DE3886237T2 - Reinigung von LFA-3. - Google Patents
Reinigung von LFA-3.Info
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Description
- Diese Erfindung betrifft T-Lymphozyt-Reaktionen.
- Antigenspezifisches, durch T-Lymphozyten vermitteltes Abtöten ist ein Mehrstufenprozeß, welcher Antigenerkennung durch einen zytolytischen T-Lymphozyten (CTL), Anhaften des CTL an eine Zielzelle, Austeilen eines tödlichen Schlages, und Zielzellenlysis umfaßt. Nachbarzellen und der CTL selbst bleiben bei der Abtötungsreaktion unbeschädigt, und der CTL kann sich ablösen und in weiteren Abtötungsreaktionen aktiv werden. Die Reaktion von Helfer-T-Lymphozyten auf Antigen, welche für das Einleiten der Immunreaktion auf zahlreiche Substanzen von wesentlicher Bedeutung ist, hängt ebenfalls von der Haftung der T-Lymphozyten an den antigentragenden Zellen ab. Die Reaktionen von Helfer-T-Lymphozyten werden anhand der Vermehrung von Lymphozyten oder der Produktion von IL-2 untersucht.
- Die molekulare Basis von durch CTL herbeigeführtem Abtöten und Reaktionen von Helfer-T-Lymphozyten wurde durch Herstellen monoklonaler Antikörper (mAK) für sowohl für CTLs als auch für ihre Ziele sowie Auswählen jener, welche die Abtötungsreaktion blockieren, untersucht. Monoklonale Antikörper auf LFA-1- (LFA steht für "lymphocyte function associated"), CD2- (auch LFA-2, T11 oder E-Rosettenrezeptor genannt) und LFA-3-Antigenmoleküle hemmen die Abtötung (Sanchez-Madrid et al., 79 Proc. Nat. Acad. Sci. 7489, 1982) und hemmen ebenfalls Reaktionen, die von Helfer-T-Lymphozyten abhängig sind.
- Human-LFA-3 ist ein Zelloberfächen-Glykoprotein, welches auf beinahe allen menschlichen Zellen exprimiert ist und ein mittleres Molekulargewicht von ungefähr 60.000 (Id.) besitzt. Es wird durch spezifische mAK immunpräzipitiert. LFA-3 wird auf Zielzellen und antigentragenden Zellen vorgefunden, und das Abtöten einer Zielzelle durch einen Effektor-CTL oder das Erkennen von antigentragenden Zellen durch Helfer-T-Lymphozyten wird durch Binden von LFA-3-mAK an die Zielzelle oder antigentragende Zellen blockiert. Insbesondere wird LFA-3 auf Monozyten, Granulozyten, CTLs, B-Lymphoblastzellinien, Blutplättchen, thymischen Epithelzellen, vaskulären Endothelzellen, glatter Muskulatur und Fibroblasten (Krensky et at., Human cytolytic T-lymphocyte clones and their function-associated cell surface molecules. In: Hybridoma technology in the biosciences and medicine, Hrsg.: Springer et al., Plenum Press, New York, 1985) vorgefunden.
- Gemäß einer Ausführungsform sieht die Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von LFA-3 vor, umfassend das Zusammenbnngen einer LFA-3 enthaltenden Flüssigkeit mit einer Affinitätssäule, welche Anti-LFA-3-Antikörper enthält, um LFA-3 an den Anti-LFA-3-Antikörper zu binden; das Waschen der Säule mit einem basischen Puffer, der einen pH-Wert aufweist, bei dem die Nicht-LFA-3-Proteine entfernt werden und LFA-3 zurückbehalten wird, und das darauffolgende Eluieren von LFA-3 aus der Affinitätssäule mittels eines Puffers, beispielsweise mittels eines sauren Puffers.
- Vorzugsweise umfaßt das Verfahren weiters das Durchleiten der LFA-3 enthaltenden Flüssigkeit durch eine Säule, die einen Antikörper enthält, welcher das LFA-3 nicht bindet, vor dem Zusammenbringen der Flüssigkeit mit der Affinitätssäule, um aus der Flüssigkeit jene Proteine zu entfernen, die nicht LFA-3 sind. Der pH-Wert des Waschpuffers kann zwischen 10 und 11 betragen, während der pH-Wert des sauren Puffers zwischen 2.5 und 4.0 liegen kann. Das LFA-3 wird aus Erythrozyten, Monozyten, Granulozyten, CTLs, B-Lymphoblastzellinien, Blutplättchen, vaskulären Endothelzellen, glatter Muskulatur oder Fibroblasten von Säugetieren oder anderen Zellen, welche LFA-3-Gene exprimieren, gereinigt; der Anti-LFA-3-Antikörper ist monoklonal; vor dem Hindurchleiten der LFA-3-enthaltenden Flüssigkeit wird das LFA-3 durch ein Reinigungsmittel oder eine Phospholipase, beispielsweise Phosphtidylinositol-phospholipase C, löslich gemacht; vorzugsweise ist das Reinigungsmittel nichtionisch; der irrelevante Antikörper ist IgG.
