JPH03502922A - インターロイキン‐１蛋白質を含む局所創傷治療用製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インターロイキン−１蛋白質を含む局所創傷治療用製剤光所■宜景 本発明は哺乳動物ＩＬ−１蛋白質を含む、創傷治癒促進用局所治療製剤に関する 。

インターロイキン−１（ＩＬ−１）は免疫性及び外傷性刺激に反応したマクロフ ァージとある種の細胞から分泌されるポリペプチド類を意味する。ＩＬ−１蛋白 質は多様な範囲の生物学的活性を有しており、損傷と感染に対するホスト反応の 開始に主要な役割を果すと思われる。ＩＬ−１はインターロイキン−２放出の誘 導により胸腺細胞増殖を誘導し、Ｂ　ＩＪンバ球の増殖と成熟を刺激することの できる主要な免疫刺激シグナルである。さらに、ＩＬ−１はプロスタグランジン 産生、炎症、発熱の誘導に関係している。

オンペンハイム（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ　）等によるＩＬ−１に関する文献ニイム ノール　ツウ−’　イＩｍｍｕｎｏ１．Ｔｏｄａ　）　７巻４５頁（１９８６） の考察はｒｌＬ−１が炎症と創傷治療に関係する細胞に多重効果を有する」と報 告している。下記の参考文献の開示によって示されるように、ＩＬ−１は線維芽 細胞の増殖を刺激し、炎症反応に関係する細胞を誘引することが知られている。

ボスドレスウェイト（Ｐｏｓｔｌｅｔｈｗａｉｔｅ）等のジエイ　イクスプーム エ＝（Ｌ■Ｌ厘虹）出８０１頁（１９８３）は、ＩＬ−１様物質がインビトロに おいて線維芽細胞増殖を刺激し、培養された線維芽細胞によるコラ−ゲナーゼ放 出をも刺激しうることを示した実験を述べている。

特表千３−５０２９２２　（２） ルーガー（Ｌｕｇｅｒ）等のジエイ　イムツール（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ＋、　） 匪８１６頁（１９８３）　、サラダ−（Ｓａｕｄｅｒ）等のジェイ　イムノ−ｔ ｖ　１３２８２８頁（１９８４）　、クルーガー（１（ｌｕｇｅｒ）等編集の「 インターロイキン−１の生理的、代謝的及び免疫学的作用（ＴｈｅＰｈｙｓｉｏ ｌｏｇｉｃ、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｎｄ　Ｉ＋＋＋ｕｎｏｌｏｇｉｃ　Ａｃｔｉ ｏｎｓ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｌｅｕ−ｋｉｎ−１）　Ｊ　　（アランアールリス社 （Ａｌａｎ　ＲＬｉ５ｓ＋Ｉｎｃ、）　、−１−、：Ｌ−ヨーク、１９８５　； 以下では「クルーガーシンポジウム（ＫｌｕｇｅｒＳｙｍｐｏｓｉｕｍ　）　Ｊ として引用〕に記載されている幾つかの論文は、表皮細胞の胸腺細胞活性化因子 （ＥＴＡＰ）と名づけられたヒト表皮細胞から誘導される因子と、生化学的にＩ Ｌ−１に類似していると思われる白血球発熱因子（ＬＰ）を述べている。これら は多形核球（ＰＭＮ）と単核白血球（ＭＮＬ　）の化学誘引剤として活性であっ た。多くの炎症性皮膚状態はＰＭＮとＭＮＬの真皮中への浸潤を特徴とするので 、ＥＴＡＰとおそらくはＩＬ−１が炎症性皮膚疾患の病因に関係しているとこれ らの著者は示唆している。ガーリング（Ｇａｈｒｉｎｇ）等は上記クルーガーシ ンポジウムで発表された別の論文で、皮膚の最外層である角質層中でＥＴＡＦの 測定可能なレベルを検出し、角質層内のこの因子の存在が創傷部位へのＥＴＡＦ の直接の付着とこれに続く炎症の誘導の機構を提供すると推測している。

ビャールス（Ｂｙａｒｓ）等の　工′　プロ　　Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、）４３．４ ６２（１９８４）は、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）によって刺激された、モル モットマクロファージ培養物の上清が毛細血管内皮細胞の増殖を誘導できること を発見した。しかし、これらの著者は培養物上清中のＩＬ−１がマイトジェン因 子（ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ　ｆａｃｔｏｒ）であることを実証しなかった。

ベビラクア（Ｂｅν１ｌａｑｕａ）等のジエイ　イクスブ　メ′、　１６０６１ ８頁（１９８４）は、不完全精製したＩＬ−１製剤がヒト血管内皮細胞の培養物 に一前凝固活性を誘導することを示した。

ヒ）ＩＬ−１活性は現在ＩＬ−１αとルー１βとして知られている２種類の離れ た関係の蛋白質中に存在する（マーチ（Ｍａｒｃｈ）等、主歪±土二（Ｎａｔｕ ｒｅ）　３１５６４１頁（１９８５）　）　、両分子は通常、分子量３１，００ ０ダルトンの大きい先駆物質として合成され、次にこれを蛋白質分解開裂によっ て処理すると分子量約１７．５００ダルトンの成熟形が得られる。これらの蛋白 質は２６％のみの相同性を共有するにすぎないが、両分子は同じ細胞表面に結合 し、初期実験では同じ範囲の生物学的活性を有するように見えた。

最近、両方のヒ１−ＩＬ−１種をコードするｃＤＮＡがクローン化され、大腸菌 （Ｅ、ｃｏｌｉ　）に表現されおり、この大腸菌が臨床評価のために充分な量の ＩＬ−１αとＩＬ−１βの産生を可能にしている。

しかし、創傷治癒過程を助成するためのＴＬ−１の直接使用の臨床的有用性は得 られていなかった。ＩＬ−１にあるとされている生物学的活性が多様であり、治 癒過程におけるこのような活性の役割が理解されていないために、ＩＬ−１を創 傷部位に局所塗布した場合にＩＬ−１が創傷治癒を遅延させるのかまたは促進す るのかを現在の技術状態では予測することができない。

ＩＬ−１蛋白質が、この蛋白質を含む局所製剤として創傷に塗布した場合に、創 傷治癒の有効な促進剤であることが、今回発見された。

２１廊口ｌ斐 本発明は、創傷治癒を促進するために充分な量の哺乳動物のインターロイキン− １（ＩＬ−１）と創傷部位へＩＬ−１を使用（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　）する ための生理的に許容される親水性ビヒクル（賦形剤）とを含む、ヒトを含めた哺 乳動物における創傷治癒促進用の局所組成物を提供する。本発明はまた哺乳動物 における創傷治癒を促進するために、創傷部位に使用する薬剤の製造へのＩＬ− １の使用を含む。

凹百少皿単星脱凱 第１Ａ図と第１Ｂ図は、それぞれ創傷表面積と治療率とによって評価して、ＩＬ −１α用量が５日間にわたって反応することを示すグラフであり： 第２Ａ図と第２Ｂ図は、それぞれ創傷表面積と治療率とによって評価して、ＩＬ −１β用量が５日間にわたって反応することを示すグラフである。

