ES2699579T3 - Composición sustituta de la sangre y procedimiento de uso - Google Patents

Abstract

Una nanopartícula que tiene una forma de disco sustancialmente bicóncavo, en la que la nanopartícula comprende un núcleo acuoso, una cubierta de dos capas que comprende un polímero anfífilo cargado positivamente, y una carga útil; en la que la cubierta de dos capas tiene una capa externa hidrófila, una capa interna hidrófila y una región hidrófoba entre las capas; el polímero anfífilo comprende un polímero ramificado que contiene amina, unido a un lípido; y la carga útil comprende un agente transportador de oxígeno seleccionado de hemoglobina sintética o hemoglobina de origen natural, un efector alostérico heterotrópico que modifica la afinidad por el O2 del agente transportador de oxígeno, y un agente reductor.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición sustituta de la sangre y procedimiento de uso

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere en general a nanopartículas que comprenden una composición transportadora de oxígeno, a procedimientos para fabricar las nanopartículas y a procedimientos para usar las nanopartículas para transportar oxígeno en la sangre.

Antecedentes de la invención

Las transfusiones de sangre son procedimientos que salvan vidas y se usan en afecciones médicas y emergencias para reemplazar los componentes perdidos de la sangre. Según la Cruz Roja Americana, cada dos segundos alguien en los Estados Unidos necesita sangre, se necesitan más de 44.000 donaciones de sangre cada día y se transfunden un total de 30 millones de componentes sanguíneos cada año en los Estados Unidos. Una víctima de un accidente automovilístico puede requerir hasta 47 litros de sangre. Además, enfermedades como la anemia de células falciformes y el cáncer afectan a millones de personas en los Estados Unidos y los pacientes con estas enfermedades pueden necesitar transfusiones de sangre frecuentes a lo largo de sus vidas. La mayoritaria escasez mundial de sangre, la sangre donada infectada, la necesidad de tipificar la sangre, la corta vida útil de la sangre almacenada y la no factibilidad de la sangre almacenada para su uso en ciertas situaciones como escenarios bélicos y traumatismos han llevado a los científicos a sintetizar y analizar hemoderivados sustitutos. Aunque los expansores de volumen no sanguíneos para los casos en que solo se requiere restauración de volumen están ampliamente disponibles, hasta la fecha no hay sustitutos de la sangre que transporten oxígeno aceptados. Los productos que transportan oxígeno a base de perfluorocarbono dependen del oxígeno disuelto, se disuelven 3 veces más en oxígeno que los eritrocitos y tienen una larga vida útil. Sin embargo, los productos a base de PFC han fallado debido a una funcionalidad insuficiente en el suministro de oxígeno, una vida media corta en la circulación, la activación del complemento por tensioactivos plurónicos en productos a base de PFC, y requieren almacenamiento en frío a temperaturas bajo cero. Por otro lado, los transportadores de oxígeno a base de hemoglobina (HBOC) actualmente disponibles tienen un corto período de funcionalidad durante la circulación, tienen una dinámica de captura y liberación de oxígeno insuficiente, y son incompatibles con el almacenamiento en seco, lo que limita su uso en áreas remotas. Además, se ha demostrado que los transportadores de oxígeno a base de hemoglobina son inseguros, causando perturbaciones hemodinámicas y gastrointestinales relacionadas con la eliminación de óxido nítrico (NO), inducción de radicales libres y alteración de parámetros bioquímicos y hematológicos tales como aumento de los niveles de enzimas hepáticas y agregación plaquetaria.

El documento WO2011/133635 desvela el uso de nanopartículas como transportadores de oxígeno a base de hemoglobina, mientras que el documento WO2009/049089 desvela nanopartículas para diversos usos. Chang (Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. 2012, 40(3):197-199) y Mozzarelli et al. (Blood Transfusion, 2010, 8 Suppl 3:s59-s68 revisan los transportadores de oxígeno artificiales como reemplazo de sangre, pero se observan deficiencias en la técnica.

Por lo tanto, existe la necesidad de un sustituto de la sangre transportador de oxígeno seguro y eficiente que tenga una dinámica de captura y liberación de oxígeno adecuada que no interfiera con la regulación normal del calibre de los vasos sanguíneos, sea capaz de mantener la funcionalidad transportadora de oxígeno durante la circulación y sea susceptible de almacenamiento prolongado y facilidad de uso.

Sumario de la invención

Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgación proporciona una nanopartícula que tiene una forma de disco sustancialmente bicóncavo, en la que la nanopartícula comprende un núcleo acuoso, una cubierta de dos capas que comprende un polímero anfífilo cargado positivamente y una carga útil; en la que la cubierta de dos capas tiene una capa externa hidrófila, una capa interna hidrófila y una región hidrófoba entre las capas; el polímero anfífilo comprende un polímero ramificado, que contiene amina, unido a un lípido; y la carga útil comprende un agente transportador de oxígeno seleccionado entre hemoglobina sintética o hemoglobina de origen natural, un efector alostérico heterotrópico que modifica la afinidad del O2 por el agente transportador de oxígeno y un agente reductor. La superficie del polímero anfífilo que comprende la capa externa de la cubierta se puede derivatizar con polietilenglicol. El diámetro promedio de la nanopartícula puede ser de aproximadamente 150 nm a aproximadamente 300 nm, y la altura promedio de la nanopartícula es de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 80 nm. La nanopartícula puede comprender un orificio pasante o una depresión. El polímero anfífilo puede comprender polietilenimina conjugada con ácido C24-pentacosadiinoico. El polímero anfífilo también puede comprender polietilenimina conjugada con ácido palmítico. El agente transportador de oxígeno puede ser hemoglobina. El efector alostérico puede ser 2,3-DPG. El agente reductor puede ser azul de leucometileno. La nanopartícula puede comprender aproximadamente 20 % a aproximadamente 60 % (p/v) de hemoglobina. La nanopartícula puede ser liofilizable y almacenarse durante períodos prolongados en condiciones ambientales. Las nanopartículas liofilizadas se pueden reconstituir en un tampón acuoso a diversas concentraciones antes de la administración. La nanopartícula puede no secuestrar sustancialmente óxido nítrico. La nanopartícula puede limitar la oxidación de la hemoglobina a aproximadamente 10 % o menos de la concentración total de hemoglobina en la nanopartícula.

En otro aspecto, también se desvela un procedimiento para la preparación de una nanopartícula como se describió anteriormente.

En otro aspecto más, la presente divulgación proporciona una composición sustituta de la sangre que comprende una nanopartícula como se describió anteriormente. La composición sustituta de la sangre puede comprender desde aproximadamente 4x1012 a aproximadamente 4x1013 nanopartículas/ml. El sustituto de la sangre se puede reconstituir de una manera que se adapte al estado del volumen de sangre circulante de un paciente; el sustituto de la sangre puede estar compuesto de una manera más concentrada para ser administrado a sujetos normovolémicos (por ejemplo, un sujeto con anemia) o de una manera más diluida para ser administrado a pacientes hipovolémicos (por ejemplo, un sujeto con hemorragia).

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un procedimiento para suplementar la capacidad de transporte de oxígeno de la sangre de un sujeto. El procedimiento comprende, administrar al sujeto una cantidad efectiva de una nanopartícula como se describió anteriormente. En una realización, la nanopartícula comprende hemoglobina o hemoglobina sintética, 2,3-DPG y azul de leucometileno. Cuando se administra a sujetos con anemia o hemorragia sintomática, la nanopartícula administrada capturará O2 durante la perfusión a través de los pulmones y, posteriormente, liberará el O2 a los tejidos durante la perfusión sistémica. La administración de O2 a los tejidos por la nanopartícula será posible gracias a las siguientes características clave de diseño de las nanopartículas:(1) La cubierta de las nanopartículas previene el atrapamiento de óxido nítrico por un agente transportador de oxígeno (por ejemplo, hemoglobina, hemoglobina modificada, leghemoglobina, hemina u otros) permitiendo la señalización endógena que normalmente dirige el flujo de sangre a las áreas deficitarias en suministro de O2. (2) La carga útil de la nanopartícula contiene una molécula efectora alostérica heterotrópica (p.ej. 2,3-DPG u otros), que modifica la afinidad por el O2 del agente transportador de oxígeno; la concentración libre del efector alostérico en el núcleo de la partícula se modula mediante unión sensible al pH a la capa interna de la nanopartícula, de modo que el efector alostérico queda secuestrado en la capa interna durante la perfusión pulmonar (a pH alto, aumentando así la afinidad por el O2 y facilitando la captura por el O2) y el agente transportador de oxígeno efector alostérico se libera de la capa interna durante la perfusión sistémica (pH bajo, reduciendo así la afinidad por el O2 del agente transportador de oxígeno). Este efecto se amplifica en entornos de necesidad fisiológica [con patología pulmonar, la hiperventilación aumenta el pH y aumenta la captura de O2; con hipoxia tisular, el metabolismo anaeróbico reduce el pH y mejora la liberación de O2]. (3) La carga útil de la nanopartícula contiene un agente reductor (por ejemplo, azul de leucometileno, glutatión, ascorbato u otros) que recicla el agente transportador oxigenado oxidado, prolongando el tiempo efectivo de circulación de la nanopartícula. De este modo, la nanopartícula liberará efectivamente O2 durante la perfusión en presencia de las tensiones/gradientes de O2 que existen en las condiciones fisiológicas normales/anormales (p.ej., la pO2 del tejido oscila de 40 a 5 Torr).

También se desvela un procedimiento para llevar a cabo la administración de una nanopartícula de la invención en un sujeto. El procedimiento comprende transfundir una solución que comprende una nanopartícula que lleva oxígeno al sujeto.

Descripción de las figuras

La FIG. 1 representa la preparación y varias características de nanopartículas que comprenden hemoglobina. (A) Representación esquemática de preparación de nanopartículas y representación esquemática de nanopartículas. (B) Un gráfico que muestra la variación de tamaños de las nanopartículas en una preparación de nanopartículas. (C) Un gráfico que muestra la variación del tamaño de las partículas de nanopartículas liofilizadas y no liofilizadas con el tiempo. (D) Imagen de microscopio electrónico de transmisión de nanopartículas depositadas por caída sobre la rejilla de níquel. (E) Vista ampliada de la porción cuadrada de la imagen de microscopio electrónico de transmisión de nanopartículas en D. (F) Imagen del microscopio de fuerza atómica de nanopartículas.