- Gemäß einer zweiten Ausführungsform sieht die Erfindung ein Verfahren zum Erkennen der Zellen, welche das CD-2-Antigen tragen, vor, wobei das Verfahren das Erkennen von Bindungen des LFA-3 an die Zellen umfaßt.
- Gemäß einer dritten Ausführungsform sieht die Erfindung ein Verfahren zum Trennen von Zellen, welche das CD-2-Antigen tragen, von anderen Zellen in einer Mischung vor, wobei das Verfahren das Zusammenbringen der Mischung mit einem festen Träger umfaßt der LFA-3 enthält, um CD-2-tragende Zellen daran zu binden.
- Gemäß einer vierten Ausfuhrungsform sieht die Erfindung im wesentlichen reines, biologisch aktives LFA-3 vor.
- Gemäß einer fünften Ausführungsform kann das LFA-3 als therapeutisches Mittel eingesetzt werden, um die Immunreaktion zu blockieren oder zu verstärken.
- Die diagnostischen und therapeutischen Verfahren der Erfindung, die sich aus unserer Entdeckung herleiten, sehen vor, daß die spezifische Rolle von LFA-3 in T-Lymphozytenanhaftung darin besteht, als Ligand für das T-Lymphozyten-Oberflächenmolekül CD2 zu wirken. CD2 ist ein Glykoprotein mit 50.000 Mr, welches auf allen T-Lymphozyten, Thymozyten sowie einer Population von großen, granulären Lymphozyten exprimiert ist, die Zellen mit natürlicher Killeraktivität umfassen. CD2 wird frühzeitig in der Differenzierung von T-Lymphozyten exprimiert, noch bevor diese in den Thymus eintreten. Kombinationen aus mAK auf CD2 bewirken die Vermehrung und Funktion von T-Lymphozyten, Thymozyten und natürlichen Killerzellen. Infolgedessen schlagen wir vor, daß der biologische Ligand von CD2, nämlich LFA-3, ähnliche Wirkungen aufweisen kann.
- LFA-3 und CD2 ist das erste Paar von Antigenen auf einer Zielzelle bzw. auf CTL, welches als ein Bindungspaar erkannt wird. Das heißt, die beiden Antigene interagieren, um das Erkennen der beiden Zelltypen zu ermöglichen. Ein Blockieren eines dieser Antigene durch einen mAK verhindert diese zelluläre Interaktion. Zusammen mit unserem neuen Reinigungsverfahren, welches LFA-3 in großen Mengen verfügbar machen wird, ermöglicht unsere Entdeckung der Rolle von LFA-3 das Erkennen von CTLs und anderen Zellen, welche CD2-Moleküle an ihrer Zelloberfläche aufweisen, und sie ermöglicht zudem das spezifische Blockieren des CD2-Moleküls durch das gereinigte LFA-3 ohne die Verwendung eines Antikörpers. Da LFA-3 ein natürlicher Bestandteil des menschlichen Körpers ist, kann es in Menschen eingebracht werden, ohne Immunreaktionen hervorzurufen. Im Gegensatz zu mAK, welche in nichtmenschlichen Spezies erzeugt werden, stimulieren sie die Produktion von Antikörpern und werden neutralisiert. LFA-3 ist weit verteilt und kann eine allgemeine Rolle bei der T-Lymphozytenanhaftung sowie bei der Rezirkulation, der extravaskulären Migration und der Entwickiung von T-Lymphozyten erfüllen.
- Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen deutlich aus der folgenden Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsformen und aus den Ansprüchen hervor.
- Zunächst wird die Zeichnung kurz beschrieben.
- Die Figur zeigt eine graphische Darstellung der Aktivität des gereinigten LFA-3. Das gereinigte LFA-3 bindet an CD2 auf T-Lymphozyten, wie durch das Hemmen der CD2-mAK-Bindung gezeigt wird.
- Viele der in der Folge verwendeten Verfahren werden in Plunkett et al., (136 J. Imunol. 4181, 1986) und Sanchez-Madrid, supra, im Detail beschrieben.
- Erfindungsgemäß wird LFA-3 im allgemeinen durch Hindurchleiten über eine Affinitätssäule gereinigt. Wir haben festgestellt, daß LFA-3 einen ungewöhnlich stabilen Komplex mit monoklonalen Antikörpern auf LFA-3 bildet, sogar bei einem basischen pH-Wert. Dies ermöglicht die Reinigung von biologisch aktivem LFA-3 in einem einzigen Schritt.
- Wir haben ebenso festgestellt, daß menschliche Erythrozyten großen Mengen an LFA-3-Antigen enthalten und als Quelle für seine Reinigung verwendet werden können. Sie sind die reichhaltigste Quelle an menschlichem Material, welches zu vernünftigen Preisen leicht verfügbar ist. Frische menschliche Erythrozyten weisen ungefähr 5000 LFA-3-Orte pro Zelle auf.
- Dies ist viel weniger als die Anzahl der LFA-3-Moleküle auf B-Lymphoblastzellinien (ungefähr 200000), allerdings enthält eine Einheit an abgelaufenen roten Blutkörperchen unter Zugrundelegung dieses Schätzwertes der Anzahl an Orten ungefähr 250 ug LFA-3. Sofern die geeigneten Zellinien verfügbar sind, ist es selbstverständlich möglich, LFA-3 aus diesen auf eine ähnliche Weise, wie sie in der Folge für Erythrozyten beschrieben wird, herauszulösen und zu reinigen.
