DE3855700T2

DE3855700T2 - Referenzelektrode und mit dieser ausgerüstete Messapparatur

Info

Publication number: DE3855700T2
Application number: DE3855700T
Authority: DE
Inventors: Yoshio Hashizume; Ryuzo Hayashi; Akio Kariyone
Original assignee: New Oji Paper Co Ltd
Current assignee: New Oji Paper Co Ltd
Priority date: 1987-08-28
Filing date: 1988-08-26
Publication date: 1997-04-10
Anticipated expiration: 2008-08-27
Also published as: EP0304933A2; EP0304933A3; US5037527A; DE3855700D1; EP0304933B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Bezugselektrode zur Verwendung in einer Meßvorrichtung vom Strömungstyp, die eine Enzymelektrode mit immobilisiertem Enzym aufweist, und insbesondere eine Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode, bei der ausgeschlossen ist, daß die Enzymaktivität durch die Abgabe von Silberionen gehemmt wird.
In der vorliegenden Beschreibung bezeichnet der Ausdruck "hydrophiles Gel" ein Wasser enthaltendes Gel, das eine Affinität für Wasser aufweist, aber nicht wasserlöslich ist und das die Wanderung von Ionen ermöglicht; er umfaßt und keine hydrophoben Gele.
Meßtechniken, bei denen Enzymelektroden zum Messen von verschiedenen chemischen Substanzen verwendet werden, sind in jüngster Zeit in der klinischen Chemie und in der Lebensmittelchemie in weitem Maße verwendet worden, da sie eine Kombination von Substratspezifität der enzymatischen Reaktion und der charakteristischen Merkmale der elektrochemischen Analyse bieten, beispielsweise eine hohe Meßgeschwindigkeit und eine hohe Meßempfindlichkeit. Die Meßtechniken, bei denen Enzymelektroden verwendet werden, lassen sich in folgende zwei Verfahrenskategorien einteilen:
(1) potentiometrische Verfahren (oder Verfahren zum Messen durch Potentialdifferenzerfassung) und
(2) amperometrische Verfahren (oder Verfahren zum Messen durch Erfassung des Elektrolysestroms bei einem kontrollierten Potential).
Beim potentiometrischen Verfahren ist es erforderlich, das Potential der Arbeitselektrode gegenüber dem von der Bezugselektrode erzeugten Bezugspotential genau zu messen; beim amperometrischen Verfahren ist es wesentlich, daß das Potential der Arbeitselektrode exakt aufrechterhalten werden muß.
Um solche genauen Messungen durchzuführen, muß das Potential der Bezugselektrode, also das Bezugspotential, stabil gehalten werden, und die Bezugselektrode muß darüber hinaus die folgenden Anforderungen erfüllen:
(1) die Elektrodenreaktion auf der Oberfläche der Bezugselektrode muß reversibel sein und muß gemäß der Nernst-Gleichung auf eine spezielle chemische Species im Elektrolyten ansprechen;
(II) die Bezugselektrode muß das Potential für die reversible Reaktion liefern, das über einen langen Zeitraum stabil und reproduzierbar sein muß;
(III) beim amperometrischen Verfahren, bei dem zwei Elektroden verwendet werden, darf sich das Potential der Bezugselektrode - bis auf ein geringes Ausmaß aufgrund des beim Meßvorgang fließenden Stroms - nicht ändern (d.h., keine Polarisierbarkeit), und wenn sich das Potential aufgrund eines geringen Stromflusses ändert, muß es rasch wieder auf seinen vorherigen Wert zurückkehren, und
(IV) es darf keine Potentialhysterese bei Temperaturänderungen auftreten.
Es ist bekannt, daß Silber/Silberchlorid-Bezugselektroden diese Anforderungen erfüllen. Eine Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode stellt eine Halbzelle dar, die aus einer Silberelektrode, die von einer Schicht bedeckt ist, die Silberchlorid enthält, und einer Innenlösung, die Chlorionen enthält, besteht;die Innenlösung der Elektrode ist elektrisch durch eine geeignete Flüssigkeitsbrücke mit einer zu analysierenden Elektrolytlösung verbunden. Die Flüssigkeitsbrücke muß die folgenden Anforderungen erfüllen:
(I) im Hinblick darauf, daß der Ausfluß der Innenlösung aus der Bezugselektrode nicht zu hoch sein sollte, um eine Verunreinigung der zu analysierenden Lösung mit der Innenlösung zu verhindern, kann ein zu langsames Ausfließen der Innenlösung dazu führen, daß die Flüssigkeitsbrücke ein anomales Potential aufweist. Daher muß die Flüssigkeitsbrücke ein mäßiges Ausfließen der Innenlösung ermöglichen;
(II) zur Erzielung eines stabilen und gut reproduzierbaren Potentials der Flüssigkeitsbrücke muß der Auslfuß der Innenlösung konstant sein.
Das bedeutet, daß eine Bezugselektrode so auszulegen ist, daß die Innenlösung mit einem konstanten Durchsatz aus der Elektrode durch die Flüssigkeitsbrücke ausfließt.
Zu diesem Zweck sind bisher mikroporöse Elemente, Salzbrücken, Glasfritten oder dergleichen als Flüssigkeitsbrücken verwendet worden, die die Bezugselektrode und die Elektrolytlösung zur Durchführung elektrolytischer Messungen miteinander verbinden.
Die Miniaturisierung der Bezugselektrode ermöglicht es, den Abstand zwischen der Arbeitselektrode und der Bezugselektrode zu verringern, wodurch das Ausmaß eines möglichen Spannungsabfalls infolge des Lösungswiderstands verringert wird, so daß ein stabileres Potential der Arbeitselektrode aufrechterhalten werden kann und sehr genauge Messungen ermöglicht werden. Es wurde daher versucht, die Größe der Silber/Silberchlorid-Bezugselektroden zu verringern, jedoch haben diese Versuche zu den im folgenden beschriebenen Problemen geführt.
Die Miniaturisierung der Silber/Silberchlorid- Bezugselektroden zusammen mit der Verkleinerung der entsprechenden Enzymelektrode führt dazu, daß sich der Mengenanteil an Innenlösung, die durch die Flüssigkeitsbrücke ausfließt, in Bezug auf die Gesamtmenge an Innenlösung vergrößert, wodurch sich im Hinblick auf die Potentialstabilität der Bezugselektrode Probleme ergeben.
Ein weiteres Problem hängt damit zusammen, daß, wenn die Größe der Flüssigkeitsbrücke für die Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode verringert wird, um das Auströmen der Innenlösung durch die Brücke zu verlangsamen, das Auftreten eines anomalen Flüssigkeitsbrückenpotentials an der Flüssigkeitsbrücke wahrscheinlich ist.
Weitere Probleme ergeben sich deraus, daß es bei Verwendung von Salzbrücken undurchführbar ist, die Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode einschließlich der Salzbrücke zu miniaturisieren, und daß es, wenn es zwischen der Ohlorionenkonzentration der Innenlösung der Elektrode und der Chlorionenkonzentration der zu messenden Lösung eine Differenz gibt, schwierig ist, eine gute Potentialstabilität zu erhalten, da es zu einer Änderung der Chlorionenkonzentration der Innenlösung kommen kann.
Wie oben ausgeführt, können die Silber/Silberchlorid-Bezugselektroden, die eine Innenlösung und eine Flüssigkeitsbrücke aufweisen, wegen der baulichen Gestaltung als solcher kaum miniatunsiert werden; deshalb ist Rahmen der Erfindung die Konzeption in Betracht gezogen, eine Bezugselektrode, die eine Schicht aufweist, die Silberchlorid enthält und auf einem Silberdraht vorgesehen ist, für elektrolytische Messungen direkt in die Elektrolytlösung einzubringen.
