DE3889724T2

DE3889724T2 - Immobilisierte enzymelektroden sowie eine methode zur reduzierung der alkoholempfindlichkeit.

Info

Publication number: DE3889724T2
Application number: DE3889724T
Authority: DE
Inventors: William Mullen
Original assignee: CAMBRIDGE LIFE SCIENCES
Current assignee: CAMBRIDGE LIFE SCIENCES
Priority date: 1987-10-19
Filing date: 1988-10-19
Publication date: 1994-11-03
Anticipated expiration: 2008-10-20
Also published as: GB8824470D0; JP2636917B2; JPH02501679A; GB8724446D0; EP0343203B1; EP0343203A1; US5231028A; GB2211300A; DE3889724D1; WO1989003871A1; GB2211300B

Description

Diese Erfindung betrifft verbesserte bzw. modifizierte Enzymelektroden des aus unserer früheren europäischen Patentanmeldung Nr. 87304688 (Veröffentlichungsnummer EP-A-0247850) bekannten Typs.
Aus jener Anmeldung sind Enzymelektroden mit verbesserter Empfindlichkeit und kürzeren Ansprechzeiten bekannt, die aus einer auf einem elektrisch leitfähigem Schichtträger aus Kohlenstoff immobilisierten Enzymschicht bestehen, ganz besonders einem elektrisch leitfähigen Schichtträger aus Kohlenstoff mit einer heterogenen porösen Oberflächenschicht, auf der das Enzym immobilisiert ist und die im wesentlichen aus feinverteilten Teilchen eines Metalls der Platingruppe, d. h. Platin oder Palladium, bestehen, die in einer porösen Matrix aus harzgebundenen Kohlenstoff- oder Graphitteilchen gleichmäßig verteilt sind. Als Harzbindemittel sind hydrophobe Harzbindemittel, insbesondere Fluorkohlenstoffharze, vor allem Polytetrafluorethylen, bevorzugt.
Die heterogene poröse Oberflächenschicht ist vorzugsweise als harzgebundene Oberflächenschicht auf einem darunterliegenden elektrisch leitfähigen Träger, z. B. einer Metallfolie, oder besonders bevorzugt einer Folie aus elektrisch leitfähigem Kohlepapier ausgebildet. Wahlweise kann die poröse Oberflächenschicht als harzgebundene Oberflächenschicht auf einem Fasergewebe aus elektrisch leitfähigen Fasern, z. B. einem Fasergewebe aus Kohlenstoffasern ausgebildet sein.
Wahlweise kann es sich bei der heterogenen porösen Oberflächenschicht auch um eine integrale, selbsttragende Schicht aus harzgebundenen Kohlenstoff- oder Graphitteilchen handeln, in der das feinverteilte Metall der Platingruppe im wesentlichen gleichmäßig verteilt ist.
Die das feinverteilte Metall der Platingruppe enthaltende Schicht aus harzgebundenen Kohlenstoff- oder Graphitteilchen läßt sich zwar durch geeignetes Pressen einer einheitlichen Mischung aus Kohlenstoff- oder Graphitteilchen und dem feinverteilten Metall der Platingruppe herstellen, doch wird das feinverteilte Metall der Platingruppe vorzugsweise vor dem Pressen unter Bildung der harzgebundenen Schicht auf der Oberfläche der Kohlenstoff- oder Graphitteilchen voradsorbiert. Die nach dieser aus GB-A-13 57 494, US-A-40 44 193 und US-A-41 66 143 im einzelnen bekannten Methode hergestellten Materialien sowie deren aus US-A-42 29 490 und aus US-A-42 93 396 bekannte Versionen mit Träger sind in Wirklichkeit handelsübliche Materialien, die bisher als Gasdiffusionselektroden in Brennstoff Zellen verwendet wurden und von der Firma Prototech aus Newton Highlands, Massachusetts, Vereinigte Staaten von Amerika, erhältlich sind.
Die oben beschriebenen und aus der vorherigen Anmeldung genauer bekannten neuartigen Enzymelektroden sind zwar insoweit höchst vorteilhaft, als sie zu extrem kurzen Ansprechzeiten, hohen Abgabestromdichten, bemerkenswerter Lagerstabilität in nassem Zustand führen und verhältnismäßig geringe Betriebsspannungen erfordern, wodurch wenig Untergrundrauschen entsteht, doch hat es sich gezeigt, daß diese Enzymelektroden alkoholempfindlich sind, d. h. daß sie in Gegenwart von Alkohol, vor allem Ethanol, beim Ablesen falsche Werte ergeben und zu einem allgemeinen Anstieg des Untergrundrauschens führen, und daher nicht zur zuverlässigen Bestimmung von Analyten, z. B. Glucose, in Proben mit Anteilen an Alkohol (Ethanol) eingesetzt werden können.
Aus der JP-A-56/163 447 ist eine Enzymelektrode bekannt, die aus einem elektrisch leitfähigen Schichtträger aus Kohlenstoff als Träger für eine Schicht aus immobilisiertem Enzym, z. B. einer immobilisierten Glucose-oxidase, besteht. Der elektrisch leitfähige Schichtträger selbst besteht aus Preßgraphit mit bis zu 10 Gewicht steilen eines Fluorkohlenstoffharzes als Bindemittel sowie einer darauf z. B. elektrolytisch oder durch Aufdampfen abgeschiedenen dünnen (weniger als 1 um dicken) Schicht aus Platin. Die Erfindung soll die bei der direkten Immobilisierung des Enzyms auf einer Platinoberfläche auftretenden Probleme vermeiden und eine Enzymelektrode ergeben, die durch kurze Ansprechzeiten (5 Sekunden), hohe Empfindlichkeit und Haltbarkeit gekennzeichnet sein soll. Beim Nacharbeiten mit solchen Elektroden im Zusammenhang mit der Patentierbarkeit von Enzymelektroden der aus EP-A-02 47 850 bekannten Art konnten jedoch keine derartigen Vorteile erzielt werden. Auch die JP-A-56/163 447 ist für die dieser Erfindung zugrundeliegenden Aufgabe, nämlich die Alkoholempfindlichkeit der aus der EP-A-02 47 850 bekannten Enzymelektroden zu überwinden, irrelevant.
