Hintergrund der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft topische, therapeutische
Zusammensetzungen zur Beschleunigung der Wundheilung, die
Säuger-IL-1-proteine umfassen.
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Interleukin-1 (IL-1) gehört zu einer Familie von
Polypeptiden, die von Makrophagen und bestimmten anderen Zelltypen
als Antwort auf eine immunogene und traumatische
Stimulierung sezerniert werden. IL-1-Proteine sind mit einem
komplexen Spektrum biologischer Aktivitäten in Verbindung
gebracht worden und scheinen eine primäre Rolle bei der
Initiierung der Antwort des Wirtsorganismus auf Verletzung und
Infektion zu spielen. IL-1 ist ein primäres,
immunstimulierendes Signal, das zur Induktion der Thymozytenproliferation
über die Induktion einer Interleukin-2-Freisetzung und zur
Stimulierung der Proliferation und Reifung von B-Lymphozyten
fähig ist. Zusätzlich ist IL-1 mit der
Prostaglandin-Produktion, Entzündung und Fieberinduktion in Verbindung gebracht
worden.
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Eine Literaturübersicht betreffend IL-1 von Oppenheim et al.
Immunol. Today 7:45 (1986) berichtet, daß "IL-1 vielfache
Wirkungen auf Zellen, die bei einer Entzündung und bei
Wundheilung involviert sind, ausübt". Wie durch die
Offenbarungen der folgenden Referenzen gezeigt, ist bekannt, daß IL-1
die Proliferation von Fibroblasten stimuliert und Zellen,
die bei der Entzündungsantwort involviert sind, anzieht.
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Postlethwaite et al., J. Exp.Med 155:801 (1983) beschrieben
Experimente, die zeigten, daß IL-1-ähnliche Moleküle dazu
fähig waren, die Fibroblastenproliferation in vitro und auch
die Freisetzung von Collagenase durch kultivierte
Fibroblasten zu stimulieren.
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Luger et al., J Immunol. 131:816 (1983), Sauder et al., J.
Immunol. 132:828 (1984) und mehrere Artikel in Kluger et
al.,Herausgeber, The Physiologic, Metabolic, and Immunologic
Actions of Interleukin-1, (Alan R. Liss, Inc., New York,
1985); nachstehend als "Kluger Symposium" zitiert)
beschreiben Faktoren,die von humanen, epidermalen Zellen abstammen,
bezeichnet als Thymozyten-aktivierender Faktor aus
epidermalen Zellen (epidermal cell thymocyte-activating factor;
ETAF) und Leukozyten-Pyrogen (LP), und biochemisch ähnlich
zu IL-1 zu sein scheinen. Diese Faktoren waren wirksam als
chemische Lockstoffe für polymorphkernige
(Polymorphonuklear; PMN) und einkernige Leukozyten
(mononukleare Leukozyten; MNL). Da viele entzündliche
Hauterscheinungen durch Infiltration von PMN und MNL in die Haut
charakterisiert sind, nahmen die Autoren an, daß ETAF und
möglicherweise IL-1 eine Rolle bei der Pathogenese
entzündlicher Hautkrankheiten spielten. Gahring et al. fanden in
einem weiteren Artikel, der in dem oben genannten Kluger
Symposium veröffentlicht wurde, meßbare Mengen an ETAF im
Strateum corneum, der äußersten Hautschicht, und
spekulierten, daß das Vorhandensein des Faktors im Strateum corneum
einen Mechanismus für die sofortige Ablagerung von ETAF in
einer Wundstelle und die nachfolgende Induktion der
Entzündung bereitstellte.
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Byars et al., Fed. Proc. 43:462 (1984) fanden, daß
Überstände von Kulturen aus Meerscheinchen - Makrophagen, die
mit Muramyldipeptid (MDP) stimuliert worden waren, dazu
fähig waren, die Proliferation von endothelialen
Kapillarzellen zu induzieren. Jedoch zeigten die Autoren nicht, daß IL-
1 in den Kulturüberständen der mitogene Faktor war.
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Bevilaqua et al., J. Exp.Med. 160:618 (1984) beschrieben
Experimente, in denen gezeigt wurde, daß partiell gereinigte
Il-1 Präparationen die Prokoagulant-Aktivität in Kulturen
humaner endothelialer Gefäßzellen induzieren.
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Die Aktivität von humanem IL-1 ist zwei entfernt verwandten
Proteinen eigen, die als IL-1α und IL-1β bekannt sind (March
et al., Nature 315:641 (1985)). Beide Moleküle werden
normalerweise als größere Vorläufermoleküle mit
Molekulargewichten von ungefähr 31.000 Dalton synthetisiert, die
nachfolgend durch proteolytische Spaltung prozessiert werden, um
die reifen Formen mit Molekulargewichten von ungefähr 17.500
Dalton zu ergeben. Obwohl die Proteine nur 26% Homologie
aufweisen, binden beide Moleküle an denselben
Zelloberflächenrezeptor und schienen nach anfänglichen Experimenten
nebeneinander bestehende, biologische Aktivitäten zu besitzen.
Kürzlich sind cDNAs, die für beide humanen IL-1 Spezies
kodieren, kloniert und in E.coli exprimiert worden, was die
Herstellung von genügenden Mengen von IL-1α und IL-1β für
klinische Auswertungen ermöglicht hat.
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Jedoch ist der klinische Nutzen einer direkten
IL-1-Applikation zur Unterstützung des der Wundheilungsprozesses niemals
festgestellt worden. Aufgrund der Verschiedenheit der
biologischen Aktivitäten, die auf IL-1 zurückgeführt worden sind,
und dem Fehlen des Verständnisses der Rolle solcher
Aktivitäten beim Heilungsprozeß erlaubt der vorliegende Stand der
Technik nicht, vorauszusagen, ob IL-1 Wundheilung verzögern
oder beschleunigen würde, wenn es topisch auf die Stelle der
Verletzung aufgetragen wird.
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Es ist nun gefunden worden, daß IL-1-Proteine wirksame
Promotoren der Wundheilung sind, wenn sie in der Form einer
topischen das Protein umfassenden Formulierung auf die
Verletzungen aufgetragen werden.
Zusammenfassung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft topische
Zusammensetzungen für die Beschleunigung der Wundheilung in Säugern,
einschließlich Menschen, die eine ausreichende Menge eines
Säuger-Interleukin-1 (IL-1) zur Beschleunigung der Wundheilung
und ein physiologisch annehmbares hydrophiles Vehikulum zur
Applikation von IL-1 auf die Stelle der Verletzung umfassen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die Verwendung von IL-
1 für das Herstellen eines topischen Medikaments zur
Beschleunigung der Wundheilung in Säugern.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Figuren 1A und 1B sind Diagramme, die die Antworten auf IL-
1α-Dosen über eine 5-Tage-Zeitdauer zeigen,
gemessen über Wundoberfläche bzw. Prozent
Heilung; und
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Figuren 2A und 2B sind Diagramme, die die Antworten auf IL-
1β-Dosen über eine 5-Tage-Zeitdauer zeigen,
gemessen über Wundoberfläche bzw. Prozent
Heilung.