- LFA-3 ist mit der Erythrozytenmembran durch eine hydrophobe Domäne verbunden und muß mit Hilfe von Reinigungsmitteln löslich gemacht werden. Dazu wird vorzugweise ein mildes, nichtdenaturierendes Reinigungsmittel (z.B.: Triton X-100) verwendet, da es das Protein nicht denaturiert. Da LFA-3 an Zellen mittels eines Glykolipidankers befestigt ist, kann es andererseits mit Phosphatidylinositol-phospholipase C ohne Notwendigkeit von Reinigungsmitteln löslich gemacht werden. Im allgemeinen werden Erythrozyten mit gepuffertem Reinigungsmittel oder Phospholipaselösung bei einem neutralen pH-Wert ungefähr 60 Min. lang bei einer Temperatur von weniger als 4ºC bei kleiner gleich 50% des gepackten Volumens lysiert. Proteasehemmer werden verwendet, um einen Zerfall von LFA-3 zu verhindern. Die lysierten Erythrozyten werden daraufhin mit hoher Geschwindigkeit zentrifugiert, um das unlösliche Material zu entfernen, und der Überstand (Lysat) wird für die Chromatographie aufbewahrt.
- Affinitätschromatographie wird durchgeführt, indem das Lysat durch eine Affinitätssäule, bestehend aus monoklonalem Anti-LFA-3-Antikörper, der mit einer inerten Matrix gekoppelt ist, mit ungefähr 2-20 mg Anti-LFA-3/ml, hindurchgeleitet wird. Vorzugsweise wird das Lysat zunächst durch eine Säule hindurchgeleitet, welche eine inerte Matrix enthält, die einen gebundenen, irrelevanten Antikörper (d.h.: einer der LFA-3 nicht bindet) aufweist, um nichtspezifisch bindende Substanzen zu adsorbieren, und daraufhin durch die Säule mit Anti-LFA-3-mAK. (Bei 2mg mAK/ml kann diese Säule das gesamte LFA-3 aus 1 Liter Lysat binden.) Danach wird die Säule mit mehreren Volumina Puffer mit neutralem pH-Wert gewaschen, welcher beispielsweise 0,15 M Salz (NaCl oder KCl) und ein nichtionisches Reinigungsmittel enthält. (Das Reinigungsmittel kann aus dem Waschvorgang und dem Eluierungspuffer weggelassen werden, allerdings kann dann der Ertrag an LFA-3 verringert sein.)
- Zur Reinigung und darauffolgenden Eluierung von LFA-3 wird die Säule im allgemeinen mit einem Puffer mit basischem pH-Wert (pH10-11) gewaschen und daraufhin neutralisiert. Das eluierte Material aus den basischen Waschungen wird gesammelt und neutralisiert, da es LFA-3 enthält, welches später rückgewonnen werden kann. Durch die Waschung bei basischem pH-Wert werden beinahe alle Verunreinigungsproteine aus der Säule entfernt. Dabei handelt es sich um einen entscheidenden Schritt, da die Reinigung auf der ungewöhnlich hohen Stabilität des LFA-3-mAK-Komplexes bei basischem pH-Wert beruht. LFA-3 wird mit einem Puffer, der sauren pH-Wert (pH 2,5-4) aufweist, mit einer geringen Durchflußgeschwindigkeit aus der Säule eluiert. LFA-3 läßt sich in weniger als ungefähr einem Säulenvolumen eluieren und wird sofort neutralisiert. (Die Säule wird ebenfalls neutralisiert und kann oft wiederverwendet werden.) Das LFA-3 in den Bruchstücken wird durch die Bindung von ¹²&sup5;I-Anti-LFA-3-mAK an Nitrozellulosepapier ermittelt, wobei eine kieine Menge jeder Fraktion gebunden wird (Dot blot assay, Plunkett, supra, 119; Hawkes et al., Anal. Biochem. 142, 1982).
- Das folgende ist ein Beispiel eines Verfahrens zum Reinigen von LFA-3. Fachleute werden erkennen, daß diese Erfindung nicht auf die exakten Bedingungen beschränkt ist, die in diesem Beispiel verwendet werden, sondern, daß die Antikörper, Puffer, Säulen und Umgebungsfaktoren durchaus verändert werden können, ohne das Wesen der Erfindung zu verlassen.