Aus der US-A-49 70 145 von Nakamura et al., sind Enzymelektroden bekannt, die aus einer Oxidase wie Glucose-oxidase bestehen, die auf einem ein Metalloxid, z. B. Rutheniumoxid, enthaltenden, elektrisch leitfähigen Schichtträger aus Graphit immobilisiert ist eine mit der Enzymreaktion gekoppelte Redoxreaktion eingehen sowie eine elektronenübertragende Wirkung zwischen dem Enzym und dem Elektronenfänger, d. h. dem Graphit, im Verlauf der enzymatischen Reaktion ausüben kann. Das Ziel von Nakamura et al. besteht vor allem darin, die verzögerte Reaktion derartiger Enzymelektroden, d. h. die Oxidation des durch die Enzymreaktion gebildeten H&sub2;O&sub2;, an der Oberfläche eines Elektronenfängers, wobei diese Ansprechgeschwindigkeit aufgrund der geringen Geschwindigkeit, mit der das H&sub2;O&sub2; an die Oberfläche des Elektronenfängers diffundiert, niedrig ist, und die Ansprechempfindlichkeit der Elektrode gegenüber den Konzentrationen an gelöstem Sauerstoff zu unterbinden. Laut Nakumara et al. erhält man Enzymelektroden mit verbesserter Ansprechzeit und verbesserter Empfindlichkeit gegenüber den Konzentrationen an gelöstem Sauerstoff, wenn man zuerst RuO&sub2;- Pulver mit Graphitpulver vermischt und dann das Mischpulver mittels einer Scheibenpresse zu einer Feststoffscheibe verpreßt, wobei das Graphit und das RuO&sub2; eine Feststoffeinheit ergeben. Danach wird auf die Scheibenoberfläche eine Glukose-oxidaselösung aufgetragen und das Enzym darauf durch Vernetzen immobilisiert. Bei einem alternativen Verfahren kann mit dem Metalloxid, d. h. dem RuO&sub2;, auf der Oberfläche des Elektronenfängers z. B. durch thermische Zersetzung, Elektroabscheidung oder Aufdampfen eine dünne Schicht gebildet werden. Bei einer weiteren Alternative kann das RuO&sub2; selbst als Elektronenfänger dienen und wird zu diesem Zweck als Oberflächenschicht auf einer darunterliegenden Glasplatte abgeschieden. Der Aufbau der Elektrode von Nakamura et al. ist angeblich in Abbildungen 3 und 4 der US-A-43 92 933 gezeigt und besteht laut Beschreibung in Spalte 2, Zeile 63 bis Spalte 4 aus einer gepreßten Scheibe 3, die als eine Feststoffeinheit aus der Mischung aus Graphitpulver (3) und RuO&sub2;-Pulver (1 und 4, sic) gebildet wurde, wobei das Enzym (4) durch Vernetzen auf der Scheibenoberfläche (3) immobilisiert wurde und das Ganze eine Festkörper- Enzymelektrode (5) bildet.
Insoweit dortige Beschreibung überhaupt verständlich ist, scheint die Elektrode von Nakamura eine Feststoffstruktur zu sein, die aus RuO&sub2; und Graphit besteht und auf deren Oberfläche ein Enzym immobilisiert ist bzw. aus einer auf der Oberfläche einer Glasplatte befindlichen dünnen RuO&sub2;-Schicht zu bestehen, wobei diese Schicht als ihr eigener Elektronenfänger wirkt. Diese Elektroden scheinen sich daher in ihrem Aufbau stark von denen aus der EP-A-0247850 von Bennetto et al. bekannten zu unterscheiden, mit denen sich die vorliegende Erfindung befaßt, nämlich Enzymelektroden aus einer im wesentlichen porösen Schicht aus harzgebundenen Kohlenstoff- oder Graphitteilchen, die feinverteilte Teilchen eines Metalls der Platingruppe enthalten, die gleichmäßig in der gesamten Schicht verteilt sind und vorzugsweise vor dem Verkleben auf der Oberfläche der Kohlenstoff- oder Graphitteilchen voradsorbiert werden, wobei die poröse harzgebundene Schicht aus Kohlenstoff- oder Graphitteilchen und den feinverteilten Teilchen eines Metalls der Platingruppe ein auf ihrer Oberfläche immobilisiertes oder adsorbiertes Enzym aufweist. Desweiteren wurde von Nakamura das Problem der Alkoholempfindlichkeit von Enzymelektroden dieses allgemeinen Typs überhaupt nicht erkannt und auch keine Antwort auf dieses Problem gegeben, und das, obwohl neben vielen anderen als geeignete Alternative für RuO&sub2; als Elektronentransfermittel mittels einer mit dem Elektronenfänger gekoppelten Redoxreaktion angegebenen Oxiden auch Platinoxid aufgeführt ist. Dieses wird wohl lediglich als Alternative zu RuO&sub2; angesehen, ohne daß dessen spezieller Charakter erkannt wird und auch keinerlei Andeutung über dessen inzwischen identifizierte Rolle bei der Lösung des Problems der Alkoholempfindlichkeit von Enzymelektroden des von Bennetto et al. in der EP 02 47 850 beschriebenen Typs gegeben wird.
In Anal. Chem. (1984) 56, 2891 - 96, wurde von Castner et al. das Nernst'sche Verhalten von auf Platin basierenden Enzymelektroden, d. h. mit direkt auf der Oberfläche einer Platinelektrode immobilisierter Glucoseoxidase unter Verwendung von vier verschiedenen Verfahren der elektrochemischen Oberflächenbehandlung der Elektrode, nämlich Oxidation, Reduktion, Doppelschicht und Platin(IV)-chlorid und ebenfalls unter Verwendung einer flammbehandelten Platinoberfläche verglichen. Hierbei handelte es sich eher um potentiometrische als um amperometrische Untersuchungen, aus denen hervorging, daß beim potentiometrischen Ansprechen solcher Elektroden, d. h. dem Ansprechen der Elektrode auf die Oxidation von H&sub2;O&sub2; an der Platinoberfläche, vor allem im Vergleich zur elektrochemischen Oxidation von H&sub2;O&sub2; an einer glatten Platinoberfläche, starke Unterschiede auftraten. Diese Autoren kamen zu dem Schluß, daß beim potentiometrischen Ansprechen solcher Sensoren zwar beträchtliche Schwankungen auftraten, es jedoch bei dem gegenwärtigen Kenntnis stand in der Oberflächenchemie von Platinoxid und aufgrund der Beteiligung verschiedener Arten von Platinoxid das potentiometrische Ansprechen solcher Elektroden zu ungewiß sei, um diese Prinzipien bei der Entwicklung eines praktischen Glucosesensors anzuwenden. Die Versuche von Castner et al. sind wohl vollkommen irrelevant für das Problem der amperometrischen Ansprechempfindlichkeit von auf Platin basierenden Elektroden des Bennetto-Typs in Gegenwart von Alkohol (Ethanol) in der Probe.
