren zum Unterscheiden von Zellen in einer speziellen Untergruppe verwendet werden.
Weiter können Einrichtungen zum Beproben der Zellsuspension im Kulturtank vorgesehen sein.
Die Kulturüberwachungseinheit kann eine Einrichtung zum Färben der Zellen oder eine Einrichtung zum Markieren der Zellen umfassen.
Die Kulturüberwachungseinheit kann eine Meßeinrichtung umfassen, um die Eigenschaften der Zellen zu messen.
Die Meßeinrichtung kann eine Einrichtung sein, um die durch ein Mikroskop erzeugten Bilder der Zellen zu verarbeiten.
Die Meßeinrichtung kann eine Lichtmeßvorrichtung umfassen.
Die Meßeinrichtung kann eine Einrichtung zum Messen der Radioisotopmenge sein.
Die Steuerung der Kulturbedingungen kann durchgeführt werden, indem die Menge der Verabreichung der bioaktiven Substanz unter Verwendung des Meßergebnisses der Eigenschaften der Zellen gesteuert wird.
Die Steuerung der Kulturbedingungen kann durchgeführt werden, indem der Austausch des Kulturmediums unter Verwendung des Meßergebnisses der Eigenschaften der Zellen gesteuert wird.
Der Zeitpunkt der Rückgewinnung der Zellen kann unter Verwendung des Meßergebnisses der Eigenschaften der Zellen gesteuert werden.
Die zu messenden Eigenschaften der Zelle können die Anzahl der Zellen oder die Zelldichte sein.
Die zu messende Eigenschaft der Zellen kann die Cytotoxizität sein.
Die zu messenden Eigenschaften der Zellen können die Art der Zellen oder das äußere Erscheinungsbild der Zellen sein.
Die zu messenden Eigenschaften der Zellen können die Form der Zellen, die Größe der Zellen oder der Grad der Deformation der Zellen sein.
Von pH-Wert, Temperatur, Feuchtigkeit und CO&sub2;-Dichte des Mediums kann mindestens ein Wert gemessen werden, so daß der gemessene Wert in einer Art Rückkopplung geregelt werden kann.
Fig. 1 ist eine schematische perspektivische Ansicht, die eine Ausführungsform einer Kultureinrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, Fig. 2 ist ein Blockdiagramm, das die Kultureinrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, die Fig. 3a bis 3e sind schematische Schaubilder, welche die wesentlichen Teile des Betriebsablaufs der Zentrifugeneinheit zeigen, Fig. 4 ist eine perspektivische Ansicht, die eine andere Ausführungsform der Trenneinheit zeigt, die Fig. 5 und 6 sind perspektivische Ansichten, die weitere Ausführungsformen der Trenneinheit zeigen, Fig. 7 ist eine schematische Ansicht, die eine andere Ausführungsform der Kultureinheit zeigt, Fig. 8 ist eine schematische Ansicht, die eine andere Ausführungsform der Überwachungseinheit zeigt, und Fig. 9 ist ein Fließbild, das einen wesentlichen Teil des Betriebsablaufs zeigt.
Wie in den Fig. 1 und 2 dargestellt, umfaßt die Einrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung eine Kultureinheit 10, eine Trenneinheit 20, eine Überwachungseinheit 30 und eine aus einem Mikrocomputer bestehende Steuereinheit 50, z. B. zur Steuerung jeder der Einheiten. In der Kultureinheit 10 wird ein in einer Kulturmediumflasche 11 gelagertes vorbestimmtes Kulturmedium durch ein Rohr 11a abgezogen und wird in einer Mischeinheit 11b mit einer Additivflüssigkeit vermischt, die aus einer Additivflüssigkeitsflasche 12 abgezogen wird, und die gemischte Lösung wird von einer Pumpe 13 in einen Kulturtank 14 überführt. Überschüssige Lösung wird über eine Pumpe 15 an einen Abfalltank 16 abgegeben.
In der Trenneinheit 20 sind eine Vielzahl von Behältern 21 vorgesehen, in welchen verschiedene Arten von Kulturmedium gelagert sind, wobei jeder der Behälter 21 an einer Zentrifugeneinrichtung 22 angebracht ist. Eine Pipette 24 ist auf einem Manipulator 23 angebracht, so daß sie auf und ab bewegt werden kann, wodurch die Pipette 24 aus den Behältern 21 herausgezogen oder in diese eingeführt werden kann, so daß das gewünschte Kulturmedium von einer Pumpe 29 abgezogen und in ein im Kulturtank 14 vorgesehenes Kulturrohr 17 überführt wird.
Um den Inhalt eines an einem der Rotationsarme 22a der Zentrifugeneinrichtung 22 hängenden Behälters 21X zu überwachen, ist eine Fernsehkamera zur Überwachung oder eine positionsempfindliche Diode (PSD) 25 vorgesehen, und ein durch die Fernsehkamera oder die positionsempfindliche Diode (PSD) 25 erhaltenes Bildsignal wird zu einem Überwachungsbildschirm 51 der Steuerung 50 geschickt, so daß der Inhalt des Behälters 21X auf dem Überwachungsbildschirm 51 überwacht werden kann.
In der Überwachungseinheit 30 wird das Kulturmedium, das im Kulturrohr 17 kultivierte Zellen enthält, von einer Pumpe 31 abgezogen, und das Kulturmedium wird von einem Manipulator 32 in jeweils vorbestimmten Mengen in einen Lagerbehälter 34 überführt, der auf einem X-Y-Tisch 33 angeordnet ist, welcher in X- und Y-Richtung beweglich ist.
Der Lagerbehälter 34 wird durch Bewegen des X-Y-Tischs 33 nach rechts in Fig. 1 transportiert, und wird in einen Vorratsraum 35 eingelagert oder diesem dann wieder entnommen.
Oberhalb des Transferpfads des X-Y-Tischs 33 ist ein Manipulator 36 zum Infundieren von Färbe-Flüssigkeit vorgesehen, mit dem die Färbe-Flüssigkeit durch Verwendung einer Pumpe 37 in das Kulturmedium infundiert werden kann, das wie oben erwähnt im Lagerbehälter 34 gelagert wird.
An einer in Y-Richtung aus dem Transferpfad 33a des X-Y- Tisches 33 heraus verschobenen Position ist ein Mikroskop 38 vorgesehen, so daß ein Bild des Kulturmediums im Lagerbehälter 34 durch Überführen des Lagerbehälters 34 auf einen Mikroskoptisch 39 unter Vergrößerung betrachtet werden kann. Das vom Mikroskop 38 vergrößerte Bild wird von der Fernsehkamera 40 aufgenommen, und deren Bildsignal wird zu einer Bildverarbeitungseinrichtung 41 übertragen, und das mittels der Bildverarbeitungseinrichtung 41 erhaltene Bildsignal wird zum Überwachungsbildschirm 51 der Steuerung 50 übertragen, so daß es dargestellt werden kann.
Wie in Fig. 1 dargestellt, wird nachfolgend der Trennvorgang des Kulturmediums für den Fall beschrieben, daß als Trenneinheit 20 die Zentrifugeneinrichtung 22 verwendet wird.