Eine Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode wird beispielsweise wie folgt hergestellt. Eine Silberelektrode wird in die Elektrolytlösung, die Chlorionen enthält, eingetaucht. Ein elektrischer Strom wird zwischen der Silberelektrode als Anode und einer Platinelektrode fließen gelassen, wobei beispielsweise eine Stromregeleinrichtung verwendet wird, wodurch auf der Oberfläche der Silberelektrode eine dünne Silber/Silberchlorid-Schicht gebildet wird (Elektroplattieren). Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß einerseits Silber/Silberchlorid-Elektroden auf einfache Weise erzeugt werden können, hat jedoch andererseits den Nachteil, daß die erzeugte dünne Schicht keine ausreichende physikalische Festigkeit aufweist und dazu neigt, sich bei längerem Gebrauch abzulösen, so daß keine gute Potentialstabilität erhalten werden kann.
Es ist ferner eine Bezugselektrode für Enzymelektroden bekannt, die aus einem Silber/Silberchlorid/Silbersulfid-Gemisch druckgeformt ist (Japanische Patent-Offenlegungsschrift Nr. 43556/1987). Diese Bezugselektrode hat den Nachteil, daß für die Herstellung der Elektrode eine schwierige Formgebung erforderlich ist, so daß es faktisch unmöglich ist, eine derartige Elektrode in miniaturisierter Form herzustellen.
Bezugselektroden, die hydrophile Gelschichten und ein Silberhalogenid enthalten, sind aus EP-A-0 100 988 und EP-A-0 024 191 bekannt.
EP-A-0 100 988 gibt eine Bezugselektrode an, die mit einer Schicht eines Polymers überzogen ist, das Stickstoffatome enthält, beispielsweise Polyacrylamid, und die Silberionen enthält, die im Polymer durch Komplexbindung zwischen den Stickstoffatomen und den Silberionen gebunden sind. Diese Schicht wird durch Elektrolyse der Silberelektrode in einer Lösung hergestellt, die das lösliche Polymer enthält. Die erhaltenen Silberionen reagieren mit dem Polymer, indem sie eine unlösliche Silberkomplexverbindung bilden, die sich auf der Elektrodenoberfläche niederschlägt. Wenn die elektrochemische Oxidation in einem Elektrolyten durchgeführt wird, der Chloridionen enthält, enthält die Komplexschicht auch Silberchlorid (S. 6, Zeilen 27 bis 32).
Auf dieser ersten Schicht kann eine zweite Schicht aufgebracht werden, die das Eindringen hemmender Ionen verhindern kann, wodurch eine Bezugselektrode mit zwei Schichten ausgebildet wird.
In EP-A-0 024 191 ist eine Silber/Silberhalogenid- Bezugselektrode beschrieben, die teilweise mit einer Zusammensetzung bedeckt ist, die einen Metallsalzelektrolyten, ein hydrophiles Polymer, Habgenidionen und ein Oxidationsmittel enthält, das das Silber oxidieren kann. Anstelle des Oxidationsmittels und der Halogenidionen kann das hydrophile Polymer eine Metallhalogenidemulsion, beispielsweise von Silberchlorid, enthalten. Hydrophile Polymere sind beispielsweise hydrophile Kolbide, wie z.B. Gelatine und Agarose. Zur Erzeugung der Zusammensetzung, mit der das Silbersubstrat beschichtet wird, wird das hydrophile Polymer in einem polaren Lösungsmittel, wie z.B. Wasser, gelöst. Nachdem die Beschichtung erzeugt ist, wird sie unter Bedingungen getrocknet, die vom hydrophilen Polymer abhängen.
Wenn, wie oben beschrieben, eine Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode direkt in die Elektrolytlösung eingebracht wird, ohne daß eine Salzbrücke verwendet wird, kann eine Enzymelektrode, in Abhängigkeit von den verschiedenen darin verwendeten Enzymen, wegen der Silberionen, die in geringem Maße von der Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode in Lösung gehen, sehr rasch ihre Wirksamkeit verlieren.
Silberchlorid ist in Wasser leicht löslich (1,9 mg/l), und Silberionen kombinieren gut mit Proteinen. Allerdings können bestimmte Enzyme auch durch die Gegenwart von Silberionen negativ beeinflußt oder inaktiviert werden. Eine Reihe derartiger Enzyme, beispielsweise die folgenden, sind bekannt: L-Sorboseoxidase (E. C. 1, 1, 3, 11), Inulinase (E., C. 3, 2, 1, 7), α-D-Glucosidase (E. C. 3, 2, 1, 20), β-D-Glucosidase (E. C. 3, 2, 1, 21), β-D-Galactosidase (E. C. 3, 2, 1, 23) und Invertase (E. C. 3, 2, 1, 26).
Es wurde angegeben, eine Palladiumelektrode als Bezugselektrode zu verwenden, um die Inaktivierung von Enzymen durch Silberionen zu verhindern (beispielsweise in US-A-4 547 280), eine derartige Elektrode erfüllt jedoch die obigen Anforderungen an die Bezugselektroden nicht vollständig, denn das Problem hinsichtlich der Langzeit-Potentialstabilität ist nach wie vor vorhanden.
Aus dem oben Dargelegten geht somit hervor, daß bisher zur Miniaturisierung von Silber/Silberchlorid- Bezugselektroden keine wirksamen Maßnahmen angegeben wurden.
Hauptaufgabe der Erfindung ist es daher, eine Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode anzugeben, bei der die oben angegebenen Probleme beseitigt sind, bei der keine Enzyme inaktiviert werden können und die in einer kleineren Größe hergestellt werden kann.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode anzugeben, die eine gute physikalische Festigkeit, ein lange Lebensdauer und eine hohe Potentialstabilität aufweist und die in einer kleineren Größe einfach hergestellt werden kann.
Die obigen und weitere Aufgaben der Erfindung werden in der folgenden Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen im einzelnen erläutert.
Zur Lösung der obigen Aufgaben gibt die Erfindung eine Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode an, wie sie in Anspruch 1 definiert ist.
Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen 1 bis 10 definiert.
Die Erfindung gibt eine Meßvorrichtung an, die eine Bezugselektrode aufweist, wie in Anspruch 11 definiert ist.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Meßvorrichtung eine Arbeitselektrode mit immobilisiertem Enzym, das die Eigenschaft aufweist, daß seine Aktivität durch Silberionen inhibiert wird, wobei noch bevorzugter ein oder mehrere Enzyme aus einer Gruppe unter L-Sorboseoxidase, Inulinase, α-D-Glucosidase, β-D-Glucosidase, β-D-Galactosidase, Invertase und Glucoamylase ausgewählt sind.
Bei einer noch bevorzugteren Ausführungsform der Erfindung ist die Meßvorrichtung eine Meßvorrichtung vom Strömungstyp, die eine Meßzelle umfaßt, die einen Strömungskanal aufweist, wobei die Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode und die Arbeitselektrode mit immobilisiertem Enzym im Strömungskanal einander gegenüberliegend angeordnet sind.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung einer Bezugselektrode nach den Ansprüchen 14 bis 19.
Die Erfindung wird nun im folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine Schnittansicht, die eine Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode 3 zeigt, die eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt;
Fig. 2 eine schematische Darstellung des Systems, die eine Meßvorrichtung der Erfindung vom Strömungstyp zeigt;
Fig. 3a, 3b, 3c Schnittansichten, die drei unterschiedliche Formen von Meßzellen gemäß der Erfindungskonzeption zeigen;
Fig. 4 eine Schnittansicht einer Arbeitselektrode mit immobilisiertem Enzym, die zusammen mit der erfindungsgemäßen Bezugselektrode verwendet wird;
Fig. 5 eine schematische Darstellung eines Systems, das eine weitere Form Meßvorrichtung vom Strömungstyp gemäß der Erfindung zeigt;
Fig. 6 eine Strom/Spannungs-Kurve, bezogen auf 1 mM Wasserstoffperoxid, im Vergleichsbeispiel 1 (wobei "o" Anfangswerte zu Beginn der Messungen und "x" Werte nach Messung von 1000 Proben darstellen);
