JPS6188872A

JPS6188872A - 高濃度連続培養方法及び装置

Info

Publication number: JPS6188872A
Application number: JP59211747A
Authority: JP
Inventors: Eitaro Kumazawa; 熊沢　栄太郎; Kisao Satou; 佐藤　喜砂夫; Yoshitomo Minamide; 南出　芳友; Shinichi Takato; 高藤　愼一; Kazuo Imon; 井門　和夫
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1984-10-09
Filing date: 1984-10-09
Publication date: 1986-05-07
Also published as: JPS6363193B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は各種菌体を培養する高濃度培養方法及び装置に
関するものである。

（従来の技術）一般に各種菌体を培養する場合、その代謝産物により増
殖阻害を受けることが多い。

そこで培養槽とＵＦ膜の濾過膜を組合せて培養中に生産
される代謝産物を除き高濃度培養を達成しようとする試
みは実験室レベルではすでに行われている。

第２図のものは培養槽（１）と保持タンク（２）との間
に透析槽（３）を設は之等をポンプ（４）を通じて連結
してあり、代謝産物が透析膜を通じて取り除かれるよう
になっていて菌体液は循環するようになっている。

これはＪｏｕｒｎａｌ　ｔｈｅ　５ｏｃｉｅｔｙ　Ｄａ
ｉｒｙ　ＴｅｃｎｏｌｏｇｙＶｏｌ　３０　　ＮＩＬ　
Ｊａｎｕａｒｙ　１９７９に掲載されている。

又Ｔｈｅ　Ａｕ５ｔｒａｌｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　Ｄａｉｒｙ　Ｔｅｃｎｏｌｏｇｙ−Ｍａｒｃｈ　１
９７７には、次のようなことが掲載されている。すなわ
ち、第３図において第１ＲＯ膜（５）、第２ＲＯ膜（６
）をポンプ（７）と圧力制御弁（８）とを通じて原料タ
ンク（９）に連結してあり、各ＲＯ膜で代謝産物を取り
除き低分子栄養成分を回収し、原料タンク（９）に還元
されるようになっている。

（発明が解決しようとする問題点）以上のような従来の方法では透析膜より除去された低分
子栄養成分を培養槽に直接供給し、培養槽内の液レベル
を一定に保持し、培養を継続していた。

しかしこの方法では培養経過に伴い、培養液の高粘度化
、膜面への菌体の目づまりにより液透過速度は急激に低
下し、培養槽内で生成した代謝物を十分に除ききれず、
したがって槽内に代謝物が蓄積され菌体の増殖が抑制さ
れるという欠点がある。

（問題点を解決するための手段）したがって本発明の技術的課題は連続的に代謝物を除き
ながら培養を継続させ、連続的に高濃度の菌体を培養さ
せることのできる高濃度連続培養方法及び装置をうろこ
とを目的とするものである。

この技術的課題を解決する本発明の技術的手段は、培養
槽で各種菌体を培養するに当たって、培養中に生産され
る代謝産物を培養槽と共に循環回路を構成する第１．２
濾過膜を通して取り除き、取り除いた代謝産物から低分
子有効成分を回収してこれを新鮮培地と共に前記濾過膜
を通して循環回路に供給するに当たり、循環回路の正流
方向では第２濾過膜に供給し、逆流方向では第１濾過膜
に供給して連続的に高濃度菌液をうるようにしたことと
、培養槽とＵＦ膜等の濾過膜を使用した第１．２濾過室
とを配管装置を介して可逆循環回路を構成する如く連結
し、かつ第１，２濾過室は新鮮培地と代謝産物から回収
した低分子有効成分とを供給できる供給タンクに切換自
在に連結すると共に代謝産物の回収装置に連結し、循環
回路の正流方向では第２濾過室を供給タンクに連結し、
逆流方向では第１濾過室を供給タンクに連結する如く配
管構成されたものである。

（発明の効果）本発明では培養中に生産される代謝産物をＵＦ膜等の濾
過膜を用いて系外に効率的に除去することができ、同伴
して流出する低分子有効成分及び新鮮培地を膜を通して
補充しながら培養し、連続的に高濃度菌液をうろことが
できる。

すなわち、正流運転時には培養槽より菌体液を第１．２
濾過室の順に通過させ、代謝物を含む透過液を高圧側の
第１濾過室より糸外に排出せしめ、一方低圧側となる第
２濾過室には代謝物を除いた低分子栄養物及び新鮮培地
を系外より押込んで培養槽内のタンクレベルを一定に保
持することができる。