Gemäß einem ersten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung hat es sich gezeigt, daß diese Alkoholempfindlichkeit unter Kontrolle gebracht werden kann, wenn man als feinverteiltes Metall der Platingruppe feinverteiltes Platin verwendet, das einer kontrollierten Oxidationsbehandlung unterzogen wurde, wodurch auf der Oberfläche der Metallteilchen eine dünne Oxidschicht entsteht. Dies kann zwar vor der Bildung des Elektrodenschichtträgers geschehen, d. h. vor dem Pressen der platinierten Kohlenstoff- oder Graphitteilchen oder der Pulvermischung aus feinverteiltem Platinmetall und Kohlenstoff oder Graphit, doch läßt sich die Oberflächenoxidation in einfacherer Weise durch Anodisierung der Metallteilchen in situ erzielen, indem man das Elektrodenmaterial z. B. einer Polarisationsbehandlung unterzieht, die vor oder nach, vorzugsweise vor, der Immobilisierung des Enzyms stattfinden kann.
In einem zweiten Gesichtspunkt hat es sich gezeigt, daß sich das Metall der Platingruppe bei Enzymelektroden des obigen Typs ganz oder teilweise durch Platinoxid ersetzen läßt. Wie zuvor kann die Bildung des elektrisch leitfähigen Trägers für das immobilisierte Enzym dadurch erfolgen, daß man eine zuvor gebildete Mischung aus pulverförmigem Kohlenstoff oder Graphit, pulverförmigem Platinoxid mit oder ohne zusätzlichem feinverteiltem Metall der Platingruppe, sowie einem Harzbindemittel, vorzugsweise einem hydrophoben Harzbindemittel, z. B. einem Fluorkohlenstoffharz wie Polytetrafluorethylen, entweder zu einer selbstragenden porösen Schicht aus harzgebundenen Kohlenstoff- oder Graphitteilchen, wobei das Platinoxid und das gegebenenfalls vorhandene Platinmetall in der gesamten Schicht im wesentlichen gleichmäßig verteilt sind, oder besonders bevorzugt zu einer porösen Oberflächenschicht auf einem darunterliegenden, vorzugsweise elektrisch leitfähigen Träger, z. B. aus Metall, elektrisch leitfähigem Kohlepapier oder einem Gewebe aus Kohlenstoffaser, verpreßt. Besonders bevorzugt wird das Platinoxid jedoch mit oder ohne zusätzlichem Platinmetall vor dem Verkleben mit dem Harz auf der Oberfläche der pulverförmigen Kohlenstoff- oder Graphitteilchen adsorbiert. Wahlweise kann gemäß dem ersten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung feinverteiltes Platinmetall eingesetzt werden, dessen Teilchenoberfläche unter Bildung einer dünnen Oxidschicht entweder vor oder nach dessen Adsorption auf den Kohlenstoff- oder Graphitteilchen unter kontrollierten Bedingungen oxidiert wird.
Als Kohlenstoffpulver lassen sich alle geeigneten Kohlenstoff- oder Graphitpulver einsetzen, die in einfacher Weise die nachfolgende Immobilisierung des Enzyms ermöglichen, und deshalb sollten Kohlenstoffpulver zum Einsatz kommen, die an der Oberfläche eine hohe Dichte an funktionellen Gruppen wie Carboxylat-, Amino- und schwefelhaltige Gruppen aufweisen, im Gegensatz zu den mehr glasartigen und gläsernen Kohlenstoffen, durch die Enzyme nur schlecht gebunden werden. Die Teilchengröße kann im Bereich von 3 bis 50 nm, normalerweise 5 bis 30 nm, liegen.
Das Platinoxid, worunter nachstehend oxidierte, d. h. anodisierte, Platinteilchen zu verstehen sind, läßt sich auf den Kohlenstoffteilchen auf jede beliebige übliche Weise abscheiden, z. B. durch Adsorption auf die Kohlenstoff- oder Graphitteilchen aus einer Suspension in einem geeigneten flüssigen Träger, wobei sich Platinoxid- Beladungen von 0,1 bis 20, vorzugsweise 0,5 bis 5, Gew.%, bezogen auf das Kohlenstoffgewicht, ergeben. Hierbei handelt es sich jedoch um praktische und nicht kritische Grenzwerte. Unterhalb etwa 0,1% Platinoxid fällt das Abgabesignal auf einen Wert, der mit Ausnahme der Verwendung sehr empfindlicher Apparaturen zur praktischen Messung zu niedrig ist. Oberhalb etwa 20% wird die Platinoxid-Beladung unwirtschaftlich und ergibt wenig zusätzliche Vorteile hinsichtlich Ansprechzeit, Empfindlichkeit usw . . Bei extrem hohen Metallbeladungen beginnt die Empfindlichkeit sogar zu fallen.