[ZENTRIFUGIEREN]

Das zu trennende Kulturmedium wird in jeden der Behälter 21 infundiert, und anschließend wird die Zentrifugeneinheit 22 auf das Befehlssignal von der Steuerung 50 hin angetrieben, so daß die Arme 22a gedreht und die Behälter 21 infolge der Zentrifugalkraft durch das Drehen in horizontaler Richtung ausgerichtet werden (in Fig. 3a dargestellt), wodurch die Zellen getrennt werden. Dann wird die Position abgetastet, in der benötigte Zellen getrennt vorliegen. Ein Abtastsignal und ein Signal, das die Differentiationsposition wiedergibt, werden über die Fernsehkamera oder die positionsempfindliche Diode (PSD) 25 erhalten, indem man den Unterschied der Klarheit jedes der getrennten Teilbereiche, den Unterschied der Absorption oder den Unterschied des Reflexionsgrades (in Fig. 3b dargestellt) ausnutzt. Die Steuerung 50 steuert den Manipulator 23 auf der Grundlage der abgetasteten Positionsinformation und bewegt das Spitzenendteil der Pipette 24 in die getrennte Position mit den benötigten Zellen. Anschließend werden die Zellen mittels der Pumpe 29 aufgesaugt. Als nächstes wird die Spitze der Pipette 24 zu einer anderen Zentrifugenbehälterposition bewegt. Die angesaugten Zellen werden mittels einer Pumpe abgegeben.
Außerdem wird eine bilanzierte Salzlösung aus einem Tank mit bilanzierter Salzlösung abgesaugt.
Als nächstes wird die bilanzierte Salzlösung zum Umrühren und Zentrifugieren in einen Zentrifugenbehälter B abgegeben, so daß eine getrennte Position der Zellen in einer dem oben erwähnten Abtastvorgang ähnlichen Weise abgetastet wird.
Zusätzlich wird die überstehende Flüssigkeit angesaugt und abgeführt. Das Kulturmedium im Kulturmediumtank wird angesaugt und in den Zentrifugenbehälter B abgegeben. Zusätzlich wird das Kulturmedium umgerührt, und die Pipette wird zum Bodenteil des Behälters bewegt, so daß das die Zellen enthaltende Kulturmedium angesaugt wird (vgl. Fig. 3c, d und e).

[RÜCKGEWINNUNGSVORGANG]