La FIG. 2 representa las curvas de unión-disociación del oxígeno de nanopartículas medidas a pH 10 (curvas de color azul oscuro), 9 (curvas verdes), 8,5 (curvas magenta), 8 (curvas de color azul claro) y 6 (curvas rojas). (A) Curvas de unión-disociación del oxígeno de nanopartículas transportadoras de oxígeno marcadas con azul de leucobencil-metileno. (B) Curvas de unión-disociación del oxígeno de nanopartículas transportadoras de oxígeno en (A) después de aproximadamente cinco días de almacenamiento. (C) Curvas de unión-disociación del oxígeno de nanopartículas transportadoras de oxígeno sin marcar. (D) Curvas de unión-disociación del oxígeno de nanopartículas transportadoras de oxígeno no marcadas en (C) después de aproximadamente cinco días de almacenamiento.

La FIG. 3 representa gráficos que muestran las propiedades reológicas (A) y el perfil farmacocinético (B) de una nanopartícula. (A) Se estudiaron suspensiones de nanopartículas:plasma de 1:9 y 1:10 en relación volumétrica al plasma de NZW (conejo) a 37,1 °C usando puntos de datos correspondientes a al menos 10 % de torque (Viscosímetro de cono y placa Wells-Brookfield). Los gráficos de viscosidad frente a tasa de cizalladura revelaron que las nanopartículas no tenían ningún efecto sobre la viscosidad del plasma. (B) La hemoglobina de nanopartículas fue radiomarcada con una dosis de trazador 99mTc (50 pCi/kg) y administrada a ratas (n = 3). Se extrajeron muestras de sangre a 0, 5, 20, 40, 60, 90, 120, 150 minutos después de la administración en tubos microcapilares heparinizados, se sellaron y se colocaron alícuotas de 10 pl en una microjeringa en tubos de plástico, se taparon y se contaron utilizando un contador gamma de pocilios automático (Perkin-Elmer, Wizard 3). Los resultados ilustran el aclaramiento biexponencial típico de las nanopartículas de este rango de tamaño particular.

La FIG. 4 representa gráficamente trazas representativas de un ensayo de secuestro de NO de las cuatro formulaciones diferentes de nanopartículas descritas en la Tabla 2. Recuadro, la muestra F-3 ha sido excluida, para dar una imagen más clara de otras respuestas. Las inyecciones de muestra son equimolares para el hemo, los datos están normalizados para permitir la superposición.

La FIG. 5 representa gráficamente trazas representativas de un ensayo de secuestro de NO de eritrocitos, Hb sin células y dos formulaciones diferentes de nanopartículas, F-3 y F-4 (ver Tabla 2). Las muestras son equimolares para hemo. Los datos están normalizados para permitir la superposición. Recuadro:tasa de secuestro inicial para cada muestra (líneas de tendencia ajustadas a los primeros ~ 10 segundos de datos).

La FIG. 6 es un gráfico de barras que representa el total de NO eliminado para cuatro formulaciones de nanopartículas (F-1, F-2, F-3 y F-4; ver Tabla 2) en comparación con los controles fisiológicos (eritrocitos y Hb sin células). El área total bajo la curva (AUC) representa el NO total secuestrado. Todas las muestras son equimolares para hemo. *p < 0,05; ANOVA de una vía (n = 5). Todas las formulaciones de nanopartículas difieren de las muestras de eritrocitos y Hb.

La FIG. 7 es un gráfico de barras que representa la tasa de secuestro de NO para cuatro formulaciones de nanopartículas (F-1, F-2, F-3 y F-4; ver Tabla 2) en comparación con los controles fisiológicos (eritrocitos y Hb sin células). La tasa inicial de eliminación de NO se calculó ajustando una línea de banda a los primeros ~ 1 min de datos después de la inyección de la muestra. * p < 0,05; ANOVA de una vía (n = 5). La Hb sin células secuestra NO con más avidez que los eritrocitos intactos (como se sabe); todas las formulaciones de nanopartículas secuestran NO menos ávidamente que los eritrocitos, con la excepción de F-3 (equivalente a eritrocitos).

La FIG. 8 representa gráficos e imágenes que muestran que los niveles de HIF de todo el cuerpo y tejidos varían como una función de la [Hb] en ratones HIF-a (ODD)-luciferasa. (A-B) El nivel de HIF-luciferasa en todo el cuerpo aumentó significativamente durante la anemia hemodilucional. En (A) se representan los niveles de HIF-luciferasa gráficamente, y en (B) se representan imágenes de todo el animal. (C-E) La luminiscencia HIF-luciferasa específica de tejido cambia de manera similar; cerebro (C), riñón (D) e hígado (E). (F-G) De manera similar a (C-E), la medición de la expresión de la proteína HIF-1 a en el cerebro mediante transferencia Western aumentó proporcionalmente con la hemodilución. (F) representa una imagen de una transferencia Wstern de HIF-a y un control (a-tubulina); en (G), los niveles de proteína HIF-a se representan gráficamente. (H-J) Del mismo modo, los niveles seleccionados de ARNm dependiente de HIF también aumentan:(H) GLUT1, (I) PDK1, (J) MCT4. (K-L) Representa imágenes y gráficos que muestran la relación entre los niveles de Hb y la luciferasa HIF de todo el cuerpo. Específicamente, la señal de HIF luciferasa está inversamente relacionada con la Hb durante el desarrollo y la resolución de la anemia. (K) imágenes de todo el cuerpo y (L) radiancia corporal normalizada (eje y izquierdo) o concentración de hemoglobina (eje y derecho) frente a anemia (eje x). NB: las medidas emparejadas de la pO2 cerebral durante la hemodilución aguda (por extinción de fosforescencia) se correlacionan con la [Hb], lo que confirma el análisis de las tendencias de expresión de HIF. Para las siguientes medidas de ([Hb] (g/l) y pO2 (mmHg), (media ± DE)), N = 8 ratones:Hb de 125,1 ± 8,3 ^ pO2 de 65,0 ± 8,3; Hb de 88,3 ± 5,4 ^ pO2 de 56,4 ± 9,5; Hb de 72,5 ± 7,4 ^ pO2 de 52,1 ± 10,3; Hb de 52,4 ± 3,9 ^ pO2 de 40,6 ± 6,8.

La FIG. 9 representa gráficos que muestran la eficacia de una nanopartícula en un modelo de choque hemorrágico en roedores. Los gráficos en (A) y (B) ilustran un aumento sorprendente y esperado en el AV de la diferencia de O2 con la extracción de sangre (aumento del 24 al 67 %), que (A) persistió después de la reanimación con solución salina normal y (B) se resolvió después de la reanimación con el sustituto de la sangre (normalizando del 67 al 31 %). (C) No se observó una diferencia en el efecto hemodinámico proporcionado por el fluido de reanimación (solución salina normal = SN, solución de nanopartículas = NP), lo que sugiere que el beneficio en la administración de O2 del sustituto de la sangre se debe a un mayor contenido de O2, además de la restauración de la presión arterial.

Descripción detallada

La presente divulgación proporciona nanopartículas transportadoras de oxígeno que son morfológicamente similares a los eritrocitos. Las nanopartículas transportadoras de oxígeno de la divulgación se autoensamblan, lo que significa que son relativamente rápidas y fáciles de preparar. Las nanopartículas transportadoras de oxígeno de la divulgación también tienen forma de disco sustancialmente bicóncavo que proporciona una mayor estabilidad mecánica. Las nanopartículas transportadoras de oxígeno de la divulgación comprenden una carga útil. La carga útil comprende un agente transportador de oxígeno, un efector alostérico y un agente reductor. Ventajosamente, una nanopartícula transportadora de oxígeno de la divulgación es capaz de incorporar alta carga útil por partícula, y es capaz de imitar las características de transporte de oxígeno de los eritrocitos desplazando la afinidad del agente transportador de oxígeno al oxígeno en función de la necesidad del tejido. Además, una nanopartícula transportadora de oxígeno no altera el tono vascular, es capaz de mantener la funcionalidad transportadora de oxígeno durante la circulación y evita la extravasación de tejido mediante el aclaramiento de partículas retículoendotelial. Y lo que es importante, las nanopartículas de la divulgación se pueden liofilizar para un almacenamiento prolongado, y se pueden reconstituir rápidamente antes del uso.

También se describen soluciones que comprenden nanopartículas y procedimientos de uso de nanopartículas y soluciones.

I. NANOPARTÍCULA

Un aspecto de la divulgación proporciona una nanopartícula transportadora de oxígeno con forma de disco sustancialmente bicóncavo. La nanopartícula comprende un núcleo acuoso, una cubierta que comprende un polímero anfífilo y una carga útil. La carga útil comprende un agente transportador de oxígeno, un efector alostérico y un agente reductor. Cada aspecto de una nanopartícula se describe en detalle a continuación. Las nanopartículas también pueden ser como se describe en la Solicitud de patente de los Estados Unidos N.° 2010/0297007.

(a) morfología

Una nanopartícula comprende una forma de disco toroidal, es decir, una forma de disco sustancialmente bicóncavo. Dichas nanopartículas tienen una forma de tipo placa de espesor finito generalmente redondeada, cóncava en ambas superficies, que imita la forma del eritrocito humano, y que aumenta el área superficial de una nanopartícula en comparación con una nanopartícula esférica, mejorando por lo tanto la dinámica de intercambio de oxígeno de una nanopartícula transportadora de oxígeno. La concavidad de las nanopartículas puede adoptar la forma de una depresión cóncava en cada superficie, o una abertura, o “agujero pasante” a través del centro aproximado del disco. Dentro de una población de nanopartículas, algunas de las nanopartículas pueden comprender una depresión, y algunas de las nanopartículas pueden comprender un orificio pasante. En general, al menos aproximadamente el 50 % de una población de nanopartículas puede tener forma de disco bicóncavo. El porcentaje de nanopartículas en forma de disco bicóncavo puede ser de aproximadamente 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de la población total de nanopartículas. En otra alternativa, el porcentaje de nanopartículas en forma de disco bicóncavo puede ser de al menos aproximadamente 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o 99 % de la población total de nanopartículas.