主班夏１鞭菓註所 皮膚は温血生物の最大器官であり、多様な重要な生体恒常性（ｈｏｍｅｏｓｔａ ｔｉｃ）機能を果す。皮膚の構造的統一性が火傷または破傷によって傷つけられ ると、一連の細胞事象が開始し、一般には創傷を閉塞させ、最後には創傷部位に おける新しい表皮細胞を増殖させる。

創傷治癒の第１段階は損傷した血管の閉塞と血管損傷部位での血小板凝集を含む 。血漿フィブリン、フィブリノゲン、フィブロネクチン、その他の血漿と皮膚の 蛍白質、プロテオグリカン及び糖量白質の凝固は創傷部位中に固体基質を形成す る。第２段階は、細菌と損傷細胞を除去し、再生過程を助成する種々な熔解因子 を分泌すると考えられる、創傷領域における白血球とマクロファージの作用によ って生ずる炎症を含む。創傷部位における組織の実際の再構成は線維芽細胞によ って開始され、線維芽細胞は創傷部位に粘着し、増殖し、コラーゲンを分泌し、 コラーゲンは架橋して以後の治癒のための構造的に安定な基礎を形成する。哺乳 動物では、欠損部の縁の表皮細胞が可動化して創傷部位の生活可能なｍ織を横切 って移動することによって、創傷治癒の最終段階は達成される。欠損部が被覆さ れると、分化の過程が生じ、それによって表皮細胞がケラチンを合成し、最後に は表皮構造を再構成する。

慢性または難治性の創傷状態が多くあり、創傷治癒テクノロジー改良の必要性を 示唆している。例えば、火傷、慢性床ずれ、潰瘍性皮膚状態、他の難治性創傷の 治癒速度を高める方法は、獣医学及びヒトの医学の実施にとって非常に重要であ る。例えば、天然の創傷治癒力の遅延を特徴とする糖尿病のような、疾患状態も 存在する。

創傷治癒テクノロジーの分野における現在の概念は、創傷治癒の初期段階におけ る湿式半閉塞性包帯の使用を強調する。ポリエチレンまたはポリウレタンフィル ムの貼布による創傷の閉塞は、ガス交換を可能にしながら、創傷を湿った状態に 維持する。一般に、表皮の治癒速度が上昇すると、疼痛が軽減する。

バイオテクノロジーの進歩及びホルモンと成長因子を産生させる新しい方法の開 発によって、創傷治癒の促進に有用である成長因子を求める研究が開始されてい る。有益だと考えられる創傷治癒促進剤であると報告されている因子には、形質 転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、表皮成長因子（ＥＧＦ）　、血管形成因子 、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）が存在する。しかし、臨床診療におけるこのよ うな因子の実際の効果は今はじめて検討されている。

本発明では、生物学的有効量のインターロイキン−１蛋白質を不活性な親水生ビ ヒクル（例えば水性ゲル）と共に含む創傷包帯組成物（ｗｏｕｎｄ　ｄｒｅｓｓ ｉｎｇ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を製造する。このようなビヒクルは創傷部位 にＩＬ−１を塗布する手段を与え、創傷部位における一時的なＩＬ−１溜め（ｔ ｅｍｐｏｒａｒｙ　ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ　ｏｆＩＬ−１’）を与え、創傷部位を 絶えず湿った状態に維持する。

ヒトを含めた哺乳動物における創傷を治癒するための薬剤の製造に、ＩＬ−１α またはＩＬ−１βのいずれかを用いることができる。ＩＬ−１蛋白質を創傷治癒 促進に有効な量で創傷部位に塗布する。本発明の創傷治療用組成物はＩＬ−１（ αまたはβ）５０ｐｇ／ビヒクルｇ〜５０眉／ヒビクルｇ好ましくは５０ｎｇ／ ｇ〜５００ｎｇ／ｇを含む。非常に低レベルのＩＬ−１で有益−な効果が認めら れている、これより多量を特定の製剤に導入することもできるが、これは製造中 または貯蔵中の蛋白質分解の原因になる。

一般に、ＩＬ−１（ＩＬ−１α、ＩＬ−１βまたは両方）は創傷表面積１ｄあた り約０．２ｎｇから約１１！ｇまでの範囲内のＩＬ−１５日間累積量を与えるよ うに、創傷部位に効果的に塗布することができる。特にＩＬ−１αまたはＩＬ− １βを下記の５日間累積量（優先順位で記載）を与えるように創傷部位に塗布す ることができる：創傷表面積１ｄにつき約２ｎｇ〜約５００ｎｇ　；約２０ｎｇ 〜約４００ｎｇ　；５０ｎｇ〜約３００ｎｇ、同様に、ＩＬ−１ａとＩＬ−１β を一緒にして、下記の５日間累積量（優先順位で記載）を与えるように創傷部位 に塗布することができる：創傷表面積１ｃ＋ｄにつきＩＬ−１α１ｎｇ〜約２５ ０ｎｇとＩＲ−１βｌＯｎｇ　〜約２００ｎｇ　；創傷表面積１ｄにつきＪＲ− １ａ　２５ｎｇ〜約１５０ｎｇとＩＲ−１β　ｌｎｇ〜約２５０ｎｇ；創傷表面 積１ｃＪにつきＩＲＩ　Ｏ：　１０ｎｇ　〜約２００ｎｇとＩＲ−１β２５ｎｇ 〜約１５０ｎｇ、創傷表面積は創傷の周辺によって画定される面積であり、創傷 の長さと幅を乗することによって算出することができる。創傷表面積のより正確 な測定はブラニメーター〔ヒューストンインストルメンツ（Ｈｏｕｓｔｏｎ　Ｉ ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）　）を用いて得られる。

用量は創傷の深さまたは種類に依存して変化する。深くて重度の創傷は通常多量 のＩＲ−１を必要とすると考えられるが、損傷した血管系を特徴とする創傷に対 して低用量を用いることができる。用量は治療される個体の健康が正常であるか または損われているかに依存しても変化する。健康障害のある個体とは例えば慢 性的床ずれ、潰瘍製皮膚状態、糖尿病または他の代謝性疾患を有する個体、老令 、栄養不良、免疫不全である個体、コルチコステロイド治療または化学療法を受 けている個体または化学物質を乱用している個体を含む。健康障害を有するこの ような固体が創傷治療に多量のＩＬ−１を必要とすること及びこのような個体が 比較的長期間治療されることが考えられる。

本発明の組成物の製造に用いる、適当な不活性な水性ビヒクルの例には、コラー ゲン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキンエチルセルロースもしくは他の セルロース系化合物またはポリエチレングリコールの混合物から製造したゲルが ある。

生体適合性と無傷または損傷した皮膚によるゲル吸収とが必要であるために、ビ ヒクル製剤（ｖｅｈｉｃｌｅ　ｆｏｒ＋＋＋ｕｌａｔｉｏｎ）に適した化合物は 一般にセルロース誘導体である。多様な長鎖化合物がこの用途に適した粘度範囲 で商業的に入手可能である。ビヒクル成分は調合の前に加圧滅菌することによっ て殺菌することができる。ＩＬ−１溶液はガンマ線照射によって殺菌することが 好ましい（１，５ｉｒａｄ）。