Ein Magnetventil 26 wird geöffnet, so daß die Zellsuspension im Kulturrohr 17 zur Pipette 24 überführt wird.
Anschließend werden das Zentrifugier- und Differentiationsverfahren und das Reinigungsverfahren ähnlich wie diejenige beim oben genannten Trennverfahren durchgeführt.
Als nächstes wird der Fall einer Verwendung einer in Fig. 4 dargestellten kontinuierlichen Zentrifugeneinrichtung als Trenneinrichtungsteil erläutert.
(A) VORBEREITUNG FÜR EINEN ZENTRIFUGIERVORGANG: Eine Dichtegradienten-Zentrifugiersubstanz, wie beispielsweise Ficoll-Paque wird über eine Pumpe 206 aus einer Flüssigkeitsflasche 200 in eine in einem Rotor 201 vorgesehene Kammer 202 infundiert. Die Zellsuspension im Kulturrohr 17 wird in einen Flüssigkeitstank 203 oder in die Kammer 202 infundiert.
(B) ZENTRIFUGIEREN: Ein kontinuierlicher Zentrifugenrotor 201 wird angetrieben.
(C) ABTASTBEGINN: Es wird mit dem Abtasten einer Gruppe benötigter Zellen mittels eines Sensors 204 begonnen.
(D) TRANSFER DER LÖSUNG: Die getrennte Lösung in der Kammer 202 wird von einer Pumpe 208 überführt.
(E) DIFFERENTIATION: Eine überschüssige getrennte Lösung wird durch Umschalten eines Ventils 207 in einen Flüssigkeitstank 205 überführt, und die gewünschte getrennte Lösung wird über die Pumpe 208 zum nächsten Verfahrensschritt überführt.
Als nächstes wird ein Betrieb einer in Fig. 5 dargestellten Membran-Trennvorrichtung als Trenneinrichtungsteil 20 erläutert.
(A) EINSTELLUNG EINES FLÜSSIGKEITSPFADES: Dreiwegeventile 608, 609 und 610 werden so geöffnet, daß die Flüssigkeit im Fall des Trennvorgangs von einer Flüssigkeitsflasche 605 über einen Filtertank 601 zu einer Abfallflasche 606 fließt, wobei auf ein von der Steuerung übermitteltes Signal hin ein Magnetventil 600 geöffnet und ein Magnetventil 603 geschlossen ist, und daß die Flüssigkeit im Fall des Rückgewinnungsvorgangs vom Kulturtank 14 über den Filtertank 601 zum Abfalltank 606 fließt. Jedes der Dreiwegeventile wird durch eine Magnetspule (nicht dargestellt) auf das von der Steuerung 50 übermittelte Steuersignal hin geschaltet.
(B) FILTRATION: Die Pumpe 629 und die Pumpe 604 werden auf ein Signal von der Steuerung 50 hin angetrieben, so daß die die Zellen enthaltende Zellsuspension von der Flüssigkeitsflasche 605 oder vom Kulturrohr 17 durch den Filter 602 fließt. Dann bleiben die Zellen im vorderen Abschnitt des Membranfilters 602 zurück. Die Maschenweite des Filters 602, durch welchen Körperchen hindurchtreten können, wird vorzugsweise so ausgewählt, daß er in Abhängigkeit vom Zelltyp bei jedem beliebigen Durchmesser zwischen 1 um bis zu mehreren 10 um liegen kann. Als Filtermaterial können zum Beispiel Stoffe der Cellulosegruppe, Polycarbonat und Stoffe der Fluorgruppe verwendet werden. Der Filter kann aus einem derartigen Material wie Nylonwolle hergestellt sein, so daß die Zellen in Abhängigkeit von der Beschaffenheit der Flüssigkeit absorbiert oder entfernt werden können.
(C) GEGENSTROMREINIGUNG: Die Richtung des Flüssigkeitsstroms wird mittels eines Signals von der Steuerung 50 geändert, so daß die Flüssigkeit von einer Pufferflüssigkeitsflasche 607 über einen Filter 602 zu einem Magnetventil 603 fließt. Das Magnetventil 600 ist geschlossen und das Ventil 603 ist geöffnet. Die Pumpen 604 und 613 werden auf das von der Steuerung 50 übermittelte Signal hin angetrieben, so daß die Zellen zum Kulturrohr 17 (im Fall der Trennung) oder zur Flüssigkeitsflasche 605 (im Fall der Rückgewinnung) überführt werden.
Fig. 6 zeigt den Fall einer Trennung unter Verwendung einer Elektrophorese-Vorrichtung.
Die über eine Pumpe 302 aus einer Flüssigkeitsflasche 301 abgezogene Zell-Lösung wird über eine Dreiwegeverbindung 304 in eine Elektrophoresekammer 305 überführt. Die Zellen werden zwischen Elektroden 306a und 306b abgegeben, die derart bereitgestellt sind, daß sie einander in der Elektrophoresekammer 305 gegenüberliegen. Zwischen den Elektroden 306a und 306b wird eine vorbestimmte Gleichspannung angelegt. Die Zellen werden gemäß dem Elektrophorese-Prinzip in die jeweiligen Arten von Zellen getrennt, und die getrennten Zellen fallen in eine der Trennkammern 307a bis 307e. Anschließend wird jeweils eines der unter den Trennkammern 307a bis 307e vorgesehenen Magnetventile 308a bis 308e selektiv geöffnet, wodurch die gewünschten Zellen unabhängig entnommen werden können.
Die entnommenen Zellen werden über eine Pumpe 309 zu einem Dreiwegeventil 310 überführt und durch Öffnen eines Magnetventils 311 über ein Dreiwegeventil 312 in das Kulturrohr 17 (in Fig. 1 dargestellt) im Kulturtank 14 überführt.
Außerdem steht während der Trennung eine Pumpe 313 still, ein Magnetventil 314 ist geschlossen und ein Magnetventil 316 zu einer Rückgewinnungsflasche 315 ist geschlossen.
Wenn die Zellen aus dem Elektrophoresetank 305 zurückgewonnen werden, wird das Magnetventil 311 geschlossen und das Magnetventil 316 wird geöffnet, wodurch die Zellen aus der Elektrophoresekammer 305 in die Rückgewinnungsflasche 315 überführt werden.
Als nächstes wird der Betrieb des Kulturbereichs 10 unter Bezugnahme auf Fig. 7 beschrieben.
(A) ZELLEINLAGERUNG: Die Pumpe 29 (in Fig. 1 dargestellt) wird angetrieben, und ein Magnetventil 26 wird geöffnet, so daß die zu kultivierenden Zellen zum Einlagern aus der Trenneinheit 20 zum Kulturrohr 17 im Kulturtank 14 überführt werden.