Debido a la forma de las nanopartículas, el diámetro de una nanopartícula es mayor que la altura de la nanopartícula. En general, el diámetro de una nanopartícula puede oscilar de aproximadamente 50 nanómetros a aproximadamente 500 nanómetros, y la altura de una nanopartícula puede oscilar de aproximadamente 20 nanómetros a aproximadamente 150 nanómetros. Como tal, el diámetro de una nanopartícula puede oscilar de aproximadamente 100 nanómetros a aproximadamente 300 nanómetros, y la altura de una nanopartícula puede oscilar de aproximadamente 40 nanómetros a aproximadamente 85 nanómetros. En otra alternativa, el diámetro de una nanopartícula puede oscilar de aproximadamente 100 nanómetros a aproximadamente 250 nanómetros, y la altura de una nanopartícula puede oscilar de aproximadamente 30 nanómetros a aproximadamente 80 nanómetros. Preferentemente, el diámetro de una nanopartícula puede oscilar de aproximadamente 120 nanómetros a aproximadamente 250 nanómetros, y la altura de una nanopartícula puede oscilar de aproximadamente 50 nanómetros a aproximadamente 70 nanómetros. El diámetro de una nanopartícula también puede ser de aproximadamente 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 o 300 nanómetros, y la altura de una nanopartícula puede ser de aproximadamente 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 u 85 nanómetros.

Las nanopartículas que comprenden una población de nanopartículas son sustancialmente uniformes en tamaño, en las que el tamaño se mide como el diámetro de una nanopartícula. La variación de tamaño entre las nanopartículas de la población es inferior a aproximadamente el 15 %. Preferentemente, la variación en el tamaño entre las nanopartículas de la población puede ser inferior a aproximadamente 10 %, e incluso más preferentemente inferior a aproximadamente 5 %. La variación de tamaño entre las nanopartículas de la población puede ser inferior a aproximadamente 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 % o 1 %.

El tamaño entre dos o más poblaciones de nanopartículas puede variar y variará, en el que el tamaño se mide como el diámetro de una nanopartícula. El tamaño de una nanopartícula puede estar influenciado por los tipos y concentraciones de agente transportador de oxígeno, efector alostérico, agente reductor y polímero anfífilo y/o agentes opcionales. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree que el tamaño de una nanopartícula puede aumentar al aumentar las concentraciones de agente transportador de oxígeno, efector alostérico, agente reductor y/o agentes opcionales. El tamaño de una nanopartícula también puede aumentar a medida que aumenta el peso molecular del polímero ramificado que comprende el polímero anfífilo.

En general, las nanopartículas en forma de disco bicóncavo tienen una mayor estabilidad en comparación con las nanopartículas en forma de disco no bicóncavo. La estabilidad puede medirse por los cambios en el diámetro de la partícula, el potencial zeta y/o la polidispersidad a lo largo del tiempo. La estabilidad también se puede medir mediante los cambios en la liberación de la carga útil a lo largo del tiempo (por ejemplo, liberación de un agente transportador de oxígeno, efector alostérico y/o agente reductor a lo largo del tiempo). Una nanopartícula estable puede reflejar menos de aproximadamente 20 %, preferentemente menos de aproximadamente 15 %, más preferentemente menos de aproximadamente 10 % de cambio con respecto a las propiedades basales. Las nanopartículas en forma de disco bicóncavo son estables a temperatura ambiente durante al menos varios meses, durante más de dos meses o durante más de tres meses. La estabilidad se mide generalmente para una población de nanopartículas en lugar de una sola nanopartícula. En general, las nanopartículas en forma de disco bicóncavo son estables a 4 °C durante al menos varios meses o durante más de dos meses. Se proporcionan detalles adicionales en los Ejemplos.

(b) cubierta

Una cubierta de una nanopartícula en forma de disco bicóncavo comprende un polímero anfífilo, en el que el polímero anfífilo comprende un polímero ramificado conjugado covalentemente con lípidos. La cubierta también puede comprender agua, una solución tampón, una solución salina, una solución de suero y combinaciones de los mismos. La cubierta puede comprender además un agente biológicamente activo, un agente de formación de imágenes, un átomo de metal o un agente terapéutico, como se detalla a continuación.

Una cubierta de una nanopartícula en forma de disco bicóncavo es de dos capas, compuesta por una capa externa hidrófila, una capa interna hidrófila y una región hidrófoba entre las capas. Para formar la cubierta de una nanopartícula, un polímero anfífilo primero se autoensambla para formar una capa doble compuesta por una capa externa hidrófila, una capa interna hidrófila y una región hidrófoba entre las capas, y luego se autoensambla en una nanopartícula en forma de disco cóncavo. La formación de la partícula en forma de disco bicóncavo está determinada por la relación de bloques hidrófobo-hidrófilo del polímero anfífilo y el procedimiento de autoensamblaje de las nanopartículas.

El polímero anfífilo puede comprender de aproximadamente 1 % a aproximadamente 40 % en peso de la nanopartícula. Por ejemplo, el polímero anfífilo puede comprender aproximadamente 1 %, 1,5 %, 2 %, 2,5 %, 3 %,

3.5 %, 4 %, 4,5 %, 5 %, 5,5 %, 6 %, 6,5 %, 7 %, 7,5 %, 8 %, 8,5 %, 9 %, 9,5 %, 10 %, 10,5 %, 11 %, 11,5 %, 12 %,

12.5 %, 13 %, 13,5 %, 14 %, 14,5 %, 15 %, 15,5 %, 16 %, 16,5 %, 17 %, 17,5 %, 18 %, 18,5 %, 19 %, 19,5 20.5 %, 21 %, 21,5 %, 22 %, 22,5 %, 23 %, 23,5 %, 24 %, 24,5 %, 25 %, 25,5 %, 26 %, 26,5 %, 27 %, 27,5 28.5 %, 29 %, 29,5 %, 30 %, 30,5 %, 31 %, 31,5 %, 32 %, 32,5 %, 33 %, 33,5 %, 34 %, 34,5 %, 35 %, 35,5 36.5 %, 37 %, 37,5 %, 38 %, 38,5 %, 39 %, 39,5 %, o aproximadamente 40 % en peso de la nanopartícula. El polímero anfífilo puede comprender de aproximadamente 1 % a aproximadamente 15 %, de aproximadamente 5 % a aproximadamente 20 %, de aproximadamente 1 % a aproximadamente 10 %, o de aproximadamente 10 % a aproximadamente 20 % en peso de la nanopartícula. En otra alternativa, el polímero anfífilo puede comprender de aproximadamente 1 % a aproximadamente 5 %, aproximadamente 5 % a aproximadamente 10 %, aproximadamente

10 % a aproximadamente 15 %, o aproximadamente 15 % a aproximadamente 20 % en peso de la nanopartícula.

Los aspectos adicionales se describen en detalle a continuación.

i. polímeros ramificados

Un polímero ramificado usado en el presente documento es un polímero ramificado que contiene amina con uno o más grupos reactivos libres. Los tipos no limitantes de polímeros ramificados adecuados incluyen polímeros ramificados en estrella, polímeros ramificados en injerto, polímeros ramificados en peine, polímeros ramificados en cepillo, polímeros ramificados en red, polímeros hiperramificados y polímeros dendríticos.

El polímero puede ser un polímero sintético, un polímero semisintético o un polímero natural. Los ejemplos no limitantes de polímeros adecuados incluyen poliacrilato, poliacrilamida, ácido sulfónico de poliacrilamida, poliacrilonitrilo, poliaminas, poliamidas, poliamidoamina (PAMAM), polibutadieno, polidimetilsiloxano, poliéster, poliéter, polietileno, polietilenglicol (PEG), polietilenimina (PEI), óxido de polietileno, polietilenglicol, polietiloxazolina, polihidroxietilacrilato, poliisopreno, polimetacrilato, polimetacrilamida, polimetacrilato de metilo, polimetiloxazolina, óxido de polioxialquileno, polifenileno, polipropilenimina, óxido de polipropileno, poliestireno, poliuretano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, ácido hialurónico, dextrano, dextrina, sulfato de heparano, sulfato de condroitina, heparina, alginato, agar, carragenano, xantano, guar, poliaminoácidos (tales como, por ejemplo, polilisina, poliglicina y poliserina), copolímeros y combinaciones de los mismos.

Un polímero ramificado comprende al menos un tipo de grupo reactivo. Los grupos reactivos adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminas primarias, secundarias o terciarias, grupos carboxilato, hidroxilo, alquilo, fluoroalquilo, arilo, acetato, amida, éster, sulfona, sulfóxido, sulfonato, sulfonamida, fosfonato y fosfonamida.

El peso molecular medio de un polímero ramificado puede variar y variará. Por ejemplo, pueden seleccionarse polímeros de un peso molecular creciente para producir una cubierta exterior de un grosor creciente. El peso molecular puede expresarse como el peso molecular promedio en número (Mn) o el peso molecular promedio en peso (Mw) de la molécula. En general, el peso molecular promedio en número y en peso de un polímero ramificado puede variar de aproximadamente 200 a aproximadamente 1.000.000 de Daltons. El peso molecular promedio en número y en peso de un polímero ramificado puede oscilar de aproximadamente 200 a aproximadamente 50.000 Dalton, lo que incluye de aproximadamente 200 a aproximadamente 5.000, de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 50.000, de aproximadamente 50.000 a aproximadamente 250.000, o de aproximadamente 250.000 a aproximadamente 1.000.000 de Daltons. Preferentemente, el peso molecular promedio en número y en peso de un polímero ramificado puede ser de aproximadamente 10.000 Daltons, aproximadamente 25.000 Daltons o aproximadamente 50.000 Daltons.

Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree que la naturaleza inherente de un polímero ramificado permite la retención de un efector alostérico (descrito en la Sección I (f)) a través de la interacción electrostática. Un experto en la materia apreciará que la elección del polímero ramificado puede influir en esta interacción. Por ejemplo, cuando un polímero ramificado es un polímero ramificado catiónico con aminas secundarias o terciarias, la densidad de amina puede ser un factor importante. Sin embargo, no es necesario que un polímero catiónico ramificado sea un polímero catiónico ramificado para interactuar electrostáticamente con un efector alostérico. Para hacer una interacción electrostática con un efector alostérico, las aminas de un polímero ramificado son suficientes. Los polímeros ramificados preferidos pueden incluir, pero no se limitan a, un polímero ramificado de polietilenimina, un dendrímero PAMAM, un polímero de estrella o un polímero de injerto. Incluso más preferentemente, el polímero ramificado es un polímero ramificado de polietilenimina. Un ejemplo de polímero ramificado es un polímero ramificado de polietilenimina 10K, un polímero ramificado de polietilenimina 50K, o un polímero ramificado de polietilenimina 100K. Un ejemplo de polímero ramificado es G4 poliamidoamina.

ii. lípidos

El polímero anfífilo también comprende lípidos unidos al polímero ramificado. Un lípido puede estar unido covalentemente o no unido covalentemente a un polímero ramificado. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree que el porcentaje de grupos reactivos de un polímero ramificado unido a lípidos influye en el carácter hidrófobo, y por lo tanto en la morfología, de la partícula. El porcentaje de grupos reactivos libres de un polímero ramificado unido a un lípido variará con los materiales con el fin de controlar la relación de bloques hidrófobos-hidrófilos, lo que determina la formación de membranas de tipo bicapa en partículas con forma de disco bicóncavo. Generalmente, un polímero anfífilo comprende lípidos unidos a un polímero ramificado, en el que al menos aproximadamente el 25 % de los grupos reactivos de un polímero ramificado están unidos a lípidos. Por ejemplo, el porcentaje de grupos reactivos libres ligados a los lípidos puede ser del 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35

%, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71

%, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89

%, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. El porcentaje de grupos reactivos unidos a los lípidos también puede ser de al menos aproximadamente 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65

%, 70 % o 75 % o más más del 75 %. Preferentemente, el porcentaje de grupos reactivos libres unidos a lípidos puede variar de aproximadamente 40 % a aproximadamente 70 % o de aproximadamente 50 % a aproximadamente

60 %. Un ejemplo de porcentaje de grupos reactivos libres unidos a lípidos puede ser aproximadamente 55 %.

Ejemplos no limitantes de lípidos adecuados incluyen ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, fosfolípidos, ácidos biliares, glicolípidos, compuestos hidrófobos alifáticos y compuestos hidrófobos aromáticos. Un lípido puede ser natural, sintético o semisintético. En general, un lípido comprende un grupo de cabeza polar y al menos un grupo hidrocarbilo hidrófobo o hidrocarbilo sustituido. Un grupo de cabeza polar une un lípido a un polímero ramificado a través de un enlace covalente. Los ejemplos de grupos de cabeza polar adecuados incluyen, pero no se limitan a, carboxi, acilo, propargilo, azida, aldehído, tiol, éster, sulfato y fosfato. Los grupos hidrocarbilo hidrófobos preferidos incluyen, pero no se limitan a, alquilo, alquinilo, heterocíclico y combinaciones de los mismos. Generalmente, los grupos alquilo o alquinilo comprenden de aproximadamente seis a aproximadamente 30 átomos de carbono, o más preferentemente de aproximadamente 12 a aproximadamente 24 átomos de carbono. Un grupo hidrocarbilo sustituido se refiere a restos hidrocarbilo que están sustituidos con al menos un átomo distinto de carbono, que incluye restos en los que un átomo de la cadena de carbono está sustituido con un heteroátomo como un átomo de nitrógeno, oxígeno, silicio, fósforo, boro o halógeno y restos en los que la cadena de carbono comprende sustituyentes adicionales. Estos sustituyentes incluyen alquilo, alcoxi, acilo, aciloxi, alquenilo, alquenoxi, arilo, ariloxi, amino, amido, acetal, carbamilo, carbamato, carbociclo, ciano, éster, éter, halógeno, heterociclo, hidroxilo, ceto, cetal, fosfo, nitro, tio, trifluorometilo, sulfonilo, sulfonamida y similares. Un lípido puede ser un fosfolípido tal como, por ejemplo, fosfatidil etanolamina, fosfatidilserina, fosfatidil inositol, cardiolipina, fosfatidil etilenglicol y similares, o un ácido biliar tal como ácido cólico. Preferentemente, un lípido puede ser un ácido graso, en el que la cadena de ácido graso comprende un grupo alquilo (saturado) o alquinilo (insaturado) como se definió anteriormente. Los ácidos grasos preferidos incluyen, pero no se limitan a, ácido 10,12-pentacosadiinoico, ácido hexadeciloctadecanoico, ácido colánico, ácido linoleico, ácido C24-pentacosadiinoico y ácido palmítico.

Preferentemente, un lípido puede ser ácido palmítico o ácido C24-pentacosadiinoico.

Un ejemplo de polímero ramificado puede ser polietilenimina y un ejemplo de lípido es ácido palmítico, ácido C24-pentacosadiinoico o ácido linoleico, en el que al menos aproximadamente 40 % de los grupos reactivos libres del polímero están unidos al lípido. Un ejemplo de polímero ramificado puede ser polietilenimina y un ejemplo de lípido es ácido palmítico, ácido C24-pentacosadiinoico o ácido linoleico, en el que al menos aproximadamente 50 % de los grupos reactivos libres del polímero están unidos al lípido. Un ejemplo de polímero ramificado puede ser polietilenimina y un ejemplo de lípido es ácido palmítico, ácido C24-pentacosadiinoico o ácido linoleico, en el que al menos aproximadamente 55 % de los grupos reactivos libres del polímero están unidos al lípido. Cuando el polímero ramificado es polietilenimina, el grupo reactivo libre es una amina, generalmente una amina primaria y/o una amina secundaria.

Un ejemplo de polímero ramificado puede ser PAMAM y un ejemplo de lípido es ácido palmítico, ácido C24-pentacosadiinoico o ácido linoleico, en el que al menos aproximadamente 10 % de los grupos reactivos libres del polímero están unidos al lípido. Un ejemplo de polímero ramificado puede ser PAMAM y un ejemplo de lípido es ácido palmítico, ácido C24-pentacosadiinoico o ácido linoleico, en el que al menos aproximadamente 20 % de los grupos reactivos libres del polímero están unidos al lípido. Un ejemplo de polímero ramificado puede ser PAMAM y un ejemplo de lípido es ácido palmítico, ácido C24-pentacosadiinoico o ácido linoleico, en el que al menos aproximadamente 30 % de los grupos reactivos libres del polímero están unidos al lípido. Cuando el polímero ramificado es PAMAM, el grupo reactivo libre es una amina, generalmente una amina primaria.

(c) núcleo acuoso

Las nanopartículas comprenden un núcleo acuoso. El núcleo acuoso puede comprender agua, una solución tampón, una solución salina, una solución de suero y combinaciones de los mismos. El núcleo acuoso también puede comprender un agente biológicamente activo, un agente formador de imágenes, un átomo de metal, un agente terapéutico, un agente transportador de oxígeno, un efector alostérico, un agente reductor, o combinaciones de los mismos, como se detalla a continuación. Preferentemente, el núcleo acuoso comprende un agente transportador de oxígeno, un efector alostérico y un agente reductor.

(d) reticulación intramolecular del exterior de la partícula

El exterior de la nanopartícula comprende la capa externa de la cubierta. La capa externa de la cubierta está reticulada intramolecularmente para neutralizar los grupos reactivos superficiales. Dicho de otra manera, la capa externa de la cubierta está reticulada intramolecularmente de modo que la nanopartícula tiene una superficie casi neutra. El grado de reticulación necesario para lograr una superficie casi neutra variará dependiendo del polímero anfífilo. Las nanopartículas con un potencial zeta de aproximadamente -15 a aproximadamente 15 mV se consideran aproximadamente neutras. Una nanopartícula con una superficie casi neutra puede tener un potencial zeta entre -15, -14, -13, -12, -11, -10, -9, -7, -6, -5, -4, -3, -2, -1, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 mV. Una nanopartícula con una superficie casi neutra también puede tener un potencial zeta de aproximadamente -15 a aproximadamente 0 mV, de aproximadamente -10 a aproximadamente 0 mV, de aproximadamente -10 a aproximadamente -5 mV, de aproximadamente -9 a aproximadamente -4 mV, de aproximadamente - 8 a aproximadamente -3 mV, de aproximadamente -7 a aproximadamente -2 mV, de aproximadamente -6 a aproximadamente -1 mV, o de aproximadamente -5 a aproximadamente 0 mV. En otra alternativa, una nanopartícula con una superficie casi neutra también puede tener un potencial zeta de aproximadamente 0 a aproximadamente 15 mV, de aproximadamente 0 a aproximadamente 10 mV, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 mV, de aproximadamente 4 a aproximadamente 9 mV, de aproximadamente 3 a aproximadamente 8 mV, de aproximadamente 2 a aproximadamente 7 mV, de aproximadamente 1 a aproximadamente 6 mV, o de aproximadamente 0 a aproximadamente 5 mV. El potencial Zeta puede afectar a la tendencia de una nanopartícula a interactuar con proteínas, micropartículas, células y otras biomoléculas. Una superficie casi neutra es una característica importante de una nanopartícula de la divulgación, ya que las nanopartículas se administrarán a un sujeto y no es deseable que la nanopartícula interactúe sustancialmente con proteínas, células y otras partículas en la sangre. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, los solicitantes también creen que el grado de reticulación contiene sustancialmente la carga útil dentro del interior de la partícula, afecta a la difusión de gases tales como oxígeno, dióxido de carbono y óxido nítrico en o dentro de la nanopartícula. La reticulación también puede impartir una mayor estabilidad mecánica a las nanopartículas, mejorar la biocompatibilidad y/o prolongar la longevidad en la circulación. La reticulación también puede inhibir el daño oxidativo a un agente transportador de oxígeno.

Los lípidos superficiales del polímero anfífilo de la cubierta externa pueden reticularse por medios químicos. Como alternativa, un polímero del núcleo del polímero anfífilo puede reticularse por medios fotoquímicos. En general, al menos aproximadamente 30 % de los grupos reactivos disponibles de un polímero anfífilo pueden estar reticulados, más del 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de los grupos reactivos disponibles del polímero anfífilo pueden estar reticulados. Los medios adecuados de reticulación se detallan a continuación en la Sección II. El grado de reticulación puede determinarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica.