Im Anschluß an die Abscheidung oder Adsorption des Platinoxids auf den Kohlenstoff- oder Graphitteilchen wird das Pulver unter Verwendung eines geeigneten Harzbindemittels, vorzugsweise eines Fluorkohlenstoffharzes wie Polytetrafluorethylen, entweder zu einem vollständig selbstragenden porösen Formkörper im wesentlichen aus harzgebundenen, oxidhaltigen pulverförmigen Kohlenstoffteilchen, oder besonders bevorzugt zu einer porösen gepreßten Oberflächenschicht aus mit einem elektrisch leitfähigen Schichtträger, z. B. aus Metall, Kohlenstoff oder Graphit, verklebten harzgebundenen Teilchen verpreßt. Als Schichtträgermaterial für die verpreßte, harzgebundene, platinierte Kohlenstoffschicht ist Kohlepapier gemäß der Lehre der US-A-42 29 490 oder offenporiges Kohlenstoffgewebe gemäß der Lehre der US-A-42 93 396 besonders bevorzugt. Zum Erhalt der maximalen Porosität sollte als Bindemittel die für die mechanische Integrität und Stabilität der Elektrodenschicht notwendige Mindestmenge an Harz verwendet werden, wobei diese Schicht im allgemeinen eine Dicke von nicht mehr als etwa 0,1 bis 0,5 mm aufweist, größere Dicken jedoch auch zur Anwendung kommen können. Je nach den Anforderungen an die strukturelle Integrität, mechanische Festigkeit und Porosität ist die Menge an Bindeharz nicht kritisch und kann im Bereich von nicht mehr als 5 oder 10 Gew.% bis hin zu 80 Gew.% liegen, bezogen auf die Menge an oxidhaltigem Kohlenstoffpulver, wobei diese Menge jedoch normalerweise im Bereich von 30 bis 70 Gew.% liegt. Hierbei läßt sich eine Reihe von Harzen verwenden, darunter leitende oder halbleitende Harze, aber vorzugsweise synthetische Fluorkohlenstoffharze, insbesondere Polytetrafluorethylen. Da für den Oxidationsvorgang eine, zwar geringe, Menge an Sauerstoff erforderlich ist, ist es wesentlich, daß das Bindemittel sauerstoffdurchlässig ist. Zu diesem Zweck sollte das Bindemittel eine Mindestsauerstofflöslichkeit bei Normaldruck von mindestens 2 · 10&supmin;³ cm³ O&sub2; (bei Normaltemperatur und -druck gemessen) pro cm³ Polymer aufweisen.
Geeignete Bindemittel sowie deren dem The Polymer Handbook (Hrsg. J. Brandrup und E.H. Immergut) 1. Ausgabe (1967), Interscience, entnommenen bekannten Sauerstofflöslichkeiten sind im folgenden aufgeführt:
S x 10² (cm³)
Polytetrafluorethylen (PTFE) 0, 276
Fluorkohlenstoffpolymere außer PTFE Variabel, 0,2 und höher
Polyethylmethacrylat 8 , 6
Polystyrol 18,2 (berechnet)
Polyvinylacetat 6,3
Polyvinylchlorid 2 , 92
Polycarbonat 0,51
Poly-(4-methyl-1-penten) 24,3
Polyisopren 10,3
Polychloropren 7,5
Poly-1,3-butadien 9,7
Silikongummi 31,1
Die erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzten Schichtträger für die Enzymelektroden sind in Wirklichkeit den von der Firma Prototech aus Newton Highlands, Massachusetts, vertriebenen platinierten Elektrodenmaterialien aus Kohlenstoff, die bisher als elektrokatalytische Gasdiffusionselektroden in Brennstoffzellen verwendet wurden, worin jedoch die Platinkomponente durch Platinoxid ersetzt ist, oder bei denen die Platinkomponente vor der Adsorption auf dem Kohlenstoffpulver anodisiert wird, ähnlich. Die Herstellung solcher Materialien ähnelt der in der US-A-40 44 193, US-A-41 66 143, US-A-42 93 396 sowie US-A-44 78 696 im einzelnen beschriebenen - ausführliche Beschreibung siehe dort - außer, daß anstelle feinverteilten Platins feinverteiltes Platinoxid eingesetzt wird, oder aber das feinverteilte Platin vor oder nach der Adsorption auf den Kohlenstoff oder Graphit und/oder vor oder nach dem Pressen mit dem Harz einer Oberflächenoxidation, z. B. einer Polarisationsbehandlung, unterzogen wird. Im allgemeinen wird jedoch kolloides Platin oder Platinoxid mit einer Teilchengröße im Bereich von 15 bis 25 Angstrom (1,5 bis 2,5 nm) zum Beispiel durch Bildung eines Platin-Sols in situ in Gegenwart pulverförmigen Kohlenstoffs, der als Keimbildner für das Sol wirkt, auf der Oberfläche des pulverförmigen Kohlenstoffs (Teilchengröße 50 bis 300 Angstrom: 5 bis 30 nm) adsorbiert. Die platinierten Kohlenstoffteilchen werden dann mittels eines synthetischen Harzbindemittels, vorzugsweise eines Fluorkohlenstoffharzes und vor allem Polytetrafluorethylen, auf eine elektrisch leitfähige Trägerstruktur, z. B. eine Folie aus Kohlepapier, auf gepreßt und anschließend im Falle von feinverteiltem Platin einer Oberflächenoxidation, z. B. einer Polarisationsbehandlung, unterzogen, wobei sich auf den Platinteilchen eine oxidierte Oberfläche bildet.
Weiterhin können die Platin oder Platinoxid enthaltenden Kohlenstoffteilchen auf ein zuvor gebildetes porös es Kohlenstoffgewebe aufgetränkt und darin mittels des Harzbindemittels, vorzugsweise Polytetrafluorethylen, erneut vor oder nach Oberflächenoxidation des feinverteilten Platins verklebt werden. Als weitere Möglichkeit können Elektroden aus Kohlepapier des aus einem Träger aus Kohlepapier bestehenden Typs eingesetzt werden, der vorzugsweise mit einem wasserabweisenden Harz wie Polytetrafluorethylen getränkt ist und auf dem eine harzgebundene, mit einem Harzbindemittel, erneut vorzugsweise Polytetrafluorethylen, verklebten Katalysatorschicht entweder aus einer einheitlichen Mischung aus Platinoxid und Kohlenstoff- oder Graphitteilchen oder einer einheitlichen Mischung aus feinverteiltem Platin und Kohlenstoff oder Graphit z. B. mittels Siebdruck abgeschieden wird, wobei das feinverteilte Platin eine Oberflächenoxidschicht hat oder anschließend damit versehen wird.
Die Immobilisierung des Enzyms auf der Oberfläche des harzgebundenen Schichtträgers aus Kohlenstoff kann nach vielen verschiedenen anerkannten Immobilisierungsmethoden erfolgen, z. B. durch kovalente Bindung mit einem Reagens aus Carbodiimid- oder Carbonyldiimidazol, kovalente Bindung mit 1,6-Dinitro-3,4-difluorbenzol (DFDNB) oder Vernetzung mit Glutaraldehyd.
Als typische beispielhafte Protokolle zur Immobilisierung des Enzyms Glucose-oxidase sind die folgenden zu nennen:

