DE3881405T2

DE3881405T2 - Antientzuendungsmittel.

Info

Publication number: DE3881405T2
Application number: DE8989900524T
Authority: DE
Inventors: Lucio Miele; Anil Mukherjee
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1987-11-19
Filing date: 1988-11-21
Publication date: 1993-09-09
Anticipated expiration: 2008-11-22
Also published as: ATE89738T1; EP0397679B1; JPH03502197A; US5266562A; AU2812789A; EP0397679A4; DE3881405D1; AU623620B2; EP0397679A1; WO1989005147A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Anwendungsgebiet:

Die vorliegende Erfindung betrifft entzündungshemmende Verbindungen. Im speziellen betrifft die vorliegende Erfindung eine neue Familie synthetischer Peptide mit hoher entzündungshemmender Wirksamkeit.

Stand der Technik:

Bei einer beträchtlichen Zahl von Erkrankungen des Menschen sind entzündliche Reaktionen beteiligt. Einige Steroidhormone sind bekannte Modulatoren der Entzündung. Es wird diskutiert, daß die Steroide ihre Wirkung durch Verminderung des Gehalts an Gewebsprostanoiden ausüben, die bekannte Mediatoren entzündlicher Reaktionen sind (als Übersicht, siehe Ferreira, Handbook of Inflammatory Diseases 5:107-116, 1985). Eines der Schlüsselenzyme, das den Gehalt an Arachidonsäure, dem Substrat für die Prostaglandinsythese, kontrolliert, ist Phospholipase A&sub2;. Ein möglicher Mechanismus zur Vermeidung einer Entzündung ist die Hemmung dieses Enzyms, wobei der Gehalt an Gewebsprostanoiden gesenkt wird (Flower et al, Nature 278:456-459, 1979; Russo-Marie et al, Biochem. Biophys. Acta. 712:177-185, 1982; and Hirata, Advances in Prostaglandin, Thromoxane and Leukotriene Research 2:73-78, 1983)
Während des vergangenen Jahrzehnts wurden verschiedene Corticosteroid-abhängige Proteine mit niedrigem Molekulargewicht, die eine Phospholipase-A&sub2;-(PLA&sub2;)- Hemmwirkung zeigen, beschrieben (Hirata et al, Biochem. Biophys. Res. 109:223-230, 1982). Lipocortine (DiRosa et al, Prostaglandins 28:441-443, 1984), eine Familie dieser durch Corticosteroide induzierten Hemmer, werden als Mediatoren der entzündlichen Wirkung diskutiert. Blastokinin, auch als Uteroglobin bekannt, ist ein genetisch verschiedenes Protein und ein hochwirksamer PLA&sub2;-Hemmer (Levin et al, Life Sci. 38:1813-1819, 1986). Vordem waren jedoch kleine Peptide mit 15 oder weniger Aminosäureresten, bei denen VLDS eine bevorzugte (aber nicht unbedingt wesentliche) Aminosäuresequenz ist, mit hoher PLA&sub2;-hemmenden und entzündungshemmenden Wirksamkeit, wie sie die Antiflammine der vorliegenden Erfindung aufweisen, nicht bekannt oder beschrieben.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Daher ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung einer Peptid-Familie mit hoher PLA&sub2;-hemmenden und entzündungshemmenden Wirksamkeit. Diese Peptide werden hierin als "Antiflammin" bezeichnet.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche als Wirkstoff eine entzündungshemmend wirksame Menge an Antiflammin umfaßt; und einen pharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxischen, sterilen Träger.
Weitere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung offensichtlich werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Diese und andere Aufgaben, Merkmale und viele der damit verbundenen Vorteile der Erfindung werden mit dem Lesen der nachstehenden ausführlichen Beschreibung in Zusammenhang mit den begleitenden Zeichnungen verständlicher werden, worin:
in Abb. 1 die Wirkung von Antiflammin-1 auf Carrageenininduzierte Entzündung und Oedema bei Pfotenballen von Ratten gezeigt ist;
in Abb. 2 Mikrobilder wiedergegeben sind, die die Wirkung des Antiflammin-1 auf Carrageenin-induzierte Entzündung bei Pfotenballen von Ratten zeigen.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Oben genannte, wie auch verschiedene andere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die Bereitstellung synthetischer Polypeptide mit Aminosäuresequenzen (Einzelbuchstaben-Code), gewählt aus MQMNKVLDS, HDMNKVLDL, MQMKKVLDS, DTMDAGMQMKKVLDS, GMASKAGAIAG, GIGKPLHSAG, GIGKPLHSAK, GWASKIGQTLG, GIGKFLHSAK und GIGKFLHSAG, erzielt.
Wenn nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten fachlichen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, die ihnen allgemein von Fachleuten auf dem Fachgebiet, zu dem diese Erfindung zählt, zugemessen wird. Zwar können jegliche Methoden und Materialien, die ähnlich oder entsprechend den hierin beschriebenen sind, bei der Durchführung oder Erprobung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, doch sollen die bevorzugten Methoden und Materialien im nachfolgenden beschrieben werden. Der Begriff "entzündungshemmende Menge", wie hierin verwendet, bezeichnet die Menge, die eine Entzündung in einem Gewebe oder Körper reduziert oder lindert.