Preferentemente, la superficie de la partícula se reticula intramolecularmente con un enlazador bifuncional, de modo que al menos aproximadamente 30 % de los grupos reactivos superficiales del polímero anfífilo se pueden reticular, incluyendo de aproximadamente 30 % a aproximadamente 50 %, de aproximadamente 50 % a aproximadamente 70 %, o de aproximadamente 70 % a aproximadamente 100 %. Los enlazadores bifuncionales preferidos incluyen, pero no se limitan a, cadenas de PEG cortas activadas (o funcionalizadas). Como alternativa, pueden usarse agentes de acoplamiento. Las cadenas de PEG cortas pueden comprender aproximadamente 1,2, 3, 4, 5 o aproximadamente 6 monómeros de óxido de etileno. Preferentemente, las cadenas cortas de PEG comprenden de 1 a 3 monómeros de óxido de etileno, o más preferentemente, 2 monómeros de óxido de etileno. Los ejemplos de enlazadores bifuncionales pueden incluir etilenglicolbis (sulfosuccinimidilsuccinato) (Sulfo-EGS), epóxidos, tosilatos o cloroformiatos. A continuación se proporcionan más detalles en la Sección II.

(e) pegilación opcional

Además, un polímero anfífilo de una nanopartícula se puede derivatizar con polietilenglicol (PEG), como se detalla a continuación en la Sección II. Preferentemente, una nanopartícula se derivatiza utilizando cadenas cortas de PEG. Las cadenas de PEG cortas pueden comprender aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5 o aproximadamente 6 monómeros de óxido de etileno. Preferentemente, las cadenas cortas de PEG comprenden de 1 a 3 monómeros de óxido de etileno, o más preferentemente, 2 monómeros de óxido de etileno.

(f) carga útil

Una nanopartícula de la divulgación comprende una carga útil, comprendiendo la carga útil un agente transportador de oxígeno, un efector alostérico y un agente reductor. La carga útil está contenida en el interior de la nanopartícula. Un agente transportador de oxígeno, un efector alostérico y un agente reductor de una nanopartícula transportadora de oxígeno pueden estar contenidos en el núcleo acuoso de la nanopartícula, pueden estar dentro de la región hidrófila de la capa interna que comprende la cubierta de la nanopartícula, puede estar dentro de la región hidrófoba que comprende la cubierta de la nanopartícula, o una combinación de las mismas. También se prevé que un agente transportador de oxígeno, un efector alostérico y un agente reductor puedan localizarse en diferentes lugares de una nanopartícula.

i. agente transportador de oxígeno

Una nanopartícula de la divulgación comprende un agente transportador de oxígeno. Cualquier molécula capaz de transportar oxígeno puede ser adecuada para su uso como agente transportador de oxígeno. Ejemplos no limitantes de agentes transportadores de oxígeno incluyen transportadores de oxígeno a base de perfluorocarbono (PFBOC), transportadores de oxígeno a base de hemoglobina (HBOC), transportadores de oxígeno de tipo hemoglobina tales como leghemoglobina, y transportadores de oxígeno a base de hemoglobina artificial tales como hemina. Como tal, el agente transportador de oxígeno usado en la invención se selecciona de hemoglobina sintética y hemoglobina de origen natural.

Las nanopartículas pueden comprender de aproximadamente 2000 a aproximadamente 10.000 moléculas de agente transportador de oxígeno por nanopartícula. Las nanopartículas pueden comprender aproximadamente 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500 o aproximadamente 10.000 moléculas de agente transportador de oxígeno por nanopartícula. Las nanopartículas también pueden comprender más de aproximadamente 10.000 moléculas de agente transportador de oxígeno por nanopartícula. El número absoluto de moléculas de agente transportador de oxígeno por nanopartícula puede variar dependiendo del tamaño de la nanopartícula, la afinidad del oxígeno por el agente transportador de oxígeno y la capacidad de limitar la formación de autooxidación durante la descarga de O2.

De aproximadamente 20 % a aproximadamente 60 % (p/v) de una nanopartícula de la divulgación puede comprender un agente transportador de oxígeno. Por ejemplo, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % o 60 % (p/v) de una nanopartícula pueden comprender un agente transportador de oxígeno. Como alternativa, aproximadamente el 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 % o aproximadamente 60 % (p/v) de una nanopartícula comprende un agente transportador de oxígeno. Preferentemente, aproximadamente 25 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 35 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 45 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 60 % (p/v) de una nanopartícula comprende un agente transportador de oxígeno.

Los transportadores artificiales de oxígeno a base de hemoglobina son conocidos, como la hemina. También se conocen los transportadores de oxígeno a base de hemoglobina. La hemoglobina es una metaloproteína transportadora de oxígeno que contiene hierro, y es el componente principal de los eritrocitos, que comprende aproximadamente el 33 % de la masa celular. Cada molécula de hemoglobina tiene 4 subunidades, dos cadenas a y dos cadenas p, que están dispuestas en una estructura tetramérica. Cada subunidad también contiene un grupo hemo, que es el centro que contiene hierro que se une al oxígeno. Como tal, cada molécula de hemoglobina puede unir cuatro moléculas de oxígeno.

La presente divulgación no está limitada por la fuente de hemoglobina. El término “hemoglobina” se refiere a hemoglobina sintética o de origen natural. Por ejemplo, un agente transportador de oxígeno a base de hemoglobina de la divulgación puede ser de animales. Como alternativa, un agente transportador de oxígeno a base de hemoglobina de la divulgación puede ser de humanos. Las fuentes preferidas de hemoglobina son los seres humanos, las vacas y los cerdos.

Un agente de transporte a base de oxígeno de hemoglobina puede aislarse y purificarse de un ser humano o de animales tales como vacas y cerdos. Como alternativa, se puede producir un agente transportador de oxígeno a base de hemoglobina mediante síntesis química y técnicas recombinantes. Los genes de la a-globina humana y pglobina se han clonado y secuenciado (véase, por ejemplo, Liebhaber et al., P.N.A.S. 77:7054-7058 (1980)); Marotta et al., J. Biol. Chem. 353:5040-5053 (1977)) (ADNc de beta-globina).

Los expertos en la materia apreciarán que pueden existir polimorfismos de secuencia de aminoácidos de hemoglobina dentro de una población (por ejemplo, la población humana, de vaca o de cerdo). Tal polimorfismo genético puede existir entre individuos dentro de una población debido a la variación alélica natural. Se pretende que todas y cada una de tales variaciones de aminoácidos y polimorfismos resultantes que son el resultado de una variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional de la hemoglobina estén dentro del alcance de la divulgación. De forma similar, la expresión agente transportador a base de oxígeno de hemoglobina incluye hemoglobina que se ha modificado por ingeniería genética para ajustar las propiedades de unión y liberación de oxígeno de la hemoglobina cuando se usa como un agente transportador de oxígeno en una nanopartícula transportadora de oxígeno (véase, p.ej., Nagai, et al., (1985) P.N.A.S., 82:7252-7255 y la patente US-5.028.588). Un agente transportador a base de oxígeno de hemoglobina también puede ser hemoglobina de origen natural, hemoglobina quimérica, hemoglobina recombinante, fragmentos de hemoglobina o hemoglobina que comprende combinaciones de los mismos sin apartarse del alcance de la divulgación.

Un agente transportador de oxígeno a base de hemoglobina puede ser nativo o posteriormente modificado por una reacción química tal como reticulación intramolecular o intermolecular, polimerización o la adición de grupos químicos tales como poli(óxidos de alquileno) u otros aductos. Se desvelan ejemplos representativos de agentes transportadores de oxígeno modificados de hemoglobina en una serie de patentes estadounidenses expedidas, que incluyen la patente US-4.857.636, patente US-4.600.531, patente US-4.061.736, patente US-3.925.344, patente U^s -4.529.719, patente US-4.473.496, patente US-4.584.130, patente US-5.250.665, patente US-4.826.811 y patente US-5.194.590.

Preferentemente, un agente transportador de oxígeno es la hemoglobina aislada de humanos, vacas o cerdos. Incluso más preferentemente, un agente transportador de oxígeno es la hemoglobina aislada de humanos. Los procedimientos para aislar hemoglobina de un sujeto son conocidos en la técnica y pueden ser como se describe en los ejemplos y en Rogers et al., 2009, revista FASEB 23:3159-3170. Independientemente de la fuente de hemoglobina, un agente transportador de oxígeno de hemoglobina es sustancialmente puro, y está libre de estroma y endotoxina.

Las nanopartículas pueden comprender de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 10.000 moléculas de hemoglobina por nanopartícula. Las nanopartículas pueden comprender aproximadamente 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 5.500, 6.000, 6.500, 7.000, 7.500, 8.000, 8.500, 9.000, 9500 o aproximadamente 10.000 moléculas de hemoglobina por nanopartícula o más. Una nanopartícula puede comprender de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 6.000 moléculas de hemoglobina por nanopartícula o de aproximadamente 6.000 a aproximadamente 10.000 moléculas de hemoglobina por nanopartícula. Una nanopartícula también puede comprender de aproximadamente 3.000 a aproximadamente 6.000 moléculas de hemoglobina por nanopartícula, de aproximadamente 4.000 a aproximadamente 7.000 moléculas de hemoglobina por nanopartícula, de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 8.000 moléculas de hemoglobina por nanopartícula, de aproximadamente 6.000 a aproximadamente 9.000 moléculas de hemoglobina por nanopartícula, o de aproximadamente 7.000 a aproximadamente. 10.000 moléculas de hemoglobina por nanopartícula. Como alternativa, una nanopartícula puede comprender de aproximadamente 3.000 a aproximadamente 4.000 moléculas de hemoglobina por nanopartícula, de aproximadamente 4.000 a aproximadamente 5.000 moléculas de hemoglobina por nanopartícula, de aproximadamente 5.000 a aproximadamente 6.000 moléculas de hemoglobina por nanopartícula, de aproximadamente 6.000 a aproximadamente 7.000 moléculas de hemoglobina por nanopartícula, de aproximadamente 7.000 a aproximadamente 8.000 moléculas de hemoglobina por nanopartícula, de aproximadamente 8.000 a aproximadamente 9.000 moléculas de hemoglobina por nanopartícula, o de aproximadamente 9.000 a aproximadamente 10.000 moléculas de hemoglobina por nanopartícula. El número absoluto de moléculas de hemoglobina por nanopartícula puede variar y variará dependiendo del tamaño de la nanopartícula.

Generalmente, aproximadamente 20 % a aproximadamente 60 % (p/v) de una nanopartícula puede comprender hemoglobina. Por ejemplo, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % o 60 % (p/v) de una nanopartícula pueden comprender hemoglobina. Como alternativa, aproximadamente 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 % o aproximadamente 60 % (p/v) de una nanopartícula comprende hemoglobina. Preferentemente, aproximadamente 25 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 35 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 40 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 45 % a aproximadamente 60 %, aproximadamente 50 % a aproximadamente 60 % (p/v) de una nanopartícula comprende hemoglobina. Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree que la alta concentración de hemoglobina puede estabilizar la hemoglobina y evitar la disociación del tetrámero de hemoglobina dependiente de la concentración en dímeros individuales a y p.