A. Behandlung mit Carbodiimid

1. Elektroden geeigneter Größe aus der Folie aus Elektrodenmaterial aus schneiden.
2. Elektroden etwa 5 Minuten in Ethanol eintauchen, damit ein gründliches Benetzen des mit PTFE beschichteten Bindemittels und der Unterlage gewährleistet wird.
3. Elektroden aus dem Ethanol herausnehmen und gründlich mit destilliertem Wasser waschen, um alle Spuren von Ethanol zu entfernen.
4. 5 ml (oder weniger) einer 0,15 M Lösung aus 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholino)carbodiimid-p- methyltoluolsulfonat in 0,1 M Acetatpuffer (pH 4,5) herstellen und Elektroden darin 90 Minuten bei Zimmertemperatur lagern. Hierbei kann mittels eines mechanischen Schüttelapparats leicht gerührt werden. Schwimmen die Elektroden auf der Oberfläche der Lösung, so wurden sie nicht genügend benetzt, und die Behandlung ist ab Schritt 2 zu wiederholen.
5. Elektroden herausnehmen und sorgfältig mit destilliertem Wasser waschen. 90 Minuten bei Zimmertemperatur in einer frisch hergestellten Lösung aus Glucose-oxidase (5,0 mg/ml) in Acetatpuffer (pH 5,6) unter leichtem mechanischen Schütteln lagern.
6. Elektroden aus der Enzymlösung herausnehmen und gründlich mit 0,1 M Acetatpuffer waschen. Die Elektroden sind dann betriebsbereit.
7. Elektroden bei 4ºC in 0,1 M Acetatpuffer (pH 5,6) lagern.
B. Behandlung mit Carbonyldiimidazol:
1. Schritt 1 wie oben durchführen und Schritte 2 und 3 auslassen.
2. Eine Lösung aus N'N'-Carbonyldiimidazol in wasserfreiem Dimethylformamid (40 mg/ml) herstellen.
3. Elektroden 90 Minuten bei Zimmertemperatur in dieser Lösung gegebenenfalls unter leichtem mechanischen Schütteln lagern.
4. Elektroden aus der Lösung nehmen und, vor dem Lagern in einer frisch hergestellten Lösung aus Glucoseoxidase während weiterer 90 Minuten, durch Entfernen überschüssiger Carbonyldiimidazol-Lösung trocknen.
5. Schritte 6 und 7 wie oben durchführen.