(B) BEGINN DER KULTIVIERUNG: Die Pumpe 13 wird angetrieben, und das Kulturmedium wird kontinuierlich in den Kulturtank 14 infundiert. Das überschüssige Kulturmedium wird durch Antreiben der Pumpe 15 in den Abfalltank 16 abgeführt. Nachdem das Kulturmedium über das Kulturrohr 17, die Pumpe 15, das Dreiwegeventil 403, das Dreiwegeventil 404, die Pumpe 13 und den Kulturtank 14 in den Kulturtank infundiert worden ist, kann dieselbe Lösung in einem vorbestimmten Zeitraum im Umlauf gehalten werden. Die Oberfläche des Kulturrohrs 17 ist vorzugsweise aus einer semipermeablen Membran hergestellt (deren Materialien z. B. der Cellulosegruppe angehören können, oder Stoffe der Polyolefin-, Polysulfon-, Polyvinyl- und Fluor-Gruppe sein können) oder aus Maschenmaterialien, durch welche die Zellen nicht hindurchtreten können, durch welche jedoch das Kulturmedium und Abfallmaterialien hindurchführbar sind.
(C) ZUGABE VON BIOAKTIVER SUBSTANZ: Die Additiv-Flüssigkeit kann mit dem Kulturmedium gemischt werden, wobei das Mischungsverhältnis gemäß den Daten der Zellaktivität geändert werden kann. In diesem Fall können mehrere Arten von Additiv- Flüssigkeit hinzugefügt werden.
(D) BEPROBUNG: Ein Magnetventil 405 wird in regelmäßigen Zeitabständen geöffnet, und die Zellsuspension, die in Kultur befindliche Zellen enthält, wird zur Überwachung aus dem Kulturrohr 17 im Kulturtank 14 beprobt.
(E) RÜCKGEWINNUNG: Gemäß den Daten der Zellaktivität (z. B. Zelldichte) wird die Zellen enthaltende Zellsuspension im Kulturtank 14 zur Trenneinheit 20 überführt.
Als nächstes wird der Betrieb der Kulturüberwachungseinheit 30 unter Bezugnahme auf Fig. 1 beschrieben.
(A) VORBEREITUNG ZUR BEPROBUNG: Der Transferpfad 33a und der X-Y-Tisch 33 werden auf das Transferpfad-Signal und die X-Y- Tisch-Signale hin angetrieben, so daß die Zellsuspension in die Vorratsposition bewegt wird. Das Meßgefäß wird aus dem Vorratsraum 35 entnommen, um es auf ein Reißverschlußbefestigungs-Signal hin durch eine Reißverschlußhalterung zu sichern. Das Meßgefäß 34 wird auf das Transferpfad-Signal und die X-Y-Tisch-Signale hin zur Infusionsposition bewegt.
(B) BEPROBUNGS-INFUSION: Die Pumpe 31 wird durch ein Infusions-Manipulator-Signal und ein Pumpen-Signal angetrieben, so daß die Zellen enthaltende Zellsuspension aus der Kulturpipette 17 im Kulturtank 14 überführt wird, wobei sie von einem Pipetten-Manipulator 32 in das in einer vorbestimmten Position angeordneten Meßgefäß 34 infundiert wird.
(C) FÄRBEN: Die überstehende Flüssigkeit der Beprobungssuspension wird von einer Pumpe 37 und einem Färbe- Manipulator 36 ausgeschlossen. (Eine Infusion, ein Ansaugen und eine Exklusion von Fixierungsmittel können eingeschlossen sein) Die Färbe-Flüssigkeit wird von der Pumpe 37 und vom Färbe-Manipulator 36 in das Meßgefäß infundiert. Die Färbeflüssigkeit wird von der Pumpe 37 und vom Färbe-Manipulator 36 angesaugt und ausgeschlossen. Die Reinigungsflüssigkeit wird von der Pumpe 37 und dem Färbe-Manipulator 36 infundiert, aufgesaugt und ausgeschlossen.
(D) VORBEREITUNG ZUR MESSUNG: Das Meßgefäß 34 wird auf das Transferpfad-Signal, die X-Y-Tisch-Signale, ein Lichtquellen- Signal und ein Bildverarbeitungsvorrichtungs-Steuersignal hin zum Mikroskopabschnitt 39 überführt. Eine Lichtquelle 39a wird eingeschaltet. Die Bildverarbeitungsvorrichtung 41 wird angesteuert, und die mittels der Fernsehkamera 40 erhaltene Bildinformation wird mittels des Bildschirms 51 beobachtet.
(E) MESSUNG: Die Bildverarbeitungsvorrichtung 41 wird auf das Bildverarbeitungs-Signal und das X-Y-Tisch-Lichtquellen-Signal hin angesteuert, so daß z. B. die Anzahl der Zellen, der Grad der Deformation und die Arten von Zellen durch Überwachen des Anzeigeschirms des Überwachungsfernsehens 51 oder durch die Datenverarbeitung in der Steuerung 50 gemessen werden.
Zusätzlich werden die Vorgänge, die eine Beprobung, eine vorläufige Verarbeitung und Messung einschließen, auf das von der Steuerung 50 jeweils in regelmäßigen Zeitabständen übermittelte Signal hin durchgeführt.
Außerdem wird die Anzahl der Zellen, der Grad der Deformation der Zellen (Grad der Jugend der Zellen) durch Ausführen der Bildverarbeitung gemessen, und das Ergebnis der Messung wird als ein Parameter für den Grad der Zellaktivierung verwendet, so daß die Verabreichung der bioaktiven Substanz, wie Lymphokin, z. B. Interleukin 2, gesteuert wird.
Ein anderes Beispiel der Kulturüberwachungseinheit 30 wird unter Bezugnahme auf Fig. 8 erläutert.
(A) INFUSION VON TARGET-ZELLEN: Target-Zellen (wie beispielsweise die K-562-Zellreihe) die unter einem Kulturvorgang Aktivität zeigen, werden auf ein Transferpfad- Signal, ein Transfermechanismus-Signal, ein Vorbehandlungsmanipulator-Signal, ein Pumpen-Signal, ein Manipulator-Vorsignal und ein Pumpen-Signal hin infundiert. Ein Meßgefäß 501 wird von einem Vorratsraum 502 zu einer Arbeitsstation überführt. Die Target-Zellen werden durch einen Manipulator 504, eine Pipette 503 und eine Pumpe 506 in das Gefäß 501 infundiert. In dasselbe Gefäß 501 wird eine Färbe- Flüssigkeit infundiert. Das Gefäß wird in einen CO&sub2;-Inkubator 507 überführt. Bei dem oben erwähnten Vorgang können (1) die Zellen in der Färbe-Flüssigkeit vorab infundiert werden. (2) Die gefärbten Zellen können in den unten aufgeführten Vorgängen (C) verwendet werden. Der Zweck der Tätigkeit ist es, daß Färbe-Substanz (wie zum Beispiel &sup5;¹Cr oder Eu) in die Target-Zellen aufgenommen wird.
