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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung oder
Erzeugung einer Biomikroelektrode mittels direkter
Immobilisierung einer biologisch aktiven Substanz. Dabei
kann die biologisch aktive Substanz wie z. B. ein Enzym
direkt auf oder in der Oberfläche bzw. den Oberflächen der
Mikroelektrode unabhängig davon immobilisiert werden, ob
quervernetzende Agenzien eingesetzt werden oder nicht.
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Bekannte Biosensoren, welche durch Inkorporieren von
Enzymen, Antikörpern oder Mikroorganismen auf der
Oberfläche von Platin oder Kohlenstoff erzeugt werden,
können eine schnelle und kontinuierliche Messung von
verschiedenen chemischen und biologisch aktiven Substanzen
ermöglichen. Bei der Herstellung wird die biologisch aktive
Substanz auf die Oberfläche der Elektrode aufgebracht,
indem zunächst unabhängig eine die biologisch aktive
Substanz enthaltende Membran hergestellt und dann die
Membran auf der Oberfläche der Elektrode anhaften gelassen
wird. Ein anderes Herstellungsverfahren wird unter Bildung
von kovalenten Bindungen zwischen dem Enzym und der
Oberfläche durchgeführt. Während jedoch zu den
Charakteristika eines Biosensors die Reproduzierbarkeit,
Lebensdauer, hohe Sensitivität und Ansprechvermögen zählen,
ist der nach dem ersteren Verfahren hergestellte Sensor
nicht zufriedenstellend in Hinsicht auf die
Reproduzierbarkeit und der mittels des letzteren Verfahrens
hergestellte macht in Hinsicht auf die Erhöhung der
Enzymdichte auf der Oberfläche Schwierigkeiten. Desweiteren
benötigt das bekannte Verfahren mehrere Schritte zur
Bildung der Bioelektrode; außerdem ist es schwierig einen
multifunktionellen Sensor herzustellen, bei dem mehrere
Arten von biologisch aktiven Substanzen auf einem Sensor
inkorporiert sind.
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Die bekannten Elektroden mit immobilisierten Enzymen weisen
ein Struktur auf, bei der eine Membran mit dem
immobilisierten Enzym auf der Oberfläche einer Platte oder
Scheibe aus Platin anhaften gelassen wird. Die Herstellung
derselben beinhaltet das Anhaftenlassen einer zuvor
hergestellten Membran mit einem darauf immobilisierten
Enzym auf der Plattenelektrode und Beschichten einer
chemisch behandelten sauberen Oberfläche der Elektrode mit
einem Enzym. In diesem Falle ist die Miniaturisierung der
Elektrode schwierig. In jüngster Zeit wurden Fortschritte
bei der Miniaturisierung mittels der sogenannten
Halbleiter-Integrationstechnik erzielt. Bei dieser
Integrationstechnik kann man eine Enzymelektrode mit einer
Größe in Bereich von mm einsetzen, jedoch führt auch das
übliche Nachweisverfahren mittels Potentialmessung zu
befriedigenden Ergebnissen in Hinsicht auf Sensitivität und
Ansprechvermögen. Die Größe der üblichen Elektroden kann
jedoch nur unter Schwierigkeiten stärker verkleinert
werden.
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Mittels des Biosensors, bei dem ein Enzym, Antikörper oder
Mikroorganismus auf der Oberfläche von Platin oder
Kohlenstoff immobilisiert wird, sind bekanntermaßen
schnelle und kontinuierliche Messungen verschiedener
chemischer oder biologischer Substanzen möglich. Bei
solchen Biosensoren wird die biologisch aktive Substanz
mittels verschiedener Verfahren immobilisiert,
beispielsweise durch Anhaftenlassen einer die biologisch
aktive Substanz enthaltenden Membran an die Elektrode oder
durch Beschichten der chemisch behandelten
Elektrodenoberfläche mit einem Enzym o. ä. sowie
anschließendem Bilden kovalenter Bindungen zwischen dem
Enzym und der Oberfläche. Wenn man jedoch die Leistung
eines derartigen Biosensors in Hinsicht auf
Reproduzierbarkeit, Beständigkeit, Sensitivität und
Ansprechvermögen bewertet, so zeigt ein mittels des ersten
Verfahren hergestellter Biosensor Vorteile in Bezug auf das
Ansprechvermögen und bei dem nach dem letzteren Verfahren
hergestellten ist das Erhöhen der Immobilisierung
schwierig.
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Die JP-A-61 195 346 offenbart einen mittels eines
zweistufigen Verfahrens hergestellten Immunosensors, wobei
eine Elektrodenmembran aus Poly-Pyrrol oder Poly-Thiophen
mit einem darauf immobilisierten, bioaktiven Material
versehen wird. Das bioaktive Material wie etwa ein Antigen
oder ein Antikörper wird mittels Adsorption auf der
Polymer-Membran immobilisiert. Die Polymer-Membran wird
mittels elektrolytischer Polymerisierung von Pyrrol oder
Thiophen in der Elektrolytlösung hergestellt; danach wird
die Membran in eine das Antigen oder den Antikörper
enthaltende Lösung eingetaucht.
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Die JP-A-56 163 447 beschreibt eine mittels eines
dreistufigen Verfahrens hergestellte Enzymelektrode, wobei
ein hauptsächlich aus Graphit bestehende Substrat mit einer
weniger als 1 um dünnen Platinschicht beschichtet wird (1.
Verfahrensschritt). Auf diese Elektrode wird eine Lösung
eines Enzyms (Glucoseoxidase) aufgebracht (2.
Verfahrensschritt). Nach Trocknung wird die Enzymschicht
mittels Reaktion in Glutaraldehyddampf quervernetzt (3.
Verfahrenschritt).
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Die US-A-4 224 125 beschreibt eine Enzymelektrode (Redox-
Elektrode), wobei das Enzym sowie - falls notwendig dessen
Coenzym - in einem Polymer eingebettet sind, das den
Elektronentransfer vermittelt (sog. Redox-Polymer, wie etwa
Hydroxymethyl-Polyacrylamid). Das Einbettungsverfahren wird
durch einfaches Mischen des Polymers mit dem Enzym in
wässeriger Lösung bewirkt. Anschließend wird das Redox-
Polymer mit dem darin eingefangenen Enzym in einen Hohlraum
bei oder nahe bei einem Elektronenkollektor eingebracht.
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Die JP-A-61-61049 beschreibt eine Oxidase-Elektrode, bei
der die Oxidase auf der Oberfläche einer Elektrodenpaste
immobilisiert oder fixiert ist. Die Elektrodenpaste aus
Kohlenstoff wird durch Vermischen eines Kohlenstoffpulvers
mit flüssigem Paraffin gebildet, das hydrophobe Eigenschaft
zeigt.
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Die ältere, jedoch nachveröffentlichte EP-A-0 304 494
beschreibt eine mit einer leitfähigen, feinpartikulären
Schicht versehene Mikrobioelektrode, wobei die Schicht
mittels elektrochemischer oder elektrolytischer Abscheidung
auf einer kleinen Oberfläche des elektrisch leitfähigen
Materials gebildet und die biologisch aktive Substanz in
der leitfähigen, feinpartikulären Schicht mittels Immersion
der Schicht in die die aktive Substanz enthaltende Lösung
eingefangen wird.
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Bei jedem der bekannten Verfahren zur Herstellung eines
Biosensors sind mehrere komplizierte Verfahrensschritte
notwendig, um Immobilisierung zu erreichen. Weiterhin ist
es schwierig einen multifunktionellen Biosensor zu
erzeugen, der mehrere Arten von biologisch aktiven
Substanzen in einem Biosensor inkorporiert.
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Unter Berücksichtigung des vorstehend Gesagten stellt die
vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer
Biomikroelektrode mittels Immobilisierens einer biologisch
aktiven Substanz zur Verfügung, welches den einzigen
Schritt einer Elektro-Abscheidung von feinen Teilchen eines
leitenden Materials aus einem löslichen Vorläufer desselben
gleichzeitig mit der aktiven Substanz auf einem Teil der
Oberfläche eines Elektrodensubstrats umfaßt, wobei das
leitfähige Material auf dem Elektrodensubstrat unter
Bildung einer die darin eingefangene aktive Substanz
inkorporierenden, porösen, leitfähigen Materialschicht oder
leitfähigen, feinpartikulären Schicht gebildet wird.