本発明の組成物には、ＩＬ−１の生物学的活性に不利な影響を与えないかぎり、 多様な添加剤を加えることができる。例えばメチルパラベンとエチルパラベンの 混合物のような、安定剤または保存剤が調合と貯蔵中の偶発的な微生物汚染の防 止に有用である。ＢＩＴ、　ＢＨＡ等のような酸化防止剤は最終調合中のＩＬ− １蛋白質の変性の阻止に有用である。α−アンチトリプシン阻害剤、α２−マク ログロブリン、大豆トリプシン阻害剤、フェニルメチルスルホニルフルオリド、 種々なハロメチルケトンペプチジル化合物、またはこれらの混合物のような、プ ロテアーゼ阻害剤は蛋白質分解剤による分解の防止に有用である。最終生成物を 金属管内に貯蔵する場合には、金属イオンによる活性インターロイキン−１成分 の反応の可能製を減するために、ＥＤＴＡのようなキレート剤を用いることがで きる。ゲルと混合する前のＩＬ−１蛋白質混合物に染料（ｄｙｅ）も加えること ができる。

製品の物質製を保証するために、染料の吸光度ピークにおいて均一な吸光度が得 られるまでゲルを混合する。これによって、最終製品中に存在するＩＬ−１蛋白 質が少量であるためにかなり困難な生物学的分析を実施する必要性が避けられる 。

えイン　−ロイキン−１の　　゛ ここで用いる「インターロイキン−１」、「組換えインターロイキン−１」、ｒ ＩＬ−Ｉ　Ｊ、ｒｒｌＬ−１」はＩＬ−１ｃｘとＩＬ−１βの天然哺乳動物型の アミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有し、天然型に共通した生物学的活 性を有する哺乳動物ＪＬ−１蛋白質を集合的に意味する。アミノ酸配列の実質的 な同一性は、配列が同一であるかまたは合成蛋白質と天然型との間に不利な機能 的不同性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｄｉｓｓｊｍｉｌａｒｉｔｙ）を生じないよ うな、１つ以上のアミノ酸変化（欠失、添加または置換）によって異なることを 意味する。本発明の組成物の製造に哺乳動物のＩＬ−１α、ＩＬ−１β蛋白質の 組換え体を用いることが好ましい。このような組換え蛋白質は例えばサツカロミ セス属（鎧２畑ごユ匹竪）または好ましくは大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）において下 記に述べるような、微生物発酵プロセスによって便利に製造することができる。

成熟ヒトＩＬ−１αとＩＬ−１βはファージＡＰＬ促進因子とＣ１８５７ｔｓ不 耐熱性抑制因子の制御下で大腸菌に表現することができる。ｒｌＬ−１αとＩＬ −１β製造のための表現プラスミドはプラスミドｐＰＬｃ２８　（ＡＴＣＣ５３ ０８２）　、プラスミドｐ■２２３−３　（ファルマシアファインケミカル（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｇ）　、スウェーデン、アブサ ラから商業的に入手可能〕及びＩＬ−１αクローンｌＯＡ［？−チ（Ｍａｒｃｈ ）等の上記文献、　ＡＴＣＣ３９９９７）とＩＬ−１βクローンＩＬ−１−１４ （ＡＴＣＣ３９９２５）とを含むプラスミドから次のように構成される。

ＩＬ−１αの表現ヘクターを形成するには、Ｓｅ　ｒ　目３　（ヌクレオチド３ ３７−３３９）から八１ａ１７１　（ヌクレオチド８１１−８１３）までの範の ＩＬ−１α遺伝子の３′部分を表現ベクターｐＰＬｃ２８に挿入する。

これは１０Ａクローンから４９９塩基対Ａ］ｕｌ−Ｎｄｅ■フラグメントを切断 し、これに下記の合成オリゴヌクレオチドリンカーを結合することによって達成 される： このリンカ−はＩＬ　−１ｃｔｓｅｒ””　〜Ｓｅｒ”’配列に加えて八ｌｕＩ とＥｃｏＲＩ末端、リポソーム結合部位及びＡＴＧ開始コードンを含む。

次にｐＰＬｃ２８を消化させ、Ｅｃｏ　Ｒ１とＮｔｌｅ　Ｉによって完成させ、 生成した大きいフラグメントをアガロースゲルによって単離した。

次にこのリンカ−１１〇八クローン、プラスミドフラグメントをＴ４リガーゼに よって融合させ、ｐＩＬαと表示される表現プラスミドを形成する。ｐｌＬαに ついてのさらに詳細は公開ヨーロッパ特許出願第１８８，８９４号の開示に認め られ、この出願の関連する開示はここに参考文献として関係する。

次に、得られた構造を用いて大腸菌株Δ旧（ＡＴＣＣ３３７６７ｉカスチラシ（ Ｃａｓｔｅｌｌａｚｉ）等のモレク　　−ン　ネ　、　　（Ｍｏｌｅｃ。

且り釦匹以）　ＬＬＬ２１１　）を標準方法によてアンピシリン耐性に形質転換 する。プラスミド支持ＩＬ−１α遺伝子を表現するために、形質転換Δ旧の培養 物をアンビリンを含まないし一ブロス（Ｌ−ｂｒｏｔｈ）中で増殖させる。培養 物が約０．５のＡ７□。に達した場合に、培養物温度は約４２°Ｃに上昇し、不 耐熱性ＰＬ促進因子の抑制解除を促進する。高温での１時間後に、遠心分離とド ライアイス／メタノール混合物中でのフラッシュ凍結によって細胞を回収する。

ｍｔａえヒトＩＬ−１βは、ここではｐｌＬＰβと名づける、他のプラスミドを 用いて製造される。このベクターはｐｌＬＰｃから集められる（マーチ等の上述 の文献）　、ｐｌＬＰｃはｐＫＫ２２３−３のＢａｇＨ１／Ｅｃｏ［フラグメン トを、λＰＩ、促進因子を含むｐＰＬｃ２ＢからのＳ！Ｌ３ｔ　３　Ａ　／脇Ｒ １フラグメントと代えることによって構成される。

このプラスミドは消化され、ＥｇＲＩとＰｓｔｌによって完成され、この最大フ ラグメントは次に（１）ヒトＩＬ−１β遺伝子〔＾１　ａ　ｌ　１　？〜Ｃ０Ｏ Ｈ末端は活性蛋白質をコード化する〕を含むｐｌＬ−１−１４（＾ＴＣＣ３９９ ２５）からの６９９塩基対Ｈｐａｌｌ／Ｐｓｔｌフラグメント及び（２）下記の ＥｃｏＲＩ／抑創合成オリゴヌクレオチド：に結合する。