Genaue Beschreibung der Erfindung
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Die Haut ist das größte Organ des warmblütigen Organismus
und stellt verschiedene, kritische, homeostatische
Funktionen bereit. Wenn die strukturelle Unversehrtheit der Haut
durch eine Verbrennung oder Verletzung verloren ist, wird
eine Folge zellulärer Ereignisse initiiert, die gewöhnlich
zum Verschluß der Wunde und letztendlich zur Proliferation
neuer epidermaler Zellen an der Stelle der Verletzung
führen.
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Das erste Stadium bei der Wundheilung beinhaltet den
Verschluß verletzter Blutgefäße und die
Blutblättchenaggregation an der Stelle der Gefäßverletzung. Die Koagulation von
Plasmafibrin, Fibrinogen, Fibronectin, weiteren Plasma- und
Hautproteinen, Proteoglycanen und Glycoproteinen stellt ein
festes Substrat in der Wundstelle bereit. Bei einem zweiten
Stadium spielt eine Entzündung eine Rolle, die durch die
Wirkung von Leukozyten und Makrophagen in der Wundregion
hervorgerufen wird, welche Bakterien und verletzte Zellen
entfernen und welche vermutlich verschiedene, lösliche
Faktoren zur Hilfe beim Regenerierungsprozeß sezernieren. Die
tatsächliche Wiederherstellung des Gewebes an der Wundstelle
wird durch Fibroblasten initiiert, die an der Wundstelle
anhaften, proliferieren und Kollagen sezernieren, das
quervernetzt wird, um eine strukurell stabile Grundlage für das
weitere Heilen bereitzustellen. Bei Säugern werden die
letzten Stadien der Wundheilung durch die Mobilisierung
epidermaler Zellen an den Rändern der Schädigung und deren
Wanderung über das lebende Gewebe in die Stelle vollendet. Wenn
die Schädigung einmal bedeckt ist, kommt es zu einem
Differenzierungsprozeß, wodurch die epidermalen Zellen Keratin
synthetisieren und letztendlich die Struktur der Epidermis
wiederherstellen.
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Es gibt eine Anzahl chronischer oder schlecht heilender
Wunderscheinungen, die eine Verbesserung der
Wundheilungstechniken verlangen. Z.B. würden Verfahren zur Erhöhung der
Heilungsrate bei Verbrennungen, chronischen wundgelegenen
Stellen, eitrigen Hauterscheinungen und anderen schwer zu
heilenden Wunden von großem Interesse für die Praxis der
Veterinär- und Humanmedizin sein. Es gibt auch
Krankheitszustände, wie z.B. Diabetes, die durch eine Verzögerung der
natürlichen Wundheilungsfähigkeit gekennzeichnet sind.
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Gegenwärtige Konzepte der Wundheilungstechniken heben die
Verwendung von feuchten Semiokkluivverbänden während der
Initialstadien der Wundreparatur hervor. Der Verschluß einer
Wunde durch Anwendungen einer Polyethylen- oder
Polyurethanfolie hält die Wunde feucht, während Gasaustausch erlaubt
wird. Im allgemeinen wird die Rate der epidermalen Heilung
erhöht, während der Schmerz gemildert wird.
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Mit dem Fortschritt der Biotechnologie und neuen Verfahren
zum Herstellen von Hormonen und Wachstumsfaktoren begann
eine Suche nach Wachstumsfaktoren, die für eine
Beschleunigung der Wundheilung verwendbar sind. Unter den Faktoren,
von denen berichtet worden ist, daß sie potentielle,
nützliche Wundheilungspromotoren sind, sind transformierender
Wachstumsfaktor beta (transforming growth factor beta; TGF-
β), epithermaler Wachstumsfaktor (epidermal growth factor;
EGF), Angiogenesefaktor und Fibroblastenwachstumsfaktor
(fibroblast growth factor; FGF). Jedoch wird die
tatsächliche Wirksamkeit solcher Faktoren in der klinischen Praxis
erst jetzt bewertet.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung werden
Wundbehandlungszusammensetzungen formuliert, die biologisch wirksame Mengen
an Interleukin-1-Proteinen in Mischung mit inerten,
hydrophilen Vehikeln, wie z.B. wäßrigen Gelen, umfassen. Solche
Vehikel stellen ein Mittel zum Auftragen von IL-1 auf die
Wundstelle und ein zeitweiliges Reservoir von IL-1 an der
Wundstelle bereit und halten die Wundstelle fortlaufend
feucht.
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Sowohl IL-1α- als auch IL-1β-Proteine können verwendet
werden, um ein Medikament für Wundheilung in einem Säuger,
einschließlich eines Menschen, herzustellen. IL-1-Proteine
werden auf die Wundstelle in Mengen aufgetragen, die wirksam
sind, Wundheilung zu beschleunigen. Die erfindungsgemäßen
Wundheilungszusammensetzungen können von 50 pg bis 50 ug IL-
1 (α oder β) pro g Vehikulum, vorzugsweise von 50 pg/g bis
500 ng/g umfassen. Eine vorteilhafte Wirkung kann mit sehr
geringen Raten an IL-1 gefunden werden, obwohl größere
Mengen in besonderen Formulierungen eingesetzt werden können,
um einem Proteinabbau während der Formulierung oder Lagerung
Rechnung zu tragen.
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Im allgemeinen kann IL-1 (IL-1α, IL-1β oder beide) in einer
solchen Weise wirksam auf eine Wundstelle aufgetragen
werden, daß über 5 Tage ansteigende Dosen an IL-1 im Bereich
von ungefähr 0,2 ng bis ungefähr 1 ug/cm² Wundoberfläche
bereitgestellt werden .Speziell kann IL-1α oder IL-1β auf die
Wundstelle aufgetragen werden, um die folgenden, über 5 Tage
ansteigenden Dosen (aufgelistet in ansteigender Reihe der
Vorteilhaftigkeit) bereitzustellen : 2 ng bis 500 ng, 20 ng
bis 400 ng, 50 ng bis 300 ng pro cm² Wundoberfläche.
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Ähnlich kann IL-1α und IL-1β kombiniert und auf die
Wundstelle auftragen werden, um die folgenden, über 5 Tage
ansteigenden Dosen (aufgelistet in ansteigender Reihe der
Vorteilhaftigkeit) bereitzustellen: 1 ng bis 250 ng IL-1α und
10 ng bis 200 ng IL-1β pro cm² Wundoberfläche, 25 ng bis 150
ng IL-1α und 1 ng bis 250 ng IL-1β pro cm² Wundoberfläche
10 ng bis 200 ng IL-1α und 25 ng bis 150 ng IL-1β pro cm²
Wundoberfläche. Wundoberf äche ist die Fläche, die durch den
Durchmesser der Wunde definiert ist und kann durch
Multiplikation der Länge und Breite der Wunde berechnet werden.
Eine genauere Messung der Wundoberfläche kann durch
Verwendung eines Planimeters (Housten Instruments) erhalten
werden.