C. Behandlung mit DFDNB

1. Schritte 1-3 wie oben unter A durchführen.
2. Elektroden gründlich in Natriumboratpuffer (0,1 M, pH 8,5) waschen.
3. Eine Lösung aus 1,6-Dinitro-3,4-difluorbenzol in Methanol (0,1021 g/5 ml) herstellen und die Elektroden darin 10 Minuten bei Zimmertemperatur lagern.
4. Elektroden herausnehmen und, vor dem Lagern in einer Lösung aus Glucose-oxidase während weiterer 90 Minuten bei Zimmertemperatur, gründlich mit Natriumboratpuffer waschen.
5. Schritte 6 und 7 wie oben unter A durchführen.
Für das Immobilisierungsverfahren lassen sich auch andere Arten von Kupplungsmitteln verwenden, darunter difunktionelle Mittel verschiedener Kettenlänge, z. B. Diimidate wie Dimethylmalonsäureimidat oder Dimethylkorksäureimidat.
Bei dem alternativen Verfahren wurde festgestellt, daß bei manchen Enzymen und insbesondere bei Glucose-oxidase eine einfache Adsorption des Enzyms auf den platinoxidhaltigen Träger aus harzgebundenem Kohlenstoffpulver, d. h. ohne Vernetzung, wirksam ist.
Normalerweise, aber nicht notwendigerweise, wird die Oberflächenschicht aus immobilisiertem Enzym durch Anwendung einer entsprechend porösen Schicht oder Membran z. B. aus Polycarbonat, die natürlich für das zu bestimmende Enzymsubstrat (Glucose) durchlässig sein muß, physikalisch geschützt. Solche Membrane sind insofern etwas nachteilig, als sie zur Erhöhung der Ansprechzeiten des Sensors führen, doch sogar mit solch einer Membran sind die vorliegenden Sensoren immer noch zu Ansprechzeiten fähig, die denen herkömmlicher Enzymelektroden vergleichbar und in vielen Fällen weit überlegen sind.
Wie bereits dargelegt, betrifft die Erfindung insbesondere Glucose-oxidase-Elektroden, d. h. solche, bei denen das immobilisierte Enzym Glucose-oxidase ist, doch versteht es sich von selbst, daß auch andere Oxidoreduktasen verwendbar sind, wenn auch nicht immer mit gleichwertiger Wirkung. Dies beruht nicht notwendigerweise darauf, daß das Enzym von Natur aus unwirksam ist, sondern auf anderen Faktoren. Z.B. erfolgt bei der Bestimmung von Oxalsäure mit Oxalat-oxidase eine elektrochemische Oxidation des Substrats aus Oxalsäure selbst an der Basiselektrode, wodurch alle vom Enzym ausgehenden Effekte weitgehend maskiert werden. Geeignet sind jedoch andere Oxido-reduktasen, unter anderem Lactat-oxidase, Galactose-oxidase, Cholesterin-oxidase sowie andere peroxidbildende Enzyme sowie ebenfalls Kombinationen aus immobilisierten Enzymen, wozu auch Kombinationen aus einer Nichtoxidase und einer Oxidase zählen, bei denen die erstere auf das betreffende Substrat unter Bildung eines oxidierbaren Substrats für die Oxidase einwirkt, und die letztere auf das oxidierbare Produkt einwirkt und so ein der Konzentration des betreffenden Substrats proportionaler meßbarer Strom entsteht. Eine solche Kombination ist etwa die Kombination aus beta- Galactosidase und Glucose-oxidase (zur quantitativen Bestimmung von Lactose), oder die Kombination aus betaglucan-depolymerisierendem Enzym, beta-Glucosidase und Glucose-oxidase (zur Bestimmung von beta-Glucanen).
Desweiteren kommen als Sensoranwendungen die Verwendung von enzymischen oder nichtenzymischen Reagenzien oder Verfahren in Frage, die mit dem betreffenden Primärsubstrat in einer Vorläuferreaktion in Wechselwirkung treten, wobei das dabei entstehende Produkt eine Substanz aufweist, die ihrerseits als Substrat für eine erfindungsgemäße Enzymelektrode wirkt. Für solche Vorläuferschritte lassen sich viele Beispiele auf dem Gebiet immunochemischer Reaktionen finden, wobei die Verfahren, bei denen solche Reaktionen beim Aufbau von Sensoren, u. a. Immunosensoren, unter Verwendung der Enzymelektroden gemäß der vorliegenden Erfindung angewendet werden, für den Fachmann ohne weiteres ersichtlich sind.
In erster Linie werden die erfindungsgemäßen Elektroden jedoch als Biosensoren zum Nachweis und/oder zur quantitativen Bestimmung eines oxidierbaren Substrats, vor allem Glucose, in einer Probe, vor allem einer klinischen Probe wie Blut, Serum, Plasma, Urin, Schweiß, Tränen und Speichel verwendet. Gerade bei solchen Anwendungen ist die relative Unempfindlichkeit der vorliegenden oxidhaltigen Elektrode gegenüber Ethanol von besonderem Vorteil.
Andere mögliche, nichtklinische Anwendungen sind z. B.:
(a) Überwachung der Fermentation
(b) Verfahrenstechnische Steuerung
(c) Umweltschutzkontrolle, z. B. Überwachung des Abwassers und der Verunreinigung von Flüssigkeiten und Gasen,
(d) Untersuchung von Lebensmitteln,
(e) Veterinäranwendungen, insbesondere Anwendungen in Zusammenhang mit den oben vorgeschlagenen klinischen Anwendungen.