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Die Erfindung wird in vorteilhafter Weise durch die in den
abhängigen Ansprüchen wiedergegebenen Maßnahmen
fortentwickelt.
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Die vorliegende Erfindung basiert darauf, ein Verfahren zur
Herstellung oder Erzeugung eines Biosensorsystems zur
Verfügung zu stellen, das die Nachteile der bekannten
Biosensoren vermeidet.
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Desweiteren kann die Mikrovorrichtung, welche eine mittels
des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltene Mikroelektrode
verwendet, ein Biosensorsystem mit hoher Auflösung zur
Verfügung stellen, so daß extrem kleine Probenmengen
gemessen werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren
vermag ein Biosensor-Analysesystem zur Verfügung zu
stellen, welches Spurensubstanzen (beispielsweise Glucose)
in Mikroproben in sehr geringer Menge nachzuweisen vermag,
wobei der Strom gemessen wird, welcher bei Anlegen einer
Potentialdifferenz an die Mikroproben erzeugt wird.
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Fernerhin kann das erfindungsgemäße Verfahren ein
analytisches System bzw. Verfahren zur Verfügung stellen,
das unabhängig von der zu messenden Probenmenge ist. Bei
dem mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen
bioanalytischen System kann man Voltammetrie-Techniken
verwenden und die Proben sogar in einem stationären Zustand
messen. Da das bioanalytische Verfahren zum Nachweis aktive
Substanzen verwendet, welche in die Elektrode inkorporiert
sind, kann es auf bedeutende Enzyme wie etwa oxidierende
und dehydrierende Enzyme angewandt werden. Desweiteren kann
das bioanalytische System als Elektrode zur
enzymimmunologischen Analyse verwendet werden.
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Bei der mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen
Biomikroelektrode wird eine biologisch aktive Substanz mit
feinen Teilchen eines elektrisch leitfähigen Materials
vereinigt, so daß eine Oberflächenschicht von feinen
Teilchen eines elektrisch leitfähigen Materials, in welches
die biologisch aktive Substanz inkorporiert ist, erzeugt
wird; die Elektrode mit einer solchen leitfähigen
Oberflächenschicht wird als funktionelle Elektrode
verwendet und mit einer Vorrichtung zum Anlegen einer
Potentialdifferenz und einer zur Messung des erzeugten
Stroms zusammengebaut. Der Wert des gemessenen Stroms
bestimmt die Konzentration der Spurensubstanz.
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Falls bei dem analytischen Verfahren ein vorgegebenes
Potential an die funktionelle Elektrode angelegt wird,
welche durch Vereinigen der biologisch aktiven Substanz mit
der Oberflächenschicht der feinen Teilchen eines elektrisch
leitfähigen Materials auf der Oberfläche der Elektrode
erzeugt wurde, wird elektrischer Strom erzeugt und
gemessen. Demgemäß kann die Konzentration der
Spurensubstanz in der sehr kleinen Probe durch die Messung des
Wertes des erzeugten Stroms bestimmt werden. Dieses
vereinigende Verfahren, die bioaktive Substanz in der
Oberflächenschicht aus feinen Teilchen eines elektrisch
leitfähigen Materials zu inkorporieren, wird mittels des
einzigen Schritts verwirklicht, bei dem die feinen Teilchen
eines elektrischen leitfähigen Materials auf der Oberfläche
eines elektrisch leitfähigen Materials bei gleichzeitiger
Adsorption der bioaktiven Substanz abgeschieden werden. Die
Biomikroelektrode aus dem die biologisch aktive Substanz
inkorporierenden, elektrisch leitfähigen Material kann eine
sehr kleine Größe aufweisen und eine den größeren
Bioelektroden ähnliche Leistung zeigen. Ihre Struktur
beruht auf der Oberflächenschicht von feinen Teilchen des
elektrisch leitfähigen Materials, welche die immobilisierte
biologisch aktive Substanz inkorporieren. Die mittels des
erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltene Biomikroelektrode
kann sowohl als Transducer-Element als auch als Bioreaktor
fungieren, nicht nur als Biomeßelement. Eine solche
Biomikroelektrode kann auch als Mikroelektrode angesehen
werden. In anderen Worten wurde gefunden, daß bei
Verwendung des mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens
erhaltenen Mikroelementes mit der immobilisierten
biologisch aktiven Substanz bei nachfolgender Anwendung
eines gegebenen Potentials ein elektrischer Strom erzeugt
wird, so daß die Konzentration der Spurensubstanz in der
Probe mittels der bestimmten darauf bezogenen Relation der
gemessenen Stromwerte bestimmt werden kann.
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Die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erzeugte
Biomikroelektrode zeigt eine Schicht von feinen Teilchen
eines auf der Oberfläche einer sehr kleinen Platten- oder
Scheibenelektrode (z. B. mit einer Größe von 1 bis 100
Mikrometer) gebildeten elektrisch leitfähigen Materials aus
vorzugsweise Platin o. ä.. Insbesondere kann eine Elektrode
mit einer Oberflächenschicht aus Platinschwarz, das durch
elektrochemische Abscheidung von Platin gebildet wird,
bekanntermaßen eine hohe katalytische Hydrieraktivität
aufweisen, jedoch war bislang das Einbringen oder
Inkorporieren einer biologisch aktiven Substanz in solch
einer Platinschwarzschicht nicht bekannt (wohingegen
Immobilisieren von Enzymen oder ähnlichem in mittels Ätzen
erzeugten Poren einer Platinscheibe und anschließendes
Binden des Enzyms mittels eines quervernetzenden Agens
bekannt war. Desweiteren war es bislang unbekannt, daß man
die Dicke des Platinschwarz wie erfindungsgemäß steuern
kann, so daß die biologisch aktive Substanz darin
inkorporiert und immobilisiert wird. Erst das
erfindungsgemäße Verfahren, die biologisch aktive Substanz
direkt zu immobilisieren, benötigt nicht notwendigerweise
ein chemisches (quervernetzendes) Agens, wie bei Bindung
mittels eines Trägermaterials, sondern erlaubt direktes
Immobilisieren der biologisch aktiven Substanz ohne
irgendeine chemische Behandlung.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung einer
Biomikroelektrode wird eine biologisch aktive Substanz
elektrisch direkt auf dem elektrisch leitfähigen Material
wie etwa Platin abgeschieden und gleichzeitig werden feine
Teilchen eines elektrisch leitfähigen Materials (wie
beispielsweise eines Metalls) zusammen mit der biologisch
aktiven Substanz durch reduzierende Elektrolyse eines
Metallsalzes präzipitiert. In anderen Worten werden feine
Teilchen des leitfähigen Materials auf einer kleinen
Oberfläche von beispielsweise Platin gebildet, wobei die
biologisch aktive Substanz in die Poren zwischen den feinen
Teilchen des leitfähigen Materials inkorporiert wird. Die
Größe der Poren und die Menge der biologisch aktiven
Substanz kann mittels Stromdichte, Elektrolysezeit und
angelegten Potentials gesteuert werden. Die Funktion der
erhaltenen Elektrode mit der immobilisierten biologisch
aktiven Substanz kann für einen langen Zeitraum aufrecht
erhalten werden. Die erzeugte Elektrode kann mit einem
dünnen Film eines polymeren Materials wie etwa Protein oder
Polysaccharid bedeckt und mittels eines vernetzenden Agens
quervernetzt sein, um so die biologische Verwertbarkeit und
die Lebensdauer der Elektrode zu bestimmen und die
Löslichkeit der biologisch aktiven Substanz zu minimieren.
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Im folgenden kann der Ausdruck "biologisch aktive Substanz"
beispielsweise Enzyme, Antikörper sowie verschiedene
Katalysatoren, Mikroorganismen, proliferierte
Mikroorganismen, Organellen, Antikörper, Antigene und Haptene
umfassen. Weiterhin können bei dem erfindungsgemäßen
Verfahren anstelle des Platins elektrisch leitfähige
Materialen wie etwa Gold, Rhodium, Ruthenium-Oxid (RuO&sub3;),
Kohlenstoff, Palladium sowie Indium verwendet werden.