- Der Maus-Anti-Human-mAK TS2/9 (Anti-LFA-3, IgGl, Sanchez-Madrid, supra) wurde als gereinigtes IgG oder als Verdünnungen von Kulturüberständen verwendet. Kurz gesagt Anti-LFA-3 wurde durch Injizieren von BALB/c-Mäusen mit Zellen von der CTL-Linie HLA-DR, Fusion von Milzzellen dieser Mäuse mit P3X63Ag8.653 oder NSI sowie durch Kultivieren der Hybridomkulturen hergestellt, welche eine Hemmung des durch CTLs verursachten Abtötens von Zielzellen zeigten, die größer als 30% war. Ein Hybridom erzeugte Antikörper gegen LFA-3. Andere mAK auf LFA-3 können durch Immunisieren von Mäusen mit LFA-3 und Isolieren von Anti-LFA-3 erzeugenden Hybridomclones hergestellt werden, und zwar durchwegs mittels herkömmlicher Verfahren. Monoklonale Antikörper werden für jene ausgewählt, die das durch CTL-Zellinien verursachte Abtöten durch Bindung an die Zielzellen hemmen und welche ein Protein mit einem Molekulargewicht von 60-70000 präzipitieren. TS2/9-mAK wurde mittels standardmäßiger Verfahrensweisen (Id.) aus Hybridomkulturüberständen durch (NH4)2S04-Präzipitation und Protein-A-Affinitätschromatographie gereinigt.
- Gereinigtes IgG wurde nach einer Abänderung des Verfahrens von March et al. (60 Anal. Biochem. 149, 1974) an Sepharose CL-4B gekoppelt. Kurz gesagt, gewaschene Sepharose CL-4B (Pharmacia, Upsala, Schweden) wurde mit 40mg/ml CNBr in 1M Na&sub2;CO&sub3; 10 Minuten lang auf Eis aktiviert und daraufhin mit destilliertem Wasser und 0,1 mM HCl gewaschen. Die aktivierte Sepharose wurde zu einem feuchten Kuchen gefiltert und der gereinigten Antikörperlösung mit 2-4mg/ml IgG (TS2/9 oder Maus-IgG) in 0,05M NaCl und 0,1M NaHCO&sub3;, pH-Wert 8,4, beigegeben. Die Suspension wurde 20 Stunden lang Ende über Ende gemischt, und alle zurückbleibenden reaktiven Gruppen wurden durch Zugabe von Etanolamin zu 50mM und einstündige Inkubation blockiert. Der Überstand wurde auf Antikörper geprüft, indem die Absorption bei 280nm gemessen wurde. Die Koppelung erfolgte für gewöhnlich in der Größenordnung von 90%. Die Sepharose wurde in eine Säule gegossen und mit einem Zyklus von pH11- und pH3-Puffern (siehe unten) vor der Verwendung zur Affinitätschromatographie gewaschen.
- LFA-3 wurde in Triton X-100 Mizellen mittels Affinitätschromatographie gereinigt. Alle Vorgänge wurden bei 4ºC durchgeführt. Abgelaufene menschliche Erythrozyten wurden seitens des Amerikanischen Roten Kreuzes (Needham, MA) bereitgestellt. Zellen von 2 Einheiten des reinen Blutes wurden 3 Mal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, und die gepackten Zellen wurden auf ungefähr 500 ml pelletisiert. Weitere 500 ml der PBS mit 2% Triton X-100, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 5 mM Iodazetamid und 150mTIU/ml Aprotinin wurden der Suspension der roten Blutkörperchen beigemischt, während diese gerührt wurde. Nach 1 Stunde wurde das Lysat mit 150000g 2 Stunden lang zentrifugiert, und das gereinigte Lysat wurde in Serie mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 20 ml/h über die beiden Antikörpersäulen geführt.
- Die erste Säule enthielt Maus-IgG-CNBr-Sepharose-CL-4B (2ml bei 2mg/ml), um Verunreinigungen zu absorbieren und Partikelmaterial herauszufiltern. Die zweite Säule war die TS2/9-mAK-CNBr-Sepharose-CL-4B- Säule (5-10ml bei 2mg/ml). Nach dem Durchfließen wurde die zweite Säule mit 5 Säulenvolumina mit 50mM Natriumphosphat, pH 7,2, 0,025M NaCl, 0,1% Triton X-100, 5 Säulenvolumina mit 20mM Triethylamin, pH 11, 0,25M NaCl, 0,1% Triton X-100 und 2 Säulenvolumina des Phosphatpuffers gewaschen, und zwar alle bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1ml/Min. Das zurückbleibende, gebundene LFA-3 wurde daraufhin mit 5 Säulenvolumina an 50mM Glyzin, pH 3, 0,25 M NaCl, 0,1% Triton X-100 bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 20 ml/hr eluiert. LFA-3 ließ sich im allgemeinen in 1 Säulenvolumen eluieren und wurde durch Auffangen in 0,1 Vol. mit 1M Tris, pH 8,6, 0,1% Triton X-100 neutralisiert. LFA-3-Reinigung folgte auf semiquantitative Weise mittels eines "Dot-Blot Assays" mit ¹²&sup5;I-TS2/9-mAK.