Fig. 7 ein Diagramm, das die zeitliche Änderung beim Ansprechen auf Glucose und Sucrose im Vergleichsbeispiel 1 zeigt (wobei sich "o" auf Glucose und "x" auf Sucrose beziehen);
Fig. 8 gestrichen;
Fig. 9 gestrichen;
Fig. 10 eine Strom/Spannungs-Kurve, bezogen auf 1 mM Wasserstoffperoxid, im Vergleichsbeispiel 2 (wobei "o" Anfangswerte am Beginn der Messungen und "x" Werte nach Messung von 1500 Proben darstellen) und
Fig. 11 eine Strom/Spannungs-Kurve, bezogen auf 1 mM Wasserstoffperoxid, im Vergleichsbeispiel 3 (wobei "o" Anfangswerte am Beginn der Messungen und "x" Werte nach Messung von 1500 Proben darstellen).
Die folgende detaillierte Beschreibung beschreibt die Ausführungsformen, die gegenwärtig als die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung angesehen werden. Es ist anzumerken, daß die Beschreibung der Ausführungsformen die allgemeine Konzeption der Erfindung nur veranschaulichen, nicht aber einschränken soll, da der Umfang der Erfindung durch die anliegenden Ansprüche vorgegeben ist.
Erfindungsgemäß ist eine hydrophile Gelschicht 2 auf einer Silberchlorid enthaltenden Schicht 1 einer Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode 3 aufgebracht, wodurch es nicht nötig ist, daß eine Innenlösung und eine Flüssigkeitsbrücke vorgesehen werden, so daß die Bezugselektrode 3 in einer kleineren Größe hergestellt werden kann. Die Suberchlorid enthaltende Schicht 1 kommt durch die hydrophile Gelschicht 2 mit einer Elektrolytlösung in Kontakt, wodurch ein Austritt von Silberionen verhindert wird, weshalb die Enzymaktivität in einer Arbeitselektrode 5 mit immobilisiertem Enzym nicht gehemmt wird. Somit können über einen längeren Zeitraum stabile Messungen gewährleistet werden.
Unter Bezug auf Fig. 1 wird im folgenden die Herstellung der erfindungsgemäßen Bezugselektrode 3 im einzelnen beschrieben, wobei sich die Beschreibung auf den Fall bezieht, in dem eine Schicht, die Silber/Silberchlorid enthält, durch Elektroplattieren erzeugt wird. Ein Silberdrahtelement 6 wird sorgfältig abschliffen, so daß eine auf seiner oberfläche befindliche Oxidschicht entfernt wird. Ein Silberanschlußdraht 14 wird mit einem Ende des Silberdrahtelements 6 verbunden, indem ein leitender Kleber verwendet wird. Ein Ende eines rohrförmigen Elements 16, das aus einem elektrisch isolierenden Material, z.B. einem Acrylharz, hergestellt ist, wird an das andere Ende des Silberdrahtelements 6 anstoßend oder von diesem Ende beabstandet angeordnet. Das Silberdrahtelement 6 und das rohrförmige Element 16 sind von einem schichtartigen rohrförmigen Element 17, das aus bei Wärme schrumpfendem Teflon oder einem ähnlichen Material hergestellt ist, überzogen und werden so zusammengehalten, daß sie linear koaxial verbunden sind.
Dann wird das Silberdrahtelement 6 in eine Elektrolytlösung eingetaucht, die Chlorionen enthält, beispielsweise eine wäßrige Chloridlösung oder eine Pufferlösung, in der ein Chlorid gelöst ist. Als Pufferlösung können verschiedene Arten derartiger Lösungen verwendet werden, wie z.B. Phosphat- und Citrat-Pufferlösungen. Als Elektrolytlösung kann eine wäßrige Lösung von Salzsäure oder eines Alkalimetallchlorids, z.B. von Natriumchlorid oder Kaliumchlorid, verwendet werden. Die Konzentration eines derartigen Chlorids sollte 0,01 bis 1 M betragen.
Dann wird mit einem Platindraht als Gegenelektrode und dem Silberdrahtelement 6 als Silberelektrode (Anode) eine Elektrolyse unter Bezug auf eine gesättigte Kalomelelektrode (im folgenden mit SCE bezeichnet), durchgeführt.
Das Potential für die Elektrolyse liegt nicht unter +0,05 V gegenüber der SCE, und es kann eine ausreichende Menge Silberchlorid dadurch erzeugt werden, daß das Potential gegenüber der SCE auf +0,20 V erhöht wird. Die für die Elektrolyse benötigte Zeit liegt üblicherweise im Bereich von 1 bis 480 min und bevorzugt von 5 bis 60 min.
Nun wird erfindungsgemäß eine Schicht, die Silberchlorid und Protein enthält, erzeugt, indem ein Protein, wie z.B. Rinderserumalbumin, in die Elektrolytlösung eingemischt wird. Dann wird das Protein unter Verwendung eines Vernetzungsmittels in ein Gel übergeführt. Das hat den Vorteil, daß bei der Verwendung des gleichen Proteingels wie in der hydrophilen Gelschicht eine bessere Haftung zwischen den Schichten erzielt wird. Dieser Punkt wird im folgenden noch eingehender erläutert.
Sodann wird in den Raum zwischen dem Abschnitt, der mit der Elektrolytlösung 7 in Kontakt kommt, und der Silberchlorid enthaltenden Schicht 1, die auf dem Silberdrahtelement 6 ausgebildet ist, ein hydrophiles Gel eingefüllt.
Das Silberdrahtelement 6, die Silberchlorid enthaltende Schicht 1, die rohrförmigen Elemente 16, 17 und die hydrophile Gelschicht 2 werden fest mit einem Trägerkörper 8 verbunden. Der Trägerkröper 8 ist aus elektrisch isolierenden Materialien, wie z.B. Fluorkunstharz und Vinylchlorid, hergestellt. Der Silberanschlußdraht 14 ist mit Hilfe eines leitenden Klebers mit einem Stecker 18 verbunden. Der Stecker 18 ist am Trägerkröper 8 befestigt.
Das Einfüllen des Gels kann so erfolgen, daß ein separat hergestelltes Gel in den Raum zwischen der das Silberchlorid enthaltenden Schicht 1 und dem Kontaktabschnitt 7 eingefüllt wird oder daß eine Protein/Vernetzungsmittel-Lösung beispielsweise in diesen Raum eingebracht wird und die Lösung dann in ein Gel übergeführt wird.
Als Beispiele für eine derartige Verwendung geeigneter hydrophiler Gele können Polysaccharidgele, wie z.B. Agarose, Agaropectin und κ-Carrageenanan, hydrophile synthetische Polymergele, wie z.B. Polyacrylamidgel und Polyvinylalkoholgel, sowie Proteingele, wie z.B. Albumin, Globulin und Gelatine, genannt werden.
Zur Herstellung eines Polysaccharidgels, wie z.B. eines Agarosegels, wird eine heiße wäßrige Agaroselösung mit einer Konzentration in der Größenordnung von 1 bis 10 %, die Vernetzungsmittel, wie z.B. Diisocyanat und Borsäure, enthält, auf Raumtemperatur abgekühlt.
Zur Herstellung eines Polyacrylamidgels werden Vernetzungsmittel, wie z.B. N,N'-Methylenbisacrylamid, und Polymerisationspromoter, wie z.B. Peroxoammoniumdisulfat, und N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin einer Acrylamidlösung zugesetzt, worauf man das Gemisch in ein Gel übergehen läßt. Das sich ergebende Gel wird in Wasser oder in einer Pufferlösung aufbewahrt, wodurch es entsalzt wird.
Zur Herstellung eines Polyvinylalkoholgels werden Aldehyde, wie z.B. Glutaraldehyd, eine Methylolverbindung, wie z.B. N-Methylolmelamin, eine aktivierte Vinylverbindung, wie z.B. Divinylsulfon, eine Epoxyverbindung, wie z.B. Epichlorhydrin, oder ein organisches bzw. anorganisches Vernetzungsmittel, wie z.B. eine Dicarbonsäure, ein Diisocyanat oder ein Kupfersalz, für eine Überführung in ein Gel dem Polyvinylalkohol zugesetzt, oder der Polyvinylalkohol wird in Gegenwart von heißem Wasser oder von Wasser durch Elektronenstrahlung oder UV-Strahlung einer Vernetzungsreaktion ausgesetzt und so in ein Gel überführt.