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Soweit nicht anderweitig Probleme auftreten, kann zur
Bildung der Schicht aus feinen Teilchen auf der Oberfläche
des elektrisch leitfähigen Materials ein beliebiges
leitfähiges Material verwendet werden. Das polymere
Material zum zusätzlichen Bedecken der Oberfläche des nach
dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Biosensors
kann Protein wie etwa Albumin und Polysaccharide wie etwa
Heparin umfassen. Als quervernetzendes Agens wird bevorzugt
ein Agens verwendet, das an das verwendete Polymermaterial
angepaßt ist, was etwa für Albumin Glutaraldehyd
beinhaltet; desweiteren sind auch Carbodiimid- und
Maleatimid-Quervernetzungsagenzien umfaßt.
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Als Mediator kann etwa Ferrocen in die feinen Teilchen des
biologisch aktiven Materials inkorporiert werden, wodurch
die Messung eines Zielmaterials sogar in Abwesenheit von
gelöstem Sauerstoff oder bei geringeren Mengen an gelöstem
Sauerstoff, wenn Sauerstoff in der das Zielmaterial
enthaltenden Lösung zur Messung gelöst werden muß,
ermöglicht wird. Desweiteren wird es dadurch möglich, in
signifikanter Weise das Potential zu reduzieren bei dem der
Sensor notwendigerweise arbeitet.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Immobilisierung der
biologisch aktiven Substanz handelt es sich um eine extrem
bedeutsame Technologie zur Fortentwicklung der
klinischchemischen Analyse wie zur Entwicklung eines tragbaren
Gesundheitsuntersuchungssystems, welches vielerlei
Nachweisfunktionen benötigt. In jüngster Zeit wurden
verschiedene Vielfachsensoren unter Verwendung von ICs
vorgeschlagen und das erfindungsgemäße Verfahren zur
Immobilisierung eines Enzyms und ähnlichem ist in dieser
Hinsicht ebenfalls von Bedeutung. Auch ist es
offensichtlich, daß die mittels des erfindungsgemäßen
Verfahrens erhaltene Biomikroelektrode, z . B. eine
Enzymelektrode, ein hochempfindliches und schnelles
Ansprechvermögen zeigt.
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Die Struktur der die immobilisierte biologisch aktive
Substanz inkorporierenden, elektrisch leitfähigen
Materialschicht wird in Fig. 1A, B gezeigt. Die feinen
Teilchen der biologisch aktiven Substanz sind wie gezeigt
homogen in den leitfähigen feinen Teilchen inkorporiert,
d. h. Enzyme u.ä. sind in der Elektrode von kleiner Größe
durch elektrolytisches Abscheiden der sehr feinen Teilchen
des leitfähigen Materials inkorporiert, wodurch die
Elektrode mit der immobilisierten biologisch aktiven
Substanz gebildet wird.
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Erfindungsgemäß wird die biologisch aktive Substanz in
hoher Dichte in dem leitfähigen Material immobilisiert, so
daß eine hochsensitive Elektrode zur Verwendung als
Biosensor zur Verfügung gestellt wird. Beispielsweise weist
die Elektrode mit einem in einer Platinschwarz-
Oberflächenschicht einer Platinelektrode immobilisierten
Enzym o. ä. eine hohe Empfindlichkeit auf, wenn sie als
Biosensor zur Messung mittels Amperometrie verwendet wird.
Deshalb kann bei Verwendung des erfindungsgemäßen
Verfahrens zum Immobilisieren einer biologisch aktiven
Substanz ein Biosensor unter Verwendung von Mikroelektroden
erzeugt werden.
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Die Größe der feinen Teilchen der biologisch aktiven
Substanz oder die Größe der Poren kann mittels Veränderung
der Herstellungsbedingungen oder durch Steuern des
reduzierenden Stroms, der Reduzierungsdauer oder des
Reduktionspotentials oder - falls Platinschwarz oder
Goldschwarz gebildet wird - durch Steuern der
Bleiacetatkonzentration in der Elektrolysierlösung verändert werden.
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Als Material für die Elektrode kommen Gold oder andere
Edelmetalle, Kohlenstoff wie etwa glasartiger Kohlenstoff
oder Kohlenstoff in Form ,von Graphit wie auch Platin als
Substrat in Frage. Anschließend wird in Form einer Schicht
ein feinpartikuläres Material wie etwa Platinschwarz,
Goldschwarz, Feinteilchen eines Edelmetalls oder
Feinteilchen eines leitfähigen Metalloxids zusammen mit der
biologisch aktiven Substanz gebildet.
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Durch Verwendung der Bildung von Platinschwarz und der
elektrochemischen Adsorption des Enzyms auf demselben wird
ein Biosensorsystem erhalten, so daß eine sehr kleine und
wirksame Enzymelektrode (Biomikroelektrode) erzeugt wird,
die von dem sehr schnellen Ansprechverhalten und einer
hohen Sensitivität Gebrauch macht.
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Die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellte,
eine Biofunktion aufweisende Biomikroelektrode weist in
ihrer Struktur eine Oberflächenschicht von feinen Teilchen
eines elektrisch leitfähigen Materials wie etwa Platin auf,
welches die biologisch aktive Substanz wie etwa ein Enzym
einschließt. Die Verwendung von Platinschwarz als einem
Trägermaterial für die biologisch aktive Substanz war
bislang nicht bekannt, wohingegen es bekannt war, eine
Platinplatte durch Ätzen mit Poren zu versehen, in welche
das Enzym oder ähnliches eingebracht und mit einem
vernetzenden Agens an der Oberfläche vernetzt wird.
Weiterhin war es bislang unbekannt, daß man die Größe von
feinen Teilchen von Platinschwarz so einstellen kann, daß
die biologisch aktive Substanz dahinein inkorporiert wird.
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Beim Erzeugen der Mikroelektrode wird erfindungsgemäß die
biologisch aktive Substanz direkt immobilisiert, wobei es
sich nicht um das bekannte Trägermaterial-Bindungsverfahren
handelt, welches ein chemisches Agens (Vernetzungsagens)
benötigt, vielmehr kann erfindungsgemäß direktes Fixieren
der biologisch aktiven Substanz ohne jede chemische
Behandlung erfolgen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der
Mikroelektrode besteht aus den Schritten, die biologisch
aktive Substanz direkt auf dem leitfähigen Material wie
etwa der Schnittfläche eines Platindrahts unter
gleichzeitiger Reduktion eines Metallsalzes (Elektrolyse)
abzuscheiden, so daß feine leitfähige Teilchen (z. B. aus
einem Metall), welche die biologisch aktive Substanz
inkorporieren, abgeschieden werden. Beispielsweise werden
feine Platinteilchen auf einem Teil der Oberfläche einer
Platinelektrode gebildet und die biologisch aktive Substanz
gleichzeitig in den kleinen Poren der feinen Teilchen
inkorporiert, um die Biomikroelektrode zu erzeugen. Die
Porengröße und die Menge an immobilisierter biologisch
aktiver Substanz kann durch Regelung von Stromdichte,
Elektrolyse, Dauer und gegebenem Potential geregelt werden.
Die Funktion der Elektrode mit der immobilisierten
biologisch aktiven Substanz kann für einen langen Zeitraum
ohne weitere chemische Behandlung aufrecht erhalten werden.
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Dementsprechend hängt die Größe der Mikroelektrode von dem
Durchmesser des verwendeten Platindrahts ab; falls ein sehr
dünner Draht verwendet wird, ist die Bioelektrode
wesentlich kleiner als im Stand der Technik bekannt.