MATERIALIEN UND METHODEN

Tiere:

Für alle Experimente wurden jungfräuliche New-Zealand-Kaninchen mit einem Gewicht von 3-3,5 kg verwendet. Diese Tiere wurden in getrennten Käfigen untergebracht und nach Belieben mit Nahrung und Wasser versorgt. Ein täglicher Zeitplan von 12 Stunden Helligkeit und 12 Stunden Dunkelheit wurde während der gesamten experimentellen Phase beibehalten.
Sprague-Dawley-Ratten beiden Geschlechts mit einem Gewicht von etwa 175 bis 200 Gramm wurden zur Erprobung der entzündungshemmenden Wirkungen von Uteroglobin und der Antiflammine bei Carrageenin-induzierter Entzündung in den Pfotenballen dieser Tiere verwendet. Die Tiere wurden zu Zehnt pro Käfig untergebracht und nach Belieben mit Nahrung und Wasser versorgt. Ein täglicher Zeitplan von 12 Stunden Helligkeit und 12 Stunden Dunkelheit wurde während der gesamten experimentellen Phase beibehalten.

Synthese der Antiflammine:

Die Aminosäuresequenz der Antiflammine der vorliegenden Erfindung erlaubte eine entsprechende Synthese dieser Oligopeptide mittels eines handelsüblichen Peptid-Synthetisierers. Die Peptide wurden üblicherweise mittels Festphasen-Verfahren auf einem Biosearch Sam II Synthetisierer unter manueller Zugabe der Aminosäurederivate synthetisiert. Die Synthese wurde mit Boc O-Bzl Ser Phenylacetamidomethylharz (Omni Biochem) begonnen, an das die Boc-Derivate, einschließlich Beta-Bzl Asp (U.S. Biochemical Corp.) und 2-Cl-2 Lys (Bachem) als Aktivester, gebildet durch Reaktion von Dicyclohexylcarbodiimid mit Hydoxybenzotriazol, gekoppelt wurden. Das Peptid wurde durch Behandlung mit Fluorwasserstoff in Gegenwart von Anisol und Ethylmethylsulfid über 45 Minuten bei 4ºC vom Harz abgespalten. Anschließend wurde das Peptid mittels semi-präparativer Chromatographie gereinigt. Dazu wurden Probenlasten von etwa 50 mg wurden auf einer uBondapak C&sub1;&sub8; 21 x 150 mm-Säule (Waters/Millipore ) bei einem Flug von etwa 6 ml/min in 0,1% Trifluoressigsäure mit einem Acetonitril- Gradienten von 0% bis 15% in 20 Minuten, weitergeführt bei 15% bis zur Gesamtelution des Materials, chromatographiert. Das resultierende Peptid war nach den Ergebnissen der analytischen HPLC und der Aminosäure-Analyse homogen (Stewart et al, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co. Rockford I11, 1984).