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Die Dosen werden in Abhängigkeit von der Tiefe oder des Typs
der Wunde variieren. Während man normalerweise erwarten
würde, daß tiefere und ernstere Wunden höhere Dosen an IL-1
benötigen, können niedrige Dosen bei Wunden verwendet
werden, die durch verletzte Gefäße charakterisiert sind. Die
Dosen werden auch in Abhängigkeit davon variiern, ob die
Gesundheit des zu behandelnden Individiums normal oder
beeinträchtigt ist. Beeinträchtigte Individuen umfassen z.B.
solche mit chronischen, wundgelegenen Stellen, eitrigen
Hauterscheinungen, Diabetes oder anderen metabolischen Krankheiten
und solche, die betagt, unterernährt, immundefizient sind,
sich gerade einer Behandlung mit Corticosteroiden und einer
chemotherapeutischen Behandlung unterziehen oder die hohe
Mengen an chemischen Substanzen einnehmen. Es wird
vorausgesehen, daß solche Individuen mit beeinträchtigter Gesundheit
zur Wundbehandlung höhere Dosen an IL-1 benötigen werden,
und daß das Individium für vergleichsweise längere
Zeitdauern behandelt werden wird.
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Beispiele geeigneter, wäßriger, inerter Vehikel für die
Verwendung bei der Formulierung der erfindungsgemäßen
Zusammensetzungen umfassen Kollagen, Carboxymethylcellulose,
Hydroxyethylcellulose oder andere celluloseartigen
Verbindungen oder Gele, die aus einer Mischung von
Polyethylenglykolen hergestellt werden. Aufgrund der Erfordernisse
hinsichtlich der Bioverträglichkeit und einer Absorption des
Gels durch unversehrte oder verletzte Haut werden geeignete
Verbindungen für die Vehikelformulierung im allgemeinen
celluloseartige Derivate sein. Verschiedene langkettige
Verbindungen sind in Viskositätsbereichen, die für diese Anwendung
geeignet sind, kommerziell erhältlich. Die
Vehikelbestandteile können durch Autoklavieren vor der Formulierung
sterilisiert werden. IL-1-Lösungen werden vorzugsweise durch
Gammabestrahlung (1,5 mrads; 1,5 x 10 &supmin;&sup5; J/kg) sterilisiert.
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Verschiedene Zusätze können in die erfindungsgemäßen
Zusammensetzungen eingebracht werden, vorausgesetzt, daß sie die
biologische Aktivität von IL-1 nicht nachteilig
beeinflussen. Stabilisatoren und Konservierungsmittel, wie Mischungen
von Methyl- und Propylparabenen sind verwendbar zur
Verhinderung zufälliger, mikrobieller Kontamination während der
Formulierung und Lagerung. Antioxidantien, wie BHT, BHA oder
andere, können verwendbar sein zum Vorbeugen des Abbaus der
IL-1-Proteine in der endgültigen Formulierung.
Proteaseinhibitoren, wie α-Antitrypsininhibitor, α&sub2;- Makroglobulin,
Sojabohnentrypsininhibitor, Phenylmethylsulfonylfluorid,
verschiedene Halogenmethylketonpeptidylverbindungen oder
Mischungen davon können verwendbar sein zur Verhinderung des
Abbaus durch proteolytische Agenzien. Komplexbildende
Agenzien, wie EDTA, können verwendet werden, wenn das endgültige
Produkt in Metalltuben gelagert wird, um die Möglichkeit
einer Reaktion der aktiven Interleukin-1-Bestandteile mit
Metallionen zu vermindern. Farbstoffe können auch zu den IL-1-
Proteinmischungen zugegeben werden, bevor sie mit dem Gel
gemischt werden. Um eine Produkthomogenität zu
gewährleisten, wird das Gel gemischt, bis eine einheitliche
Extinktion
beim Extinktions-Peak des Farbstoffs erreicht wird.
Dies vermeidet die Notwendigkeit, relativ aufwendige,
biologische Assays für die geringen Mengen an IL-1-Proteinen, die
im endgültigen Produkt vorhanden sind, durchzuführen.
Quellen rekombinanter Interleukin-1-Proteine
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Wie hierin verwendet, beziehen sich "Interleukin-
1","rekombinantes Interleukin-1", "IL-1" und "rIL-1" im
ganzen auf Säuger-IL-1 Proteine mit Aminosäuresequenzen, die im
wesentlichen identisch zu denjenigen nativer Formen von IL-
1α und IL-1β aus Säugern sind, und die die biologische
Aktivität wie die nativen Formen besitzen. Wesentliche Identität
der Aminosäuresequenzen bedeutet, daß die Sequenzen
identisch sind oder sich durch eine oder mehrere
Aminosäureänderungen (-deletionen, -additionen, -substitutionen)
unterscheiden, die keine bedeutende, funktionelle
Verschiedenartigkeit zwischen dem synthetischen Protein und der nativen
Form verursachen. Vorzugsweise werden rekombinante Formen
der Säuger-IL-1α- und -IL-1β-Proteine zur Formulierung der
erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet. Solche
rekombinanten Proteine können geeigneterweise durch mikrobielle
Fermentationsverfahren z.B. in Saccharomyces oder
vorzugsweise in E.coli, wie nachstehend beschrieben, hergestellt
werden.
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Matures, humanes IL-1α und IL-1β kann in E.coli unter der
Kontrolle des PL-Promotors des Phagen λ und des
thermolabilen Repressors cI857 ts exprimiert werden.
Expressionsplasmide für die Herstellung von rIL-1α und rIL-1β können
ausgehend vom Plasmid pPLc28 (ATCC 53082), vom Plasmid pKK223-3
(kommerziell erhältlich von Pharmacia Fine Chemicals,
Uppsala, Schweden) und von Plasmiden, die den IL-1α Klon 10A
(March et al., s.o.; ATCC 39997) und IL-1β Klon IL-1-14
(ATCC 39925) enthalten, wie folgt konstruiert werden.
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Um einen Expressionsvektor für IL-1α zu erzeugen, wird der
3' Teil des IL-1α-Gens, der sich von Ser¹¹³ (Nukleotide 337-
339) bis Ala²&sup7;¹ (Nukleotide 811-813) streckt, in den
Expressionsvektor pPLc28 inseriert. Dies wird durch Ausschneiden
eines 499 Basenpaare langen AluI-NdeI-Fragments aus dem 10-A
Klon erreicht, an das der folgenden synthetische
Oligonucleotid-Linker angehängt wird.
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Dieser Linker umfaßt AluI und EcoRI-Enden, eine
Ribosombindungsstelle und ein ATG-Initiationscodon zusätzlich zu der
IL-1-α-Ser¹¹³-Ser¹¹&sup7;-Sequenz. pPLc28 wird danach vollständig
mit EcoRI und NdeI gespalten, und das sich ergebende größere
Fragment durch Agarosegelelektrophorese isoliert. Der
Linker, der 10A Klon und Plasmidfragmente werden danach unter
Verwendung von T4-Ligase verknüpft, um ein als pILα
bezeichnetes Expressionsplasmid bereitzustellen. Zusätzliche
Einzelheiten von pILPα können in der Offenbarung der
veröffentlichten EP-A-188,864 gefunden werden, wobei hier auf die
relevante Offenbarung Bezug genommen wird.