Dementsprechend kann eine Bioelektrode mit einer Größe im
Bereich von Mikrometern leicht hergestellt werden und in
bequemer Weise für medizinische Anwendungen, wie
beispielsweise Anwendungen am lebenden Organismus verwendet
werden. Bei Verwendung für analytische Zwecke kann eine
Vorrichtung mit einer sehr kleinen Probenzelle hergestellt
werden, wodurch die Analyse von nur in Spurenmengen
vorhandenen Proben ermöglicht wird, wobei gleichzeitig eine
hohe Meßgeschwindigkeit und ein hohes Ansprechverhalten
erzielt wird. Falls eine größere Elektrode erzeugt wird,
kann die analytische Vorrichtung mit einem höheren
Nachweissignal betrieben werden
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Das bei der Herstellung der Mikroelektrode als Substrat
oder Träger verwendete leitfähige Material muß nicht
notwendigerweise identisch sein mit dem leitfähigen
Material, das feinteilig (poröses Material) abgeschieden
werden soll. Beispielsweise kann eine Struktur verwendet
werden, bei dem auf der Oberfläche von Graphit
Platinschwarz abgeschieden wird. Zur Bildung des porösen
leitfähigen Materials kann anstelle von Platin auch ein
"elektrisch leitfähiges Material" wie etwa Gold und Rhodium
und überhaupt jegliches Material verwendet werden, das
imstande ist, eine leitfähige, feinpartikuläre Schicht auf
der leitfähigen Oberfläche zu bilden, so weit sich nicht
andere Schwierigkeiten ergeben.
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Die im wesentlichen aus Platinschwarz bestehende Elektrode
kann in verschiedenerlei Form wie etwa in Form einer
Scheibe, in Kugelform oder in tubulärer Form vorliegen.
Deshalb kann sie jegliche an Messungen mittels eines
Biosensors oder an andere Bedingungen geknüpfte
Anforderungen erfüllen und kann auch als Bioreaktor
verwendet werden.
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Die erfindungsgemäß erhaltene Bioelektrode kann mit einem
polymeren Material wie etwa Protein und Polysaccharid zur
Beschichtung bedeckt sein und anschließend mit der
Deckschicht mittels eines quervernetzenden Agens vernetzt
werden, wodurch eine Anpassung an biologische
Verhältnisse, eine längere Lebensdauer erzielt und die
Loslösung der biologisch aktiven Substanz minimiert wird.
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Der Ausdruck "biologisch aktive Substanz" beinhaltet
beispielsweise Enzyme und Antikörper sowie verschiedene
Katalysatoren, Mikroorganismen, proliferierte
Mikroorganismen, Organelle, Antigene und Haptene.
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Weiterhin kann als Mediator etwa Ferrocen in die feinen
Teilchen der biologisch aktiven Substanz inkorporiert
werden, so daß auch Messung einer Zielsubstanz in
Abwesenheit von gelöstem Sauerstoff oder in Anwesenheit von
wenig Sauerstoff möglich wird, wodurch in signifikanter
Weise das Arbeitspotential des Sensors verringert wird.
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Das Abscheidungsverfahren von feinen Teilchen eines
leitfähigen Materials zur Herstellung der Biomikroelektrode
kann auch ohne die Verwendung der Elektrolyse erfolgen,
wohingegen das vorstehend erwähnte Fertigstellungsverfahren
mittels elektrolytischer Abscheidung durchgeführt wird.
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Die Mikroenzymelektrode wird elektrochemisch behandelt oder
anodisiert, wodurch die Selektivität der Messung verbessert
wird.
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Beim analytischen Verfahren erfolgt die Messung mittels
eines miniaturisierten Biosensorsystems mit hoher
Geschwindigkeit und hoher Sensitivität. Dabei handelt es
sich um eine extrem bedeutende Technik zur Fortentwicklung
der klinischen Analyse oder zur Entwicklung eines tragbaren
Gesundheitsuntersuchungssystems, das Miniaturisieren des
Biosensors und Vielfachdetektorfunktionen erfordert.
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Fig. 5 zeigt eine Mikrovorrichtung (16), welche eine
Mikroelektrode (11) mit einem Durchmesser von etwa 1
Mikrometer bis 500 Mikrometern als funktionelle Elektrode,
eine Gegenelektrode (12) aus Platindraht und eine
Referenzelektrode (13) aus Silber/Silberchlorid umfaßt,
wobei die drei Elektroden in dem Harz (15), welches sich in
einem Loch eines PTFE (Polytetrafluoroethylen) - Harzes
(14) befindet, befestigt sind. Da diese Mikrovorrichtung
(16) lediglich drei darin eingebaute Metalldrähte umfaßt,
kann sie in der Größe sehr klein sein.
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Falls eine derartige Mikrovorrichtung verwendet wird, so
gestattet sie, eine mengenmäßig sehr kleine Probe zu
messen, z. B. eine Lösung von lediglich einem Volumen von 1
ul. Nach Titrieren der sehr kleinen Probenmenge wird ein
Potential angelegt und der dabei erzeugte Strom gemessen,
wodurch die Menge an Zielmaterial in der Probe bestimmt
wird.
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Dementsprechend kann das in der Elektrode mittels der
biologisch aktiven Substanz wie einer Enzymmolekül erzeugte
aktive Material direkt in Echtzeit gemessen werden.
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Verschiedene voltammetrische Nachweisverfahren können bei
der vorstehend beschriebenen Elektrode angewendet werden,
wobei die Probe sogar ohne Rühren der Probenflüssigkeit
gemessen werden kann.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zum Immobilisieren der
biologisch aktiven Substanz stellt eine Biomikroelektrode
zur Verfügung, die zum einen ein gutes Ansprechverhalten
und hohe Nachweisempfindlichkeit sowie zweitens das
vollständige Inkorporieren der biologisch aktiven Substanz
wie etwa eines Enzyms ohne Beschädigung derselben durch
leichte und direkte Immobilisierung gewährleistet. Drittens
wird dabei eine hohe Dichte der auf der Oberfläche der
Mikroelektrode immobilisierten aktiven Substanz erzielt,
wodurch eine schnelle Antwort erhalten wird; viertens ist
leichtes und schnelles Immobilisieren der aktiven Substanz
wie etwa eines Enzyms ohne chemische Behandlung auf der
kleinen Oberfläche der Elektrode möglich und fünftens wird
ein multifunktioneller Enzymsensor mit einer kleinen
Oberfläche erhalten, in dem verschiedene Enzyme
immobilisiert oder aufgebracht sind. Dabei vermag das
Elektrodenelement schnell und empfindlich zu messen, da es trotz der
scheinbar kleinen Oberfläche eine sehr große Oberfläche
von dem mehrtausendfachen der augenscheinlichen Oberfläche
der Elektrode aufweist, was durch Abscheidung der feinen
Teilchen auf der Oberfläche der Elektrode erzeugt wird, so
daß die Sensitivität das Elements anwächst.
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Das mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltene
analytische System kann zum einen ein Hochleistungs-
Biosensorsystem mit einem sehr schnellen Ansprechvermögen
und hoher Sensitivität zur Verfügung stellen, das es
erlaubt, eine Probe ohne Rühren der Probenflüssigkeit zu
messen; zweitens vermag es die zu messende Probenmenge zu
reduzieren, da die Mikroenzymelektrode (d. h. die
Biomikroelektrode), die Gegenelektrode und die Referenzelektrode
auf einer sehr kleinen Oberfläche eingebaut sind. Drittens
vermag es direkt durch die Enzymmoleküle innerhalb der
Elektrode erzeugtes, aktives Material in Realzeit zu
messen. Viertens können verschiedene voltammetrische
Verfahren verwendet werden, so daß auch ein Nachweis mit
ausreichender Sensitivität sogar ohne Rühren der
Probenflüssigkeit möglich ist. Fünftens werden aktive Substanzen
in der Elektrode sowie wichtige Enzyme oder biologisch
aktive Substanzen wie etwa oxidierende Enzyme oder
dehydrierende Enzyme verwendet. Sechstens kann ein in
Lebewesen verwendetes Biosensorsystem oder ein tragbarer
Biosensor zur Verfügung gestellt werden.