そして逆流運転時には第１濾過室と第２濾過室の高圧側
と低圧側とが逆転し、これまで透過液を系内から系外に
排出していた第１濾過室では代謝物を除いた低分子栄養
物及び新鮮培地が系外から系内へ押込まれる状態、すな
わち逆′／′ｊｃ務状態に入り膜面に付着した菌体等が
除去され、次の正流運転に備えて洗務を兼ねながら低分
子栄養分を補給することができる。

このように第１．２濾過室の高圧、低圧側を切換えるこ
とにより異なる機能を交互にもたせ透過流速を低下させ
ることなく連続的に代謝物を除きながら培養を継続させ
、連続的に高濃度の菌体を培養することができる。

したがって本発明によれば培養により生成する増殖阻害
物質を除去しながら培養を行うので従来のバッチ式を太
き（上進る高濃度培養が達成できる。

又菌体の高濃度化に伴い所定菌体を製造する場合培養タ
ンク容積は大巾に削減できるので小型でコンパクトな設
計ができる。

更に又培養により生産される代謝生産物を効果的に除去
しながら培養を行うので所要培地量は１１５以下に削減
でき、補給する培地は膜を通して系内に入るため培地の
滅菌は不要となり省エネルギーが可能である。

（実施例）以下図面に示す実施例について説明する。

第１図において、（１０）は培養槽であり、（１１）　
　（１２）はフォローファイバーＵＦ膜を使用した第１
．２濾過室である。

培養槽（１０）と第１絶過室（１１）とはポンプ（３７
）のある管（１３）で連結され、第１濾過室（１１）と
第２＃、、過室（１２）とは管（３５）で連結されてい
る。

第２濾過室（１２）は又管（１５）を介して培養槽（１
０）に連結され、第１濾過室（１１）は管（１３）から
バルブ（２０）を介して分枝した管（１４）で培養槽（
１０）に連結されている。

管（１３）の途中には以上の外バルブ（１９）から分枝
した管（３６）がバルブ（２１）を介して管（１５）に
連結されている。

以上のようなことから実線で示す矢印の正流運転時では
培養槽（１０）からの菌体液は管（１３）から第１濾過
室（１１）　、第２濾過室（１２）を経て管（１５）で
培養槽（１０）に還元されるようになっていて１つの循
環回路を構成している。

又鎖線で示す矢印の逆流運転時では管（３６）から管（
１５）を介して第２濾過室（１２）　、第１濾過室（１
１）の順に通過し、管（１４）で培養槽（１０）に還元
されるようになついる。

第１．２濾過室には培地供給タンク（２９）からポンプ
（３１）を通じて培地が管（３０）に送られ、バルブ（
３２）を介して管（３４）　　（３３）の何れかを通じ
て第１．２濾過室に押込まれるようになっている。

又ＵＦ膜より除去された代謝物を含む低分子栄養成分は
第１．２濾過室（１１）　　（１２）から管（２２）　
　（４０）　、バルブ（２３）　、管（２４）　、ポン
プ（２６）を通じて濾過室（２７）に導かれ、ここでＲ
Ｏ膜を通じて代謝物の除去後、管（２８）を通じて培地
供給タンク（２９）に還元されるようになっている。

その他管（１３）から管（１６）　、ポンプ（１８）を
通じて濃縮菌液が濃縮菌液回収タンク（１７）に回収さ
れるようになっている。

さて第１図のフローシートにしたがって具体的に説明し
て行くと、まず培養槽（１０）で種菌を接種し、培養を
開始する。

数時間後に代謝産物が蓄積され始め、ある濃度に達する
と膜の運転を開始する。

実線矢印の正流運転時には培養槽（１０）よりポンプ（
３７）で引抜いた菌体液を第１．２濾過室の順に通過さ
せる。

第１．２濾過室におけるＵＦ膜はフォローファイバーＵ
Ｆ膜からなるものでこの場合第１濾過室（１１）が高圧
側となり、代謝物を含む透過液が管（２２）　、バルブ
（２３）　、管（２４）　、ポンプ（２６）　、管（２
５）を経て濾過室（２７）に導かれここでＲＯ膜で代謝
物が除去され代謝物が除去された低分子栄養成分は管（
２８）を通し培地供給タンク（２９）に戻され、培地の
有効利用が計れようになっている。