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Das resultierende Konstrukt wird danach verwendet, um den
E.coli-Stamm ΔH1 (ATCC 33767; Castellazi et al., Molec. gen.
Genet. 117:211) zu Ampicillinresistenz unter Verwendung von
Standardtechniken zu transformieren. Um das mit dem Plasmid
übertragene IL-1α-Gen zu exprimieren, werden Kulturen des
transformierten ΔH1-Stammes in L-Medium ohne Ampicillin
kultiviert. Wenn die Kulturen einen A&sub7;&sub2;&sub0;-Wert von ungefähr 0,5
erreichen, wird die Kulturtemperatur auf ungefähr 42ºC
angehoben, um die Dereprimierung des thermolabilen PL-Promotors
zu begünstigen. Nach 1 Stunde bei der erhöhten Temperatur
werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und in einer
Trockeneis/Methanol-Mischung schockgefroren.
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Rekombinates, humanes IL-1β kann unter Verwendung eines
weiteren, hierin pILPβ bezeichneten Plasmids hergestellt
werden. Dieser Vektor wird ausgehend von pILPc (March et al.,
s.o.) aufgebaut, welcher durch Ersetzen des BamHI/EcoRI-
Fragments von pKK223-3 durch ein Sau3A/EcoRI-Fragment aus
pPlc28, der den λ PL-Promotor enthält, konstruiert wird.
Dieses Plasmid wird vollständig mit EcoRI und PstI
gespalten, und das größte Fragment wird danach an (1) ein 669
Basenpaare langes HpaII/PstI-Fragment aus pIL-1-14 (ATCC
39925), welches das humane IL-1-β-Gen (A1a¹¹&sup7; bis zum COOH-
Terminus kodiert das aktive Protein) enthält, und (2) das
folgende EcoRI/HpaI synthetische Oligonucleotid ligiert:
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Das Plasmid pILPβ wird danach verwendet, um E. coli H1 oder
andere Zellen, die einen thermolabilen Repressor der PL-
Transkription enthalten, zu transformieren. Nach Wachstum
bis zu einem A&sub7;&sub2;&sub0;-Wert von ungefähr 0,5 wird die Expression
des rIL-1β-Gens durch Hitzeinduktion, wie vorstehend
beschrieben, erhalten. Die rIL-1α-Aktivität kann wie auch im
Fall von rIL-1α unter Verwendung des vorstehend erwähnten
Thymozyten-Kernteilungs- oder IL-1-Konversionsassays
identifiziert werden.
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Rekombinante, humane IL-1-Proteine können aus Rohextrakten
von Bakterien durch saure Extraktion in geeigneten Puffern
isoliert werden. Die Zellen können durch jedes geeignete
Verfahren, umfassend mehrfaches Einfrieren und Auftauen,
Beschallung mechanisches Aufbrechen oder unter Verwendung
von zellysierenden Agenzien aufgebrochen werden.
Vorzugsweise wird der säurevermittelte Extraktionsschritt für rIL-
1α in einem wäßrigen, gepufferten Medium mit einem pH von
2,0 bis 3,5, und am meisten bevorzugt bei einem pH von 2,6
bis 3,0 durchgeführt. Im Fall von rIL-1-β wird der saure
Extraktionsschritt vorzugsweise bei einem pH von 3,5 bis 4,5
und am meisten bevorzugt bei einem pH von 3,7 bis 4,1
durchgeführt.
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Für eine vollständige Reinigung folgt auf den anfänglichen
sauren Extraktionsschritt eine Chromatographie im wäßrigen
Medium. Dieser Teil des Reinigungsverfahrens kann eine
anfängliche Ionenaustauschchromatographiestufe, gefolgt von
Affinitätschromatographie, umfassen. Die Ionenaustauschstufe
umfaßt in einem bevorzugten Aspekt
Kationenaustauschchromatographie, gefolgt von Anionenaustauschchromatographie.
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Geeignete Medien für Kationenaustauschchromatographie
umfassen verschiedene, unlösliche Grundsubstanzen, umfassend
Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen. Sulfopropylgruppen sind
bevorzugt. Die Grundsubstanzen können Acrylamid, Agarose,
Dextran, Cellulose oder andere Ionenaustauschharze oder
Substrate, die gewöhnlich bei der Proteinreinigung verwendet
werden, sein. Ein besonders geeignetes Material für
Kationenaustauschchromatographie von rIL-1α und rIL-1β ist
Sulphopropyl -Sephadex C-25 (Pharmacia Fine Chemicals,
Uppsala, Schweden). Wenn Medien, die Sulfopropylgruppen
enthalten, verwendet werden, werden rIL-1-Spezies enthaltende
Extrakte bei einem pH von ungefähr 4,0 in einem geeigenten
Puffer, wie Natriumcitrat, aufgetragen. rIL-1-Spezies werden
durch den Ionenaustauscher gebunden und können in höher
gereinigter Form durch Anwendung eines schwach basischen
Elutionsmittels, z.B.10 mM Tris-HCl, pH 8,1 eluiert werden.
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Geeignete Medien für Anionenaustauschchromatographie
umfassen verschiedene, unlösliche Grundsubstanzen, umfassend
Diethylaminoethyl (DEAE) -oder Diethyl-(2-hydroxypropyl)
aminoethyl (QAE) -Gruppen. DEAE Gruppen sind bevorzugt. Die
Grundsubstanzen können Acrylamid, Agarose, Dextran,
Cellulose oder andere bei der Proteinreinigung gewöhnliche
verwendete Arten sein. Ein besonders geeignetes Material für
Anionenaustauschchromatographie von rIL-1α und rIL-1β ist
DEAE-Sephacel (Pharmacia). Wenn DEAE-Gruppen enthaltende
Medien verwendet werden, werden die rIL-1-Spezies enthaltenden
Extrakte bei schwach basischem pH aufgetragen. Z.B. können
die vereinigten, rIL-1-enthaltenden Fraktionen, die aus der
vorausgegangenen Kationenaustauschchromatographiestufe (bei
einem pH von 8,1) stammen, direkt in einem geeigneten
Puffer, wie Tris-HCl, aufgetragen werden. rIL-1-Spezies
werden durch Anionenaustauschmedien gebunden und können in
höher gereinigter Form durch Anwendung eines Salzgradienten im
selben Puffer eluiert werden. Es ist ermittelt worden, daß
rIL-1α von DEAE-Sephacel bei 0,17-0,22 M Nacl, und rIL-1β
bei 0,075-0.155 M NaCl eluiert. Folglich sind Gradienten im
Bereich von 0 bis 600 mM NaCl und 0 bis 400 mM NaCl für die
Reinigung von rIL-1α bzw. rIL-1β verwendbar.