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Die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellte
Biomikroelektrode zeigt eine sehr große Oberfläche von dem
mehrtausendfachen der augenscheinlichen Oberfläche der
Elektrode, so daß sie wie eine Makroelektrode wirkt,
wodurch die Nachweissensitivität erhöht wird. Die
Biosensorelektrode zeigt eine Schicht von feinen Teilchen
und die aktiven Substanzen können sehr tief in die
Elektrode eindringen und dort immobilisiert werden, wodurch
ein schnelles Ansprechvermögen ermöglicht wird. Bei dem
erfindungsgemäßen Verfahren zur Immobilisierung der aktiven
Substanzen wird dieselbe direkt immobilisiert oder in
Zwischenräumen zwischen den feinen Teilchen des elektrisch
leitfähigen Materials fixiert, wodurch die Herstellung
leicht gemacht wird.
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Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die
Zeichnung erläutert:
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Es zeigen:
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Fig. 1A einen schematischen Schnitt durch die Struktur
der mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens zur
Immobilisierung der biologisch aktiven Substanz hergestellten
Biomikroelektrode. Fig. 1B zeigt schematisch einen vergrößerten
Schnitt der in Fig. 1A eingekreisten Stelle
(gestrichelte Linie), wodurch Details der Struktur des
feinpartikulären leitfähigen Materials mit der darin
imprägnierten biologisch aktiven Substanz gezeigt werden
sollen.
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Fig. 2 ist eine schematische Darstellung des Verfahrens zur
Bestimmung der Glucosekonzentration und der Verwendung der
Biomikroelektrode im batch-System.
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Fig. 3 ist eine graphische Darstellung des
Ansprechverhaltens des Biosensorsystems bei Messung wie in Fig. 2
dargestellt.
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Fig. 4 zeigt in graphischer Darstellung die Beziehung
zwischen dem Antwortsignal des Sensors und der
Glucosekonzentration, wobei zur Messung das Biosensorelement im
System gemäß Fig. 2 verwendet wurde.
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Fig. 5 ist eine schematisch perspektivische Darstellung der
Mikrovorrichtung mit einem Drei-Elektrodensystem (zur
Messung mittels Pulsverfahrens), wobei die
Biomikroelektrode gemäß Fig. 1A und 1B verwendet wurde.
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Fig. 6 zeigt in graphischer Darstellung den bei Anlegen
eines konstant gepulsten Potentiales an die
Mikrovorrichtung gemäß Fig. 5 erhaltenen Strom.
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Fig. 7 zeigt in graphischer Darstellung die Beziehung
zwischen dem erhaltenen Wert für den Strom und der
Glucosekonzentration, gemessen mittels des Biosensorelements gemäß
Fig. 5.
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Fig. 8 zeigt in graphischer Darstellung die Beziehung
zwischen dem Volumen der Glucoseprobe und dem "peak"-Wert
(Meßwertspitze) des Stroms, gemessen mittels des
analytischen Systems im Pulsverfahren nach Fig. 5.
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Fig. 9 zeigt eine detaillierte graphische Darstellung des
auf ein angelegtes Pulspotential hin erhaltenen
Stromsignals gemäß Fig. 6.
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Fig. 10 ist die zeichnerische Darstellung der Beziehung
zwischen Glucosekonzentration und dem zwei Millisekunden
nach Anlegen des gepulsten Potentials gemäß Fig. 9
erhaltenen Wert für die Differenz zwischen dem
Antwortsignal und dem Leerwert.
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Fig. 11 ist eine graphische Darstellung der Beziehung
zwischen der Menge an Glucoseprobe und der zwei
Millisekunden nach Anlegen des gepulsten Potentials gemäß Fig. 9
erhaltenen Differenz zwischen dem Wert des erhaltenen
Stromsignals und demjenigen des Leerwerts.
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Fig. 12 ist eine schematische Darstellung des unter
Verwendung der mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens
hergestellten Biomikroelektrode dem Nachweis dienenden
Teils der Durchflußinjektions-Analysevorrichtung.
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Fig. 13 zeigt die unter Verwendung der vorstehend genannten
Durchflußinjektions-Analysevorrichtung erhaltene
Ergebnisse, wenn eine Glucose enthaltende Probe gemessen wird.
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Fig. 14 ist eine graphische Darstellung der Beziehung
zwischen der Glucosekonzentration und dem Antwortsignal,
wie es bei Verwendung der
Durchflußinjektions-Analysevorrichtung erhalten wird.
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Fig. 15 zeigt in Form einer graphischen Darstellung die
Verbesserung in der Selektivität der nachzuweisenden
Spurensubstanzen, wie sie unter Verwendung einer oxidativ
behandelten Biomikroelektrode gemessen wird.
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Fig. 16 zeigt in graphischer Darstellung die Selektivität
für die zu messenden Spurensubstanzen, wie sie bei
Verwendung einer nicht oxidativ behandelten
Biomikroelektrode gemessen wird.
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Die Struktur der Biomikroelektrode, wie sie durch das
erfindungsgemäße Verfahren zur Immobilisierung der
biologisch aktiven Substanz erzeugt wird, ist in den Fig. 1A
und 1B in Schnittansicht bzw. als Vergrößerung gezeigt.
Es wird eine Mikroelektrode zur Verfügung gestellt, welche
feine Teilchen (4) eines elektrisch leitfähigen Materials
(4), feine Teilchen (5) der biologisch aktiven Substanz und
das elektrisch leitfähige Substrat (7) aufweist.
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Fig. 5 zeigt die Mikrovorrichtung (16), welche eine Enzym
(Glucoseoxidase) - Mikroelektrode (11) mit einem
Durchmesser von etwa 1 Mikrometer bis 500 Mikrometer als
funktionelle Elektrode und eine Gegenelektrode (12) aus
einem Platindraht sowie eine Referenz- oder Bezugselektrode
(13) aus Silber/Silberchlorid aufweist. Diese drei
Elektroden, d. h. Mikroelektrode (11), Gegenelektrode (12) und
Bezugselektrode (13) sind im Harz (15) fixiert, das in ein
Loch des PFTE (Polytetrafluoretyhlen) - Harzes (14)
eingebracht und befestigt ist. Eine derartige Mikrovorrichtung
(16) zeigt eine lediglich aus drei fixierten Metalldrähten
bestehende Struktur und kann deshalb eine sehr kleine Größe
aufweisen.
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Deshalb ist mit der Mikroelektrode ein Nachweis in einer
sehr kleinen Probenmenge, beispielsweise in einer Menge von
einem Mikroliter möglich. Nachdem die sehr kleine
Probenmenge eingebracht ist, wird ein Potential angelegt und der
daraufhin erzeugte Stromwert wird gemessen, wodurch die
Menge der zu bestimmenden Spurensubstanz in der Probe
bestimmt wird.
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Entsprechend kann die Vorrichtung direkt die in der
Elektrode mittels der biologisch aktiven Substanz,
beispielsweise mittels eines in der Mikroelektrode
enthaltenen Enzyms erzeugte aktive Substanz nachgewiesen
werden. Fernerhin können bei der Elektrode verschiedene
Arten von voltammetrischen Nachweisverfahren durchgeführt
werden. So kann auch die Probe untersucht werden, ohne daß
Rühren der Probenflüssigkeit erforderlich ist.
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Da die Elektrode zum Nachweis von aktiven Substanzen dient,
können zur Bioanalyse wichtige aktive Substanzen, wie etwa
oxidierende oder dehydrierende Enzyme verwendet werden.
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Fig. 12 zeigt in Schnittansicht die bei Verwendung des
Durchflußinjektionsverfahrens verwendete analytische
Vorrichtung. Die Flüssigkeit (21), die die nachzuweisende
Spurensubstanz enthält, wird durch den Einlaß (22)
zugeführt, strömt anschließend durch einen Durchfluß mit
der Mikroelektrode (23) sowie durch einen Durchfluß ,mit der
Bezugselektrode (26) und der Gegenelektrode (27), wodurch
die in der Probenflüssigkeit (21) enthaltene Substanz
nachgewiesen wird. Die Biomikroelektrode zeigt in Form
einer einheitlichen Struktur die biologisch aktive Substanz
und Platinschwarz auf der Oberfläche des Platindrahts,
wodurch die Vorrichtung in einer sehr kleinen Größe,
beispielsweise in einer Größe im Bereich von Mikrometern,
hergestellt werden kann. Dementsprechend kann auch die
Durchflußzelle wie in der Abbildung dargestellt in sehr
kleiner Größe hergestellt werden.