(B) REINIGUNG: Das Gefäß wird aus dem CO&sub2;-Inkubator 507 entnommen und auf ein von der Steuerung übermitteltes Signal, ein Transfermechanismus-Signal, ein Transferpfad-Signal, ein Vorbehandlungsmanipulator-Signal und ein Pumpen-Signal hin nach einem vorbestimmten Zeitraum zur Arbeitsstation überführt. Die Targetzellsuspension im Gefäß wird über den Vorbehandlungsmanipulator 504, die Pipette 503 und die Pumpe 506 in ein Zentrifugenrohr 510 infundiert. Die Targetzellsuspension wird auf ein Zentrifugenvorrichtungs- Signal hin zentrifugiert, und eine Zentrifugeneinheit 511 wird aktiviert, um die Zelldifferentiation aufzunehmen, und wird nach einem vorbestimmten Zeitraum (5 bis 10 min) angehalten. Ein Abtasten der Zelldifferentiation wird vom Sensor 40 durchgeführt. Das Abtast-Signal wird als Differentiations- Positions-Information verwendet. Die überstehende Flüssigkeit wird durch die Pipette 503, den Manipulator 504 und die Pumpe 506 in Bezug auf die Abtast-Daten auf das Vorbehandlungsmanipulator-Signal und das Pumpen-Signal hin ausgeschlossen. Das Kulturmedium wird auf das Vorbehandlungs- Signal und das Pumpen-Signal hin in das Zentrifugenrohr 510 infundiert. Die Pipette 503 wird in das Zentrifugenrohr eingeführt, und die Pumpe 506 wird so betätigt, daß sie auf ein Vorbehandlungsmanipulator-Signal und ein Pumpen-Signal hin im Ansaug- und Ausstoß-Betrieb arbeitet, wodurch die Lösung umgerührt wird.
(C) INFUSION VON KULTURZELLEN: Die Targetzellsuspension wird vom Zentrifugenrohr zu einem Meßgefäß 2 überführt, und die im Kulturtank kultivierten Zellen werden beprobt und in dasselbe Gefäß 2 infundiert. Das Meßgefäß 2 wird auf das Transferpfad- Signal und das Ausbringmechanismus-Signal hin vom Vorratsraum zur Arbeitsstation überführt. Die Pipette 503, die Pumpe 506 und der Vorbehandlungsmanipulator 504 werden auf das Pumpen- Signal und das Vorbehandlungsmanipulator-Signal hin angetrieben, so daß die Targetzellsuspension vom Zentrifugenrohr 510 in das Meßgefäß 2 infundiert wird. Die vom Kulturrohr 17 im Kulturtank 14 überführte Kulturzellsuspension wird auf das Pumpen-Signal hin über die Pumpe 508 und den Zellsuspensions-Infusions-Manipulator 505 infundiert. Das Meßgefäß 2 wird im CO&sub2;-Inkubator 507 eingelagert, indem der Transferpfad 512 auf das Transferpfad-Signal und das Ein/Ausbringmechanismus-Signal hin benutzt wird.
(D) VORBEHANDLUNG ZUR MESSUNG: Das Meßgefäß 2 wird aus dem CO&sub2;- Inkubator 507 ausgebracht und zur Arbeitsstation überführt, indem der Transferpfad 512 und der Ein/Ausbringmechanismus auf das Ein/Ausbringmechanismus-Signal und das Transferpfad-Signal hin benutzt wird. Die Mischzellsuspension wird zum Zentrifugenrohr 510 überführt, indem die Pumpe 506 die Vorbehandlungsmanipulatoren 503 und 504 auf das Pumpen-Signal und das Manipulator-Signal hin benutzt werden. Die Mischzellsuspension wird auf das Zentrifugeneinrichtungs- Signal hin zentrifugiert, so daß die Zelldifferentiation (5 bis 10 min) getrennt wird. Die Zelldifferentiation wird vom Sensor 25 abgetastet, so daß mit dem Abtastsignal Daten über die Differentiationsposition übermittelt werden. Ein Meßgefäß 3 wird aus dem Vorratsraum 502 ausgebracht und auf das Ein/Ausbringmechanismus-Signal und das Transferpfad-Signal hin zur Arbeitsstation überführt. Das Überstehende der Mischzellsuspension wird entnommen (auf der Grundlage der Differentiationspositionsdaten) und in das Meßgefäß 3 infundiert, indem die Pipette 503, die Pumpe 506 und der Vorbehandlungsmanipulator 504 auf das Pumpen-Signal und das Vorbehandlungsmanipulator-Signal hin verwendet werden. Durch den oben erwähnten Betriebsablauf wird das Meßgefäß 2 ausgetragen, und die Mischzellsuspension wird zum Zentrifugenrohr überführt, um nach einem vorbestimmten Zeitraum auf das von der Steuerung übermittelte Signal hin zentrifugiert zu werden.
(E) MESSUNG: Das Meßgefäß 3 wird auf das Transferpfad-Signal hin zu einem Meßraum 509 überführt, um es zu messen. Das Ausgangssignal des Meßraums wird zur Steuerung 50 übermittelt. Für den Fall, daß eine fluoreszierende Substanz, wie zum Beispiel Eu (Europium) in der Färbe-Flüssigkeit verwendet wird, wird eine Fluoreszenzmessung durchgeführt. Im Fall einer Verwendung eines radioaktiven Isotops, wie zum Beispiel &sup5;¹Cr, wird ein RI-Meßinstrument verwendet.
Zusätzlich besteht das Prinzip der Messung darin, daß Eu während der Kultur in die Target-Zellen aufgenommen wird. Das Eu wird infolge der Killer-Aktivität der die Kultur durchlaufenden Zelle aus der Target-Zelle abgegeben.
Außerdem ist im Fall einer Verwendung von &sup5;¹Cr (RI) anstelle von Eu das Prinzip dasselbe wie oben.
Es werden Daten gesammelt, um zu beurteilen, ob die Zellen in der Kultur eine Killer-Aktivität besitzen oder nicht. Auf der Grundlage der Daten wird die Verabreichung der bioaktiven Substanz, wie Lymphokin, z. B. Interleukin 2 gesteuert.
Eine Reihe von Messungen wird unter der Kontrolle der Steuerung 50 in regelmäßigen Zeitabständen durchgeführt.
Die Zusammenfassung der oben beschriebenen Steuerung der Kultur ist wie folgt.