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Auf die vorangehenden Extraktions- und
Ionenaustauschchromatographieverfahren folgt Affinitätschromatographie. Für
IL-1α können Affinitätsmedien, umfassend überhängende
Phenyl-glycidyl-äthergruppen wie Phenyl-Sepharose CL-4B
(Pharmacia), verwendet werden. rhIL-1α wird auf solche
Medien in einer Lösung, die 0,5 bis 0,7 M (vorzugsweise 0,6 M)
Ammoniumsulfat enthält, in einem geeigneten Puffer bei einem
pH von 8,1 aufgetragen und danach mit einem abfallenden,
linearen Gradienten von Ammoniumsulfat, gefolgt von einem
Puffer, der kein Salz enthält, eluiert. rhIL-1α eluiert von
Phenyl-Sepharose CL-4B bei 0,25 bis 0,10 M Ammoniumsulfat.
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Für den letztendlichen Affinitätsschritt zur Reinigung von
IL-1α können Affinitätsmedien, umfassend überhängende
Ligandengruppen des roten Farbstoff Triazinyl, wie Procion Red
Agarose (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg,
Maryland U.S.A.) verwendet werden. Die vereinigten und rIL-
1β enthaltenden Fraktionen werden auf die
Farbstoff-Liganden-Medien bei einer niedrigen, ionischen Stärke, z.B.,
weniger als 40 mM, in einem geeigneten Puffer, wie 10 mM Tris-
HCl aufgetragen. Die gebundenes rIL-1β umfassenden Medien
werden dann mit zusätzlichem Auftragungspuffer gewaschen,
und das gewünschte Protein wird mit einem linearen
Gradienten
ansteigender Salzkonzentration, z,B. 0 bis 1 M NaCl,
eluiert. rIL-1β eluiert von Procion Red bei 0,36 bis 0,46 M
NaCl. Die resultierenden Fraktionen können durch einen
letztendlichen Chromatographieschritt an Medien, die
überhängende Sulfoprophylgruppen enthalten, konzentriert werden.
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IL-1-Aktivität in Zellextrakten und während der Reinigung
kann durch entweder einen Thymozyten-Kernteilungsassay oder
einem Assay einer durch IL-1 induzierten IL-2 Produktion,
wie beschrieben von Conlon, J. Immunol. 131:1280 (1983) and
Kronheim et al., J. Exp. Med. 1261:490 (1985) getestet
werden. SDS-PAGE kann ebenso, wie im wesentlichen von Kronheim
et al., s.o., beschrieben, verwendet werden, um das
Reinigungsverfahren zu überwachen.
Beispiel 1: Wirkungen topischer Anwendung von humanem
Interleukin-1 auf die Wundheilung bei Mäusen
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Das folgende Experiment wurde darauf ausgerichtet, die
Wirkung von IL-1 auf die Produktion von Granulationsgewebe und
den Wundverschluß zu bewerten und die möglichen
Applikationsarten zu untersuchen.
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Vierzig weibliche Swiss CB-Mäuse (Charles Ricer Breeding
Labs, Boston, MA) wurden in dieser Studie verwendet. Die
Mäuse wurden einzeln für eine Zeitdauer von einer (1) Woche
vor Beginn des Experiments und über die experimentelle
Zeitdauer (4 Wochen) in Käfigen gehalten. Die Tiere wurden mit
einer Basaldiät ad libitum gefüttert und in einer
kontrollierten Umgebung (Temperatur 19-21ºC, 12 Stunden Licht-12
Stunden Dunkelheit-Zyklus und 50% relative Luftfeuchtigkeit)
gehalten.
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Zwanzig Mäuse wurden verwendet, um die Wirkung von IL-1α auf
die Produktion von Granulationsgewebe zu bestimmen. In
diesem Versuch wurden poröse Wundkammern in eine Wundstelle
implantiert und später auf das Hineinwachsen von Zellen
getestet.
Wundkammern wurden aus Ivalon -Kissen aus
Polyvinylalkohol und Formaldehyd hergestellt. Um die Kammern zu
implantieren, wurde jede Maus unter leichtem Äther anästhesiert
und ein 3 x 3 cm großes Quadrat dorsaler Haut wurde mit
einem Antiseptikum abgetupft. In die dorsale Nackenhaut wurde
1 cm tief eingeschnitten. Die sterile Wundkammer wurde
subkutan inseriert, paravertebral ausgerichtet, und der
Einschnitt wurde mit zwei Einzelnähten verschlossen.
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Vierundzwanzig Stunden nach der subkutanen Implantation der
Wundkammer wurden die 20 Mäuse aufgeteilt in drei (3)
Behandlungsgruppen. Gruppe A erhielt eine 1 ml subkutane
Injektion von 15 ng/ml IL-1α in 1% Rinderserumalbumin (bovine
serum albumin; BSA) enthaltendem PBS-Puffer. Das Mittel
wurde direkt in die Wundkammer injiziert. In die Gruppe B-
Wundkammern wurde 1 ml einer 60 ng/ml IL-1α-PBS-BSA-Lösung
injiziert. In die Gruppe C-Kammern wurde Kontrollösung in
PBS-BSA-Puffer injiziert. Die Wundkammern wurden nur einmal
behandelt.
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Zehn Tage nach Behandlung wurden die Mäuse getötet, die
Wundkammern gesammelt und wie folgt histologisch untersucht.
Ein vier Millimeter (4 mm) großes zylindrisches Teil der
Wundkammer, der ihre Hülle einschließt, wurde in Formalin
fixiert und in Paraffin eingebettet. Vier Micron breite
Schnitte wurden danach gefärbt und qualitativ auf das
Hineinwachsen von Zellen und Bindegewebe untersucht.
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Nach Untersuchung der Schnitte von 10-Tage alten Wundkammern
konnte ein klarer Unterschied zwischen den Kammern, die mit
IL-1α und Kontrollösungen behandelt worden waren, gesehen
werden. Kammern, die mit dem aktiven Mittel behandelt worden
waren, zeigten signifikant mehr zelluläre Infiltration im
Vergleich zu Kontrollkammern. Nur geringe Unterschiede
konnten zwischen Kammern, die mit 15 ng und solchen, die mit 60
ng IL-1α behandelt worden waren, gesehen werden. Die mit IL-
1α behandelten Kammern hatten eine viel dickere Hülle um das
Implantat im Vergleich zu den Kontrollen. Es gab auch einen
signifikanten Unterschied in der Menge des neuen
Bindesgewebes, das innerhalb und um die Kammer abgelagert war.
Kammern, die mit IL-1α (mit beiden Konzentrationen) behandelt
worden waren, zeigten eine signifikant größere
Gewebeanhäufung im Vergleich zu den Kontrollbeispielen.
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In einem zweiten Experiment wurden die Mäuse anästhesiert
und wie vorstehend beschrieben für den Eingriff präpariert.
Zwei Hautwunden über die volle Dicke wurden jedem
Versuchstier mit einer 6 mm Lochzange zugefügt. Die Tiere wurden in
4 Gruppen unterteilt und wie folgt behandelt: Gruppe A hatte
eine Wunde, die mit 15 ng des aktiven Mittels in einer PBS-
BSA-Pufferlösung behandelt wurde, und eine weitere Wunde,
die mit einer Kontrollösung, die nur aus Puffer bestand,
behandelt wurde. Gruppe B hatte eine Wunde, die mit 60 ng IL-
1α in einer PBS-BSA-Lösung behandelt wurde, und eine
weitere, die nur mit einer Kontrollösung behandelt wurde. Gruppe
C hatte eine Wunde, die mit 60 ng des aktiven Mittels, das
in einem hydrophilen Vehikulum (Aquaphor , Biersdorf Inc.)
gemischt war, behandelt wurde, und eine weitere Wunde wurde
mit dem Vehikulum und der Kontrollösung behandelt. Gruppe D-
Mäuse hatten eine Wunde, die mit dem hydrophilen Vehikulum
(Aquaphor ) behandelt wurde, während die andere Wunde
unbehandelt blieb.