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Dadurch, daß das Biosensorsystem sogar für den Nachweis von
sehr kleinen Mengen in kleinen Probenvolumina
miniaturisiert werden kann, kann eine auf der Elektrode
immobilisierte biologisch aktive Substanz, beispielsweise
eine Enzymelektrode verwendet werden. Fernerhin kann man
bei kontinuierlichen Messungen mehrere hundert Proben je
Minute untersuchen.
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Das unter Verwendung der mittels des erfindungsgemäßen
Verfahrens hergestellten Biomikroelektrode erhaltene
bioanalytische System kann auch für potentiometrische
Messungen verwendet werden.
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Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme
auf die bevorzugten Ausführungsformen in Form von
Beispielen näher erläutert:
Beispiel 1
Herstellung einer Elektrode mit einer immobilisierten
biologisch aktiven Substanz sowie deren Meßeigenschaften
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In Gegenwart von Glucoseoxidase wird Glucose in Gluconsäure
und Wasserstoffperoxid umgewandelt. Deren Konzentration
kann durch Messung des der Glucosekonzentration
entsprechenden, auf der Oxidation von Wasserstoffperoxid
beruhenden Stroms und unter Verwendung einer ein Enzym
enthaltenden Platinelektrode bestimmt werden.
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Zunächst wird die Herstellung der Elektrode mit dem darauf
fixierten Enzym dargestellt und anschließend der Test zur
Messung der Glucosekonzentration unter Verwendung der
erhaltenen Elektrode näher ausgeführt.
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Ein Platindraht mit einem Durchmesser von 100 Mikrometern
wurde an einem Sodaglas-Röhrchen fixiert und an seinem Ende
mittels Aluminiumoxidpulver poliert.
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Die Immobilisierung des Enzyms erfolgt mittels der
nachfolgend beschriebenen zwei verschiedenen
Verfahrensvarianten:
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(A) Eine Elektrolyse wurde in einer Lösung von
Natriumsulfat (0,2 M; PH = 3,2) mit einem Gehalt an
Hexachlorplatinat (1 mg/ml) und Glucoseoxidase (1 mg/ml)
unter Verwendung einer Silber/Silberchlorid-Elektrode als
Bezugselektrode und des vorbereiteten Platindrahts als
funktionelle Elektrode unter Anlegen eines konstanten
Potentials von -0,2 V zehn Minuten lang durchgeführt,
wodurch ein das Enzym inkorporierender Niederschlag von
Platinschwarz gebildet wurde.
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(B) In 1 ml einer Lösung von Natriumsulfat (pH = 3,5) mit
einem Gehalt an Hexachlorplatinat (33 mg), Bleiacetat (0,6
mg) sowie Glucoseoxidase (10 mg) wurde mittels Anlegen
eines konstanten Stroms von -5 uA zehn Minuten lang eine
Elektrolyse durchgeführt, wodurch ein das Enzym
inkorporierender Niederschlag von Platinschwarz gebildet
wurde.
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Die erhaltene Elektrode wurde danach in 0,1 M
Phosphorsäure-Pufferlösung gewaschen und anschließend in
Bezug auf die Messung von Glucosekonzentrationen
untersucht, wie nachfolgend beschrieben:
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Die Elektrode wird einfach in einem Schritt hergestellt und
kann im Batch-System mit stabilem und schnellem
Ansprechverhalten verwendet werden. Die Struktur der auf
der Oberfläche der Elektrode abgeschiedenen Schicht ist in
Fig. 1B in Schnittansicht gezeigt und stellt den
Sensorteil dar.
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Bei der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen
Herstellung der Elektrode wurde positiv geladene
Glucoseoxidase (mit einem isoelektrischen Punkt von 4,2)
auf der Oberfläche der Elektrode unter Bildung von
elektolysiertem Platin abgeschieden; als Ergebnis wurde das
Enzym in den Poren der feinen Teilchen von Platinschwarz
immobilisiert.
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Die Vorrichtung gemäß Fig. 2 zeigt eine Bezugselektrode
(1), eine Gegenelektrode (2), eine funktionelle Elektrode
(3), feine Teilchen (4) eines elektrisch leitfähigen
Materials, eine biologisch aktive Substanz (5) sowie das
leitfähige Substrat (7).
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Das Enzym kann mit jedem der vorstehend erwähnten beiden
Verfahren zur Erzeugung der Elektrode immobilisiert werden.
Die festgelegte Menge an Enzym kann man eher mittels des
Verfahrens A einstellen, so daß eine einheitliche Schicht
aus feinen Teilchen von Platinschwarz mit darin
inkorporiertem Enzym gebildet wird, da das positiv geladene
Enzym im Bereich eines negativen Potentiales abgeschieden
wird und das Platinschwarz bei einem konstanten Potential
wachsen gelassen werden kann. Dagegen ändert sich bei dem
Verfahren B, bei dem man den Niederschlag durch Anlegen
eines konstanten Stroms bildet, das Potential, wodurch sich
die Stromdichte bei Abscheidung der Platinschwarzschicht
langsam ändert. Somit ist die dabei benötigte Zeit zur
Herstellung verlängert und es ist schwierig, einen
homogenen Niederschlag zu erzeugen.
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Mit der Biomikroelektrode wurde ein Test mit dem Ziel
durchgeführt, in einer Phosphorsäure-Pufferlösung mittels
einer Meßvorrichtung im Batch-Verfahren gemäß Fig. 2 das
Ansprechverhalten zu bewerten. Dabei repräsentiert das
Bezugszeichen (1) die Bezugs- bzw. Standard-Elektrode, (2)
die Gegenelektrode, (3) die funktionelle Elektrode, wobei
es sich um die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
hergestellte Platinschwarz-Elektrode mit darin fixierter
Glucoseoxidase handelt. Jede dieser Elektroden wurde wie in
den Zeichnungen gezeigt mit jeder Elektrode der
potentiometrischen Vorrichtung verbunden. Unter Anlegen
einer Spannung von 0,6 V an die funktionelle Elektrode (3)
relativ zu der Bezugselektrode (1) wurde Glucose unter
Rühren der Lösung hinzugefügt und der zwischen der
Gegenelektrode und der funktionellen Elektrode erzeugte
Oxidationsstrom in Abhängigkeit von dem erzeugten
Wasserstoffperoxid gemessen.
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Das von dem Sensor gemäß der vorliegenden Erfindung
erzeugte Signal war assoziiert mit der Zugabe von Glucose
zu der Lösung, womit gemeint ist, daß - wie in Fig. 3
gezeigt - sehr schnell ein Signal erhalten wird, wenn sich
der Oxidationsstrom durch erzeugtes Wasserstoffperoxid
ändert. Es wurde gefunden, daß die Antwort innerhalb von
drei Sekunden auf die Rate von 100% steigt. Die Antwort
des Sensors erfolgte sehr schnell und erreichte schnell
diesen konstanten Wert. Das erzielte Ergebnis ist in Fig. 4
gezeigt, wobei die Beziehung zwischen Glucosekonzentration
und dem Signal des Sensors gezeigt ist. Es ist
offensichtlich, daß der Biosensor sogar eine Konzentration
von 0,1 mg/dl messen kann sowie daß eine Linearität
zwischen dem gemessenen Wert und der Konzentration im zu
messenden Bereich von 0,1 mg/dl bis 100 mg/dl besteht.
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Durch erfindungsgemäßes Immobilisieren der biologisch
aktiven Substanz zeigt der Biosensor ein schnelles
Ansprechverhalten und hohe Sensitivität und kann auch
leicht und schnell hergestellt werden.
Beispiel 2
Analytische Vorrichtung bzw. Verfahren unter Verwendung der
erfindungsgemäß hergestellten Biomikroelektrode
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Ein feiner Platindraht von 100 Mikrometern Durchmesser, ein
Platindraht von 200 Mikrometern Durchmesser für die
Gegenelektrode und ein Silberdraht von 500 Mikrometern
Durchmesser wurden mittels des Harzes (14) fixiert und
anschließend erfolgte unter Verwendung von
Aluminiumoxidpulver das Polieren des feinen Platindrahts.