[1] STEUERUNG DER VERABREICHUNG DER BIOAKTIVEN SUBSTANZ

(1) STEUERUNG DURCH DIE ANZAHL DER ZELLEN ODER DIE ZELLDICHTE

Die Anzahl der Zellen wird mittels Bildverarbeitung gemessen, welche von der Kulturüberwachungseinheit durchgeführt wird, und die Zelldichte der Zellen unter Kultivierung wird auf der Grundlage der von der Steuerung gemessenen Menge der Zellsuspension berechnet. Für den Fall, daß die unter Kultivierung gemessene Zelldichte unter der von der Steuerung eingestellten Dichte liegt (Beispiel für den eingestellten Wert: 5 · 10&sup6; Zellen/ml) wird zum Beispiel Interleukin 2 als bioaktive Substanz zugegeben. Die oben genannte Tätigkeit wird an der Kultureinheit durchgeführt.

(2) STEUERUNG DURCH CYZOTOXIZITÄT

Gemäß der Messung der Cytotoxizität durch die Kulturüberwachungseinheit erhält man die Cytotoxizität der Zellen unter Kultivierung. Als Markierung für die Zellen können &sup5;¹Cr, Eu und CFDA (Carboxy-Fluorescen-Diacetat) verwendet werden. Wenn die Cytotoxizität der Zellen unter Kultivierung unter der von der Steuerung eingestellten Dichte liegt, d. h. wenn die erhaltene Cytotoxizität unter der Annahme, das Verhältnis betrage 100%, wenn man die Cytotoxizität sämtlicher Target-Zellen erzielt, unter 20% liegt, wird die bioaktive Substanz, z. B. Interleukin 2 zugegeben. Der Betriebsteil findet in der Kultureinheit statt.

(3) STEUERUNG DURCH DIE ART DER ZELLEN

Die Art der Zellen unter Kultivierung wird durch eine Bildverarbeitungseinheit unter Verwendung eines Fluoreszenzbildes mit Hilfe der Kulturüberwachungseinheit oder durch eine Lichtmeßvorrichtung unter Verwendung einer Fluoreszenz-Meßvorrichtung gemessen, so daß man ihre Verteilung und ihren Anteil aus der von der Steuerung durchgeführten Berechnung erhält. Als eine Färbe-Substanz können in diesem Fall monoklonale Antikörper verwendet werden, die mit einer fluoreszierenden Substanz markiert sind. Wenn der Anteil eines bestimmten Zelltyps in den Zellen unter Kultivierung (z. B. NK-Zellen; natürliche Killer-Zellen) unter dem von der Steuerung eingestellten Wert (Anteil) liegt, wird die bioaktive Substanz zugegeben. Der oben genannte Vorgang wird in der Kultureinheit durchgeführt.

(4) STEUERUNG DURCH DIE FORM DER ZELLEN

Der Parameter der Form der gefärbten und ungefärbten Zellen wird durch die von der Kulturüberwachungseinheit durchgeführte Bildverarbeitung gemessen. Als ein Form-Parameter kann z. B. (i) die Größe der Zelle, (ii) die Flachheit der Zelle verwendet werden. Für den Fall, daß die Verteilung oder der Mittelwert der Form-Parameter der Zellen unter Kultivierung kleiner als der von der Steuerung eingestellte Wert ist, wird die bioaktive Substanz, z. B. Interleukin 2 zugegeben. Der oben genannten Vorgang wird in der Kultureinheit durchgeführt.

[2] STEUERUNG DES AUSTAUSCHS DES KULTURMEDIUMS

(1) STEUERUNG DURCH DIE ANZAHL DER ZELLEN ODER DIE ZELLDICHTE

Die Anzahl der Zellen wird mittels der von der Kulturüberwachungseinheit durchgeführten Bildverarbeitung gemessen, so daß die Zelldichte von der Steuerung auf der Grundlage der Menge der Zellsuspension berechnet wird. Als Steuerungsverfahren wird sie (i) zum Beispiel wenn die Dichte der Zellen unter Kultivierung über die von der Steuerung eingestellte Dichte hinausgeht, so gesteuert, daß das Kulturmedium in regelmäßigen Zeitabständen, z. B. jeden Tag ausgetauscht wird. (ii) Wenn die Dichte der Zellen unter Kultivierung über die von der Steuerung eingestellte Dichte hinausgeht, wird so gesteuert, daß die Zellsuspension auf die ursprüngliche Dichte verdünnt wird. Der oben genannte Vorgang wird in der Kultureinheit durchgeführt.

(2) STEUERUNG DURCH DEN pH-WERT

Der pH-Wert der Zellsuspension oder des Mediums, in dem die Zellen kultiviert werden, wird mit Hilfe der Lichtmeßvorrichtung der Kulturüberwachungseinheit gemessen. Wenn der gemessene pH-Wert des Mediums zeigt, daß der Säuregrad über den von der Steuerung eingestellten Wert hinausgeht, wird das Kulturmedium ausgetauscht. Der oben genannte Vorgang wird in der Kultureinheit durchgeführt.
Die Zusammenfassung der Steuerung einer Rückgewinnung der Zellen wird wie folgt beschrieben.