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Alle Wunden wurden nach der Behandlung mit einer
Co-Polyesterfolie auf einem druckempfindlichen Heftpflasterverband
(Co-Film ; Chesebrough-Ponds Inc.) verbunden. Die Wunden
wurden nur einmal behandelt. Alle Wunden wurden jeden
zweiten Tag durch Serienphotographie bewertet, und der
Wundverschuß wurde durch Planimetrie gemessen. Alle Daten wurden
unter Verwendung des Student-t-Tests aus paarweisen
Vergleichen berechnet.
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Die Wirkung von IL-1α auf die Wundverschlußrate variierte
mit Hinsicht darauf, ob das Protein in dem hydrophilen
Vehikulum
vorhanden war oder nicht. Wunden die mit IL-1α (60 ng)
in dem hydrophilen Vehikulum (Gruppe C) behandelt wurden,
verheilten schneller als Wunden, die nur mit einem Vehikulum
als Kontrolle behandelt wurden. Statistische Signifikanz (p
0,05) zwischen den Heilungsraten von Wunden, die mit IL-1α
in dem hydrophilen Vehikulum (Gruppe C) behandelt wurden,
und denjenigen, die nur mit dem hydrophilen Vehikulum
behandelt wurden, wurde am Tag 12 und Tag 15 nach der Verwundung
erreicht. Wunden, die mit entweder 15 ng oder 60 ng (A oder
B) IL-1α in einem PBS-BSA-Vehikulum behandelt wurden,
heilten etwas langsamer, als Wunden, die nur mit dem hydrophilen
Vehikulum während der gesamten Dauer des Experiments
behandelt wurden, obwohl der Unterschied statistisch nicht
signifikant war. Keine signifikanten Unterschiede wurden zwischen
den Heilungsraten von Wunden, die mit IL-1α in einem PBS-
BSA-Puffer allein behandelt wurden, und unbehandelten
Kontrollen (Gruppe D) gesehen.
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Die Wunden, die mit dem aktiven Mittel oder der
Kontrollösung in einem PBS-BSA-Puffer behandelt wurden, heilten
langsamer als Wunden, die durch Behandlung mit der hydrophilen
Salbengrundlage feucht gehalten wurden. Die Wunden, die mit
dem wäßrigen Grundlagenvehikulum (PBS-BSA) mit oder ohne IL-
1α behandelt wurden, waren 24 Stunden nachdem der
Folienverband entfernt worden war, trocken. Im Gegensatz dazu
blieben Wunden, die mit der Salbengrundlage behandelt
wurden, für eine längere Zeitdauer feucht. Eine trockene Kruste
entwickelte sich auf den Wunden, die mit dem wäßrigen
Vehikulum behandelt wurden. Dieser dicke Schorf blieb fast über
den gesamten Heilungszeitraum auf der Wunde. Die mit der
Salbe behandelten Wunden (mit oder ohne IL-1α) hatten einen
dünneren, weicheren Schorf, der zwischen dem Tag 9 und dem
Tag 12 nach der Verwundung abgeworfen wurde.
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Zusammengefaßt, Wunden, die mit IL-1α in der hydrophilen
Salbengrundlage behandelt wurden, waren ungefähr 6 Tage vor
den anderen Behandlungsgruppen reepithelialisiert.
Beispiel 2: Die Wirkung von topisch aufgetragenem, humanen
Interleukin-1 auf die Heilung von oberflächlichen Hautwunden
bei Schweinen
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Dieser einfache in vivo-Blindversuch wurde daraufhin
ausgerichtet, die Wirkung von topisch aufgetragenen, hydrophilen,
IL-1α und IL-1β enthaltenden Gelen auf die Heilung
oberflächlicher Hautwunden zu bewerten.
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Gesamtkonzentrationen von rhIL-1α und rhIL-1β wurden in ein
Carboxymethylcellulose und Propylenglycol enthaltendes Gel
formuliert. Die IL-1/Pufferlösung wurde unter Verwendung
eines Eppendorf Pipettiergeräts unter einer sterilen Werkbank
(laminar flow hood) aseptisch zu dem Gel zugegeben. Das Gel
wurde danach mit einem Teflon -Spatel für ungefähr 3
Sekunden gerührt. Die Druckkolben wurden von sterilen 5
ml-Plastikspritzen entfernt und diese Spritzen wurden von oben mit
dem Gel beladen. Die Druckkolben wurden danach wieder
eingesetzt. Alle Stufen wurden aseptisch und in einer sterilen
Werkbank ausgeführt. Geeignete Verdünnungen von IL-1α und
IL-1β wurden hergestellt, und Aliquots wurden zu dem Gel
zugefügt, um die folgenden Konzentrationen (Gewicht
Protein/Gewicht Gel) herzustellen:
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IL-1α 40 ng/g (1)
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200 ng/g (2)
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2 ug/g (3)
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IL-1β 40 ng/g (4)
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200 ng/g (5)
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2 ug/g (6)
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Sechs junge Yorkshire-Schweine, die jeweils ungefähr 10 kg
wogen, wurden mit einer Basaldiät ad libitum gefüttert und
einzeln in einem Stall unter kontrollierten Bedingungen (19-
20ºC, 12 Stunden Licht-12 Stunden Dunkelheit-Zyklus, 65%
relative Luftfeuchtigkeit) gehalten. Jedes Tier wurde mit
Standard-Tierklammern fixiert. Die Haut auf beiden Seiten
des Tieres wurde durch Waschen mit steriler Kochsalzlösung
vor der Verwundung präpariert. Die Tiere wurden unter
Verwendung von Pentobarbitalnatrium (Nembutal Natrium 12/mg/kg
i.p.) anästhesiert, und ungefähr 120 Wunden mit den Maßen 7
x 10 mm und 0,3 mm tief wurden in den paravertebralen und
thorakalen Bereich mit einem Elektrokeratom gesetzt, wie
beschrieben in Alvarez et al., J. Plast. & Reconstr. Surg.
69:284 (1982). Die Wunden waren voneinander durch wenigstens
15 mm normale Haut getrennt.
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Die Wunden eines jeden Tieres wurden in 8 Gruppen geteilt
und wie folgt behandelt: Kontrolle (keine Behandlung)
Vehikulumgel (Placebo) und 6 Behandlungsgruppen, umfassend 40
ng/g, 200 ng/g und 2 ug/g rekombinantes humanes IL-1α und 40
ng/g, 200 ng/g und 2 ug/g rekombinantes humanes IL-1β. Die
Behandlungsgruppen waren durch mindestens 2 cm normale Haut
voneinander getrennt. Sofort nach der Verwundung wurden die
Wunden mit 0,2 ml des entsprechenden Mittels behandelt,
wobei sichergestellt wurde, daß das Mittel die gesamte Wunde
bedeckte. Um die Möglichkeit auszuschließen, daß die Wunden,
die in verschiedenen anatomischen Bereichen gesetzt wurden,
unterschiedlich heilen könnten, wurden die Bereiche, die für
die jeweilige Behandlung ausgewählt worden waren, unter den
Tieren variiert.