Insoweit die Bio- und anderen Sensoren mit eingebautem Enzymelektrodenmaterial gemäß der vorliegenden Erfindung gegebenenfalls andere strukturelle Elemente wie elektrische Leitungsdrähte, elektrisch nichtleitende (isolierende) Träger oder Sonden usw. aufweisen, so sind solche in deren Struktur vorhandene Elemente herkömmlich und bedürfen keiner ausführlichen Beschreibung. Es sei nur soviel gesagt, daß in den Fällen, in denen, wie dies meistens der Fall ist, das Elektrodenmaterial aus einer papierdünnen Folie oder Wafer besteht, der Biosensor normalerweise ein isolierendes Trägermaterial oder eine Sonde aufweist, auf dem oder der das Elektrodenmaterial angebracht ist und mit dessen oder deren Hilfe das Elektrodenmaterial in die Probe eingeführt werden kann. In solchen Fällen kann die tatsächliche Größe des Teils aus Elektrodenmaterial recht klein sein, und zwar nicht größer als einige Quadratmillimeter oder noch kleiner. Der elektrische Kontakt mit dem Elektrodenmaterial kann auf vielerlei Arten erfolgen, wie etwa durch direkten Kontakt des Elektrodenmaterials mit einem elektrisch leitfähigen Kontakt oder Anschluß, z. B. aus Platin, Silber oder einem anderen geeigneten Leiter. Ist das Elektrodenmaterial so dick und stabil, daß es vollkommen selbsttragend ist, kann man ohne isolierende Träger für das Elektrodenmaterial auskommen, und die elektrischen Leitungsdrähte können direkt an die Oberfläche des Elektrodenmaterials angeschlossen werden.
Bei dem alternativen Verfahren dieser Erfindung, d. h. der Oxidierung des feinverteilten Platinmetalls in situ, kann dies bei Enzymelektroden des aus der GB-A-21 91 003 bekannten Typs dadurch erreicht werden, daß man das elektrisch leitfähige Substrat vor oder nach der Immobiliserung des Enzyms einer Polarisationsbehandlung unterzieht, durch die die Oberfläche der in der Elektrode enthaltenen Platinteilchen anodisiert wird. Solch eine Behandlung kann durch eine kurzzeitige, z. B. 1 bis 30 Minuten dauernde Polarisation des Elektrodensubstrats mit einer bezüglich einer Silber/Silberchlorid-Elektrode positiven Spannung erfolgen. Der genaue Wert der angelegten Spannung ist nicht ausschlaggebend, doch kann die Behandlungsdauer unterhalb etwa +1000 mV zuviel Zeit in Anspruch nehmen. Analog wird auch der Maximalwert von praktischen Erwägungen bestimmt, da bei zu hoher Spannung eine zu hohe Stromdichte mit möglichen Folgeschäden oder möglicher Zerstörung des Elektrodenmaterials, ganz abgesehen von der Inaktivierung des Enzyms, entsteht. Als zufriedenstellend haben sich in der Praxis Polarisationsspannungen von +1000 mV bis +2000 mV, gemessen bezüglich einer Silber/Silberchlorid-Elektrode, erwiesen, vorzugsweise von +1200 mV bis +1500 mV, die zu einer relativ kurzen Behandlungsdauer, d. h. 1 bis 30 Minuten, führen.
In manchen Fällen läßt sich eine zyklische Polarisationsbehandlung mit abwechselnden Polarisationszyklen von z. B. ±2 Volt, vorzugsweise +1,5 Volt bis -1,5 Volt, bezüglich einer Silber/Silberchlorid-Elektrode verwenden, vorausgesetzt, die zyklische Polarisation endet bei einer bezüglich einer Silber /Silberchlorid-Elektrode positiven Spannung endet. Polarisation, oder Beendigung des Zyklus, bei einer bezüglich einer Silber/Silberchlorid-Elektrode negativen Spannung kann zu einer Erhöhung der Ethanolempfindlichkeit führen.
Die mit dem obigen Verfahren erzielte Verringerung der Ethanolempfindlichkeit wird durch die nachfolgenden Daten veranschaulicht. Zu diesem Zweck wurde die Stromabgabe an 2-mm-Scheiben aus platiniertem Kohlepapier (von der Firma Prototech bezogen) in Gegenwart von 1% V/V Ethanol mit einer Zelle des in Abbildung 15 der Zeichnungen der GB-A-2 191 003 gezeigten Typs gemessen. Zur Messung des Ansprechens von Ethanol wurde das Elektrodenmaterial bei verschiedenen Spannungen wie angegeben polarisiert und sowohl vor als auch nach der Polarisation vermessen. Betriebsspannung mV Abgabestrom (uA) 1% V/V Ethanol Platiniertes Kohlepapier (unbehandelt) Platiniertes Kohlepapier nach zyklischer Polarisation
Die nachfolgenden Daten wurden mit Enzymelektroden eines Durchmessers von 2 mm des aus der GB-A-2 191 003 bekannten Typs bestehend aus auf einem von der Firma Prototech bezogenen Elektrodenmaterial aus platiniertem Kohlepapier immobilisierter Glucose-oxidase unter Verwendung der aus jener Patentanmeldung bekannten polarographischen Zelle, deren Elektroden vor Immobilisierung des Enzyms anodisch polarisiert wurden, erzielt. Dieselben analog behandelten Elektroden wurden auch mit einer 0,2%igen V/V Ethanollösung auf Ethanolempfindlichkeit hin untersucht. Die Polarisation erfolgte in einer 3-Elektrodenzelle bei den angegebenen Spannungen bezüglich einer Silber/Silberchlorid- Elektrode: Polarisationsbehandlung Strom uA 10 mM Glucose 0,2% V/V Ethanol Unpolarisierte Elektrode
Diese Ergebnisse zeigen die durch die Polarisationsbehandlung erzielte erhebliche (> 12 x) Verringerung der Ethanolempfindlichkeit.
Zur Veranschaulichung der Verwendung von Platinoxid wurde eine den in der GB-A-2 191 003 beschriebenen Elektroden ähnliche Elektrode aus Kohlepapier, die jedoch an Stelle von Platin feinverteiltes Platinoxid enthielt, das vor dem Verkleben mit einem Träger aus Kohlepapier auf den Kohlenstoffteilchen vordispergiert wurde, in einen 5 mg/ml Glucose-oxidase enthaltenden Phosphatpuffer (pH 7) übernacht eingetaucht. Dies bewirkte eine Adsorption der Glucose-oxidase auf die Oberfläche der platinoxidhaltigen Elektrode aus Kohlepapier. Die Bestimmung der Empfindlichkeit des Enzymelektrodenmaterials gegenüber Glucose und Ethanol erfolgte auf die zuvor beschriebene Weise mit einer 2-mm Scheibe aus Elektrodenmaterial bei einer angelegten Spannung von 280 mV:
10 mM Glucose 0,2% V/V Ethanol
Stromabgabe (uA) 7,0 0,1
Diese Zahlen zeigen erneut die hohe Substratempfindlichkeit und die beim Einsatz von Enzymelektroden aus platinoxidhaltigem harzgebundenem Kohlepapier erzielte niedrige Alkohol (Ethanol) -empfindlichkeit.