Auf der solcherart polierten Oberfläche wurde das Enzym wie
nachstehend beschrieben immobilisiert:
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Der polierte Draht wurde in eine Lösung (1 ml; pH = 3,5)
mit 33 mg Hexachlorplatinat, 0,6 mg Bleiacetat und 10 mg
Glucoseoxidase eingetaucht und anschließend wurde unter
Anlegen eines konstanten Potentials von -0,2 V oder eines
konstanten Stroms von -0,5 uA eine zehnminütige
Elektrolyse durchgeführt, wodurch ein Niederschlag von in
Platinschwarz immobilisierter Glucoseoxidase erzeugt wurde.
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Die in Fig. 5 gezeigte Mikrovorrichtung (16) verwendet wie
vorstehend erwähnt einen Silberdraht als
Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode und wird in 0,1 M
Phosphorsäure-Pufferlösung über Nacht gewaschen, was zu
einer Drei-Elektroden-Mikrovorrichtung führt. Fig. 5 zeigt
eine funktionelle Elektrode (Mikroelektrode) (11), eine
Gegenelektrode (12), eine Bezugselektrode (13), das Harz
(15), aus PTFE (Polytetrafluorethylen) (14) und die
Mikrovorrichtung (16).
Messung der Glucosekonzentration unter Verwendung der
Elektrode mit dem immobilisierten Enzym
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20 ul einer Glucoseprobe wurden in die Mikrovorrichtungen
des Dreielektrodensystems gemäß Fig. 5 eingebracht und ein
Potential von 0,6 V angelegt. Mehrere Proben mit
verschiedener Glucosekonzentration wurden in die
Vorrichtung unter Anlegen des Potentiales von 0,6 V
eingetropft. Die maximalen Werte für den erhaltenen Strom
wurden gemessen und die Beziehung zwischen diesen
gemessenen Werten und den Glucosekonzentrationen
untersucht. Das Ergebnis ist in Fig. 6 gezeigt.
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Falls man ein Potential von 0,6 V anlegt wird der in Fig. 6
gezeigte Strom erzeugt. Wenn die Probe keinerlei Glucose
enthält, wird ein Strom wie im linken Teil der Fig. 6
gezeigt erzeugt. Falls es sich bei der Probe um eine
Phosphorsäure-Pufferlösung (50 mM, pH = 7, 0,05 mM NaCl)
mit 10 mM Glucose handelt, zeigt sich ein Signalstrom wie
im rechten Teil der Fig. 6 gezeigt.
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Aus dieser Fig. 6 ergibt sich, daß der Antwort- oder
Signalstrom unmittelbar nach Anlegen des Potentials erzeugt
wird und sich anschließend schnell verringert. Dies
unterstützt die Annahme, daß das mittels des Glucose
oxidierenden Enzyms erzeugte Wasserstoffperoxid direkt und
sofort oxidiert wird, wenn das Potential angelegt wird.
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Falls man das Potential mehrfach anlegt, verbleibt der
minimale Wert des Antwortstroms konstant nach Anlegen von
mehreren Zeitzyklen.
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Falls das Potential in einer Phosphorsäure-Pufferlösung
angelegt wird, wird ein ähnliches Ergebnis in ähnlicher
Weise erhalten. Der Wert für die maximale Stromantwort,
sog. "Peak"-Wert wurde an Proben mit gegebener
Glucosekonzentration im Vergleich zu dem maximalen
Antwortstrom gemessen, der in einer Lösung ohne Glucose
(sog. Leerwert) erhalten wurde. Die Differenz dieser beiden
maximalen Werte für den Antwortstrom mit und ohne Glucose
in der Lösung wurden berechnet. Die Beziehung dieser
Differenzwerte zur gegebenen Glucosekonzentration wurde
untersucht. Das Ergebnis ist in Fig. 7 gezeigt, wobei das
Volumen (V) der Probelösung 20 ul und die Größe (d) der
Elektrode 50 um beträgt. Wenn sich die Glucosekonzentration
im Bereich von 1 mM bis 100 mM ändert, wird die in Fig. 7
gezeigt Kurve gemessen, welche die Beziehung zu dem
maximalen Wert des Antwortstroms zeigt.
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Folglich kann man mit dem Enzym-Analysesystem die
Konzentration von Spurensubstanzen in Echtzeit sogar in
einer sehr kleinen Probenmenge ohne Rühren messen.
Untersuchung der Abhängigkeit von der Probenmenge
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2, 5, 10, 15 bzw. 20 ul einer Glucosestandardprobe mit 10
mM Glucose wurden für jeden Test in den Biomikrosensor
eingetropft und jeweils der bei Anlegen eines Potentials von
0,6 V erzeugte Strom gemessen. Das Ergebnis ist in Fig. 8
gezeigt, wobei die vorstehend erläuterten Abkürzungen
verwendet wurden. Es wurde gefunden, daß der maximale
Antwortstrom unabhängig von der Probenmenge ist.
Selektive Konzentrationsbestimmung durch Messung der
transienten Antwort mittels Pulsvoltammetrie
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Das Anfangsstadium der Antwort des Sensors wurde mittels
eines Momentanspeichers aufgezeichnet, um bei Anlegen eines
Potentiales von 0,6 V an die Enzymelektrode eine
detaillierte Messung des im rechten Teil der Fig. 6
gezeigten Pulses zu ermöglichen. Das Ergebnis ist in Fig. 9
gezeigt. Es zeigt sich ein signifikanter Unterschied
zwischen der anfänglichen Antwort in der glucosehaltigen
Pufferlösung und derjenigen in der Probe mit dem Leerwert
(Phosphorsäurepuffer) sowie einer fructosehaltigen
Phosphorsäure-Pufferlöung. Deshalb wurde, wie in Fig. 10
gezeigt, die Differenz in der Stromantwort 2 Millisekunden
nach Anlegen des Potentials an glucosehaltige Probe bzw.
Leerwert zu der Konzentration an Glucose in Bezug gesetzt
und graphisch aufgetragen. Eine lineare Beziehung in
Abhängigkeit von der Glucosekonzentration wurde im Bereich
zwischen 1 mM und 100 mM gefunden.
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Desweiteren wurde die Beziehung zwischen dem Sensorsignal
und der Probenmenge gemessen, wobei die
Glucosekonzentration konstant gehalten wurde. Das gemessene
Ergebnis ist in Fig. 11 gezeigt. Hier wird bestätigt, daß
das Sensorsignal nicht von der Probenmenge (ul) abhängt.
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Somit wurde gezeigt, daß das mittels des erfindungsgemäßen
Verfahrens erhaltene analytische System Information über
die gesamte Probe im stationären Zustand liefert, wobei nur
ein Teil der Probe einer Messung unterzogen wird.
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Weiterhin bedarf das analytische System nicht der
Durchführung eines Rührvorgangs und kann deshalb als
Biosensorsystems innerhalb von Lebewesen oder als tragbarer
Biosensor verwendet werden. Das bioanalytische System kann
in einen Gegenstrombehälter oder nach Art des Batch-
Verfahrens, aber auch in einem stationären Behälter
verwendet werden und vermag schnell und hochsensitiv
Hochgeschwindigkeitsergebnisse zu liefern.
Beispiel 3
Durchflußinjektions-Analysevorrichtung bzw. Verfahren unter
Verwendung der Mikroelektrode
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Zunächst wird die Endoberfläche eines dünnen Platindrahts
von 100 um Durchmesser mittels Aluminiumoxidpulver poliert,
so daß eine Mikroplatinelektrode erhalten wird.
Anschließend wird eine zehnminütige Elektrolyse in einem
Milliliter einer Lösung (pH = 3,5) mit Hexachlorplatinat
(33 mg), Bleiacetat (0,6 mg) und Glucoseoxidase (10 mg)
unter Anlegen eines konstanten Potentials von -0,2 V oder
eines konstanten Stroms von -5 uA durchgeführt, wodurch
ein Niederschlag an Glucoseoxidase inkorporierendem
Platinschwarz gebildet wird. Der so hergestellte
Platinschwarzniederschlag mit der darin inkorporierten
Glucoseoxidase war mehrere Mikrometer dick.