- Die oben beschriebene Affinitätsreinigungsstrategie bedient sich der ungewöhnlichen Stabilität des LFA-3-mAK-Komplexes gegenüber basischem pH (pH 11), welcher viele Proteine aus Affinitätssäulen eluiert. Dieser hohe pH-Wert bewirkt auch, daß viele verunreinigende Proteine aus der Säulenmatrix löslich gemacht werden, und durchbricht wahrscheinlich die hartnäckige Wechselwirkung der Verunreigungen mit LFA-3. Dieser Waschschritt ermöglicht die Reinigung von homogenem, reinem LFA-3 aus der Affinitätssäule in einem Einstufen-Abtrennverfahren. Bisweilen wird eine kleine Menge an Hämoglobin (weniger als 10%) bei pH 3 mit LFA-3 miteluiert, allerdings kann dieses gegebenenfalls auf einfache Weise durch ein zweites Hindurchführen über dieselbe Affinitätssäule entfernt werden. Das gereinigte LFA-3 aus Erythrozyten migriert auf SDS-PAGE als breites Band von 40000-70000 Mr. Dieses weist ein geringeres Molekulargewicht als LFA-3 von B-Lymphoblastzellen auf, ist jedoch LFA-3 von einem Epithelkarzinom ähnlich.
- Gereinigtes LFA-3 bindet an das CD-2-Molekül auf T-Lymphozyten und kann die Interaktion von CD2 mit Zelloberflächen-LFA-3 hemmen. Die Figur zeigt die Fähigkeit von verschiedenen Konzentrationen von LFA-3, die Bindung von Anti-CD2-mAK zu hemmen. Diese Daten zeigen, daß sich lösliches LFA-3 direkt an CD2 binden kann und CD2 bei einer Konzentration von ungefähr 140mM sättigt.
- Unter Bezugnahme auf die Figur wurde die Fähigkeit von gereinigtem LFA-3, die Bindung des Anti-CD2-mAK zu stören, anhand von Durchflußmikrofluorimetrie wie folgt ermittelt. mAK wurden gegenüber Jurkat und Lymphozyten des peripheren Blutes titriert, um die niedrigste Konzentration an mAK zu ermitteln, die eine optimale Färbung ergibt. Die Jurkat-T-Lyphomzellen (von Dr. M-K Ho, Dupont/NEN Boston, MA) und T-Zellen des peripheren Blutes wurden durch Entfernen von anhaftenden Zellen gewonnen, indem mononukleare Zellen des peripheren Blutes in kompletten Medien (RPMI 1640 (Sanchez-Madrid, supra), enthaltend 10% fötales Rinderserum (FBS)) in gewebskulturbehandelten Petrischalen zu 2x10&sup7; Zellen/10cm der Platte 60 Minuten lang zweimal inkubiert wurden, und die anhaftenden Zellen vorsichtig entfernt wurden; mononukleare Zellen aus peripherem Blut wurden durch Dextransedimentierung von reinem Blut und Ficoll-Hypaque-Zentrifugierung (d = 1,077, Sigma) hergestellt. Alle Vorgänge wurden bei 4ºC durchgeführt. Die Zellen (10&sup5;) wurden mit LFA-3 oder Kontrollpuffer in 20ul HBSS 15% BSA, enthaltend Rinderserumalbumin (BSA), 60 Min. lang inkubiert. mAK wurden in zusätzlichen 20 ul desselben Puffers zugegeben, und die Suspension wurde 15 Min. lang inkubiert. Die Zellen wurden dreimal gewaschen und mit fluoreszierendem FITC-Ziegen-Anti-Maus-IgG (H+L, Zymed, San Francisco, CA) 30 Min. lang inkubiert, dreimal gewaschen, mit 1% Paraformaldehyd fixiert und innerhalb einer Woche auf einem Coulter Epics V Durchflußzytometer analysiert.
- Die oben genannten Zellen wurden 1 Stunde lang auf Eis inkubiert, entweder mit LFA-3 in der angegebenen Konzentration (offene Quadrate: Jurkat-T-Zellen; und gefüllte Quadrate: periphere Zellen), Kontrollpuffer derselben Zusammensetzung wie die LFA-3 enthaltende Lösung (der "O"-LFA-3-Punkt), oder gereinigtem LFA-1-Membranprotein (offene und gefüllte Kreise). Nach der Zugabe von Anti-CD-2-mAK (Plunkett, supra) wurden die Zellen gewaschen, mit dem fluoreszierenden Ziegen-Anti-Maus-IgG inkubiert und analysiert, um die Bindung der mAK quantitativ zu bestimmen. Nichtbindende und bindende Kontroll-mAK wurden in allen Experimenten verwendet, um die spezifische Fluoreszenz und die Spezifität der Wirkung von LFA-3 auf die Anti-CD2-Bindung zu ermitteln.
- Die Resultate zeigen, daß gereinigtes LFA-3 eine dosisabhängige Hemmung der Anti-CD2-mAK-Bindung verursacht, und daß LFA-3 wahrscheinlich CD2 bei weniger als 140 mM sättigt. Ein Kontrollmembranprotein hatte keine Wirkung auf die Anti-CD2-mAK-Bindung, und LFA-3 wirkte sich nicht auf die Bindung des als Kontrollsubstanz verwendeten Anti-LFA-1-mAK (hergestellt wie von Plunkett, supra, beschrieben) aus.