Um ein Protein durch Reaktion mit einem Vernetzungsmittel in ein Gel zu überführen, können verschiedene bekannte Vernetzungsmittel für Proteine verwendet werden. In erster Linie sind Aldehyde, wie z.B. Formaldehyd, Glutaraldehyd und Glyoxal, bevorzugt, da sie gut wasserlöslich sind und eine gute physikalische Festigkeit ergeben können.
Um Proteine unter Verwendung eines Vernetzungsmittels in ein Gel zu überführen, beträgt die Konzentration des Proteins bevorzugt 0,1 bis 10 Gew.-%, und die Konzentration des Vernetzungsmittels beträgt bevorzugt 0,1 bis 10 Gew.-%. Liegt die Konzentration des Proteins unter 0,1 Gew.-%, läßt sich keine ausreichende Festigkeit des Gels erhalten, und die sich ergebende Gelschicht kann sich ablösen. Wenn der Proteingehalt über 10 Gew.-% liegt, ist die sich ergebende Lösung zu viskos und schwierig zu handhaben. Wenn die Konzentration des Vernetzungsmittels unter 0,1 Gew.-% liegt, ist die Gelfestigkeit nicht ausreichend, und wenn sie über 10 Gew.-% liegt, erfolgt die Reaktion zu rasch, und es ist keine gleichmäßige Gelbildung möglich.
Die Gelbildung kann bei Raumtemperatur erfolgen, oder sie kann unter Erwärmen oder Kühlen stattfinden. Zum Zweck einer Vernetzung mit Aldehyden ist es ratsam, die Vernetzung in einem dichten Gefäß und in einer Atmosphäre mit dem gesättigtem Dampf einer Aldehydlösung stattfinden zu lassen, da auf diese Weise ein gleichmäßig vernetztes Gel erhalten werden kann.
Von den verschiedenen Arten hydrophiler Gele können insbesondere Proteingele bevorzugt verwendet werden, da die Mercaptogruppen im Protein Silberionen binden, wobei Mercaptide gebildet werden, wodurch die Herauslösung von Silberionen wirksam verhindert werden kann. Besonders bevorzugt sind Proteinsubstanzen, z.B. Albumin, die einen größeren Mengenanteil an Mercaptogruppen enthalten.
Die Dicke des hydrophilen Gels beträgt 0,1 bis 20 mm und bevorzugt 0,5 bis 10 mm. Wenn die Dicke weniger als 0,1 mm beträgt, ist die Gelschicht anfällig dafür, sich unter der Einwirkung von Scherkräften abzulösen. Liegt die Dicke über 20 mm, ist die Elektrode notwendigerweise größer, und es ergibt sich ein instabiles Potential.
Bei der auf diese Weise erhaltenen Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode 3 ist weder eine Innenlösung vorhanden, noch gibt es eine Flüssigkeitsbrücke, und sie kann daher in einer kleineren Größe hergestellt werden. Darüber hinaus weist die hydrophile Gelschicht 2 gute physikalische Festigkeitseigenschaften auf. Wenn die Bezugselektrode 3 in einer Meßvorrichtung vom Strömungstyp (im folgenden in Fig. 2 beschrieben) verwendet wird, wird die Elektrode 3 der Scherkraft einer Pufferlösung ausgesetzt. Aus den oben angegebenen Gründen tritt jedoch keine Probleme wie eine Potentialänderung infolge des Ausströmens der Innenlösung auf, auch dann nicht, wenn die Bezugselektrode 3 gegenüber der Arbeitselektrode 5 mit immobilisiertem Enzym (Platinelektrode oder dergleichen, auf deren Oberfläche ein Enzym immobilisiert ist) angeordnet ist und direkt mit dem Strom einer Pufferlösung im Kontakt bleibt.
Fig. 2 ist eine schematische Darstellung des Systems, die eine Meßvorrichtung vom Strömungstyp zeigt, die mit der in Fig. 1 gezeigten Bezugselektrode ausgestattet ist. Eine Pufferlösung (Elektrolytlösung) 27 in einem Gefäß 26 wird mit einem konstanten Durchsatz von einer Pumpe 9 zugeführt. Eine zu messende Probenlösung wird von einer Einspritzeinrichtung 10 in einem Thermostaten 29 zum Mischen mit der Pufferlösung (Elektrolytlösung) eingeleitet. Die Meßzelle 4 über einen Flansch 11 mit einer Leitung verbunden, die zur Einspritzeinrichtung 10 führt; sie ist ferner über einen Flansch 11a mit einer Leitung verbunden, die zu einer Hilfsoder Gegenelektrode 12 führt. Die erfindungsgemäße Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode 3 ist in der Meßzelle 4 angeordnet. Die Arbeitselektrode 5 mit immobilisiertem Enzym ist ebenfalls in der Meßzelle 4 angeordnet. Der Ausgangsstromwert dieser Arbeitselektrode 5 wird von einem Potentiostaten 13 gemessen.
Fig. 3a ist eine vergrößerte Schnittansicht der Meßzelle 4. Die Elektroden 3, 5 sind einander gegenüberliegend in einem Strömungskanal 28 angeordnet, so daß der Abstand zwischen ihnen geringer ist als der Abstand in der Anordnung nach dem Stand der Technik, wodurch die Meßgenauigkeit verbessert werden kann.
Fig. 3b ist eine Schnittansicht, die eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform der Meßzelle 4 zeigt. Die Elektroden 3, 5 liegen zwar auch hier einander gegenüber, sind in Richtung des Strömungskanals 28 etwas gegenseitig versetzt angeordnet.
Fig. 3c ist eine Schnittansicht, die eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform der Meßzelle 4 zeigt. Die Elektroden 3, 5 sind auf einer Seite längs des Strömungskanal 28 ein wenig voneinander beabstandet angeordnet (in Fig. 3c an der oberen Seite).
Fig. 4 ist eine Schnittansicht, die eine Arbeitselektrode 5 mit immobilisiertem Enzym zeigt. Ein Silberleitungsdraht 20 ist mit Hilfe eines leitenden Klebers 21 mit einem Platindrahtelement 19 verbunden, das abgeschliffen wurde. Das Platindrahtelement 19 ist mit einem elektrisch isolierenden, schichtartigen rohrförmigen Element 22, das aus in der Wärme schrumpfendem Teflonmaterial hergestellt ist, überzogen und mit einem Trägerkörper 23 verbunden. Der Trägerkörper 23 ist aus einem elektrisch isolierenden Material, z.B. aus Fluorkunstharz, einem Vilylchloridmaterial oder dergleichen, hergestellt. Der Leitungsdraht 20 ist mit einem leitenden Kleber mit einem Stecker 24 verbunden. Der Stecker 24 ist mit dem Trägerkörper 23 verbunden. An einem Ende des Platindrahtelements 19 ist eine Enzymschicht 25 mit immobilisiertem Enzym ausgebildet.
Der in der Meßvorrichtung vom Strömungstyp verwendeten Pufferlösung wird 0,01 bis 0,5 M Kaliumchlorid oder dergleichen zugesetzt, so daß die Pufferlösung Chlorionen enthält. Infolgedessen wird das Potential der Bezugselektrode 3 weiter stabilisiert, und auf diese Weise kann eine hohe Meßgenauigkeit erzielt werden.
Durch die erfindungsgemäße Bezugselektrode ist gewährleistet, dab keine Silberionen austreten können. Auch wenn daher die Bezugselektrode nahe an der Arbeitselektrode mit dem immobilisierten Enzym angeordnet ist, das durch Silberionen nachteilig beeinflußt werden könnte, z.B. Invertase, besteht keine Tendenz zur Inaktivierung des immobilisierten Enzyms. Daher kann mit der Bezugselektrode, die nahe an der Arbeitselektrode mit immobilisiertem Enzym angeordnet ist, eine hohe Meßgenauigkeit erzielt werden.
Erfindungsgemäß wird in die Schicht 1, die Silberchlorid enthält, ein hydrophiles Gel eingebracht, und anschließend wird auf der Schicht 1, die Silberchlorid enthält, eine hydrophile Gelschicht 2 ausgebildet. Auf diese Weise kann eine Bezugselektrode erzeugt werden, die eine längere Lebensdauer aufweist und stabilere und zuverlässigere Messungen ermöglicht. Erfindungsgemäß wird als hydrophiles Gel ein vernetztes Protein verwendet, das deshalb in die Silberchlorid enthaltende Schicht 1 eingebracht wurde, weil auf diese Weise ausgezeichnete Eigenschaften erzielt werden können und die Silberchlorid und Protein enthaltende Schicht einfach herzustellen ist. Das Protein selbst hat eine negative Ladung bei einem pH-Wert über seinem isoelektrischen Punkt; aus diesem Grunde kann es gleichzeitig mit der Bildung einer Schicht, die AgCl enthält, elektrolytisch abgeschieden werden. Die Erzeugung einer derartigen Schicht ist daher recht einfach.