Induktion der Entzündung:

Die dorsale Haut von Kaninchen wurde abrasiert und es wurden Flächen von 3,23 cm² mit einem Filzmarkierer leicht markiert. Die Tinte dieses Stiftes wurde vor Beginn dieser Experimente getestet und als nicht-entzündungserregend befunden. Die markierten Flächen wurden zur Identifizierung der Stellen verwendet, an denen Phorbol, Carrageenin oder andere Testsubstanzen injiziert wurden. Unter Verwendung einer 25er-Nadel und einer Tuberkulinspritze (1 ml) wurde Phorbolmyristatacetat-Lösung (10mM) in alle Flächen injiziert, ausgenommen von zwei Flächen, in die überhaupt keine Injektionen verabreicht wurden und von zwei anderen Flächen, in die nur das Lösungsmittel von Phorbolmyristat, Dimethylsulfoxid (DMSO), injiziert wurde. Auf eine Seite der Wirbelsäule wurden verschiedene Testsubstanzen injiziert, während die gegenüberliegende Seite zur Kontrolle diente. Mit diesem System konnte leicht ein Vergleich von Phorbolinduzierter Entzündung mit den Wirkungen verschiedener Testsubstanzen angestellt werden. Diese Flächen wurden täglich beobachtet und der Durchmesser des Erythems und der Induration jeder Läsion von der gleichen Beobachtungsperson gemessen. Einige der Tiere wurden 72 Stunden nach der Injektion geopfert und die markierten Flächen aus der Haut herausgeschnitten und in 2,5% Glutaraldehyd in Kakodylat- Puffer (pH-Wert 7,4) fixiert. Diese Gewebe wurden für die histopathologische Analyse verwendet.
Eine vergleichbare Gruppe von Tieren wurde 48 Stunden nach Durchführung der Injektionen geopfert und die Hautläsionen herausgeschnitten und in kalter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH-Wert 7,4) homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 2500 X g über 10 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Die Überstände wurden bei -70ºC bis zur Untersuchung auf Prostaglandine eingefroren. Für die Prostanoid-Bestimmungen wurde ein Radioimmunotest (DeMars, Laboratory Medicine pp. 1-23, 1974) verwendet. Eine kleine Teilmenge (500 ul) wurde von jeder Probe beiseitegestellt und die Gesamtproteine gemäß dem Verfahren von Lowry et al (J. Biol. Chem. 193:265-269, 1951) bestimmt.
Verschiedene Peptide wurden in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung in den gewünschten Konzentrationen aufgelöst. Für alle Pfotenballen-Injektionen wurde 1% Carrageenin (0,1 ml) verwendet. Es wurden zwei Experiment-Reihen durchgeführt: (i) den Tieren wurde Carrageenin in beide Hinterpfotenballen injiziert; 2 bis 3 Minuten später wurde das gewünschte Peptid in eine Pfote injiziert, während die andere eine Injektion mit derselben Menge an PBS erhielt und als nicht-behandelte Kontrolle diente; (ii) das Peptid wurde intravenös durch die dorsale Schwanzvene injiziert, und zwar 2 bis 3 Minuten vor der Injektion des Carrageenin in eine der Pfoten, während die andere zur Kontrolle PBS erhielt. Die Tiere wurden 4 Stunden später geopfert und die Pfote im Winkel des Knöchels bei der Knochenprotuberanz herausgeschnitten. Das Gewicht der einzelnen Pfoten wurde gemessen und aufgezeichnet. Diese Untersuchung wurde durch Heranziehen uninjizierter Tiere standardisiert. Das Gewicht der Hinterpfoten, wenn wie beschrieben herausgeschnitten, erwies sich als bemerkenswert ähnlich. Nach der Gewichtsmessung wurden die Pfoten in 2,5% Glutaraldehyd in Kakodylat-Puffer (pH-Wert 7,4) fixiert und für die histopathologische Analyse weiterverwendet.
In Tabelle 1 sind die Aminosäuresequenzen verschiedener synthetischer Antiflammine gezeigt, in Tabelle 2 die relative PLA&sub2;-Hemmwirkung repräsentativer Antiflammine. Es sollte zur Kenntnis genommen werden, daß die Familie der Antiflammine der vorliegenden Erfindung eine hohe PLA&sub2;-Hemmwirksamkeit besitzen. Es wird weiterhin festgestellt, daß dann, wenn eine (NH&sub2;)-Gruppe dem Carboxyterminus, zum Beispiel dem Antiflammin 3, angefügt wird, dies zu einem totalen Verlust der PLA&sub2;-Hemmwirksamkeit bei einer Konzentration von 10&supmin;³M führt, wie die Daten in Tabelle 2 zeigen. Ebenso führten verschiedene Deletierungen von Antiflamminen 1 oder Zugaben zu basischem Tetrapeptid (VLDS) zur völligen Aufhebung der PLA&sub2;-Hemmwirksamkeit (Tabelle 2). Diese Befunde weisen darauf hin, daß mindestens neun Aminosäuren erforderlich sind, damit die Antiflammine Wirksamkeit zeigen. TABELLE 1 AMINOSÄURESEQUENZ DER ANTIFLAMMINE Peptid-Bezeichnung Aminosäuresequenz Antiflammin