- Aus nachfolgender Tabelle geht hervor, daß gereinigtes LFA-3 die CD2-abhängige Interaktion zwischen Human-T-Lymphozyten und Schaf-Erythrozyten hemmen kann. Dies ist ein zweckmäßiger Assay der CD-2-abhängigen Haftungsbahn. Jurkat-T-Lymphoblastomzellen (10&sup5;) wurden mit Schaferythrozyten (10&sup7;) in 10ul einer isotonischen Lösung mit 15% BSA, um Reinigungsmittel zu absorbieren, vermischt. Zugaben von mAK und/oder gereinigtem LFA-3 erfolgten in 10 ul derselben Lösung, und die Suspension wurde auf Eis 15 Min. lang inkubiert, 5 Min. lang mit 200g zentrifugiert, und nach einer Stunde auf Eis wurden die Zellen vorsichtig resuspendiert und nach Prozent an nukleiierten Zellen mit mehr als 3 anhaftenden Erythrozyten ausgewertet. Die Resultate zeigen, daß Anti-CD2-mAK dieses Rosettenbildungsphänomen hemmt. (Die Rosettenbildung wird nicht durch Anti-LFA-3 gehemmt, da der LFA-3-Homolog auf Schaferythrozyten durch den Anti-Human-LFA-3-mAK nicht erkannt wird.) Gereinigtes LFA-3-Protein hemmt diese Rosettenbildung zur Gänze, und Anti-LFA-3-mAK scheint die LFA-3-Aktivität durch Kombination mit LFA-3 in Lösung zu neutralisieren. % SRBC-Rosetten Jurkat T-Zellinie Lymphozyten aus peripherem Blut Kontrolle Anti-CD2-mAK LFA-3 (70 nM) Anti-LFA-3-mAK LFA-3 + αFA-3-mAK LFA-l (1000 nM
- In einem weiteren Experiment wurde die Hemmung der LFA-3-Bindung an CD-2 enthaltende Zellen durch Anti-LFA-3 nachgewiesen. Um LFA-3 zu markieren, wurde LFA-3 in Triton X-100-Mizellen gegenüber boratgepufferter Kochsalzlösung (pH 8,2) dialysiert, mit ¹²&sup5;I unter Verwendung von 1,3,4,6-Tetrachlor-3a,6 Diphenylglykoluril (Iodogen; Peirce, Rockford, IL) nach dem Verfahren von Fraker et al., (80 Bioc. Biop. Res. Comm. 1849, 1978) markiert und daraufhin gegenüber PBS dialysiert. Die Reinheit des iodierten LFA-3 war größer als 80% nach SDS-PAGE, und die spezifische Aktivität betrug schätzungsweise 170 Ci/mmol. Bindeassays wurden mit 2x10&sup6; Zellen in 100 ul mit einem Input von 80000 cpm in HBSS, enthaltend 3% BSA, durchgeführt. Nach 60 Min. bei 4ºC wurde die Analyse mittels Zentrifugieren durch ein 0,8 ml 15% BSA-Kissen abgeschlossen. Der Überstand wurde gründlich abgesaugt, und die Spitze des Zentrifugenrohrs, welches das Pellet enthielt, wurde herausgeschnitten und gezählt. mAK wurde 15 Min. vor der Zugabe des ¹²&sup5;I-LFA-3 zugegeben.
- Wir erkannten, daß sich iodiertes LFA-3 an Jurkat-Zellen band und 80% dieser Bindung durch überschüssiges, nichtmarkiertes LFA-3 und auch durch TS2/18 (eine Zellinie mit einem CD-2-Antigen, Plunkett, supra) gehemmt werden konnten.
- Da das ¹²&sup5;I-LFA-3 80%ig rein war und ungefähr 2% der Inputzahlen in diesen Experimenten gebunden wurden, war es wichtig nachzuweisen, daß die "spezifische" Bindung auf Material zurückzuführen war, welches das TS2/9-Epitop trug. Der Einschluß von TS2/9 und TS2/18 in den Assays erwies sich als nicht leistungsfähiger beim Hemmen der Bindung als eines der beiden alleine, was darauf schließen läßt, daß beide mAK Bindungen derselben Art blockierten. Zudem fanden wir heraus, daß sich iodiertes LFA-3 an die SKW3-Zellinie (beschafft von Dr. P. Cresswell, Duke University, Durham, NC.) in einem niedrigeren Ausmaß als den anderen Zellinien band, was im Vergleich zu diesen Zellinien dem geringeren Ausmaß an CD-2-Expression auf SKW3 entspricht.
- Andere durchflußmikrofluorimetrische Experimente zeigten, daß lösliches LFA-3 mit demselben Ort auf CD2 interagiert wie TS2/18-mAK. Zudem stellten wir fest, daß LFA-3 eine Zusammenballung von Jurkat-Zellen verursacht und daß diese Zusammenballung durch Anti-CD2-mAK gehemmt wird.
- LFA-3 funktioniert für gewöhnlich als Protein, welches durch eine hydrophobe Domäne an der Membran verankert ist. Daher ist es wichtig nachzuweisen, daß das gereinigte Protein in Lipiddoppelschichten funktionieren kann.