Wenn die Silberchlorid enthaltende Schicht elektrochemisch durch Elektroplattieren erzeugt wird, muß ein Protein in die Elektrolytlösung eingebracht werden, das einen isoelektrischen Punkt aufweist, der unter dem pH-Wert einer Elektrolytlösung liegt, die Chlorionen enthält (d.h., ein Protein, das in der Elektolytlösung eine negative Ladung aufweist).
Das Protein, das negative Ladung aufweist, kann zur Oberfläche einer Silberelektrode, d.h., der Anode, wandern und wird dort adsorbiert. Infolgedessen wird eine dünne Schicht eines Gemisches aus Silber, Silberchlorid und Protein erzeugt; wenn das Protein in der dünnen Schicht mit einem Vernetzungsmittel behandelt wird, entsteht eine dünne Schicht, die ausgezeichnete physikalische Festigkeitseigenschaften aufweist.
Eine hydrophile Gelschicht 2 wird auf der so erhaltenen Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode erzeugt, wie gemäß Fig. 1. Durch diesen Aufbau weist die dünne Silber/Silberchlorid-Schicht hohe Festigkeitseigenschaften auf, und zwischen der Silberchlorid enthaltenden Schicht 1 und der hydrophilen Gelschicht 2 besteht hohe Affinität, und es gibt zwischen den zwei Schichten 1 und 2 keinen freien Raum. Die Bezugselektrode kann somit für einen weit längeren Zeitraum ein stabiles Potential liefern.
Im folgenden wird die Anordnung der Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode 31 im einzelnen beschrieben. Zunächst wird ein Silberdrahtelement sorgfältig abgeschliffen, um die Oxidschicht zu entfernen. Dann wird eine Elektrolytlösung hergestellt, die eine wäßrige Chloridlösung oder eine Pufferlösung enthält, in der Chlorid gelöst ist, und ein Protein wird in diese Lösung gegeben, wonach das Silberdrahtelement in die Elektrolytlösung eingetaucht wird. Es können verschiedene Arten von Pufferlösungen verwendet werden, aber wegen der Tatsache, daß die isoelektrischen Punkte vieler Proteinsubstanzen in einem schwach sauren Bereich vorliegen, wird bevorzugt eine Phosphatpufferlösung verwendet. Um die Proteinlösung stabil zu halten, sollte die Konzentration der Pufferlösung in der Größenordnung von 0,01 bis 1 M und bevorzugt von 0,05 bis 0,5 M vorliegen.
Als Chloridquelle kann Salzsäure verwendet werden, jedoch werden bevorzugt Alkalimetallchloride, z.B. Natriumchlorid und Kaliumchlorid, verwendet, da sie nicht zur Gelbildung oder zum Ausfällen von Proteinen führen. Die Chloridkonzentration sollte im Bereich von 0,01 bis 1 M liegen.
Zur praktischen Anwendung der Erfindung werden verschiedene Proteine verwendet, die einen isoelektrischen Punkt aufweisen, der unter dem pH-Wert der Pufferlösung liegt, unter anderen werden bevorzugt Globulin (pI 6,4 bis 7,2), Ovalbumin (pI 4,6), Serumalbumin (pI 4,8), Collagen und Gelatine verwendet, da sie dazu beitragen; eine vernetzte Proteinschicht mit einer hohen Festigkeit zu erzielen. Der Proteingehalt sollte im Bereich von 0,1 bis 100 mg/ml und bevorzugt von 0,5 bis 50 mg/ml liegen, damit eine Blasenbildung im Elektrolyten verhindert und eine vernetzte Schicht mit einer ausreichenden Festigkeit erhalten wird.
Sodann wird unter Verwendung von Platin als Gegenelektrode und einer Silberelektrode als Anode in Bezug auf eine gesättigte Kalomelelektrode (im folgenden mit SCE bezeichnet) eine Elektrolyse durchgeführt.
Das Potential für die Elektrolyse sollte mindestens +0,05 V, bezogen auf die SCE, betragen. Wenn das Potential auf +0,2 V, bezogen auf die SCE, erhöht wird, kann eine ausreichende Proteinadsorption bewirkt werden. Die für die Elektrolyse benötigte Zeit sollte im Bereich von 1 bis 480 min und bevorzugt 5 bis 60 min liegen. Wenn die Zeit zu kurz ist, kann keine ausreichend feste Schicht erzeugt werden, und wenn sie übermäßig lang ist, wird die erzeugte Schicht zu dick, was schließlich zu Rissen in der vernetzten Schicht führen kann.
Danach wird die auf diese Weise auf dem Silberdrahtelement erzeugte dünne Silber/Silberchlorid- Protein-Schicht mit einem Vernetzungsmittel behandelt. Als Vernetzungsmittel können verschiedene bekannte Vernetzungsmittel für Proteine verwendet werden, jedoch sind u.a. Aldehyde, wie z.B. Formaldehyd, Glutaraldehyd und Glyoxal, bevorzugt, weil sie sehr gut wasserlöslich sind und zu einer ausreichenden physikalischen Festigkeit führen. Nach dem Abschluß des Elektrolyseprozesses wird die Vernetzung in der folgenden Art und Weise durchgeführt. Die Elektrode, die leicht mit Wasser gewaschen wurde, wird in eine 0,1 bis 10 %ige wäßrige Lösung des Vernetzungsmittels eingetaucht, dann getrocknet und vernetzt; das Vernetzungsmittel kann aber auch vorher in die Elektrolytlösung eingebracht werden. Im letzteren Falle ist es jedoch erforderlich, daß das Protein und das Vernetzungsmittel in einer niedrigen Konzentration vorliegen, um eine Gelbildung des Elektrolyten während des Elektrolyseprozesses zu verhindern.
Es ist auch möglich, eine Erwärmung auf Temperaturen im Bereich von 40 bis 60 ºC vorzunehmen, um die Vernetzungsreaktion zu beschleunigen.
Um ein eventuelles Inlösunggehen von Silberionen zu verhindern, wird erfindungsgemäß eine hydrophile Gelschicht 2 in der oben unter Bezug auf Fig. 2 beschriebenen Art und Weise ausgebildet. Das in diesem Zusammenhang verwendete Vernetzungsmittel ist bevorzugt das gleiche wie das bei der Ausbildung der Silberchlorid enthaltenden Schicht 1 verwendete Vernetzungsmittel. Der Grund hierfür ist, daß dann, wenn das für die hydrophile Gelschicht 2 verwendete Vernetzungsmittel von dem Vernetzungsmittel verschieden ist, das für die Silberchlorid enthaltende Schicht 1 verwendet wurde, bei der Vernetzungs- und Härtungsbehandlung unterschiedliche Schrumpffaktoren auftreten könnten, was zu einer Geltrennung führen könnte.
Die mit dem oben beschriebenen Verfahren erhaltene Bezugselektrode wird beispielsweise in der in Fig. 5 gezeigten Meßvorrichtung verwendet.
Fig. 5 ist eine schematische Darstellung des Systems, die eine Meßvorrichtung vom Strömungstyp zeigt. Eine Pufferlösung 38 (Elektrolytlösung) in einem Gefäß 37 wird bei einem konstanten Durchsatz mit Hilfe einer Pumpe zugeführt. Mit einer Einspritzeinrichtung 36 in einem Thermostaten 35 wird eine Meßsubstanz eingespritzt. Eine erfindungsgemäße Bezugselektrode 31 und eine Enzym-Arbeitselektrode 33 sind im Strömungskanal 39 in einer Meßzelle 32 angeordnet.
Daher kann die erfindungsgemäße Bezugselektrode in einer Meßvorrichtung vom Strömungstyp, in der die Scherkräfte durch eine Pufferlösung vorliegen, derart verwendet werden, daß die Bezugselektrode gegenüber oder parallel zu einer Arbeitselektrode 33 (einer Platinelektrode oder dergleichen, auf deren Oberfläche ein Enzym immobilisiert ist) oder parallel zur Arbeitselektrode angeordnet werden kann, wie in Fig. 5 gezeigt ist.
Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren detaillierten Erläuterung der Erfindung; es wird jedoch betont, daß die Erfindung nicht auf Beispiel 1 eingeschränkt ist. In den Beispielen ist die Einheit "%" gewichtsbezogen.