Si la concentración de hemoglobina de una nanopartícula transportadora de oxígeno no puede determinarse directamente, como se describe en el presente documento, puede estimarse a partir del contenido de hierro de la nanopartícula. El contenido de hierro de la hemoglobina es conocido en la técnica. Ver, por ejemplo, Bernhart FW y Skeggs L 1943 J Biol Chem 147:19-22.

ii. Efecto alostérico

Una nanopartícula de la divulgación comprende un efector alostérico que modula la afinidad de un agente transportador de oxígeno por oxígeno, y modula la velocidad o cantidad de oxígeno que se une a, o se libera de, un agente transportador de oxígeno en una nanopartícula. Un efector alostérico puede aumentar la descarga de oxígeno de un transportador de oxígeno a un tejido o célula que está desoxigenada dentro de un sujeto, y/o aumentar la carga de oxígeno en un transportador de oxígeno desde un tejido oxigenado, como los pulmones. Como tal, un efector alostérico puede permitir que el oxígeno se una en los pulmones y se libere en los tejidos dentro del estrecho rango fisiológico de presiones parciales de oxígeno de 40-100 mmHg en los tejidos desoxigenados y en los pulmones ricos en oxígeno. El control fácil de la afinidad por el O2 es esencial para el diseño de una nanopartícula transportadora de oxígeno robusta, lo que permite adaptar el diseño de la nanopartícula al contexto clínico. Por ejemplo, la capacidad de modular la afinidad por el O2 permite el diseño de una nanopartícula con una mayor afinidad por el O2 adecuada para el tratamiento de la hipoxia a gran altitud, y el diseño de una nanopartícula con una afinidad por el O2 menor adecuada para el tratamiento de la hipoxia a nivel del mar.

Una nanopartícula puede comprender un efector alostérico o una combinación de más de un efector alostérico. Los ejemplos no limitantes de efectores alostéricos capaces de modular la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno incluyen 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG) (también conocido como ácido 2,3-bisfosfoglicérico o 2,3-BPG) o un isómero derivado del mismo, hexafosfato de inositol (IHP), piridoxal-fosfato (PLP) o ácido RSR-4, RSR-13(2-[4-[[(3,5-dimetilanilinocarbonil]metil]-fenoxi]-2-metilpropiónico), cuya estructura se representa a continuación.

La concentración de efector alostérico en una nanopartícula transportadora de oxígeno puede variar, y puede determinarse experimentalmente para optimizar la dinámica de unión y liberación de oxígeno de una nanopartícula como se describe en el presente documento. La concentración de 2,3-DPG se puede describir en términos de una relación molar respecto al agente transportador de oxígeno. La relación molar entre efector alostérico y agente transportador de oxígeno puede ser de aproximadamente 0,20, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,45, 0,50, 0,55, 0,60, 0,65, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 1,00, 1,05, 1,10, 1,15, 1,20, 1,25, 1,30, 1,35, 1,40, 1,45, 1,50, 1,55, 1,60, 1,65, 1.70, 1,75, 1,80, 1,85, 1,90, 1,95, 1,00, 1,05, 1,10, 1,15, 1,20, 1,25, 1,30, 1,35, 1,40, 1,45, 1,50, 1,55, 1,60, 1,65, 1.70, 1,75, 1,80, 1,85, 1,90, 1,95, 2,00, 2,05, 2,10, 2,15, 2,20, 2,25, 2,30, 2,35, 2,40, 2,45, 2,50, 2,55, 2,60, 2,65, 2.70, 2,75, 2,80, 2,85, 2,90, 2,95, 3,00, 3,05, 3,10, 3,15, 3,20, 3,25, 3,30, 3,35, 3,40, 3,45, 3,50, 3,55, 3,60, 3,65, 3.70, 3,75, 3,80, 3,85, 3,90, 3,95, 4,00, 4,05, 4,10, 4,15, 4,20, 4,25, 4,30, 4,35, 4,40, 4,45, 4,50, 4,55, 4,60, 4,65, 4.70, 4,75, 4,80, 4,85, 4,90, 4,95, 5,00, 5,05, 5,10, 5,15, 5,20, 5,25, 5,30, 5,35, 5,40, 5,45, 5,50, 5,55, 5,60, 5,65, 5.70, 5,75, 5,80, 5,85, 5,90, 5,95, 6,00, 6,05, 6,10, 6,15, 6,20, 6,25, 6,30, 6,35, 6,40, 6,45, 6,50, 6,55, 6,60, 6,65, 6.70, 6,75, 6,80, 6,85, 6,90, 6,95, 7,00, 7,05, 7,10, 7,15, 7,20, 7,25, 7,30, 7,35, 7,40, 7,45, 7,50, 7,55, 7,60, 7,65, 7.70, 7,75, 7,80, 7,85, 7,90, 7,95, 8,00, 8,05, 8,10, 8,15, 8,20, 8,25, 8,30, 8,35, 8,40, 8,45, 8,50, 8,55, 8,60, 8,65, 8.70, 8,75, 8,80, 8,85, 8,90, 8,95, 9,00, 9,05, 9,10, 9,15, 9,20, 9,25, 9,30, 9,35, 9,40, 9,45, 9,50, 9,55, 9,60, 9,65, 9.70, 9,75, 9,80, 9,85, 9,90, 9,95, o aproximadamente 10,00.

Preferentemente, un efector alostérico es 2,3-DPG. El 2,3-DPG puede modular la afinidad de un agente transportador de oxígeno por el oxígeno al aumentar la capacidad de respuesta de una nanopartícula transportadora de oxígeno al pH. El 2,3-DPG puede sintetizarse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, que incluye síntesis química o síntesis enzimática. Ver por ejemplo, Baer E. “A synthesis of 2,3-diphospho-d-glyceric aid”. J Biol Chem. 1950; 185:763-767; o Grisolia S, Joyce BK. “Enzymatic synthesis and isolation of 2,3-diphosphoglycerate”. J Biol Chem. 1958; 233:18-19. La síntesis se puede confirmar mediante EM y/o RMN.

[0054] La concentración de 2,3-DPG en una nanopartícula transportadora de oxígeno puede variar y se puede determinar experimentalmente para optimizar la dinámica de unión y liberación de oxígeno de una nanopartícula como se describe en el presente documento. Cuando un agente transportador de oxígeno es la hemoglobina, la concentración de 2,3-DPG puede ser de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 o aproximadamente 2 mg/mg de hemoglobina. Preferentemente, la concentración de 2,3-DPG puede ser de aproximadamente 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2 o aproximadamente 1,3 mg/mg de hemoglobina. Como alternativa, la concentración de 2,3-DPG se puede describir en términos de una relación molar respecto a la hemoglobina. Cuando un agente transportador de oxígeno es la hemoglobina, la relación molar entre 2,3-DPG y hemoglobina puede ser de aproximadamente 0,20, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,45, 0,50, 0,55, 0,60, 0,65, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 1,00, 1,05, 1,10, 1,15, 1,20, 1,25, 1,30, 1,35, 1,40, 1,45, 1,50, 1,55, 1,60, 1,65, 1,70, 1,75, 1.80, 1,85, 1,90, 1,95, 1,00, 1,05, 1,10, 1,15, 1,20, 1,25, 1,30, 1,35, 1,40, 1,45, 1,50, 1,55, 1,60, 1,65, 1,70, 1,75, 1.80, 1,85, 1,90, 1,95, 2,00, 2,05, 2,10, 2,15, 2,20, 2,25, 2,30, 2,35, 2,40, 2,45, 2,50, 2,55, 2,60, 2,65, 2,70, 2,75, 2.80, 2,85, 2,90, 2,95, 3,00, 3,05, 3,10, 3,15, 3,20, 3,25, 3,30, 3,35, 3,40, 3,45, 3,50, 3,55, 3,60, 3,65, 3,70, 3,75, 3.80, 3,85, 3,90, 3,95, 4,00, 4,05, 4,10, 4,15, 4,20, 4,25, 4,30, 4,35, 4,40, 4,45, 4,50, 4,55, 4,60, 4,65, 4,70, 4,75, 4 80, 4,85, 490, 495, 500, 5,05, 5, 10, 5, 15, 5,20, 525, 5,30, 5,35, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 5,70, 5,75 5 80, 5,85, 590, 595, 600, 6,05, 6, 10, 6, 15, 6,20, 625, 6,30, 6,35, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 6,70, 6,75 6 80, 6,85, 690, 695, 700, 7,05, 7, 10, 7, 15, 7,20, 725, 7,30, 7,35, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 7,70, 7,75 7 80, 7,85, 790, 795, 800, 8,05, 8, 10, 8, 15, 8,20, 825, 8,30, 8,35, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 8,70, 8,75 8 80, 8,85, 890, 895, 900, 9,05, 9, 10, 9, 15, 9,20, 925, 9,30, 9,35, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 9,70, 9,75 9,80, 9,85, 9,90, 9,95 o aproximadamente 10,00.

iii. agente reductor

Una nanopartícula de la divulgación comprende un agente reductor. Cuando un agente transportador de oxígeno es la hemoglobina, la hemoglobina puede oxidarse a metahemoglobina, en la que el hierro en el grupo hemo se encuentra en el estado Fe3+ (férrico), no en el estado Fe2+ (ferroso) de la hemoglobina normal. La oxidación de la hemoglobina en metahemoglobina reduce la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno y reduce la capacidad de transporte de oxígeno de las nanopartículas a lo largo del tiempo. Un agente reductor puede prevenir la oxidación de la hemoglobina, regenerar la hemoglobina oxidada o una combinación de ambos. Se contempla dentro del alcance de esta invención que un reductor pueda evitar la oxidación de cualquier agente transportador de oxígeno que comprenda hemo. Como tal, un agente reductor puede ser capaz de mantener y ampliar la funcionalidad de transporte de oxígeno de las nanopartículas durante un período de tiempo más largo, en comparación con cuando un agente reductor no está presente.