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Die so erhaltene Mikroelektrode wurde als funktionelle
Elektrode verwendet und in die Mikrovorrichtung gemäß
Fig. 12 eingebaut. Bei der Messung im
Durchflußinjektionsverfahren fließt die Flüssigkeit (21) aus einem Einlaß (22)
längs des Durchgangs (25) mit der Elektrode (23). Als
Referenzelektrode (26) wird eine Silber/Silberchlorid-
Elektrode verwendet und als Gegenelektrode (27) eine
Elektrode aus rostfreiem Stahl.
Messung der Glucosekonzentration
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Die zu messende Flüssigkeit wurde in das
Durchflußinjektionsmessystem gemäß Fig. 12 mittels einer
Einmalspritze (ER 8711 - Typ hergestellt von Erma Inc.)
eingebracht. Eine Blockelektrode aus rostfreiem Stahl wurde
als Gegenelektrode sowie eine Silber/Silberchloridelektrode
als Bezugselektrode verwendet. Ein Potential von 0,6 V
wurde an die Mikroelektrode angelegt und das dadurch sich
bildende Wasserstoffperoxid oxidiert. Eine 0,1 M
Phosphorsäure-Pufferlösung (pH = 6,8) wurde als mobile
Phase verwendet und mehrere Arten von Proben mit
verschiedenen Glucosekonzentrationen wurden untersucht. Die
Durchflußgeschwindigkeit variierte im Bereich von 0,4
ml/min bis 1,8 ml/min.
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Unter Verwendung der Mikroelektrode, welche auf der
Endoberfläche des Platindrahts mit einem Durchmesser von
100 Mikrometern ein Glucoseoxidase inkorporierendes
Platinschwarzpräzipitat aufwies, wurde die Antwort auf ein
schubweises Einbringen einer Glucoselösung (10 mM) gemessen
und aufgezeichnet. Das Ergebnis ist in Fig. 13 gezeigt. Wie
in den Zeichnungen gezeigt, erreicht der Antwortstrom
seinen maximalen Wert drei Sekunden nach Beladung mit der
Probe und kehrt innerhalb von zehn Sekunden auf den
ursprünglichen Wert zurück.
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Wenn die Vorrichtung innerhalb von einer Minute mit sieben
Proben beladen wird, bleibt das ermittelte Stromsignal
vollständig unabhängig von den verschiedenen maximalen
Werten, welche der Beladung mit jeweils einer Probe
entsprechen. Es wurde gefunden, daß eine Probe innerhalb
von neun Sekunden gemessen werden konnte. Die für die
vollständige Messung einer Probe benötigte Zeitdauer ist
eng von der Größe der Mikroelektrode abhängig. Falls der
Durchmesser der Mikroelektrode kleiner ist, ist die
Zeitdauer zur Messung der Probe kürzer. Deshalb können
Hochgeschwindigkeitsmessungen bei Verringerung des
Durchmessers der Mikroelektrode durchgeführt werden.
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Als nächstes wurde die Zeitdauer ermittelt, die notwendig
war, um die Glucosekonzentration und den maximalen
Antwortstrom zu messen, wobei die Durchflußrate der mobilen Phase,
d. h. der Lösung variiert wurde. Es wurde gefunden, daß die
zur Messung der Glucosekonzentration benötigte Zeit kürzer
war, wenn man die Durchflußrate erhöhte und daß
gleichzeitig der Wert für die maximale Stromantwort
niedriger war.
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Die Beziehung zwischen der Glucosekonzentration und der
maximalen Stromantwort ist in Fig. 14 gezeigt. Aus dieser
Fig. 14 geht hervor, daß eine Linearität zwischen der
maximalen Stromantwort und der Glucosekonzentration im
Bereich von 50 uM bis 20 mM besteht.
Beispiel 4
Ergebnisse der anodischen Polarisierung
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Ein Platindraht mit einem Durchmesser von 100 Mikrometern
wurde in einen Acrylharzblock versiegelt und die Oberfläche
dieses Blocks wurde mit einem Aluminiumoxidschleifmittel
mit einem Teilchendurchmesser von 30 um bis 0,05 um
poliert. Anschließend erfolgte Eintauchen in eine Lösung
von 3% Hexachlorplatinat mit 500 ppm Bleiacetat und 10%
Glucoseoxidase, worauf sich eine Elektrolyse zur Bildung
eines Präzipitats von feinen Platinteilchen auf der glatten
Endoberfläche des Platindrahts anschloß. Diese Elektrolyse
wurde fünf Minuten lang bei einem angelegten Potential von
-0,08 Volt durchgeführt. Sechs von diesen Elektroden mit
feinen Platinteilchen wurden hergestellt, wovon hernach
drei einer anodischen Oxidation unterzogen wurden, die drei
übrigen aber nicht. Diese Behandlung wurde durch Eintauchen
der erhaltenen porösen Enzymelektroden und anschließende
zehnminütige Elektrolyse bei einer angelegten Spannung von
1,0 Volt durchgeführt. Danach wurde die Elektrode mit der
darin inkorporierten Glucoseoxidase über Nacht in einer
0,1 M Phosphatpufferlösung gewaschen. Die so erhaltene
Glucoseoxidase-Elektrode wurde als funktionelle Elektrode
in die Durchflußmeßvorrichtung gemäß Fig. 11 eingebaut.
Probenlösungen mit verschiedenen Arten von Sacchariden
wurden mittels Durchflußinjektion unter Verwendung einer
Einmalspritze oder -pumpe (SPY 2502 U, hergestellt von
Nippon Seimitu Co.) in das Meßsystem eingebracht, so daß
Messungen an den oxidierten Elektroden in den Proben mit
verschiedenen Sacchariden durchgeführt werden konnten. Als
Gegenelektrode wurde eine Blockelektrode aus rostfreiem
Stahl verwendet. Als mobile Phase wurde eine Lösung von
0,1 M Phosphorsäure-Puffer verwendet. Die an die
Glucoseoxidase-Elektrode angelegte Spannung betrug 0,6 V.
Fig. 15 zeigt die erhaltenen Werte, wenn die oxidierten,
d. h. einer anodischen Polarisation unterzogenen
Glucoseoxidase-Elektroden verwendet wurden. Analog dazu zeigt
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Fig. 16 die Stromantwort, welche unter Verwendung der
unbehandelten Glucoseoxidase-Elektroden erzielt wurde.
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Normalerweise können Saccharide wie Glucose, Galactose und
Fructose nicht bei einem Potential von 0,6 V oxidiert
werden. Jedoch kann bei dem vorliegenden Experiment Glucose
mittels der Wirkung der auf die Elektrode angebrachten
Glucoseoxidase oxidiert und ein der Menge an Glucose
entsprechender Oxidationsstrom nachgewiesen werden. Die
anderen Saccharide können nicht oxidiert werden, da die
Glucoseoxidase dazu nicht in der Lage ist. Also erfolgt
keine Stromänderung, sogar wenn eine die anderen Saccharide
enthaltene Lösung in die in der Zelle befindliche Lösung
injiziert wird. Jedoch zeigen die unbehandelten, d. h. nicht
einer anodischen Polarisierung unterzogenen
glucoseoxidasehaltigen Elektroden nach Injektion von
Galactose und Fructose eine Stromantwort. Umgekehrt dazu
erfolgt eine solche Stromantwort nicht bei Injektion der
anderen Saccharide, wenn die einer oxidierenden Behandlung,
d. h. einer anodischen Polarisierung unterzogenen
glucoseoxidasehaltigen Elektroden verwendet werden. Das
erfindungsgemäße Verfahren zur Immobilisierung einer
biologisch aktiven Substanz, die damit hergestellte
Biomikroelektrode und die analytische Methode unter
Verwendung der Biomikroelektrode können für eine Vielzahl
von Messungen sowie Meßvorrichtungen unter Verwendung einer
biologisch aktiven Substanz eingesetzt werden. Auch ist es
möglich die als Meßwandler oder Reaktionselement
fungierende Biomikroelektrode zur Messung in einer
Analysevorrichtung von sehr kleiner Größe bei gleichzeitig
sehr schnellem Ansprechverhalten und hoher Sensitivität
anzupassen.