VERGLEICHSBEISPIEL 1 (keine Ausführungsform der Erfindung)

Die Erläuterung bezieht sich auf Fig. 1. Die Enden eines 5 mm langen Silberdrahtelements 6 mit einem Durchmesser von 2 mm wurden mit einem Schleifpapier einer Körnung von 1600 mesh/25,4 mm glattgeschliffen, und ein 20 mm langer Silberleitungsdraht 14 mit einem Durchmesser von 0,1 mm wurde mit einem wärmehärtbaren leitenden Kleber 15 mit einem Ende des Silberdrahtelements 6 verbunden, wonach die Anordnung in einem elektrischen Ofen 1 h bei 120 ºC einer Härtungsbehandlung unterzogen wurden. Das andere Ende des Silberdrahtelements 6 wurde mit einem Ende eines Acrylrohrelements 16, das einen Außendurchmesser von 2 mm, einen Innendurchmesser von 1 mm und eine Länge von 5 mm aufwies, derart in Kontakt gebracht, daß das Silberdrahtelement 6 und das Acrylrohrelement 16 miteinander fluchteten, und auf die Außenoberfläche der Anordnung wurde ein bei Wärmebehandlung schrumpfendes rohrförmiges Element 17 aus Teflon aufgeschrumpft.
Der vordere Endbereich der Anordnung, die als Arbeitselektrode verwendet wurde, wurde in eine Pufferlösung von 0,1 M Natriumphosphat getaucht, die 0,05 M Kaliumchlorid bei einem pH-Wert von 7,0 enthielt; eine Platinelektrode einer Größe von 1 cm² wurde als Gegenelektrode und eine SCE als Bezugselektrode verwendet. Die Elektrolyse wurde 30 min bei +0,2 V und Raumtemperatur durchgeführt, auf diese Weise wurde eine Schicht 1 erhalten, die Silberchlorid enthielt.
Nach dem Abschluß des Elektrolyseprozesses wurde der Silberdraht leicht in Wasser gewaschen; und eine wäßrige Lösung mit 5,0 % Rinderserumalbumin, die 5,0 % Glutaraldehyd enthielt, wurde mit einer Mikrospritze in den Raum innterhalb des röhrenförmigen Acrylelements 16 eingefüllt. Dann wurde die Anordnung zur Überführung in ein Gel 30 min bei Raumtemperatur stehengelassen, wobei sich die hydrophile Gelschicht 2 ausbildete.
Das Silberdrahtelement 6 wurde an einem Trägerkröper 8 befestigt, und ein Steckverbinder 18 mit einem daran angelöteten Leitungsdraht wurde montiert. Auf diese Weise wurde eine Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode erhalten.
Als nächstes wird unter Bezug auf Fig. 4 eine Arbeitselektrode 5 beschrieben. Die Enden eines 10 mm langen Platindrahtes 19 mit einem Durchmesser von 2 mm wurden mit Schleifpapier einer Körnung von 1600 mesh/25,4 mm glattgeschliffen, und ein 20 mm langer Silberleitungsdraht 20 mit einem Durchmesser von 0,1 mm wurde mit einem wärmehärtbaren leitenden Kleber 21 mit einem Ende des Platindrahtes 19 verbunden, wonach die Anordnung in einem elektrischen Ofen 1 h bei 120 ºC einer Wärmebehandlung unterzogen wurde. Auf die Außenoberfläche des Platindrahtes wurde ein bei Wärmebehandlung schrumpfendes rohrförmiges Element 22 aus Teflon aufgeschrumpft, und der so überzogene Platindraht wurde aneinem die Elektrode haltenden Trägerkörper 23 befestigt. Ein Steckverbinder 24 mit einem daran angelöteten Silberleitungsdraht 20 wurde am Trägerkörper 23 angebracht. An einem Ende des Platindrahtes 19 wurde eine Enzymmembran 25 mit immobilisiertem Enzym vorgesehen, die eine Kombination von immobilisierter Glucoseoxidase, Invertase und Mutarotase zusammen mit Rinderserumalbumin enthielt, die mit Glutaraldehyd vernetzt worden war. Auf diese Weise wurde die Arbeitselektrode 5 hergestellt.
Die Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode 3 und die Arbeitselektrode 5 wurden in der in Fig. 3a gezeigten Meßzelle 4 angeordnet, und ein elektrisch leitender Flansch wurde an der mit der Meßzelle 4 verbundenen Leitung stromab von der Meßzelle angeordnet, wobei der Flansch als Hilfselektrode 12 (Gegenelektrode) diente.
Diese drei Elektroden aufweisende Meßzelle wurde mit der Leitung verbunden und in die in Fig. 2 gezeigte Meßvorrichtung vom Strömungstyp eingebaut. Von einem Potentiostaten 13 wurde eine vorgegebene Spannung angelegt, und die Messung wurde durchgeführt, wobei die Ausgangsstromwerte mit einem Schreiber aufgezeichnet wurden.
Über eine Pumpe 9 wurde eine Pufferlösung mit 0,1 M Natriumphosphat und einem pH-Wert von 7,0, die 0,05 M Kaliumchlorid enthielt, bei einem Durchsatz von 1,0 ml/min zugeführt. Die folgenden Messungen wurden in einem Thermostaten 29 (Innentemperatur 37,0 ± 0,2 ºC) durchgeführt.
Die angelegte Spannung wurde geändert, und es wurde bestätigt, daß wenn mit einer Einspritzeinrichtung 10 mit Hilfe einer Mikrospritze 5 µl einer wäßrigen Lösung mit 1 mM Wasserstoffperoxid eingespritzt wurden, ein klar erkennbarer Grenzstrom erhalten werden konnte (Fig. 6; ein generell konstanter Stromwert kann bei einer Spannung im Bereich von 0,35 bis 0,6 V erhalten werden).
Danach wurden 5 µl einer Probe, die Glucose oder Sucrose enthielt, mit Hilfe einer Mikrospritze durch eine Einspritzöffnung eingespritzt, und es wurde eine Messung durch Drei-Elektroden-Voltammetrie derart durchgeführt, daß an die Arbeitselektrode 5 relativ zur Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode eine Spannung von +0,60 V angelegt wurde, wobei eine Wasserstoffperoxidelektrode als Arbeitselektrode 5 verwendet wurde. Diese Messungen von Glucose oder Sucrose enthaltenden Proben wurden 30 Tage lang fortgesetzt, bis insgesamt 1000 Proben analysiert worden waren (in Fig. 6 bezeichnen "0" die Anfangswerte am Beginn der Messungen und "x" die Werte nach dem Messen von 1000 Proben).
Sogar nach 30 Tagen Messungen konnte bestätigt werden, daß der Grenzstrom durch die Verwendung einer wäßrigen Lösung mit 1 mM Wasserstoffperoxid mit guter Reproduzierbarkeit erfaßt werden konnte (Fig. 6 "x").
Das bedeutet, daß sogar nach dem Messen von 1000 Glucose oder Sucrose enthaltenden Proben sich hinsichtlich eines Ansprechens auf Glucose oder Sucrose keine Verluste einstellen, wenn an die Bezugselektrode eine Spannung von 0,35 bis 0,6 V angelegt wird. Daher sind sogar nach dem Messen von 1000 Proben stabile Messungen möglich.
Während der 30 Meßtage zeigte die Enzymelektrode konstantes Ansprechniveau sowohl in Bezug auf Glucose als auch auf Sucrose. Fig. 7 zeigt die jeweiligen Ansprechwerte, die auf der Basis der Ansprechstromwerte am Beginn der Messungen berechnet wurden (in Fig. 7 bezeichnen "0" die Werte für Glucose und "x" die Werte für Sucrose).