次にプラスミドｐｌＬＰβを用いて、大腸菌ＩＩＩまたは、ＰＬ転写の不耐熱性 すブレ、サーを含む他の細胞を形質転換する。約０．５のＡ？１゜に増殖した後 に、既述したように熱誘導によってｒｌＬ−１β遺伝子の表現が得られる。　ｒ ｌＬ　−１αの場合と同様に胸腺細胞***（ｍｉｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）または上 記のＩＬ−１転化分析を用いてｒｌＬ　−１β活性を確認することができる。

適当な緩衝液中での酸抽出によって、粗細菌抽出物から組換えヒ）ｒＬ−１蛋白 質を単離することができる。細胞は凍結−解凍サイクリング、超音波処理、機械 的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む便利な方法によって破壊することができ る。ｐＨ約２．０〜約３．５、特に９Ｎ２．６〜約３．０を有する水性緩衝媒質 中でｒｌＬ−１αの酸仲介抽出工程を実施することが好ましい、ｒｌＬ−１βの 場合には、ｐｈｉ約３．５〜約４．５、特にｐＨ約３．７〜約７．１において酸 抽出を実施することが好ましい。

精製を完全にするために、最初の酸抽出工程の次に水性媒質中でのクロマトグラ フィーを実施する。精製プロセスのこの部分は初期イオン交換クロマトグラフィ 一工程と次のアフィニティクロマトグラフィーとを含む。イオン交換工程は、好 ましいＢｌ’ｌでは、陽イオン交換クロマトグラフィーと次の陰イオン交換クロ マトグラフィーとを含む。

適当な陽イオン交換クロマトグラフィー媒質には、スルホプロピルまたはカルボ キシメチル基を含む種々な不溶性マトリックスがある。スルホプロピル基が好ま しい。マトリックスは蛋白質精製に一般に用いられるアクリルアミド、アガロー ス、デキストラン、セルロースまたは他のイオン交換樹脂または支持体（ｓｕｂ ｓｔｒａｔｅ）でありうる。ｒｌＬ　−Ｉ　ＣｒとｒｌＬ　−１βの陽イオン交 換クロマトグラフィーに特に有用な物質はスルホプロピルセファデックス（Ｓｕ ｌｐｈｏｐｒｏｐｙｌ　５ｅｐｈａｄｅｘ　）　Ｃ−２５（７ｙルマシアファイ ンケミカルス、スウェーデン、アブサラ〕である。スルホプロピル基を含む媒質 を陽いる場合には、例えばクエン酸ナトリウムのような適当な緩衝液に溶がした ｐＨ約４．０の、ｒＩＬ−１種を含む抽出物を塗布する。ｒｌＬ　−１種はイオ ン交換装置に結合し、例えばＩＯｍＭＴｒｉｓ−）１ｃｊ２　（ｐＨ８，１）の ような弱塩基性溶離剤によって、光度に精製された形で溶離する。

適当な陰イオン交換クロマトグラフィー媒質には、ジエチルアミノエチル（ＤＥ ＡＥ）またはジエチル（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル（ＱＡＥ）基を 含む種々な不溶性マトリックスがある。ＤＥＡＥ基が好ましい。マトリックスは アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたは蛋白質精製に一 般に用いられる他の型のマトリックスでありうる。ｒｌＬ　−１αとｒｌＬ−１ βの陽イオン交換クロマトグラフィーに特に有用な物質はＤＥＡＥ−セファセル （Ｓｅｐｈａｃｅｌ）　　（ファルマシア）である。

ＤＥＡＥ基を含む媒質を用いる場合には、ｒＩＬ−１種を含む抽出物を弱塩基性 ｐＨで塗布する。例えば、種々な陽イオン交換クロマトグラフィ一工程（ｐＨ約 ８．１）から生ずるプールしたｒＩＬ　−１含有分画を例えばＴｒｉｓ−ＨＣ６ のような適当な緩衝液に溶かして直接塗布することができる。ｒｌＬ−１種は陰 イオン交換媒質に結合し、同し緩衝液での塩勾配の塗布によって高度に純粋な形 で溶離される。ｒｌＬ−１ｃｒがＤＥＡＥ−セファセルから０．１７〜０．２２ ＭＮａＣｊ！において溶離し、ｒＩＬ　−１βは０．０７５〜０．１５５Ｍ　Ｎ ａＣ１において？容離する。このように、Ｏ〜６００ｍＭ　ＮａＣ１とＯ〜４０ ０ｍＭ　ＮａＣ１の範囲の勾配がｒｌＬ−１αと、ｒｌＬ　　１βの精製にそれ ぞれ有用である。

前述の抽出とイオン交換クロマトグラフィー処置の後に、アフィニティクロマト グラフィーを実施する。ＩＬ−１αには、例えばフェニルセファロースＣＬ−４ Ｂ　（ファルマシア）のような、ペンダントフェニルグリシジルエーテル基を含 むアフィニティ媒質を用いることができる。ｒｌＬ　−１αはｐＨ約８．１の適 当な緩衝液中に約０．５〜０．７Ｍ　（好ましくは約０．６Ｍ）硫酸アンモニウ ムを含む溶液に溶かして、このような媒質に塗布し、漸減線形勾配の硫酸アンモ ニウムと、次に塩を含まない緩衝液によって溶離する。ｒｈｌＬ−１αはフェニ ルセファロースＣＬ　−４Ｂから約０．２５〜０．１０Ｍｇ酸アンモニウムにお いて溶離する。

ＩＬ−１βを精製するための最後のアフィニティ工程では、例えばプロジオンレ ッドアガロース（Ｐｒｏｃｉｏｎ　Ｒｅｄ　Ａｇａｒｏｓｅ）〔ベセスダリサー チラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏ ｒｉｅｓ）米国メリーランド州ガイザースブルグ］のようなペンダントトリアジ ニルレッド染料リガンド基を含むアフイニティ媒質を用いることができる。ｒｌ Ｌ−１βを含むプール分画を１０ｍＭＴｒｉｓ　−Ｈ（Ｊ！のような適当な緩衝 液中の、例えば４０ｍＭ未満のような、低イオン強度の染料−リガント媒質に塗 布する。結合ｒｌＬ−１βを含む媒質を次に付加的な塗布緩衝液によって洗浄し 、目的蛋白質を例えばＯ〜ＩＭＮａＣ／のような漸増塩濃度の線形勾配で溶離し た。ｒｌＬ−１βはプロジオンレッドから約０．３６〜０．４６Ｍ　ＮａＣｎに おいて溶離する。生成分画をペンダントスルホプロピル基含有媒質上での最終ク ロマトグラフィ一工程によって濃縮することができる。

コンロン（Ｃｏｎ　Ｉｏｎ　）がジェイ　イムツール、ｌ］：１２８０　（１９ ８３）に述べ、クロンハイム（Ｋｒｏｎｈｅｉｍ）等がジエイ　イクスプ　メｆ ｌｆｉｉ、４９０　（１９８５）に述べているような、胸腺細胞***分析または ＩＬ−１誘導ＩＬ−２産生の分析によって、細胞抽出中と精製中のＩＬ−１活性 を分析することができる。ＳＯＳ　−ＰＡＧＥも用いて、上述文献のクロンハイ ム等が述べているのと実質的に同様に、精製進行をモニターすることができる。