[1] STEUERUNG DURCH DIE ANZAHL DER ZELLEN ODER DIE ZELLDICHTE

Die Anzahl der Zellen wird mittels der von dem Kulturüberwachungsteil durchgeführten Bildverarbeitung gemessen, und die Dichte der Zellen unter Kultivierung wird von der Steuerung auf der Grundlage der gemessenen Menge der Zellsuspension berechnet. Wenn zum Beispiel die gemessene Dichte der Zellen unter Kultivierung über die von der Steuerung eingestellte Dichte der Zellen hinausgeht (Beispiel für den eingestellten Wert; 1 · 10&sup7; Zellen/ml), wird ein Signal von der Trenneinheit zur Kultureinheit übermittelt, und der Rückgewinnungsvorgang beginnt. Die oben genannten Vorgänge werden in der Trenneinrichtung und in Kultureinheiten durchgeführt.

[2] STEUERUNG DURCH CYTOTOXIZITÄT

Die Cytotoxizität der Zellen unter Kultivierung erhält man durch Messung der Cytotoxizität mit Hilfe der Kulturüberwachungseinheit. Als Markierung für die Zellen kann CFDA, &sup5;¹Cr und Eu verwendet werden. Wenn die Cytotoxizität der Zellen unter Kultivierung größer wird, als der in der Steuerung eingestellte Wert (zum Beispiel unter der Annahme, der Wert betrage 100%, wenn sämtliche der Target-Zellen toxisch sind, in dem Fall, daß die erhaltene Cytotoxizität über 30% liegt), werden die Steuer-Signale von der Steuerung zur Trenneinrichtung und den Kultureinheiten übermittelt, so daß der Rückgewinnungsvorgang beginnt. Der oben genannte Vorgang wird in der Trenneinrichtung und in den Kultureinheiten durchgeführt.

[3] STEUERUNG DURCH DIE ART DER ZELLEN

Die Art der Zellen unter Kultivierung wird mit Hilfe der Bildverarbeitung unter Verwendung von Fluoreszenzbildern gemessen, die von der Kulturüberwachungseinheit oder von der Lichtmeßvorrichtung durchgeführt wird, welche eine Fluoreszenzlicht-Meßvorrichtung verwendet, so daß man die Verteilung ihres Anteils mittels der von der Steuerung durchgeführten Berechnung erhält. In diesem Fall kann als Färbe-Material ein mit fluoreszierenden Stoffen (z. B. FITC, P.E., RITC) markierter monoklonaler Antikörper verwendet werden. Wenn der Anteil einer speziellen Art von Zellen unter Kultivierung (z. B. NK-Zellen) über den in der Steuerung eingestellten Wert (Anteil) hinausgeht, werden die Signale von der Steuerung zur Trenneinrichtung und den Kulturteilbereichen übermittelt, so daß der Rückgewinnungsvorgang beginnt. Der oben erwähnte Vorgang wird in der Trenneinrichtung und den Kultureinheiten durchgeführt

[4] STEUERUNG DURCH DIE FORM DER ZELLEN

Die Form-Parameter der gefärbten und ungefärbten Zellen werden durch die von der Kulturüberwachungseinheit durchgeführte Bildverarbeitung gemessen. Als Form-Parameter können zum Beispiel (i) die Größe der Zellen, (ii) die Flachheit der Zellen verwendet werden. Wenn die Verteilung oder der Mittelwert der Form-Parameter der Zellen unter Kultivierung größer als der in der Steuerung eingestellte Wert wird, werden die Steuersignale von der Steuerung zur Trenneinheit und den Kulturreinheiten übermittelt, so daß der Rückgewinnungsvorgang beginnt. Der Vorgang wird in der Kultureinheit durchgeführt. Bei jedem der Steuervorgänge kann eine Kombination von mehr als zwei oben genannten Steuerungsvorgängen verwendet werden, und die vorliegende Erfindung ist nicht auf die oben genannten Steuerungsvorgänge beschränkt.
Die Auswirkungen der vorliegenden Erfindung werden wie folgt beschrieben.
(1) Das Wachstum und die Aktivierung der Zellen kann mühelos durchgeführt werden, indem einfach die Bedingungen für jeden der Mechanismen eingestellt und ohne jegliche spezielle Technik mit den Betriebsabläufen der Vorrichtung begonnen wird; der Arbeitsaufwand, speziell der Arbeitsaufwand eines Arztes kann bemerkenswert verringert werden, und im Fall der Anwendung zur Therapie kann ein Arzt mehr Patienten als zuvor betreuen.
(2) Falls der gesamte Teil der Vorrichtung in einer Reinbank oder in einem Sicherheitsschrank angebracht ist, kann der Betriebsablauf ohne Zuhilfenahme einer menschlichen Hand unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden, deshalb ist die Möglichkeit einer Kontamination mit verschiedenen Bakterien gering, so daß die zur Therapie verwendete Vorrichtung eine hohe Sicherheit aufweist. Außerdem braucht der Arzt keine Infektion mit pathogenen Pilzen zu befürchten.
(3) Da die Zelldichte und die Aktivität der Zellen bei dem manuell betriebenen Zell-Züchtungsverfahren des Standes des Technik in vielen Fällen nicht gemessen wurden, kann man den optimalen Zustand für das Wachstum und die Aktivität der Zellen nicht erhalten. Da die Dichte und die Aktivität der Zellen bei der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung in geeigneter Weise gemessen werden können, z. B. zum Zeitpunkt der Einstellung, so daß die Kulturbedingungen dynamisch gesteuert werden können, kann daher eine optimale Kultivierung durchgeführt werden, so daß die Dichte und die Aktivität der Zellen sehr viel stärker vergrößert werden können als im Stand der Technik, und die Zellen stabil bereitgestellt werden können.
(4) Selbst in dem Fall, wo der Unterschied der Zelleigenschaften infolge der Patienten eingeschlossen ist und viele Arten von Zellen kultiviert werden, bestehen geringe Risiken, daß man irrtümlich ein Kulturverfahren nimmt, so daß die Kultivierung gleichzeitig sicher durchgeführt werden kann.