一方低圧側となる第２濾過室（１２）ではポンプ（３１
）により代謝物を除いた低分子栄養物及び新鮮培地がタ
ンク（２９）から管（３０）　、バルブ（３２）　、管
（３３）を通じて押込まれ培養槽（１ｏ）内のタンクレ
ベルを一定に保持するように運転される。

以上のような運転状態を継続すると、第１濾過室からの
透過液速度が培養過程で菌数増加に伴う高粘度化、膜の
目づまりにより低下するのでこの時三方電磁バルブ（１
９）　　（２０）　　（２１）（２３）　　（３２）を
同時に切換え鎖線矢印で示す逆流運転に入る。

このバルブ切換により高圧側と低圧側とが逆転し、これ
まで透過液を系内から系外に排出していた第１濾過室で
は系外から系内に液が押し込まれる状態すなわち、タン
ク（２９）　、ポンプ（３１）　、管（３０）　、バル
ブ（３２）　、管（３４）を介して逆洗務状態に入り膜
面に付着した菌体等が除去され、次の正流運転に備えて
洗務を兼ねながら低分子栄養分を補給する。

このように第１．２濾過室の高圧、低圧側を切換えるこ
とにより異なる機能を交互にもたせ透過流速を低下させ
ることなく連続的に代謝物を除きながら培養を継続させ
連続的に高濃度の菌体を培養させることができる。

実施例のものでは第１．２濾過室を直列に配置したもの
について説明したが並列に配置したものでもよい。

又実施例のものでは連続式の場合を示しているが二次増
殖期までバッチ式で運転を終了させてもよい。

以下ビヒダス菌の連続高濃度培養の実験について説明す
る。

１０ｆｆｉ容積培養タンクに酵母エキス１．０％、ペプ
トン１．０　％、バーミエートＩｆ１３．０％、肉エキ
ス０，５％、Ｋ２ＨＰ　０４０．５％、ＫＨ，ＰＯ４０
，１％アスコルビン酸Ｎａ　Ｏ，１％、水９３．８％か
らなる組成の培地６１を仕込み、１２０℃１５分間の滅
菌後冷却し、あらかじめ前培養を行ったＢ　、　　Ｌ　
ｏｎｇｕｍの種菌を接種し、３３°Ｃ±０．５℃の温度
条件で培養を行った。

ここで接種前には培地中にＮ　ガスを通気して培地中に
溶存している０２　ガスを除去し、また培養液面上には
Ｎ２　ガスを封入して培養中に０２ガスとの接触を断っ
た。培養過程における生菌数、乳糖含量及び代謝産物で
あるし一乳酸濃度の変化は第４図に示す。

初発のＰＨは６．８であるが培養過程と共にＰＨは低下
して行き、ある値を越えると増殖が停止するので、本実
験では２Ｎ−ＮＨ，ＯＨを用いて６．０の定ＰＨコント
ロールを行った。

培養１０時間後には、制限基質となる乳糖濃度は２ｇ／
ｆ以下となり、Ｌ−乳酸濃度は１０ｇ／ｊ！を越えて増
殖は停止するので、この時期より、本発明で明示した膜
システムの運転を開始する。

実験に使用した膜は、旭化成工業（株）製のフォローフ
ァイバー膜Ｓ　Ｅ　Ｐ４Ｏ１０（分画分子量６０００、
膜面積０．２　ｒｄ、耐熱温度９０℃）二本である。膜
内及び配管系内の無菌化は、８０℃温水を１時間循環後
、次亜塩素酸液２００ｐｐｍ、浸漬３時間後、無菌水を
用いて次亜塩素酸液を排除し、１０ｊｌ’培養ダンクと
無菌的に接合し、実験に供した。

培養開始後１０時間よりペリスタポンプを作動させて膜
運転を開始する。正逆の流路切換えはタイマーを用いて
３０分間隔で行った。

供給する培地は酵母エキス１．０％、ペプトン１．０％
、バーミエート粉３．０％、肉エキス０．５％、Ｋ２Ｈ
Ｐ　Ｏ，０，５％、ＫＨ，ＰＯ，０，１％、アスコルビ
ン酸Ｎａ　Ｏ，１％、水９３．８％組成の培地をあらか
じめ５ＥＰ１０１３膜を通したものを用いた。

また培養槽液レベルは６ρ一定になるように保、持した
。

その結果、膜を通して透過する液速度は第５．６図に示
すように菌の増殖と共に低下するが、ある目標濃度［１
０”（／　ｍｊり　］に達してから菌液を定常的に排出
しはじめると、液透過速度の低下は認められず、連続的
な菌液の取得が可能であった。