裏隻貫よ マウスの創傷治癒に対するヒトインターロイキン−１局所塗の六 肉芽組織産生と創傷閉塞とに対するＩＬ−１の効果を評価し、可能な塗布形式を 研究するために、下記の実験を設計した。

４０匹の雌スイスＣＢ　（Ｓｗｉｓｓ　ＣＢ）マウス〔千ャールスリハーブジー ディングラブス（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　Ｌａｂｓ） 　、マサチュセッツ州ボストン〕をこの研究に用いた。マウスを実験開始前１週 間と全実験期間（４週間）個別にオリに入れた。これらのマウスには基本食餌を 任意に与え、制御された環境（温度１９〜２１°Ｃ１１２時間明、１２時間暗サ イクル、５０％相対湿度）下に維持した。

２０匹のマウスを用いて、肉芽組織産生に対するＩＬ−１αの効果を評価した。

このアプローチでは、孔質創傷チャンバ（ｐｏｒｏ−ｕｓ　ｗｏｕｎｄ　ｃｈａ ｍｂｅｒ）を創傷部位に移植し、後に細胞の逓昇成長（ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｉｎ ｇｒｏｗｔｈ）を調べた。創傷チャンバはポリビニルアルコールとホルムアルデ ヒドから製造したイバロン（Ｉｖａｌｏｎ”）スポンジから作製した。チャンバ を移植するために、各マウスを軽エーテル（ｌｉｇｈｔ　ｅｔｈｅｒ）下で麻酔 し、３×３ＣＩ１１平方の背側皮膚に消毒薬を綿棒で塗布した。背側頭部皮膚を １ｃｍ切開した。滅菌創傷チャンバを皮下に挿入し、を椎労に整列させ、２結節 縫合によって切開を閉じた。

創傷チャンバの皮下挿入から２４時間後に、これらのマウス２０匹を３処置群に 分割した。Ａ群には１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰ　Ｂ　Ｓ　１１ 衝液中ＩＬ　−１α１５ｎｇ／ｄをｌｌ１１皮下注射した。この作用剤は創傷チ ャンバ中に直接注入した。Ｂ群の創傷チャンバにはＨ，−１ａ−ＰＢＳ−ＢＳＡ 溶液６０ｎｇ／ｍの１ｄを注入した。０群チャンバにはＰＢＳ　−ＢＳＡ緩衝液 中の対照溶液を注入した。

創傷チャンバは１回のみ処置した。

処置の１０日後に、マウスを殺し、創傷チャンバを回収し、次のように組織学的 に分析した。そのカプセルを含む創傷チャンバ４鵬部分をホルマリン中で固定し 、パラフィン中に包埋した。

次に４ミクロン切片を染色し、細胞の逓昇成長と結合組織に関して定性的に検査 した。

１０日間経過創傷チャンバからの切片の検査では、ＩＬ−１α処置チ中ンバと対 照溶液処置チャンバとの間に明白な差異が認められた。作用剤処置チャンバは対 照チャンバよりも有意に多い細胞浸潤を示した。ＩＬ−１αの１５ｎｇ処置チャ ンバと６０ｎｇ処置チャンバとの間にはごく僅かな差が見られたにすぎなかった 。ＩＬ−１α処置チヤンバは対照と比べた場合に、非常に厚いカプセルを有した 。チャンバの内部とチャンバ全体に付着した新しい結合組織量の間にも有意差が 存在した。ＴＬ−１α（いずれかの濃度）で処置したチャンバは対照被検物より も有意に多い結合組織蓄積を示した。

第２実験では、マウスを麻酔し、前述したように手術の準備をした。各実験動物 で６肛バイオプシーパンチによって２つの完全な厚さの皮膚創傷を形成した。動 物を４群に分け、次のように処置した：Ａ群では１創傷をＰＢＳ　−ＢＳＡ緩衝 溶液中の活性剤１５ｎｇで処置し、他の創傷は緩衝液のみから成る対照溶液で処 置した。Ｂ群では１創傷をＰＢｓ　−ＢＳＡ溶液中ＩＬ　　１　ａ６０ｎｇで処 置し、他の創傷は対照溶液のみで処置した。０群では１創傷は親水性ビヒクル〔 アクアホール（Ａｑｕａｐｈｏｒ”）　、ビーラドルフ社（Ｂｉ−ｅｒａｄｏｒ ｆ　Ｉｎｃ、）　：ｌ中にブレンドした活性剤６０ｎｇで処置し、他方の創傷は ビヒクルと対照溶液で処置した。Ｄ群マウスでは１創傷を親水性ビヒクル（アク アホールジのみで処置し、他方の創傷は無処置のままにした。

全ての創傷は処置後、感圧性接着剤〔コーフィルム（Ｃｏ−Ｆｉｌｍ”）　）で 裏打したコポリエステルフィルム包帯〔チーズブラソフーポンズ社（Ｃｈｅｓｅ ｂｒｏｕｇｈ　Ｉｎｃ、）　）で包帯した。創傷は１回のみ処置した。全ての創 傷を１日おきに連続写真術とブラニメトリーによって測定した創傷閉塞度とによ って評価した。全てのデータはベアード比較（ｐａｉｒｅｄ　ｃｏｍｐａｒｉｓ ｏｎ）に対するスチューデントも検定を用いて評価した。

創傷閉塞速度に対するＩＬ−１αの効果は蛋白質が親水性ビヒクル中に存在する か否かによって変化する。親水性ビヒクル中ＩＬ−１α（６０ｎｇ）によって処 置した創傷（０群）がビヒクルのみの対照によって処置した創傷よりも迅速に閉 塞した。親水性ビヒクル中ＩＬ−１αで処置した創傷（０群）と親水性ビヒクル のみで処置した創傷との間の治癒速度の統計的有意差（ｐｏ、０５）は創傷形成 から１２日後と１５日後に得られた。ＰＢＳ　−ＳＢＡビヒクル中１５ｎｇまた は６０ｎｇ（ＡまたはＢ）のＩＬ−１αで処置した創傷は実験の全過程において のみ、親水性ビヒクルで処置した創傷よりも幾らか緩慢に治癒したが、この差は 統計的に存意でなかった。ＰＢＳ　−ＢＳＡ緩衝液のみに加えたＩＬ−１αによ って処置した創傷と無処置対照（Ｄ群）との間に創傷治癒速度の有意差は見られ なかった。

ｐＢｓ−Ｂｓｄｉ衝液中の活性剤または対照溶液で処置した創傷は、親水性軟膏 ベースでの処置によって湿った状態に維持された創傷よりも緩慢に治癒した。Ｉ Ｌ−１αを含むまたは含まない水性塩基ビヒクル（ＰＢＳ−ＢＳＡ）で処置した 創傷は、フィルム包帯を除去した２４時間後に乾燥した。これに比べて、軟膏ベ ースで処置した創傷はさらに長時間湿った状態であった。水性ビヒクルで処置し た創傷には乾燥したかさぶたが発生した。この厚い焼癲は治癒期間の殆んど全て を通して創傷上に残留した。軟膏処置創傷（ＩＬ−１αを含むまたは含まない） は薄くて柔い焼癲を有し、されは創傷形成後９日目〜１２日目に剥離した。