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An jedem Tag nach der Verwundung (Tag 0) wurden für eine
Zeitdauer von 6 Tagen mehrere Wunden und umgebende normale
Haut von jeder Behandlungsgruppe unter Verwendung eines
Elektrokeratoms, das mit einer 2 mm-Klinge ausgestattet war,
zu 0,5 mm ausgeschnitten, wie beschrieben bei Alvarez et
al., Arch. Dermatol. 119:222 (1983). Die die Wundstelle
enthaltende, ausgeschnittene Haut wurde für 12-24 Stunden bei
4ºC in 0,25% Trypsin inkubiert, um die Dermis von der
Epidermis zu trennen. Die epidermale Wanderung wurde bewertet,
wie beschrieben von Alvarez et. al., J. Invest. Dermatol.
81:144 (1983). Diese Methode ist, kurz zusammengefaßt, eine
makroskopische Untersuchung der abgetrennten Epidermis auf
Defekte. Die Defekte sind als Löcher in der abgetrennten,
epidermalen Schicht oder durch ein Fehlen eines epidermalen
Kontinuums in dem Bereich, der die Wunde enthielt, sichtbar
gemacht. Die Wunde wird als reepithelialisiert angesehen,
wenn keine Defekte in der Epidermis vorhanden sind, und als
nicht reepithelialisiert, wenn ein oder mehrere Defekte
vorhanden sind.
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Alle Daten wurden unter Verwendung des Student-t-Tests
statistisch analysiert, wie beschrieben in Alvarez et al.,
Arch. Dermatol. 119:222 (1983). Eine Probit-Analyse wurde
gemäß dem Verfahren von Zar durchgeführt, wie beschrieben in
Alvarez et al., J. Invest. Dermatol. 81:144 (1983).
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Die Daten zeigten, daß IL-1β in einer Menge von 2 ug/g Gel
die Heilung von oberflächlichen Hautwunden um 44% im
Vergleich zu unbehandelten und um 30% im Vergleich zu mit dem
Vehikulum behandelten steigerte. Zusätzlich beschleunigte
IL-1β in einer Menge von sowohl 40 ng/g Gel als auch
200 ng/g Gel die Wundheilungsrate signifikant (z.B. 33% im
Vergleich zu unbehandelten, 23% in Vergleich zu mit einem
Vehikulum behandelten Wunden bei 40 ng/g). TL-1α führte zu
einer ähnlichen, jedoch quantitativ geringeren Förderung der
Wundheilung unter den getesteten Bedingungen. Letztendlich
heilten alle Wunden, die mit einem topischen Mittel
behandelt wurden, schneller als unbehandelte Kontrollen, die
für die Luft zugänglich gelassen wurden. Die erhaltenen
Daten sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt, und alle
Werte sind ausgedrückt als die Anzahl der geheilten Proben
zu der Gesamtzahl der untersuchten Proben zu jedem
Zeitpunkt. Die Zahlen in Klammern stellen Prozent Geheilte dar.
Tabelle 1: Wirkung von hydrophilen, rhIL-1α und rhIL-1β
enthaltenden Gelen auf die Heilung von oberflächlichen
Hautwunden
Anzahl und Prozent der geheilten Proben Tage nach Verwundung
Behandlung .
nur Vehikel
unbehandelt
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Ein Vergleich der relativen Heilungsraten zwischen den
Behandlungsgruppen und Kontrollgruppen ist in der
nachstehenden Tabelle 2 dargestellt. In der Tabelle 2 bedeutet "HT50"
die Anzahl von Tagen, die benötigt wurden, um 50% der Wunden
zu heilen.
Tabelle 2: Vergleich der Heilungsraten von unbehandelten
Wunden und mit rekombinantem, humanem IL-1α und IL-1β
behandelten Wunden
relative Heilungsrate verglichen zu:
Behandlung
Tage
unbehandelt (%)
nur Vehikulum (%)
unbehandelt
Beispiel 3: Wirkung der topischen Applikation von humanem
IL-1 in niedriger Dosierung auf die Wundheilung bei Ratten
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Das folgende Experiment war ein einfacher Blindversuch, der
darauf ausgerichtet war, die Wirkung von IL-1 auf den
Wundverschluß zu bewerten und spezieller, um die Heilungsantwort
bei verschiedenen Dosierungen von IL-1 zu untersuchen.
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Fünfunddreißig (35) spezifische, pathogenfreie, normale,
weibliche Lewis-Ratten (Charles Ricer Raleigh, Raleigh, NC)
wurden in dieser Studie verwendet. Die Ratten wurden einzeln
für eine Zeitdauer von einer Woche vor dem Beginn des
Experiments und über die Experimentdauer hinweg (1 Woche) in
Käfigen gehalten. Diese Tiere wurden mit einer Basaldiät at
libitum gefüttert und in einer kontrollierten Umgebung
(Temperatur 19-21ºC, 12 Stunden Licht-12 Stunden Dunkelheit-
Zyklus und 50% relative Luftfeuchtigkeit) gehalten.
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Alle Ratten wurden für die Operation durch Anästhesierung
mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin/Rompun
präpariert. Der zu operierende Bereich wurde rasiert, mit
Jodseife gewaschen und gründlich mit einer sterilen
Kochsalzlösung gespült. Sterile Tücher, Handschuhe und
Instrumente wurden verwendet, um ein steriles Umfeld zu erreichen.
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Vier Schnittwunden über die gesamte Hautdicke (1,5 cm lang,
0,3 cm breit und ungefähr 0,2 cm tief in die Muskelfascie)
wurden mit einer chirurgischen Klinge (# 15) in die dorsale
Haut eines jeden Versuchstieres gesetzt, um elliptisch
geformte Wunden mit einem Oberflächenbereich von ungefähr 0,5
cm² zu erzeugen. Die Wunden blieben über das Experiment
hinweg ungenäht. Zum Zweck einer Quantifizierung einer Antwort
der Wundoberfläche auf eine bestimmte IL-1-Dosis wurde die
Oberfläche aller Wunden durch Multiplizieren der maximalen
Länge mit der maximalen Breite der elliptisch geformten
Wunde abgeschätzt. Die Wunden waren voneinander durch
mindestens 2 cm normale Haut getrennt.