Claims

1. Enzymelektrode des Typs bestehend aus (a) einem elektrisch leitfähigen Träger aus einer porösen, elektrisch leitfähigen Schicht aus harzgebundenen Kohlenstoff- oder Graphitteilchen mit feinverteilten aus einem Metall der Platingruppe bestehenden oder dieses enthaltenden Teilchen, die in der gesamten Schicht verteilt sind und mit den Kohlenstoff- oder Graphitteilchen in engem Kontakt stehen, wobei die Kohlenstoff- oder Graphitteilchen und die feinverteilten aus einem Metall der Platingruppe bestehenden oder dieses enthaltenden Teilchen mittels eines Kunstharzes miteinander zu einer heterogenen, porösen Trägerschicht, die im wesentlichen aus harzgebundenen Kohlenstoff- oder Graphitteilchen mit feinverteilten aus einem Metall der Platingruppe bestehenden oder dieses enthaltenden Teilchen besteht, die in der Schicht gleichmäßig verteilt sind, verklebt sind und (b) einem auf der Oberfläche dieser porösen Schicht immobilisierten oder adsorbierten Enzym, wobei die Elektrode bei deren Eintauchen in eine, ein Substrat für das Enzym enthaltende Flüssigprobe auf die Aktivität des Enzyms anspricht, dadurch gekennzeichnet, daß die Metall- oder metallhaltigen Teilchen entweder i) Teilchen sind, die vollständig aus Platinoxid bestehen oder ii) Platinteilchen sind, die zur Herstellung einer Oberflächenschicht aus Platinoxid auf der Teilchenoberfläche oxidiert sind.

2. Enzymelektrode nach Anspruch 1, worin das Bindemittel ein hydrophobes Kunstharz ist.

3. Enzymelektrode nach Anspruch 1 oder 2, worin das Bindemittel aus Kunstharz ein Fluorkohlenstoffharz ist.

4. Enzymelektrode nach Anspruch 3, worin das Bindemittel aus Kunstharz Polytetrafluorethylen ist.

5. Enzymelektrode nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Teilchen aus feinverteiltem Platinoxid oder feinverteiltem oxidiertem Platinmetall vor dem Verkleben der feinverteilten Kohlenstoff- oder Graphitteilchen unter Bildung der Schicht auf der Oberfläche der feinverteilten Kohlenstoff- oder Graphitteilchen voradsorbiert werden.

6. Enzymelektrode nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die heterogene Schicht aus harzgebundenen Kohlenstoff- oder Graphitteilchen feinverteilte Platinteilchen enthält, deren Oberfläche zur Bildung einer dünnen Oxidschicht anodisiert wurde.

7. Enzymelektrode nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das auf der Oberfläche des Schichtträgers immobilisierte oder adsorbierte Enzym eine Oxidoreduktase ist.

8. Enzymelektrode nach Anspruch 7, worin die Oxidoreduktase Glucose-oxidase ist.

9. Enzymelektrode nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die das feinverteilte Platinoxid oder die oxidierten Platinteilchen aufweisende heterogene Schicht aus harzgebundenen Kohlenstoff- oder Graphitteilchen als mit einem darunterliegenden Träger verbundene poröse Oberflächenschicht vorgesehen ist.

10. Enzymelektrode nach Anspruch 9, worin der zugrundeliegende Träger elektrisch leitfähig ist.

11. Enzymelektrode nach Anspruch 9, worin der elektrisch leitfähige Träger ein elektrisch leitfähiges Kohlepapier ist.

12. Enzymelektrode nach einem der Ansprüche 1 bis 11, deren Oberfläche durch eine für das Substrat durchlässige mikroporöse Membran geschützt ist.

13. Enzymelektrode nach Anspruch 12, worin die Membran eine Polycarbonatmembran ist.

14. Verfahren zur Verringerung der Alkoholempfindlichkeit von Enzymelektroden des Typs bestehend aus einem Enzym, das auf der Oberfläche eines eine poröse Schicht aus harzgebundenen Kohlenstoff- oder Graphitteilchen enthaltenden oder daraus bestehenden elektrisch leitfähigen Trägers immobilisiert oder adsorbiert ist, wobei mit diesen Teilchen feinverteiltes Platin innig vermischt oder vor der Schichtbildung auf der Oberfläche der einzelnen Teilchen abgeschieden oder adsorbiert wird, wodurch eine poröse Trägerschicht entsteht, auf der das Enzym immobilisiert oder adsorbiert wird, sowie einer im wesentlichen heterogenen Schicht aus harzgebundenen Kohlenstoff- oder Graphitteilchen, wobei das feinverteilte Platin im wesentlichen gleichmäßig in der gesamten Schicht verteilt ist, wobei das Verfahren darin besteht, daß man die Teilchen aus feinverteiltem Platin vor oder nach Einarbeitung in die Elektrode einer Anodisierungsbehandlung unterzieht, wodurch die Teilchen mit einer anodisierten Oberfläche versehen werden.

15. Verfahren nach Anspruch 14, worin die feinverteilten Platinteilchen nach deren Einarbeitung in die poröse Schicht und bevor oder nach der auf dieser Schicht erfolgenden Immobilisierung des Enzyms anodisiert werden.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin die Anodisierung durch eine Polarisationsbehandlung des elektrisch leitfähigen Trägers mit den darauf in die poröse Schicht eingearbeiteten Teilchen erfolgt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin die Anodisierungsbehandlung darin besteht, daß man den diese Teilchen aufweisenden elektrisch leitfähigen Träger 1 bis 30 Minuten lang einer Polarisation bei einer Spannung von +1 bis +2 Volt bezüglich einer Silber/Silberchlorid-Elektrode unterzieht.

18. Verfahren nach Anspruch 16, worin die Polarisationsbehandlung bei einer Spannung von etwa +1,5 Volt bezüglich einer Silber/Silberchlorid-Elektrode erfolgt.

19. Verfahren nach Anspruch 16, worin die Polarisationsbehandlung darin besteht, daß man die Elektrode 1 bis 30 Minuten lang einer zyklischen Polarisation bei einer Spannung von etwa ±2 Volt bezüglich einer Silber/Silberchlorid-Elektrode unterzieht.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin die zyklische Polarisationsbehandlung innerhalb des Bereichs ±1,5 Volt bezüglich einer Silber/Silberchlorid-Elektrode erfolgt.