Una nanopartícula puede comprender un agente reductor o una combinación de más de un efector alostérico. Los ejemplos no limitantes de agentes reductores adecuados para regenerar la hemoglobina oxidada incluyen azul de leucometileno y derivados de los mismos, tales como azul de leucobencil metileno, así como glutatión y ascorbato. La concentración de un agente reductor puede ser suficiente para limitar las concentraciones de metahemoglobina en una nanopartícula a no más de aproximadamente 1 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 % o menos de la concentración total de hemoglobina en nanopartículas. Preferentemente, la concentración de un agente reductor es suficiente para limitar las concentraciones de metahemoglobina en una nanopartícula a no más de aproximadamente 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, o aproximadamente 15 % o menos de la concentración total de hemoglobina en nanopartículas. Cuando un agente transportador de oxígeno es la hemoglobina, la concentración de un agente reductor puede ser de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1.9 o aproximadamente 2 mg/mg de hemoglobina. Preferentemente, la concentración de un agente reductor puede ser de aproximadamente 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 o aproximadamente 0,8 mg/mg de hemoglobina. En otra alternativa, la concentración de agente reductor se puede describir en términos de una relación molar respecto a la hemoglobina. Cuando un agente transportador de oxígeno es la hemoglobina, la relación molar entre un agente reductor y la hemoglobina puede ser de aproximadamente 0,20, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,45, 0,50, 0,55, 0,60, 0,65, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,95, 1,00, 1.05, 1,10, 1,15, 1,20, 1,25, 1,30, 1,35, 1,40, 1,45, 1,50, 1,55, 1,60, 1,65, 1,70, 1,75, 1,80, 1,85, 1,90, 1,95, 1,00, 1.05, 1,10, 1,15, 1,20, 1,25, 1,30, 1,35, 1,40, 1,45, 1,50, 1,55, 1,60, 1,65, 1,70, 1,75, 1,80, 1,85, 1,90, 1,95, 2,00, 2.05, 2,10, 2,15, 2,20, 2,25, 2,30, 2,35, 2,40, 2,45, 2,50, 2,55, 2,60, 2,65, 2,70, 2,75, 2,80, 2,85, 2,90, 2,95, 3,00, 3.05, 3,10, 3,15, 3,20, 3,25, 3,30, 3,35, 3,40, 3,45, 3,50, 3,55, 3,60, 3,65, 3,70, 3,75, 3,80, 3,85, 3,90, 3,95, 4,00, 4.05, 4,10, 4,15, 4,20, 4,25, 4,30, 4,35, 4,40, 4,45, 4,50, 4,55, 4,60, 4,65, 4,70, 4,75, 4,80, 4,85, 4,90, 4,95, 5,00, 5.05, 5,10, 5,15, 5,20, 5,25, 5,30, 5,35, 5,40, 5,45, 5,50, 5,55, 5,60, 5,65, 5,70, 5,75, 5,80, 5,85, 5,90, 5,95, 6,00, 6.05, 6,10, 6,15, 6,20, 6,25, 6,30, 6,35, 6,40, 6,45, 6,50, 6,55, 6,60, 6,65, 6,70, 6,75, 6,80, 6,85, 6,90, 6,95, 7,00, 7.05, 7,10, 7,15, 7,20, 7,25, 7,30, 7,35, 7,40, 7,45, 7,50, 7,55, 7,60, 7,65, 7,70, 7,75, 7,80, 7,85, 7,90, 7,95, 8,00, 8.05, 8,10, 8,15, 8,20, 8,25, 8,30, 8,35, 8,40, 8,45, 8,50, 8,55, 8,60, 8,65, 8,70, 8,75, 8,80, 8,85, 8,90, 8,95, 9,00, 9.05, 9,10, 9,15, 9,20, 9,25, 9,30, 9,35, 9,40, 9,45, 9,50, 9,55, 9,60, 9,65, 9,70, 9,75, 9,80, 9,85, 9,90, 9,95, o aproximadamente 10,00.

iv. ajuste de las nanopartículas transportadoras de oxígeno

Una característica importante de una nanopartícula de la divulgación es la relación fisiológica entre la afinidad por el O2 de la partícula y la respiración tisular. Mientras que los sustitutos de la sangre convencionales conocidos en la técnica aumentan el contenido de O2 arterial, la liberación apropiada de O2 (es decir a lo largo de una curva de disociación de O2 fisiológica) por estos sustitutos de la sangre raramente se encuentra in vivo, debido a la falta de control alostérico normal de la afinidad Hb~O2 (expresada como p50, la pO2 a la cual la saturación de hemoglobina con O2 (SHb O2) es 50 %). La presente invención resuelve este problema con el diseño innovador de un reservorio lanzadera del efector alostérico. Para ilustrar cómo la estructura de la nanopartícula influye en su función, se considera una partícula que comprende hemoglobina como un ejemplo de agente transportador de oxígeno, 2,3-DPG como un ejemplo de efector alostérico y polietilenimina (PEI) como un ejemplo de polímero ramificado. La carga útil de las nanopartículas contiene una molécula efectora alostérica heterotrópica (2,3-DPG), que modifica la afinidad del O2 por la Hb; la concentración libre de 2,3-DPG en el núcleo de la partícula se modula mediante una unión sensible al pH a la capa interna de la nanopartícula, de modo que la 2,3-DPG queda secuestrada en la cubierta durante la perfusión pulmonar (a pH alto, aumentando así la afinidad HbO2 y facilitando la captura de O2) y 2,3-DPG se libera de la cubierta durante la perfusión sistémica (pH bajo, lo que reduce la afinidad HbO2 y facilita la liberación de O2). Este efecto se amplifica en entornos de necesidad fisiológica [con patología pulmonar, la hiperventilación aumenta el pH y aumenta la captura de O2; con hipoxia tisular, el metabolismo anaerobio reduce el pH y aumenta la liberación de O2]. A medida que se completa el tránsito circulatorio en el pulmón (o, a medida que disminuye la hipoxia) y aumenta el pH, el 2,3-DPG se volverá a asociar cada vez más con la cubierta, de modo que:1) se facilitará la carga de O2 en el pulmón y 2) vinculando la p50 a la falta de O2 en el tejido y su resolución. Este reservorio-lanzadera de efector alostérico fisiológicamente sensible diferencia de manera significativa las nanopartículas transportadoras de oxígeno de la divulgación de todos los diseños de HBOC. Además, el diseño de una nanopartícula transportadora de oxígeno de la divulgación permite que algunos aspectos de esta lanzadera sean refinados o “ajustados”, lo que proporciona la capacidad de adaptar el diseño de las nanopartículas al contexto clínico.

Las nanopartículas de la divulgación pueden ajustarse para imitar las características de transporte de oxígeno de los eritrocitos. Los expertos en la materia apreciarán que las características de transporte de oxígeno de los eritrocitos se pueden describir mediante la curva de disociación de oxígeno-hemoglobina de la hemoglobina. La curva de disociación de oxígeno-hemoglobina representa la saturación de oxígeno (sO2) frente a la presión parcial de oxígeno en la sangre (pO2), y describe la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno en condiciones fisiológicas de pO2, presión parcial de CO2 (pCO2), pH, temperatura y concentración de efectores alostéricos, entre otros factores. Como tal, las nanopartículas pueden ajustarse para imitar sustancialmente la curva de disociación de oxígeno-hemoglobina de la hemoglobina.

Las nanopartículas pueden ajustarse para generar nanopartículas con un 50 % de saturación del agente transportador de oxígeno (p50) de aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35 o aproximadamente 40 mmHg o más. Preferentemente, las nanopartículas transportadoras de oxígeno se ajustan para generar nanopartículas con p50 de aproximadamente 20 mmHg, 25 mmHg o aproximadamente 30 mmHg. También preferentemente, las nanopartículas transportadoras de oxígeno se ajustan para generar nanopartículas con p50 de aproximadamente 26 mmHg. Los procedimientos para ajustar la p50 de las nanopartículas pueden incluir ajustar la morfología de las nanopartículas para aumentar o disminuir el área superficial de las nanopartículas, ajustar la concentración de un agente transportador de oxígeno como la hemoglobina en una nanopartícula, ajustar la concentración de un agente reductor para limitar la oxidación de la hemoglobina en una nanopartícula, ajustando la cubierta externa de una nanopartícula para controlar la difusión de oxígeno hacia y desde las nanopartículas, o combinaciones de las mismas.

Las nanopartículas pueden ajustarse para mejorar la capacidad de respuesta de una nanopartícula que transporta oxígeno al pH. La capacidad de respuesta de la hemoglobina al pH, también llamada efecto Bohr, permite una unión del oxígeno más eficiente en el entorno de pH alto de los pulmones y una liberación más eficiente de oxígeno en el entorno de pH bajo del tejido desoxigenado. Los procedimientos para mejorar la capacidad de respuesta de una nanopartícula al pH pueden incluir ajustar la concentración de un efector alostérico de una nanopartícula. Tal efector alostérico puede ser 2,3-DPG.

Las nanopartículas pueden ajustarse para limitar la oxidación de la hemoglobina a metahemoglobina. Como se describió anteriormente, las nanopartículas pueden ajustarse para limitar las concentraciones de metahemoglobina en una nanopartícula a no más de aproximadamente 1 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 % o menos de la concentración total de hemoglobina en las nanopartículas. Preferentemente, las nanopartículas transportadoras de oxígeno están ajustadas para limitar las concentraciones de metahemoglobina en una nanopartícula a no más de aproximadamente 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 % o aproximadamente 15 % o menos de la concentración total de hemoglobina en nanopartículas. Los procedimientos para ajustar la oxidación de la hemoglobina pueden incluir ajustar la morfología de las nanopartículas para aumentar o disminuir el área superficial de las nanopartículas, ajustar la concentración de un agente reductor de una nanopartícula y combinaciones de las mismas. Preferentemente, la oxidación de la hemoglobina puede sintonizarse ajustando la concentración de un agente reductor tal como azul de leucometileno o azul de leucobencil metileno.