全体的に、親水性軟膏ベース中のＩＬ−１αで処置した創傷は他の処置群よりも 約６日間早く、上皮を再形成した。

夫施皿Ｉ ブタにおける中間層創傷の治癒に対する局所塗布したヒトイン　−ロイキンーｌ の六 このインビボ単盲検はＩＬ−１αまたはＩＬ−１βを含む局所塗布親水性ゲルの 中間層創傷の治癒に対する効果を評価するように設計した。

容積濃度（ｂｕｌｋ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）のｒｈＩＬ　　ＩＱ’とｒ ｈｌＬ　　１βをカルボキシメチルセルースとプロピレングリコールを含む局所 ゲルに調合した。ＩＬ−１／Ｍ衝剤溶液を層流フード下でエッペンドルフ（Ｅｐ ｐｅｎｄｏｒｆ　）ピペッタ−を用いてゲルに無菌添加した。次に、このゲルを テフロンスパチュラで約３秒間撹拌した。無菌５ｄプラスチツク注射器からプラ ンジャーを抜き出し、ゲルをこれらの注射器中へ頂部から分配した。プランジャ ーを次に交換した。全ての過程は無菌条件、層流フード下で実施した。ＩＬ−１ αとＩＬ−１βを適当に希釈し、アリコートをゲルに加えて、次の濃度゛（蛋白 質重量／ゲル重量）を得た：ＩＬ　−１α４０　ｎｇ／ｇ（１） ２００　ｎｇ／ｇ（２） ２　ｕｇ／ｇ（３） ＩＬ−１β　　　　４０　ｎｇ／ｇ（４）２００　ｎｇ／ｇ（５） ２　ｎｇ／ｇ（６） ６匹の若いヨークシャーブタ（Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ　ｐｉｇ）　　（重量それぞ れ約１０ｋｇ）に基本食餌を任意に与え、制御条件下（１９〜２０°Ｃ１１２時 間明、１２時間暗のサイクル、６５％相対濃度）の施設に個別に収容した。各ブ タに標準動物クリッパーを止めた。動物の両側綿の皮膚を無菌の生理的食塩水で 洗浄することによって、創傷形成の準備をした。動物をベントパルビタールナト リウム〔ネンブタールナトリウム（Ｎｅｍｂｕｔａｌ”　ｓｏｄｉｕｍ）　１２ ｍｇ／ｋｇ、腹腔内〕を用いて麻酔し、アルバレッ（ｎｌｖａｒｅｚ）等がジエ イプースト　アン゛レコンス　ル　サーブ、　　（Ｊ、Ｐｌａｓｔ、＆　Ｒｅｃ ｏｎ−■ム錘■、）６９２８４Ｎ　（１９８２）に述べているように、エレクト ロケラドームを用いて、７　Ｘ　１０ｍｍ　Ｘｏ、３胴深さの約１２０創傷をを 椎労と胸郭領域に形成した。創傷は互いから少なくとも正常皮Ｉｆ１５ｍｍの間 隔をおいて離れていた。

各動物の創傷を８群に分け、次のように処置した：対照（処置せず）、ビヒクル ゲル（プラセボ）、組換えヒトＩＬ−１α４０ｎｇ／ｇ、　２００ｎｇ　／ｇ、 ２ｔｔｇ／ｇと組換ヒトＩＬ−１β４０ｎｇ／ｇ、２００ｎｇ／ｇ、２βｇ／ｇ 。各治療群は正常皮膚少なくとも２Ｃ１１１の間隔をおいて離れていた。創傷形 成の直後に、創傷を適当な作用剤０．２雄で処置して、作用剤が創傷全体を確実 に覆うようにした。

種々な解剖学的領域に形成した創傷が難治性である可能性を避けるために、各処 置のために選択した領域は動物毎に異なった。

６日間の創傷形成後の各々の日（０日目）に、各処置群の幾つかの創傷と周囲正 常皮膚をアルハレツ等がヱニ±−尤火ヱ上二五、　　（Ａｒｃｈ、Ｄｅｒｍａｔ ｏｌ）　１１９．２２２頁（１９８３）に述べているような、２閣ブレードを備 えたエレクトロケラドームを用いて０．５＝深さで摘出した。創傷部位を含む摘 出皮膚を０．２５％トリプシン中で１２〜２４時間４°Ｃにおいてインキュベー トして、真皮を表皮から分離した。表皮移動（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｍｉｇｒａ ｔｉｏｎ）をアル２、レッ等が’；　ｘ　４　４７＜７．５　−”）Ｌｔ７　） −）ｂ、　　（Ｊ、Ｉｎｖｅｓｔ。

Ｄｅｒｍａｔｏｌ、）８１．１４４頁（１９８３）に述べているように、評価し た。

簡単に説明すると、この方法は分離した表皮の欠陥の顕微鏡検査である。欠陥は 分離表皮シートの孔としてまたは創傷を含む領域の表皮連続性の欠如として可視 化された。表皮に欠陥がないならば創傷は上皮再形成されたと見なされ、１つ以 上の欠陥が存在する場合には、上皮再形成されていないと見なされる。

データの全ては、アルハレツ等がアーチ　−゛ルマール１１９．２２２頁（１９ ８３）に述べているように、スチューデントを検定を用いて統計的に分析した。

アルバレツ等がジェイ　インベス　。

云火ヱ上二上社、１４４頁（１９８３）に述べているようなザールの方法（ｔｈ ｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｚａｒ）に従って、プロビット分析を実施した。

データはＩＬ−１α２尾／ゲルｇが中間層創傷の治癒を無処置創傷に比べて４４ ％、ビヒクル処置創傷に比べて３０％高めることを示唆した。さらに、ＩＬ−１ β４０ｎｇ／ゲルｇと２００ｎｇ／ゲルｇの両方は創傷の治癒速度を有意に促進 した（例えば、４０βｇ／ｇにおいて無処置に比べて３３％、ビヒクル処置に比 べて２３％）。ＩＬ−１αも試験条件下で同様な、但し量的には劣る、創傷治癒 促進を示した。局所作用剤で処置した全ての創傷は、空気中に開放した状態の無 処置創傷よりも迅速に治癒した。得られたデータを下記第１表に示し、全ての値 は各時点で検査した標本総数あたりの治療標本数として表現する。括弧中の数字 は治癒率を中間層創傷の治癒に対するｒｈｌＬ−１αとｒｈｒＬ　　１βを含む 親゛ルの六 ＩＬ−１α　　　２３　　　　４　　　　５　　　　６４０βｇ／ｇ　　　Ｏ／ １０（０）　１２／３Ｈ３９）　１６／２６（８１）　１９／２１（９０）　　 ９／９（１００）２００βｇ／ｇ　　Ｏ／６　（０）　Ｏ／２６　（０）　　１ １／２３（４３）　２０／２４（８３）　１１／ＩＨ１００）２　ｕｇ／ｇ　　 　Ｏ／７　（０）　Ｏ／３２　（０）　　１２／２８（４３）　１５／１Ｂ（８ ３）　１９／１９（１００）ＩＬ−１β ４０βｇ／ｇ　　　Ｏ／４　（０）　１２／２５（４８）　１９／２５（７６） 　１７／１９（８９）　１３／１３（１００）２００βｇ／ｇ　　Ｏ／７　（０ ）　８／２０　（３０）　１．９／３０（６３）　２０／２０（１００）　８／ ６　（１００）２　ｕｇ／ｇ　　　Ｏ／８　（０）　１Ｂ／２６（８８）　２５ ／２９（８６）　１６／１８（１００）　８／８　（１００）ビヒクルのみ　　 　　０／６　　（０）　　Ｏ／２２　　（０）　　　１０／２７（４９）　　１ ７／２２（７７）　　　９／９　　（１０O） 無処置　　０／３　（０）　Ｏ／１５　（０）　　３／３０　（１０）　７／１ ５　（４７）　１４／１９（７４）処置群と対照群の間の相対治癒速度の比較を 第２表に示す。