BEISPIEL 1 (bevorzugte Ausführungsform der Erfindung)

Das gleiche Silberdrahtelement wie bei der Herstellung der Bezugselektrode von Beispiel 1 wurde zur Herstellung einer Bezugselektrode verwendet. Für die Ausbildung einer Silberchlorid enthaltenden Schicht durch Elektroplattieren wurden jedoch 10 mg/ml Rinderserumalbumin in einer Pufferlösung von 0,1 M Natriumphosphat mit einem pH-Wert von 7,0 gelöst, die 0,05 M Kaliumchlorid enthielt. Außer den obigen Arbeitsschritten wurde auf die gleiche Weise wie im Vergleichsbeispiel 1 ein Silberdraht in diese Pufferlösung eingetaucht und die Elektrolyse durchgeführt.
Nach dem Abschluß des Elektrolyseprozesses wurde eine Gelschicht aus Rinderserumalbumin in der gleichen Weise wie im Vergleichsbeispiel 1 ausgebildet. Diese Elektrode wurde für die gleichen Messungen wie im Vergleichsbeispiel 1 verwendet. Es wurden zufriedenstellende Ergebnisse erhalten. Wie in den Fig. 6 und 7 gezeigt ist, waren die Ergebnisse ähnlich wie die Ergebnisse aus Vergleichsbeispiel 1. Insbesondere zeigte eine visuelle Untersuchung eine ausgezeichnete Verbindung zwischen der hydrophilen Gelschicht und der Silberchlorid enthaltenden Schicht, weshalb der Prozentsatz des Ausschusses bei der Herstellung verringert werden konnte.

VERGLEICHSBEISPIEL 2 (keine Ausführungsform der Erfindung)

Zur Herstellung der in Fig. 5 gezeigten Bezugselektrode 31 wurden die Enden eines Silberdrahtes mit einem Durchmesser von 2 mm mit einem Schleifpapier einer Körnung von 1600 mesh/25,4 mm glattgeschliffen; und auf die Außenoberfläche des Drahtes wurde ein bei Wärmebehandlung schrumpfendes Teflonmaterial aufgeschrumpft. Der vordere Endteil des Silberdrahtes wurde in eine Pufferlösung mit 0,1 M Natriumphosphat mit einem pH-Wert von 7,0, die 10 mg/ml Rinderserumalbumin (Fraktion V, hergestellt von Sigma) und 0,05 M Kaliumchlorid enthielt, eingetaucht, die als Arbeitselektrode verwendet wurde, wobei eine Platinelektrode einer Größe von 1 cm² und eine SCE als Bezugselektrode verwendet wurden. Die Elektrolyse wurde bei +0,2 V 30 min bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach dem Abschluß der Elektrolyse wurde die Silberelektrode leicht mit Wasser gewaschen und dann 5 min in eine wäßrige Lösung von 0,1 % Glutaraldehyd getaucht. Danach wurde die Elektorde für die Vernetzungs- und Wärmebehandlung der Silberchlorid enthaltenden Schicht 15 min bei 40 ºC getrocknet
Die so hergestellte Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode wurde, wie in Fig. 5 gezeigt, als Bezugselektrode 31 in der Meßvorrichtung vom Strömungstyp angeordnet, so daß sich die auf ihr ausgebildete, Silberchlorid enthaltende Schicht in direktem Kontakt mit dem Strom der Pufferlösung befand.
Eine Arbeitselektrode 33 mit einem Durchmesser von 2 mm, auf deren Platindraht sowohl Glucoseoxidase als auch Rinderserumalbumin mit Glutaraldehyd immobilisiert worden waren, wurde in einer Meßzelle 32 so angeordnet, daß die Arbeitselektrode relativ zum Strömungskanal der Bezugselektrode 31 gegenüberliegend angeordnet war. Eine Pufferlösung von 0,1 M Natriumphosphat mit einem pH-Wert von 7,0, die 0,5 M Kaliumchlorid enthielt, wurde mit Hilfe einer Pumpe 34 mit einem Durchsatz von 1,0 ml/min strömen gelassen. Die folgenden Messungen wurden in einem Thermostaten 35 (Innentemperatur 37,0 ± 0,2 ºC) durchgeführt. Die angelegte Spannung wurde geändert, und es wurde bestätigt, daß, wenn 5 µl einer wäßrigen 1 mM Wasserstoffperoxidlösung eingespritzt wurden, ein ausgeprägter Grenzstrom erhalten werden konnte. Wie aus Fig. 10 ersichtlich, wurde ein generell konstanter Stromwert bei einer Spannung im Bereich von 0,35 bis 0,7 V erhalten.
Danach wurden 5 µl einer Probe, die Glucose enthielt, mit Hilfe einer Mikrospritze mit einer Einspritzeinrichtung 36 eingespritzt, und an die Wasserstoffperoxidelektrode als Bezugselektrode wurde eine Spannung von +0,45 V angelegt, wodurch die Messungen in Form einer Zwei-Elektroden-Voltammetrie durchgeführt wurden. Auf diese Weise wurden die Messungen 20 Tage lang durchgeführt, wobei insgesamt 1500 Proben analysiert wurden.
Sogar nach 20 Tagen Messungen konnte bestätigt werden, daß der Grenzstrom durch die Verwendung einer wäßrigen Lösung von 1 mM Wasserstoffperoxid erfaßt werden konnte, und gut reproduzierbar war, wie Fig. 10 zeigt. Das bedeutet, daß der vorgegebene Stromwert sogar nach dem Messen von 1500 Proben in der gleichen Weise wie zu Beginn der Messungen erhalten werden konnte, wenn an die Bezugselektrode eine Spannung von 0,35 bis 0,7 V angelegt wurde. Daher werden durch die erfindungsgemäße Bezugselektrode durchgehend stabile Messungen erhalten (in Fig. 10 bedeuten "o" die Werte am Beginn der Messungen und "x" die Werte nach der Messung von 1500 Proben). Durch visuelle Untersuchung der aus der Zelle entnommenen Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode wurde festgestellt, daß sich an der Oberfläche der Bezugselektrode keine Unregelmäßigkeiten, wie z.B. Ablösen der Silberchlorid enthaltenden Schicht, zeigten.