- LFA-3 wurde durch Oktylglukosid-(OG)-Dialytikum (Gay et al., 136 J. Immunol. 2026, 1986) zu Liposomen (künstliche Membrane) rekonstituiert, und die Liposomen wurden auf Glasdeckplättchen aufgeschmolzen, um eine Beobachtung der Zellbindung zu ermöglichen. Kurz gesagt LFA-3 wurde aus der Affinitätssäule in Gegenwart von 34mM (1%) OG anstelle von Triton X-100 eluiert. Lipide in Chloroform wurden in einem Verhältnis von Eier-Phosphatidylchlolin:Cholesterin von 7:2 gemischt. Die Lipide (0,5 mg) wurden daraufhin unter einem Stickstoffstrom getrocknet und 1 Stunde lang unter verminderten Druck gestellt, um das restliche Chloroform zu entfernen. Der Lipidfilm wurde in 1ml Proteinlösung mit 20-30ug Protein und 34 mM OG aufgenommen und gegenüber zwei Auswechslungen der PBS und einer des HBSS 36-48 Stunden lang dialysiert. Als Kontrollsubstanz wurde Human-Glykophorin (Sigma) ebenfalls anhand derselben Vorgangsweise rekonstituiert.
- In den folgenden Experimenten wurden Concanavallin-Zellen (Con-A-Blasts) durch 3-tägiges Kultivieren von mononuklearen Zellen aus peripherem Blut mit 1 ug/ml Con-A in RPM1-1640, 20% FBS bei 5 x 10&sup5; Zellen/ml hergestellt. Das Con-A wurde herausgewaschen und die Zellen wurden in 1 ng/ml an rekombinantem IL-2 mindestens 3 Tage lang kultiviert. Diese Zellen wurden mit 51Cr (durch Inkubieren von 10&sup7; Zellen mit 300 uCi an Na &sup5;&sup0;CrO&sub4; in 3 ml 90 Minuten lang) markiert, um eine quantitative Analyse zu ermöglichen, und mit Methyl-α-D-mannopyranosid gewaschen, um das gesamte restliche Con-A von der Zelloberfläche zu entfernen.
- Planare Membranen wurden gemäß Brian et al., 81 Proc. Natl. Acad. Sci. 6159, 1984, hergestellt. Kurz gesagt, es wurden runde Glasdeckplättchen (11 mm) in 1:6 7X Limbro Reinigungsmittel-Wasser 15 Minuten lang gekocht. Daraufhin wurden sie 24 Stunden lang mit destilliertem Wasser ausgiebig gewaschen und in der Folge über Nacht in 70% Ethanol eingeweicht und danach trocknen gelassen. Ein Tropfen (100 ul) der Liposomensuspension, verdünnt auf 0,1 bis 0,2 mM Lipid, wurde in Vertiefungen von 24-Vertiefungs-Clusterplatten (Falcon) plaziert. Glasdeckplättchen wurden sanft auf die Lipidsuspensionstropfen aufgesetzt und 20-30 Min. bei Umgebungstemperatur belassen. Die Vertiefung wurde dreimal mit Prüfmedium (RPMI 1640, 10% FBS, 25 mM Hepes) gewaschen, um nicht aufgeschmolzene Liposomen zu entfernen. Die Lipidoberfläche wurde niemals der Luft ausgesetzt.
- Wenn Con-A-Blasts sanft auf die oben beschriebenen planaren Membranen zentrifugiert und bei 37ºC 15 Min. lang, oder bei 4ºC eine Stunde lang, inkubiert wurden, dann banden mehr als 90% der Zellen an die LFA-3 exprimierenden, planaren Membranen jedoch nicht an jene, welche Human-Glykophorin enthielten. Eine Vorbehandlung der Con-A-Blasts mit TS2/18 oder eine Vorbehandlung der LFA-3 tragenden planaren Doppelschicht mit TS2/9 F(ab')&sub2; (das Fragment von IgG ohne Fc) hemmte mehr als 95% der beobachteten Bindungen, im wesentlichen auf das Niveau, welches bei Human-Glykophorin tragenden planaren Membranen beobachtet wurde. Wenn die LFA-3 tragende planare Membran mit TS2/9 behandelt und der gesamte ungebundene mAK herausgewaschen wurde, war die Hemmung der Con-A-Blast-Bindung noch immer größer als 90%, wodurch nachgewiesen wurde, daß die Blockierwirkung von TS2/9 auf die Bindung an die planare Doppelschicht und nicht an die T-Lymphozyten zurückzuführen war. (Der beobachtete niedrige Bindungsgrad an die planaren Kontrollglykophorinmembrane und an planare LFA-3-Membranen in Gegenwart von TS2/18 und TS2/9 ist vermutlich auf das Einschließen der Zellen unter dem Deckplättchen und möglicherweise auf das unvollständige Entfernen ungebundener Zellen zurückzuführen.)
- Für ein Adhäsionsmolekül weist LFA-3 eine unerwartet große Affinität zur Zellbindung auf. Die kalkulierbare Dissoziationskonstante für die meisten Adhäsionsmoleküle, unter Berücksichtigung der Tatsache, daß sie mit äußerst hoher Valenz bei der Vermittlung von Zelladhäsion zusammenwirken können, scheint eine Größenordnung von 1 uM oder darüber aufzuweisen. Unsere Daten zeigen, daß sich LFA-3 an Zellen mit einer Dissoziationskonstante in der Größenordnung von 10 nM bindet.