In Abbildung 1 ist die Wirkung der Antiflammine (veranschaulicht durch Antiflammin-1) auf Carrageenininduzierte Entzündung und Oedema bei Pfotenballen von Ratten gezeigt. Beachtenswert ist das Nicht-Vorhandensein von Oedema und Entzündung bei beiden Pfoten bei 0,2 ml der intravenös injizierten 10 uM-Lösung von Antiflammin-1.
In Abbildung 2 ist der histologische Nachweis der Wirkung von Antiflammin in Kombination oder nicht in Kombination mit anderen Mitteln auf Carrageenin-induzierte Entzündung bei Pfotenballen von Ratten vorgestellt. Bemerkenswert ist die mit ausschließlich Antiflammin in einer Konzentration von 10 uM erzielte überlegene entzündungshemmende Wirkung im Vergleich zu derselben Konzentration von Dexamethason. Die Ergebnisse weisen auch auf eine entzündungshemmende Wirksamkeit einer Kombination von Antiflammin und Dexamethason hin.
Ähnlich entzündungshemmende Wirkungen wurden bei einer Kombination von Antiflamminen mit Ibuprofen beobachtet. Verglichen zur Kombination von Dexamethason mit Antiflamminen (Abbildung 2) war diese Kombination allerdings weniger wirksam. Die entzündungshemmenden Wirkungen der Antiflammine waren aufgehoben, wenn diese Substanzen in Kombination mit äquimolaren Mengen an Arachidonat (Abbildung 2) verwendet wurden, was abermals den Schluß zuläßt, daß die Antiflammine ihre Wirkungen überwiegend durch Hemmung der Phospholipase A&sub2;-Enzymwirkung ausüben und nicht durch Hemmung der Cyclo- oder Lipo-Oxygenase-Enzyme, wie das bei der Wirkung der nicht-steroidalen Entzündungshemmer der Fall ist.
In Tabelle 2 ist der Nachweis darüber wiedergegeben, daß andere, ähnlich erscheinende Peptide keine PLA&sub2;- Hemmwirksamkeit besitzen. Es ist wichtig, zur Kenntnis zu nehmen, daß die Antiflammine der vorliegenden Erfindung eine mindestens eineinhalb Mal so hohe PLA&sub2;-Hemmwirksamkeit besitzen, verglichen zu bekannten Polypeptiden, wie etwa PGL und Magainine (Daten nicht aufgeführt). TABELLE 2 PROZENT PLA&sub2;-HEMMWIRKSAMKEIT REPRÄSENTATIVER ANTIFLAMMINE* Peptid-Bezeichnung Molarität %PLA&sub2;-Hemmung Antiflammin
* Andere Peptide, wie zum Beispiel KVLD, MKKVLD, MNKVLD, MQMKKVLDS (NH&sub2;) und GICPRFAHVI, zeigten, wenn sie bei einer Konzentration von 10&supmin;³M unter denselben Bedingungen getestet wurden, keine PLA&sub2;-Hemmwirksamkeit.
Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, das Antiflammine hochwirksame Entzündungshemmer und in nM-Mengen außerdem auch hochwirksame PLA&sub2;-Hemmer sind.
Natürlich läßt sich eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als Wirkstoff eine entzündungshemmende Menge an Antiflammin, alleine oder in Kombination mit anderen Entzündungshemmern, wie etwa Dexamethason, in einem pharmazeutisch annehmbaren, nicht-toxischen, sterilen Träger gemäß der vorliegenden Erfindung leicht herstellen. Die Kombination kann zur topischen oder systemischen Anwendung bestimmt sein und in jeglicher geeigneten Form vorliegen, wie etwa als injizierbare Flüssigkeit, Salbe, Paste, Tablette oder ähnliches, die entsprechend den Standardmethoden, wie sie den Fachleuten in diesem Fachbereich allgemein bekannt sind, mit oder ohne Füllstoffe oder Träger hergestellt werden.
Die Erfindung kann bei einem Verfahren zur Behandlung von Entzündung angewendet werden, umfassend das Verabreichen an einen Wirt oder das In-Berührung-bringen mit einem von Entzündung betroffenen Gewebe, mit einer entzündungshemmend wirksamen Menge an Antiflammin, zur Verminderung der Entzündung. Die Antiflammine können natürlich auch mit anderen kompatiblen Zusatzstoffen und ähnlichem, die den Fachleuten in diesem Fachgebiet allgemein bekannt sind, kombiniert werden.