VERGLEICHSBEISPIEL 3 (keine Ausführungsform der Erfindung)

Eine Bezugselektrode wurde in der gleichen Weise wie in Vergleichsbeispiel 2 hergestellt mit dem Unterschied, daß die Elektrolytlösung kein Rinderserumalbumin enthielt und keine Wärmebehandlung durchgeführt wurde. Das bedeutet, daß der Silberdraht auf die gleiche Weise in einer Pufferlösung von 0,1 M Natriumphosphat mit einem pH-Wert von 7,0, die nur 0,5 M Kaliumchlorid enthielt, einer Elektrolyse unterworfen wurde. Nach dem Abschluß der Elektrolyse wurde der Silberdraht leicht in Wasser gewaschen, und die so erhaltene Bezugselektrode wurde in einer Meßvorrichtung vom Strömungstyp wie in Fig. 5 gezeigt, angeordnet, und die Messungen wurden auf die gleiche Weise durchgeführt. Die Meßergebnisse sind in Fig. 11 dargestellt. Wie ersichtlich ist, konnte die Lage des Grenzstroms nach dem Messen von 1500 Proben nicht klar ermittelt werden. Anders als bei den Werten zu Beginn der Messungen änderte sich der Stromwert nach der Messung von 1500 Proben mit dem Potential der Bezugselektrode, was bedeutet, daß sich mit einer derartigen Bezugselektrode keine durchgehend stabilen Messungen durchführen lassen. (In Fig. 11 bezeichnen "o" die Werte zu Beginn der Messungen und "x" die Werte nach dem Messen von 1500 Proben). Ferner wurde festgestellt, daß an der Oberfläche der Bezugselektrode die Silberchlorid enthaltende Schicht an mehreren stromauf liegenden Stellen abgelöst war.

Claims

1. Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode (3), die umfaßt:

- eine Silberelektrode (6),

- eine erste hydrophile Gelschicht (1), die auf der Silberelektrode vorgesehen ist und Silberchlorid und ein vernetztes Proteingel enthält, und

- eine zweite hydrophile Gelschicht (2), die auf der ersten hydrophilen Gelschicht (1) angeordnet und dafür vorgesehen ist, mit einer zu messenden Elektrolytlösung in Kontakt gebracht zu werden,

erhältlich durch

(A) elektrolytisches Bearbeiten der Silberelektrode (6) in einer Elektrolytlösung, die Chloridionen und ein Protein, dessen isoelektrischer Punkt unter dem pH-Wert der Lösung liegt, enthält, wodurch eine dünne Schicht, die Silberchlorid und Protein enthält, erzeugt wird, und

(B) Behandeln der dünnen Schicht mit einem Vernetzungsmittel unter Erhalt der ersten hydrophilen Gelschicht (1).

2. Bezugselektrode nach Anspruch 1, erhältlich

- entweder durch Aufbringen eines separat hergestellten hydrophilen Gels auf die erste hydrophile Gelschicht (1)

- oder durch Aufbringen einer Lösung eines Proteins und eines Vernetzungsmittels auf die erste hydrophile Gelschicht (1) und Überführen der Lösung auf dieser ersten hydrophilen Gelschicht (1) in ein Gel.

3. Bezugselektrode nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite hydrophile Gelschicht aus einem vernetzten Polysaccharidgel, aus einem Gel aus einem vernetzten synthetischen Polymer oder aus einem vernetzten Proteingel besteht.

4. Bezugselektrode nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß

- das Polysaccharid Agarose, Agaropektin und/oder κ-Carrageenan ist,

- das hydrophile synthetische Polymer ein Polyacrylamid und/oder ein Polyvinylalkohol ist und

- das Protein ein Albumin, ein Globulin und/oder Gelatine ist.

5. Bezugselektrode nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ein Albumin ist.

6. Bezugselektrode nach einem oder mehreren der Ansprüche 3 bis 5, erhältlich durch Verwendung eines oder mehrerer Aldehyde, die unter Formaldehyd, Glutaraldehyd und Glyoxal ausgewählt wurden, als Vernetzungsmittel für das Proteingel.

7. Bezugselektrode nach einem oder mehreren der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die erste und die zweite hydrophile Gelschicht (1, 2) aus Proteingelen bestehen, die mit dem gleichen Vernetzungsmittel vernetzt sind.

8. Bezugselektrode nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die erste und die zweite hydrophile Gelschicht (1, 2) das gleiche Protein enthalten.

9. Bezugselektrode nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (B) die folgenden Teilschritte umfaßt:

- Aufbringen einer Lösung, die das Protein und das Vernetzungsmittel enthält, auf die nach Schritt (A) erhaltene Silberelektrode (6) und

- Vernetzen des Proteins und dadurch gleichzeitiges Erzeugen der ersten und zweiten hydrophilen Geischicht (1, 2).

10. Bezugselektrode nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite hydrophile Gelschicht (2) eine Dicke von 0,1 bis 20 mm aufweist.

11. Meßvorrichtung, die eine Arbeitselektrode (5) und eine Silber/Silberchlorid-Bezugselektrode (3) nach einem der Ansprüche 1 bis 10 umfaßt.

12. Meßvorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Meßvorrichtung vom Strömungstyp handelt, die eine Meßzelle (4) aufweist, in der die Arbeitselektrode (5) und die Bezugselektrode (3) vorgesehen sind.

13. Meßvorrichtung nach einem oder mehreren der Ansprüche 11 und 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Arbeitselektrode (5) eine Enzymelektrode mit immobilisiertem Enzym ist, die ein oder mehre Enzyme, vorzugsweise L-Sorboseoxidase, Inulinase, α-D-Glucosidase, β-D-Glucosidase, β-D-Galactosidase, Invertase und/oder Glucoamylase enthält.

14. Verfahren zur Herstellung der Silber/Silberchlorid- Bezugselektrode nach den Ansprüchen 1 bis 10, das die folgenden Schritte umfaßt:

(I) Vorsehen einer Silberelektrode (6),

(II) elektrolytisches Bearbeiten der Silberelektrode (6) in einer Elektrolytlösung, die Chioridionen und ein Protein, dessen isoelektrischer Punkt unter dem pH-Wert der Lösung liegt, enthält, wodurch eine dünne Schicht erzeugt wird, die Silberchlorid und Protein enthält,

(III) Behandeln der dünnen Schicht mit einem Vernetzungsmittel, wodurch die erste hydrophile Gelschicht (1) erzeugt wird, und

(IV) Vorsehen einer zweiten hydrophilen Geischicht (2) auf der ersten hydrophilen Gelschicht (1), wobei die zweite hydrophile Gelschicht (2) dafür vorgesehen ist, mit der zu messenden Elektrolytlösung in Kontakt gebracht zu werden.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt IV

- entweder ein separat hergestelltes Gel auf die erste hydrophile Gelschicht (1) aufgebracht wird

- oder eine Lösung eines Proteins und eines Vernetzungsmittels auf die erste hydrophile Gelschicht (1) aufgebracht und auf dieser ersten hydrophilen Gelschicht (1) in ein Gel übergeführt wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß

- ein Polysaccharid, vorzugsweise Agarose, Agaropektin und/oder κ-Carrageenan,

- ein hydrophiles synthetisches Polymer, vorzugsweise ein Polyacrylamid und/oder ein Polyvinylalkohol, oder

- ein Protein, vorzugsweise ein Albumin, ein Globulin und/oder Gelatine,

für die zweite hydrophile Gelschicht (2) verwendet werden.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß ein Protein verwendet wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere Aldehyde, die unter Formaldehyd, Glutaraldehyd und Glyoxal ausge-wählt werden, als Vernetzungsmittel für ein Protein verwendet werden.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte III und IV die folgenden Teilschritte umfassen:

- Aufbringen einer Lösung, die das Protein und das Vernetzungsmittel enthält, auf die erhaltene Silberelektrode (6) und

- Vernetzen des Proteins, wodurch die erste und die zweite hydrophile Gelschicht (1, 2), die das gleiche Protein enthalten, gleichzeitig erzeugt werden.