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Zur topischen Applikation von IL-1 wurde ein
Carboxymethylcellulose (CMC)-Gel wie folgt formuliert. 25 g Glycerin und
25 g Propylenglykol wurden mit 0,1 g Propyl-p-hydroxybenzoat
und 1 g Methyl-p-hydroxybenzoat gemischt. 950 ml
Natriumphosphatpuffer (0,1 M, pH 6,0) wurden danach zu der Mischung
zugefügt. Die sich ergebende Lösung wurde gerührt, bis sie
fließend war, und durch ein 0,22 um Filter filtriert. 30g
autoklaviertes CMC wurden danach zu den filtrierten Puffer
zugefügt. Die letztendliche Menge des CMC als Vehikulum
enthaltenden Gels war ungefähr 1000 g. Gereinigtes, steriles,
rekombinantes humanes IL-1α oder IL-1β wurde zu Aliquots des
CMC-Vehikulumgels zu einer Endkonzentration von 0,1 ng, 1,0
ng, 10 ng, 50 ng oder 100 ng IL-1α oder IL-1β pro 50 ul Gel
zugefügt.
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Sofort nach der Verwundung wurden die Wunden wie folgt
behandelt. Kontrollwunden wurden nicht behandelt.
Placebo-Kontrollwunden wurden mit 50 ul CMC-Vehikulumgel allein direkt
behandelt. Testwunden wurden mit 0,1 ng, 1,0 ng, 10 ng, 50
ng oder 100 ng von sowohl IL-1α als auch IL-1β in 50 ul CMC-
Vehikulumgel für jede Wundstelle direkt behandelt. Jede
Wunde wurde nur einmal behandelt.
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Die Tiere wurden in 7 Gruppen jeweils 5 Tiere unterteilt
und wie folgt behandelt: Gruppe A hatte zwei Wunden, die nur
mit Vehikulum behandelt wurden, und zwei Wunden, die mit 0,1
ng IL-1α im Vehikulum behandelt wurden. Gruppe B hatte zwei
Wunden, die mit 1,0 ng IL-1α im Vehikulum behandelt wurden,
und zwei Wunden mit 10 ng IL-1α im Vehikulum behandelt
wurden. Gruppe C hatte zwei Wunden,die mit 50 ng IL-1α im
Vehikulum behandelt wurden, und zwei Wunden, mit 100 ng IL-1α im
Vehikulum behandelt wurden. Gruppe D hatte zwei Wunden, die
unbehandelt waren und zwei Wunden, die nur mit dem Vehikulum
behandelt wurden. Die Gruppen E, F und G hatten Wunden, die
mit IL-1β in Konzentrationen behandelt wurden, die mit
denjenigen von IL-1α identisch waren, die für die Behandlung
der Gruppen A, B bzw. C verwendet wurden. Um sterile
Bedingungen zu erhalten, wurden die Wunden mit Okklusivverbänden
bedeckt, die Telpha -verdichte Mullkompressen und eine Op
Site -Polyurethan-Klebedeckschicht umfaßten. Alle mit IL-1α
oder IL-1β behandelten Wunden hatten Okklusivverbände. Nur
Ratten in Gruppe D, die unbehandelte oder mit einem Placebo
behandelte Wunden hatten, wurden nicht mit einem
Okklusivverband versehen, um zu beobachten, ob das Fehlen des
Okklusivverbands eine Wirkung auf die Wundheilung hatte.
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Fünf Tage nach der Behandlung wurden die Tiere getötet. Die
Verbände wurden danach von den Wunden entfernt, und die
Wunden wurden visuell untersucht, um qualitativ die Wirkungen
der Behandlung auf die Wundheilung zu bestimmen, die als
Prozent Heilung im Vergleich zur ursprünglichen Wunde
gemessen
wurde. Der Heilungsanteil wurde durch visuelles
Inspizieren und durch Bewerten jeder Wunde als 0% , 25%, 50%, 75%
oder 100% geheilt gemessen, wobei 0% Heilung eine offene
Wunde mit keinen Anzeichen einer Heilung zeigt, und 100%
Heilung eine vollständig geheilte Wunde mit
Reepithelialisierung ohne beobachtete Schorfbildung zeigt. Weitere
Kriterien, die verwendet wurden, um den Wundheilungsanteil zu
bestimmen, umfaßten Wundfarbe, Wundoberfläche, Anzeichen einer
Schwellung oder Infektion und Vorhandensein von
Granulationsgewebe, soweit vom Äußeren des Tieres beobachtet. Die
Wundoberfläche wurde auf dieselbe Weise gemessen, wie die
der ursprünglichen Wunden (vorstehend beschrieben), und die
Daten wurden verwendet, um die nicht-geheilte Wundfläche
auszurechnen. Folglich wurde jede Wunde nach der visuellen
Abschätzung des Wundheilungsanteils und der nicht-geheilten
Wundoberfläche bewertet.
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Die sich ergebenden Daten wurden unter Verwendung des
Student-t-Tests statistisch analysiert, wie beschrieben in
Alvarez et al., Arch. Dermatol., 119:222 (1983). Jede
Behandlungs- oder Kontrollgruppe bestand aus 10 Wunden. Die
Daten sind dementsprechend als Mittel +/- SEM für n=10
dargestellt.
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Die Daten, die durch Messen der Wundoberfläche nach fünf
Tagen erhalten wurden, sind in den Figuren 1A und 2A graphisch
dargestellt. Figur 1A zeigt, daß die Applikation von IL-1α
eine signifikante Wundheilung (verglichen mit Wunden, die
mit einem Placebo behandelt wurden) bei der 10 ng-Dosis
ergab, wie durch die Verkleinerung der Wundoberfläche
gemessen wurde. Figur 2A zeigt, daß die Applikation von IL-1β
eine signifikante Wundheilung (verglichen mit unbehandelten
Wunden und mit Wunden, die mit einem Placebo behandelt
wurden) bei der 50 ng-Dosis von Il-1β ergab, wie durch die
Verkleinerung der Wundoberfläche gemessen wurde. Die Daten
zeigen, daß so niedrige Dosierungen von IL-1α wie ungefähr 1,0
ng und so niedrige Dosierungen von IL-1β wie ungefähr 50 ng
wirksam bei der Förderung der Wundheilung sind.
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Die Daten, die durch Beobachten des Heilungsanteils nach
fünf Tagen erhalten wurden, sind in den Figuren 1B und 2B
graphisch dargestellt. Die Figuren 1B und 2B zeigen, daß
Wunden, die mit entweder 50 ng oder 100 ng IL-1α oder IL-1β
behandelt wurden, signifikant schneller heilten als Wunden,
die mit einem Placebo behandelt wurden.
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Die vorstehenden Ausführungsformen der Erfindung sind als
Erläuterung gedacht. Offensichtliche Varianten oder
Äquivalente der tatsächlich hierin offenbarten Zusammensetzungen
würden verschiedene Wundheilungszusammensetzung
einschließen, die mutierte oder analoge Formen von IL-1-Proteinen mit
ähnlichen biologischen Aktivitäten umfassen oder
Wundheilungszusammensetzungen für eine Verwendung in der
Veterinärmedizin, die geeignete Mengen an IL-1-Proteinen einer
bestimmten Spezies, wie z.B. IL-1-Proteinen vom Rind, Schwein,
Pferd, Schaf, Kaninchen oder Katze, umfassen. Zusätzlich
werden die Dosierungen in Abhängigkeit von der Wundtiefe
oder des Wundtyps variieren und davon, ob das zu behandelnde
Individuum normal oder erkrankt ist.