Claims

1. Zellproliferationsvorrichtung, umfassend:

eine Trenneinrichtung (20) zum Trennen von Zellen;

eine Kultureinrichtung (10) mit einem Kulturtank (14) zum

Kultivieren der Zellen, eine Transfereinrichtung (13) zum Überführen der Zellen zwischen der besagten Trenneinrichtung (20) und der besagten Kultureinrichtung (10); und

eine Steuereinrichtung (50) zum Steuern des Betriebs der Trenneinrichtung (20) und der Transfereinrichtung (13), dadurch gekennzeichnet, daß die besagte Trenneinrichtung (20) eine zum Zentrifugieren einer Lösung geeignete Zentrifugeneinrichtung (22), eine zum Aufnehmen und Abgeben der Lösung geeignete Pipettiereinrichtung (24), einen Manipulator (23) zum Manipulieren der besagten Pipettiereinrichtung (24) und einen Sensor (25) zum Abtasten der Position von jeder von Zelldifferentiationen nach einem Zentrifugieren umfaßt, so daß der Pipettiervorgang auf der Grundlage des Abtastergebnisses von jeder der Differentiationspositionen gesteuert wird, daß eine Kulturüberwachungseinrichtung (30) vorgesehen ist, um die Eigenschaften der in der besagten Kultureinrichtung (10) eingelagerten Zellen zu messen, und daß die besagte Steuereinrichtung (50) die mittels der besagten Kulturüberwachungseinrichtung (30) erhaltenen Eigenschaften der Zelle berechnet, sowie zum Steuern der Kulturbedingungen des Kulturtanks (14) und zum Steuern des Betriebs der besagten Trenneinrichtung (20), der besagten Transfereinrichtung (13) und der besagten Kulturüberwachungseinrichtung (30).

2. Zellproliferationsvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Zentrifugiervorgang der besagten Trenneinheit (20) ein kontinuierliches Zentrifugieren ist.

3. Zellproliferationsvorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Dichtegradienten-Zentrifugieren zum Trennen der Zellen verwendet wird.

4. Zellproliferationsvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte Trenneinheit (20) einen Membranfilter (602) zum Trennen der Zellen, ein Gerät zum Halten des besagten Membranfilters und einen Flüssigkeitspfad umfaßt, so daß die Zellen durch Filtration getrennt werden.

5. Zellproliferationsvorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der besagte Membranfilter (602), das besagte Gerät zum Halten des Membranfilters und der Flüssigkeitspfad im Gegenstrom gereinigt werden können.

6. Zellproliferationsvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte Trenneinheit (20) die Zellen unter Verwendung von Unterschieden der Menge an elektrischer Ladung auf den Zellen trennt.

7. Zellproliferationsvorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte Trenneinheit (20) einen Tank mit Elektroden zum Anlegen einer Spannung an die Lösung und einen Flüssigkeitspfad umfaßt.

8. Zellproliferationsvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der besagte Kulturtank (14) zum Infundieren und Abgeben einer Kulturlösung geeignet ist.

9. Zellproliferationsvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der besagte Kulturtank (14) abnehmbar in der Kultureinheit (10) vorgesehen ist, und daß die besagte Transfereinrichtung (13) den besagten Kulturtank (14) zwischen der Kultureinheit (10) und der Trenneinheit (20) überführt.

10. Zellproliferationsvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Betrieb der Trenneinheit (20), der Kultureinheit (10) und der Transfereinrichtung (13) jeweils unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden können.

11. Zellproliferationsvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte Vorrichtung außerdem eine Beprobungseinrichtung umfaßt, um die in den Kulturtank (14) eingelagerte Zellsuspension zu beproben.

12. Zellproliferationsvorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß eine Kulturüberwachungseinheit (30) eine Färbeeinrichtung zum Färben der Zellen oder eine Markiereinrichtung zum Markieren der Zellen umfaßt.

13. Zellproliferationsvorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte Kulturüberwachungseinheit eine Meßeinrichtung zum Messen der Eigenschaften der Zellen umfaßt.

14. Zellproliferationsvorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Bildverarbeitung der durch ein Mikroskop erhaltenen Bilder der Zellen von der besagten Meßeinrichtung durchgeführt wird.

15. Zellproliferationsvorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte Meßeinrichtung eine Lichtmeßvorrichtung umfaßt.

16. Zellproliferationsvorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte Meßeinrichtung die Radioisotopmenge mißt.

17. Zellproliferationsvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kulturbedingungen durch Steuerung der Verabreichungsmenge an bioaktiver Substanz unter Verwendung des Meßergebnisses der Eigenschaften der Zellen gesteuert werden.

18. Zellproliferationsvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kulturbedingungen durch Steuerung des Austauschs des Kulturmediums unter Verwendung des Meßergebnisses der Eigenschaften der Zellen gesteuert werden.

19. Zellproliferationsvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Zeitpunkt einer Rückgewinnung der Zellen unter Verwendung des Meßergebnisses der Eigenschaften der Zellen gesteuert wird.

20. Zellproliferationsvorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die zu messende Eigenschaft der Zellen die Anzahl der Zellen oder die Zelldichte ist.

21. Zellproliferationsvorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die zu messende Eigenschaft der Zellen eine Cytotoxizität ist.

22. Zellproliferationsvorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die zu messende Eigenschaft der Zellen die Art der Zellen oder deren äußeres Erscheinungsbild ist.

23. Zellproliferationsvorrichtung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die zu messende Eigenschaft der Zellen die Form der Zellen, die Größe der Zellen oder der Grad der Deformation der Zellen ist.

24. Zellproliferationsvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß von pH-Wert, Temperatur, Feuchtigkeit oder CO&sub2;-Dichte des Mediums mindestens einer gemessen wird, und der gemessene Wert in einer Art Rückkopplung geregelt wird.