- Es ist klar, daß Erythrozyten-LFA-3 als leistungsstarker Ligand für CD2 wirken kann, wenn es in der großen Dichte vorliegt, welche bei den oben genannten Rekonstituierungsexperimenten verwendet wurde. Demnach scheint LFA-3 von Erythrozyten dem äquivalenten LFA-3-Antigen von klassischeren Zielzellen, welche bei der T-Lymphozytenadhäsion im Spiel sind, funktionell ähnlich zu sein. Das Molekulargewicht von Erythrozyten-LFA-3 ist ebenfalls jenem von LFA-3 aus den Epithelzellen, beispielsweise dem Stamm A431, ähnlich.
- Gereinigtes LFA-3 oder in künstliche Membranen eingegliedertes LFA-3 können verwendet werden, um T-Zellenteilmengen und Zellen, welche das CD2-Antigen tragen, zu erkennen, wobei standardmäßige Verfahren wie oben beschrieben, beispielsweise Radioimmunoassay mit ¹²&sup5;I-LUA-3 oder Binden von Zellen an LFA-3 in künstlichen Membranen, verwendet werden. Des weiteren kann LFA-3 in künstlichen Membranen an einen festen Träger, beispielsweise ein Deckplättchen, gebunden werden, wie oben beschrieben wird, und dazu verwendet werden, B- und T-Zellen zu trennen. Dies ermöglicht die Bestimmung des Anteiles an T-Zellen in einer Population und ist zweckmäßig für klinische Diagnosen und die Überwachung von Krankheiten, welche durch eine übermäßige Anzahl an T-Zellen gekennzeichnet sind, beispielsweise Autoimmunkrankheiten, Abstoßung von Allotransplantaten und Graft-versus-Host-Krankheit T-Zellen können mittels dieses Verfahrens gereinigt werden.
- Gereinigtes LFA-3 kann auch verwendet werden, um die Reaktivität von T-Lymphozyten mit anderen Zellen konkurrenzierend zu hemmen. Eine therapeutische wirksame Menge LFA-3 in einem physiologisch kompatiblen Puffer, beispielsweise Kochsalzlösung, kann einem menschlichen Patienten injiziert werden (50-500ug/kg des Patienten/Tag), um die CD2-Rezeptororte zu sättigen und somit Krankheiten zu behandeln, welche durch übermäßig reaktive T-Zellen gekennzeichnet sind, beispielsweise, Autoimmunkrankheiten wie primärchronische Polyarthritis; Abstoßung von Allotransplantaten; und Graft-versus-Host-Krankheit. Außerdem können monoklonale Antikörper zu gereinigtem LFA-3 der Erfindung verwendet werden, um LFA-3 auf Ziel- oder Träger-Zellen zu blockieren und zu verhindern, daß einige T-Lymphozyten mit ihnen in Wechselwirkung treten.
- Weitere Ausführungsformen liegen im Bereich des folgenden Ansprüche.
Claims (11)
1. Verfahren zur Reinigung von LFA-3, umfassend das Aufbringen einer
LFA-3 enthaltenden Flüssigkeit auf eine Affinitätssäule, welche
Anti-LFA-3-Antikörper enthält, um LFA-3 an den Anti-LFA-3-Antikörper zu
binden; das Waschen der Säule mit einem basischen Puffer mit einem pH-Wert,
bei dem die Nicht-LFA-3-Proteine entfernt werden und LFA-3 zurückbehalten
wird, und das darauffolgende Eluieren von LFA-3 aus der Affinitätssäule mittels
eines Puffers.
2. Verfahren nach Anspruch 1, weiters umfassend das Durchleiten der
LFA-3 enthaltenden Flüssigkeit durch eine Säule, die einen Antikörper enthält,
welcher das LFA-3 nicht bindet, vor dem Aufbringen der Flüssigkeit auf die
Affinitätsäule, um aus der Flüssigkeit jene Proteine zu entfernen, die nicht
LFA-3 sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der pH-Wert des
Waschpuffers zwischen 10 und 11 beträgt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin der Eluierpuffer
einen pH-Wert von zwischen 2,5 und 4,0 aufweist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das LFA-3 aus
Erythrozyten, Monozyten, Granulozyten, CTLs, B-Lymphoblastzellinien,
Knochenmarkzellinien, Blutplättchen, vaskulären Endothelzellen, Epithelzellen,
glatter Muskulatur oder Fibroblasten von Säugetieren gereinigt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin der
Anti-LFA-3-Antikörper monoklonal ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das LFA-3 vor
dem Schritt des Aufbringens der Flüssigkeit auf die Säule durch ein
Reinigungsmittel oder eine Phospholipase löslich gemacht wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das Reinigungsmittel nichtionisch
ist.
9. Verfahren nach Anspruch 2, worin der Antikörper, welcher LFA-3
nicht bindet, IgG ist.
10. Biologisch aktives LFA-3, welches durch ein Verfahren nach einem
der Ansprüche 1 bis 9 gewonnen werden kann.
11. LFA-3 nach Anspruch 10 mit einer Reinheit von mindestens 80%.
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