Claims

1. Antiflammin, welches die Aminosäuresequenzen MQMNKVLDS, HDMNKVLDL, MQMKKVLDS, DTMDAGMQMKKVLDS, GIGKPLHSAG und/oder GIGKPLHSAK besitzt.

2. Antiflammin, welches die Aminosäuresequenzen MQMNKVLDS, HDMNKVLDL, MQMKKVLDS, DTMDAGMQMKKVLDS, GIGKPLHSAG, GIGKPLHSAK, GMASKAGAIAG, GWASKIGQTLG. GlGKFLHSAK und/oder GIGKFLHSAG besitzt, zum Verwenden bei einem Verfahren zur Entzündungshemmung bei Patienten oder Geweben, die von einem Entzündungszustand betroffen sind.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche als Wirkstoff eine entzündungshemmend wirksame Menge eines Antiflammins umfaßt, welches die Aminosäuresequenzen MQMNKVLDS, HDMNKVLDL, MQMKKVLDS, DTMDAGMQMKKVLDS, GIGKPLHSAG, GIGKPLHSAK, GMASKAGAIAG, GWASKIGQTLG, GIGKFLHSAK und/oder GIGKFLHSAG besitzt; und ein pharmazeutisch annehmbarer, nicht-toxischer, steriler Träger.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche als einen Wirkstoff eine entzündungshemmend wirksame Menge eines Antiflammins umfaßt, welches die Aminosäuresequenzen MQMNKVLDS, HDMNKVLDL, MQMKKVLDS, DTMDAGMQMKKVLDS, GIGKPLHSAG und/oder GIGKPLHSAK besitzt; und ein pharmazeutisch annehmbarer, nicht-toxischer, steriler Träger.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3 oder 4, welche weiterhin eine entzündungshemmend wirksame Menge an Dexamethason oder Ibuprofen umfaßt.

6. Verwendung eines Antiflammins, welches die Aminosäuresequenzen MQMNKVLDS, HDMNKVLDL, MQMKKVLDS, DTMDAGMQMKKVLDS, GIGKPLHSAG, GIGKPLHSAK, GMASKAGAIAG, GWASKIGQTLG, GIGKFLHSAK und/oder GIGKFLHSAG besitzt, zum Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Entzündungshemmung bei Patienten oder Geweben, die von einem Entzündungszustand betroffen sind.

7. Verwendung nach Anspruch 6, worin eine entzündungshemmend wirksame Menge an Dexamethason oder Ibuprofen beim Herstellen der pharmazeutischen Zusammensetzung zugefügt wird.