第２表では、ｒ　ＨＴ５０　Ｊは創傷５０％治癒に要する日数を表す。

」じし表 無処置創傷と組換えヒ１−ＩＬ−１αとＩＬ−１βによって処置した１　との？ ム・、庁の　六 ■且准思速度 ４０βｇ／ｇ　　　　３．５　　　　　＋３０　　　　　　　　＋　１３２００ βｇ／ｇ　　　　４．１　　　　　＋　１８　　　　　　　　　３２ｕｇ／ｇ　 　　　　４．２　　　　　＋１６　　　　　　　−５ＩＬ−１β ４０βｇ／ｇ　　　　　３．１　　　　　＋３８　　　　　　　　　＋　２３２ ００βｇ／ｇ　　　　３．５　　　　　＋　３０　　　　　　　　＋　１３２　 ｕｇ／ｇ　　　　２．８　　　　　＋４４　　　　　　　　＋３０ビヒクルのみ ４．０　　　　　＋２０ 無処置　　　５．０　　　　　　　　　　　　　−２５尖施拠主 ラットにおける低用量での創傷治癒に対するヒトＩＬ−１局所°　　の六 次の実験は、創傷閉塞に対するＩＬ−１の効果を評価し、さらに詳しくはＩＬ− １の種々な用量における治癒反応を調べるように設計した単盲検であった。

３５匹の特定病原菌を含まない、正常な雌ルイスラット〔チャールスリバーラレ イフ（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｒａｌｅｉｇｈ）　、ノースカロライナ州 うレイフ〕をこの試験に用いた。実験開始前１週間と全実験期間（１週間）中、 ラットを個別にオリに入れた。これらの動物には基本食餌を任意に与え、制御環 境下（温度１９〜２１゛Ｃ〜１２時間明、１２時間暗サイクル、３０％相対湿度 ）に維持した。

全てのラットをケタミン／ロムプン（ｋｅｔａｍｉｎｅ／ｒｏｍｐｕｎ）の腹腔 内注入によって麻酔して、手術の準備した。手術領域の毛をそり、ヨウ素面ケン で洗浄し、無菌生理的食塩水によって完全にすすぎ洗いした。無菌の施術者、手 袋器具を用いて無菌の場を形成した。

４全層切開創（長さ１．５ＣＩ＋１、幅０．３ｃｍ、筋膜まで約０．２ｃｍ深さ ）を各実験動物の背側皮膚に＃１５手術ブレードで形成して、約０．５ｃｒｌｒ の表面積を有するだ円形状創傷を得た。創傷は全実験を通して縫合しなかった。

創傷表面積のＩＬ−１用量反応性を数量化するために、各創傷の表面積をだ円形 創傷の最大長さと最大幅を乗するときによって算出した。創傷は互いに少なくと も正常皮膚２Ω分離していた。

ＩＬ−１の局所塗布のために、グリセロール２５ｇとプロピレングリコール２５ ｇとにプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート０．１ｇとメチル−ｐ−ヒドロキ シベンゾエート１ｇを混合した。次にリン酸ナトリウム緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ ６，０）　９５０−を混合物に加えた。生成溶液を滑らかになるまで撹拌し、０ ．２２ミクロンフィルターを通して濾過した。加圧滅菌叶Ｃ３０ｇをか過緩衝液 に加えた。ＣＭＣビヒクルゲルの最終収率は約１０００ｇであった。精製した無 菌の組換えヒトＩＬ−１αまたはＩＬ−１βをＣＭＣビビクルゲルのアリコート にゲル５０ダノにつきＩＬ−１αまたはＩＬ−１β０．１βｇ、　１．Ｏｎｇ、 Ｌｏｎｇ、５０βｇまたは１１００ｎの最終濃度になるまで加え創傷形成の直後 に、創傷を次のように処置した。対照創傷は処置しなかった。プラセボ対照創傷 はＣＭＣビヒクルゲル５０ｔｒｌのみによって直接処置した。試験創傷は各創傷 部位においてＣＭＣビヒクルゲル５０ｔｒｌ中のＩＬ−１αまたはＩＬ−１β０ ．１βｇ、　１．０βｇ。

Ｌｏｎｇ、　５０βｇまたは１１００ｎによって直接処置した。

動物を各５匹から成る７群に分割して、次のように処置した：Ａ群では２創傷を ビヒクルのみで、２創傷はビヒクル中ＩＬ−１α０．１ｎｇによって処置した。

Ｂ群では２創傷をビヒクル中ＩＬ−１α１．Ｏｎｇによって、２創傷をビヒクル 中ＩＬ−１α１０ｎｇによって処置した。Ｃ群では２創傷をビヒクル中ＩＬ−１ α５０ｎｇによって、２創傷をビヒクル中ＩＬ−１α１１００ｎによって処置し た。

Ｄ群では２創傷を処置せず、他の２創傷をビヒクルのみで処置した。Ｅ、Ｆ、Ｇ 群ではそれぞれＡ、Ｂ、Ｃ群の処置に用いたＩＬ−１αと同じ濃度のＴＬ−１β で創傷を処置した。無菌の場を維持するために、創傷をテルファ（Ｔｅｌｐｈａ ）　”充てんガーゼパッドとオプシン）　（Ｏｐ　５ｉｔｅ）ＴＩ″接着性カバ ーから成る閉塞性包帯で覆った。

ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βによって治療した創傷は全て、閉塞性包帯を有した 。無処置創傷とプラセボ処置創傷とを有するＤ群のラットのみは、閉塞性包帯の 不存在だ創傷治癒に影響するかどうかを観察するために、閉塞性包帯で覆わなか った。

処置の５日間後に動物を殺した。次に、包帯を創傷から除去して、創傷を目視検 査して、最初の創傷と比べた治癒率によって測定した、創傷治癒に対する処置の 効果を定性的に評価した。