定常運転に至るまでの菌の比増殖速度μ（Ｈｒ”　）は
、−次比増殖速度μ　（培８槽のみの運転時）！は０．２３　ＣＨｒ−’　）であり、二次比増殖速度μ
２（膜運転を行いながら培養槽運転を行った時）は０．
１０　（Ｈｒ　　）となる。

以上の結果を用いて系内の基質、生菌、生産物の収支を
取る事により、連続運転時の苗生産速度、濃縮菌液抜き
出し速度、基質消費速度、代謝産物速度等の決定を行う
ことができる。

このように−次増殖期間（１０時間）、二次増殖期間゛
（８時間）を経た後、菌体濃度１０’（−／ｍε）の液
、０．６　Ｊ／ＨｒＸ３６Ｈｒ＝２１．６ｊ！を安定的
に取得する事ができた。

槽内残留液及び配管内液量６．８１を回収すると２１．
６＋　６．８＝２８．１となった。この間に使用した培
地量は１００１である。また総運転時間は５４時間であ
る。

従来、この種の菌の高濃度培養液の取得には定ＰＨ培養
法を用いて菌液を得た後、遠心分離法でスラッジ状菌を
集菌し、分散液を用いて１０１１（／ｍｊｌりの菌液を
得ている。この従来法と、本実験結果を比較すると、１　　　　　　１従　来　法１本発明法１比　１１培養
槽容積　　１　２５０Ａ　　　ｌ　　１０　／　　１０
．０４１（培　養　法　　１バッチ式　１連続式　１−
１１培養時間　　　１１６時間　１５４時間　１３１１
使用培地量　　ｌ　　２００ｚ　　　１１００　ｅ　　
１０．５　１１取得菌液量　　１　　　　　１　　　　
１　１１１０”（−／ｍｌ）　　ｌ　　１０ｊ！　　　
１２８．４１１２．８４１１　　　換算　　Ｉ　　　　
　Ｉ　　　　１　１１菌液／使用培地１０．０５　（−
）　　Ｉ　Ｏ，２８４１５，６８１１１１（−）ＩＩ以上のように本発明を用いると所定菌数の高濃度液を等
量得る際従来法にくらべて培養槽容積は大巾に縮小でき
、かつ使用培地量も削減できる。

本実験例では透過液中の有効成分の回収は行っていない
が、これを行うと、さらに使用培地量の削減を行うこと
は可能になる。

なお、本実験例ではビヒダス菌の高濃度培養例を示した
が、好気性菌の培養等にも十分利用できる。

又本実験例では分画分子量６０００のＵＦ膜を使用した
が除菌効果を有する０、１〜０．４５μ程度のマイクロ
フィルターの使用により効果的な代謝物除去が可能であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明装置のフローシート第２．３図は従来の培養装置を示すフローシート第４図は培養タイムコート図第５図は膜よりの透過流速変化図第６図は膜１本当りの透過液流速の経時変化図第７図は正流運転時におけるＵＦ膜前後の圧力分布図で
ある。（１０）・・・・培養槽（１１）・・・・第１濾過室（１２）・・・・第２濾過室（２９）・・パ・培地供給タンク培誉時第６図培促時間　　（＋−（ｒ　）第７図（入Ｌ１）（出口）（入口）　　　　　（出Ｄ）間　　
（）Ｔ　ｒ　）第５図膜運転開始から０１時間

Claims

【特許請求の範囲】

（１）培養槽で各種菌体を培養するに当たって、培養中
に生産される代謝産物を培養槽と共に循環回路を構成す
る第１、２濾過膜を通して取り除き、取り除いた代謝産
物から低分子有効成分を回収してこれを新鮮培地と共に
前記濾過膜を通して循環回路に供給するに当たり、循環
回路の正流方向では第２濾過膜に供給し、逆流方向では
第１濾過膜に供給して連続的に高濃度菌液をうるように
したことを特徴とする高濃度連続培養方法。
（２）培養槽とＵＦ膜等の濾過膜を使用した第１、２濾
過室とを配管装置を介して可逆循環回路を構成する如く
連結し、かつ第１、２濾過室は新鮮培地と代謝産物から
回収した低分子有効成分とを供給できる供給タンクに切
換自在に連結すると共に代謝産物の回収装置に連結し、
循環回路の正流方向では第２濾過室を供給タンクに連結
し、逆流方向では第１濾過室を供給タンクに連結する如
く配管構成されたことを特徴とする高濃度連結培養装置
。