治癒率は目視検査と各創傷を治癒０％、２５％、５０％、７５％または１００％ と等級化することによって算出した、治癒０％は治癒の徴候のない開放側を示し 、治癒１００％はかさぶた形成がなく上皮再形成が観察される完全に治癒した創 傷を示す。創傷治癒率算出に用いた他の基準には創傷の色、創傷表面積、膨潤ま たは感染症の徴候、動物の外部から観察される肉芽組織の存在がある。創傷表面 積は最初の創傷を測定した（上述）と同じやり方で算出し、このデータを用いて 、非治癒創傷面積を算出した。

このように、治癒率の目視算出と非治癒創傷面積とに従って、各創傷等級化した 。

生成データはアルバレツ等がアーチ　−ルマ　−ルｌ［、２２２（１９８３）に 述べているように、スチューデントを検定を用いて統計的に分析した。各処置群 と対照群は１０創傷を含んだ。従って、データは平均値±ＳＥＭ　（ｎ　＝１０ ）として表す。

５日間後に創傷表面積を測定することによってデータは第１Ａ図と第２Ａ図にグ ラフとして表現する。第１Ａ図は、ＴＬ−１αの塗布が創傷表面積の減少によっ て評価して、Ｌｏｎｇ用量で有意な創傷治癒（無処置創傷とブラセポ処置創傷に 比べて）を生ずることを示す。第２Ａ図はＩＬ−１βの塗布が創傷表面積の減少 によって評価して、ＩＬ−１β５０Ｂｇ用量で有意な創傷治癒（無処置創傷とブ ラセポ処置創傷に比べて）を生ずることを示す。データは、約１．０Ｂｇ程度の 低いＩＬ−１α量と約５０ｎｇ程度の低いＩＬ−１β量が創傷治癒促進に有効で あることを示す。

５日間後の治癒率観察によって得られたデータを第１Ｂ図と第２Ｂ図にグラフと して示す。第１Ｂ図と第２Ｂ図はＩＬ−１αまたはＩＬ−１βの５０Ｂｇまたは １１００ｎによって治療した創傷がプラセボ処置創傷に比べて有意に迅速に治癒 することを示唆する。

本発明の上記実施態様は説明のみを意味し、限定を意味しない。実際にここに開 示した組成物の明白な変更物または等個物には、同様な生物学的活性を有するＩ Ｌ−１蛋白質の変異体または同族体を含む種々な創傷治癒組成物または、例えば ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ウサギまたはネコのＩＬ−１蛋白質のような、特定 種のＴＬ−１蛋白質の適当量を含む獣医学用の創傷治癒組成物があると考えられ る。さらに、用−量は創傷の深さと種類に応じて、また被治療個体が正常である か障害を有するかに応じて変化する。このような変更は全て、下記の請求の範囲 に含まれると考えられる。

ミ９　奢皆　訣 謁　函・ト　凌 手続補正書坊式） 平成　３年　４月〆０日 特許庁長官　　　植　松　　　敏　　殿１、事件の表示　　　　　　　　　　　 　　　　　　ウ配ＰＣＴ／ＵＳ８８１０４４８８ ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 住所 名　称　　イミュネックス・コーポレーション４、代理人 住　所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正命令の日付　　平成　３年　３月１２日　溌送日）６、補正の対象 （１）タイプ印書により浄書した明細書及び請求の範囲の翻訳文国際調査報告

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．創傷治癒を促進するための有効量の哺乳動物インターロイキン−１（ＩＬ− １）と、ＩＬ−１を創傷部位に使用するための生理的に許容される親水性ビヒク ルとから成る、ヒトを含めた哺乳動物における創傷治癒を促進するための局所組 成物。
2. ２．哺乳動物ＩＬ−１がＩＬ−１β蛋白質である、請求項１記載の組成物。
3. ３．組換えヒＨＬ−１β１０ｐｇ／ｇ〜１００μｇ／ｇを含む、請求項２記載の 組成物。
4. ４．組換えヒトＩＬ−１β５０ｎｇ／ｇ〜５００ｎｇ／ｇを含む、請求項３記載 の組成物。
5. ５．哺乳動物ＩＬ−１がＩＬ−１α蛋白質である、請求項４記載の組成物。
6. ６．組換えヒトＩＬ−１α１０ｐｇ／ｇ〜１００μｇ／ｇを含む、請求項５記載 の組成物。
7. ７．組換えヒトＩＬ−１α５０ｎｇ／ｇ〜５００ｎｇ／ｇを含む、請求項６記載 の組成物。
8. ８．哺乳動物における創傷治癒を促進するために、創傷部位に使用する薬物の製 造へのＩＬ−１の使用。
9. ９．創傷表面積１ｃｍ２につきＩＬ−１約０．２ｎｇ〜約１μｇの５日間累積量 を与えるように創傷部位に使用する、哺乳動物における創傷治癒を促進するため の薬物の製造へのＩＬ−１の使用。
10. １０．創傷部位に使用する薬物が創傷表面積１ｃｍ２につきＩＬ−１β約２ｎｇ 〜約５００ｎｇの５日間累積量を与える、請求項９記載のＩＬ−１の使用。
11. １１．創傷部位に使用する薬物が創傷表面積１ｃｍ２につきＩＬ−１β約２０ｎ ｇ〜約４００ｎｇの５日間累積量を与える、請求項１０記載のＩＬ−１の使用。
12. １２．創傷部位に使用する薬物が創傷表面積１ｃｍ２につきＩＬ−１β約５０ｎ ｇ〜約３００ｎｇの５日間累積量を与える、請求項１１記載のＩＬ−１の使用。
13. １３．創傷部位に使用する薬物が創傷表面積１ｃｍ２につきＩＬ−１α約２ｎｇ 〜約５００ｎｇの５日間累積量を与える、請求項９記載のＩＬ−１の使用。
14. １４．創傷部位に使用する薬物が創傷表面積１ｃｍ２につきＩＬ−１α約２０ｎ ｇ〜約４００ｎｇの５日間累積量を与える、請求項１３記載のＩＬ−１の使用。
15. １５．創傷部位に使用する薬物が創傷表面積１ｃｍ２につきＩＬ−１α約５０ｎ ｇ〜約３００ｎｇの５日間累積量を与える、請求項１４記載のＩＬ−１の使用。
16. １６．創傷部位に使用する薬物が創傷表面積１ｃｍ２につきＩＬ−１α約１ｎｇ 〜約２５０ｎｇとＩＬ−１β約１ｎｇ〜約２５０ｎｇの５日間累積量を与える、 請求項９記載のＩＬ−１の使用。
17. １７．創傷部位に使用する薬物が創傷表面積１ｃｍ２につきＩＬ−１β約１０ｎ ｇ〜約２００ｎｇとＩＬ−１β約１０ｎｇ〜約１５０ｎｇの５日間累積量を与え る、請求項１６記載のＩＬ−１の使用。
18. １８．創傷部位に使用する薬物が創傷表面積１ｃｍ２につきＩＬ−１α約２５ｎ ｇ〜約１５０ｎｇと、ＩＬ−１β約２５ｎｇ〜約１００ｎｇの５日間累積量を与 える、請求項１７記載のＩＬ−１の使用。