Las nanopartículas también pueden ajustarse para limitar la eliminación de NO. El NO es una molécula importante de señalización celular en mamíferos y está involucrada en muchos procesos fisiológicos y patológicos. Además, el NO es un potente vasodilatador. La hemoglobina se une al NO con una avidez similar a la avidez de unión de la hemoglobina al oxígeno. Si no se controla, un transportador de oxígeno a base de hemoglobina puede secuestrar NO y puede provocar vasoconstricción. Los procedimientos para ajustar nanopartículas transportadoras de oxígeno de la divulgación para limitar la eliminación de NO pueden incluir ajustar la morfología de las nanopartículas para aumentar o disminuir el área superficial de las nanopartículas expuestas al oxígeno y al NO, ajustar la cubierta externa de una nanopartícula para controlar la difusión de NO en las nanopartículas, ajustar el tamaño global de las partículas, ajustar la densidad de la carga útil o combinaciones de los mismos. Los expertos en la materia apreciarán que las nanopartículas pueden ajustarse para limitar la difusión de NO en una nanopartícula, pero permiten la difusión de oxígeno para el transporte de oxígeno. Por ejemplo, el grado de reticulación de la capa externa se puede variar para modular el grado y la tasa de secuestro de NO por la nanopartícula.

Los procedimientos para ajustar la cubierta de una nanopartícula pueden incluir el ajuste de las relaciones de los componentes, el ajuste de la reticulación de componentes de la cubierta y el ajuste de la pegilación de la cubierta de las nanopartículas. Los componentes de la cubierta, la reticulación de los componentes de la cubierta y la pegilación de la cubierta de las nanopartículas pueden ser como se ha descrito anteriormente. Preferentemente, la cubierta de una nanopartícula puede ajustarse aumentando o disminuyendo el grosor de la cubierta, aumentando o disminuyendo la hidrofobicidad o hidrofilicidad de la cubierta, y aumentando o disminuyendo el nivel de reticulación o pegilación de la cubierta. Se proporcionan detalles adicionales en los Ejemplos.

(g) realizaciones preferidas

En algunas realizaciones, una nanopartícula tiene una forma de disco sustancialmente bicóncavo, comprende un núcleo acuoso y una cubierta de dos capas que comprende un polímero anfífilo, y tiene una carga útil que comprende un agente transportador de oxígeno, un efector alostérico y un agente reductor. La carga útil está en el interior de la nanopartícula. El polímero anfífilo comprende un polímero que contiene aminas ramificadas con grupos reactivos y está unido a un lípido a través de los grupos reactivos, de modo que al menos aproximadamente el 25 % de los grupos reactivos libres están unidos a lípidos. Los grupos reactivos superficiales del polímero anfífilo que comprende la cubierta están reticulados con un enlazador bifuncional. El diámetro promedio de la nanopartícula puede ser de aproximadamente 130 nm a aproximadamente 300 nm, y la altura promedio de la nanopartícula es de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 80 nm. La nanopartícula puede comprender un orificio pasante o una depresión. El polímero ramificado puede ser un polímero ramificado de polietilenimina, un dendrímero PAMAM, un polímero de estrella o un polímero de injerto. El lípido puede ser ácido palmítico o ácido C24-pentacosadiinoico. La nanopartícula puede comprender de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 % (p/v) de moléculas de agente transportador de oxígeno. La relación entre agente transportador de oxígeno y efector alostérico y agente transportador de oxígeno y agente reductor puede seleccionarse independientemente entre el grupo que consiste en 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, y 10:1. El diseño de las nanopartículas permite la liberación efectiva de O2 durante la perfusión en presencia de las tensiones/gradientes de O2 que existen en las condiciones fisiológicas humanas normales/anormales (p.ej., la pO2 del tejido oscila de 40 a 5 Torr). La nanopartícula puede secuestrar no sustancialmente óxido nítrico. La nanopartícula puede limitar la oxidación del agente transportador de oxígeno a aproximadamente 10 % o menos de la concentración total de agente transportador de oxígeno en la nanopartícula.

En algunas realizaciones, una nanopartícula tiene una forma de disco sustancialmente bicóncavo, comprende un núcleo acuoso y una cubierta de dos capas que comprende un polímero anfífilo, y tiene una carga útil que comprende un agente transportador de oxígeno, un efector alostérico y un agente reductor. La carga útil está en el interior de la nanopartícula. El polímero anfífilo comprende un polímero que contiene aminas ramificadas con grupos reactivos y está unido a un lípido a través de los grupos reactivos, de manera que al menos aproximadamente 40 % de los grupos reactivos están unidos a lípidos. Los grupos reactivos superficiales del polímero anfífilo que comprende la cubierta están reticulados con un enlazador bifuncional. El diámetro promedio de la nanopartícula puede ser de aproximadamente 130 nm a aproximadamente 300 nm, y la altura promedio de la nanopartícula es de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 80 nm. La nanopartícula puede comprender un orificio pasante o una depresión. El polímero ramificado puede ser un polímero ramificado de polietilenimina, un dendrímero PAMAM, un polímero de estrella o un polímero de injerto. El lípido puede ser ácido palmítico o ácido C24-pentacosadiinoico. La nanopartícula puede comprender de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 % (p/v) de moléculas de agente transportador de oxígeno. La relación entre agente transportador de oxígeno y efector alostérico y agente transportador de oxígeno y agente reductor puede seleccionarse independientemente entre el grupo que consiste en 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, y 10:1. El diseño de las nanopartículas permite la liberación efectiva de O2 durante la perfusión en presencia de las tensiones/gradientes de O2 que existen en las condiciones fisiológicas humanas normales/anormales (p.ej., la pO2 del tejido oscila de 40 a 5 Torr). La nanopartícula puede secuestrar no sustancialmente óxido nítrico. La nanopartícula puede limitar la oxidación del agente transportador de oxígeno a aproximadamente 10 % o menos de la concentración total de agente transportador de oxígeno en la nanopartícula.

En algunas realizaciones, una nanopartícula tiene una forma de disco sustancialmente bicóncavo, comprende un núcleo acuoso y una cubierta de dos capas que comprende un polímero anfífilo, y tiene una carga útil que comprende un agente transportador de oxígeno, un efector alostérico y un agente reductor. La carga útil está en el interior de la nanopartícula. El polímero anfífilo comprende un polímero que contiene aminas ramificadas con grupos reactivos y está unido a un lípido a través de los grupos reactivos, de manera que al menos aproximadamente el 55 % de los grupos reactivos libres están unidos a lípidos. Los grupos reactivos superficiales del polímero anfífilo que comprende la cubierta están reticulados con un enlazador bifuncional. El diámetro promedio de la nanopartícula puede ser de aproximadamente 130 nm a aproximadamente 300 nm, y la altura promedio de la nanopartícula es de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 80 nm. La nanopartícula puede comprender un orificio pasante o una depresión. El polímero ramificado puede ser un polímero ramificado de polietilenimina, un dendrímero PAMAM, un polímero de estrella o un polímero de injerto. El lípido puede ser ácido palmítico o ácido C24-pentacosadiinoico. La nanopartícula puede comprender de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 % (p/v) de moléculas de agente transportador de oxígeno. La relación entre agente transportador de oxígeno y efector alostérico y agente transportador de oxígeno y agente reductor puede seleccionarse independientemente entre el grupo que consiste en 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, y 10:1. El diseño de nanopartículas permite la liberación efectiva de O2 durante la perfusión en presencia de las tensiones/gradientes de O2 que existen en las condiciones fisiológicas humanas normales/anormales (p.ej., la pO2 del tejido oscila de 40 a 5 Torr). La nanopartícula puede secuestrar no sustancialmente óxido nítrico. La nanopartícula puede limitar la oxidación del agente transportador de oxígeno a aproximadamente 10 % o menos de la concentración total de agente transportador de oxígeno en la nanopartícula.

En algunas realizaciones, una nanopartícula tiene una forma de disco sustancialmente bicóncavo, comprende un núcleo acuoso y una cubierta de dos capas que comprende un polímero anfífilo, y tiene una carga útil que comprende hemoglobina, 2,3-DPG y un agente reductor seleccionado del grupo que consiste en azul de leucometileno, ascorbato y glutatión. La carga útil está en el interior de la nanopartícula. El polímero anfífilo comprende un polímero que contiene aminas ramificadas con grupos reactivos y está unido a un lípido a través de los grupos reactivos, de modo que al menos aproximadamente el 25 % de los grupos reactivos libres están unidos a lípidos. Los grupos reactivos superficiales del polímero anfífilo que comprende la cubierta están reticulados con un enlazador bifuncional. El diámetro promedio de la nanopartícula puede ser de aproximadamente 130 nm a aproximadamente 300 nm, y la altura promedio de la nanopartícula es de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 80 nm. La nanopartícula puede comprender un orificio pasante o una depresión. El polímero ramificado puede ser un polímero ramificado de polietilenimina, un dendrímero PAMAM, un polímero de estrella o un polímero de injerto. El lípido puede ser ácido palmítico o ácido C24-pentacosadiinoico. La nanopartícula puede comprender de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 % (p/v) de moléculas de hemoglobina. La relación entre hemoglobina y efector alostérico y hemoglobina y agente reductor se puede seleccionar independientemente entre el grupo que consiste en 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 y 10:1. El diseño de las nanopartículas permite la liberación efectiva de O2 durante la perfusión en presencia de las tensiones/gradientes de O2 que existen en las condiciones fisiológicas humanas normales/anormales (p.ej., la pO2 del tejido oscila de 40 a 5 Torr). La nanopartícula puede secuestrar no sustancialmente óxido nítrico. La nanopartícula puede limitar la oxidación de la hemoglobina aproximadamente 10 % o menos de la concentración total de hemoglobina en la nanopartícula.

En algunas realizaciones, una nanopartícula tiene una forma de disco sustancialmente bicóncavo, comprende un núcleo acuoso y una cubierta de dos capas que comprende un polímero anfífilo, y tiene una carga útil que comprende hemoglobina, 2,3-DPG y un agente reductor seleccionado del grupo que consiste en azul de leucometileno, ascorbato y glutatión. La carga útil está en el interior de la nanopartícula. El polímero anfífilo comprende un polímero que contiene aminas ramificadas con grupos reactivos y está unido a un lípido a través de los grupos reactivos, de manera que al menos aproximadamente 40 % de los grupos reactivos están unidos a lípidos. Los grupos reactivos superficiales del polímero anfífilo que comprende la cubierta están reticulados con un enlazador bifuncional. El diámetro promedio de la nanopartícula puede ser de aproximadamente 130 nm a aproximadamente 300 nm, y la altura promedio de la nanopartícula es de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 80 nm. La nanopartícula puede comprender un orificio pasante o una depresión. El polímero ramificado puede ser un polímero ramificado de polietilenimina, un dendrímero PAMAM, un polímero de estrella o un polímero de injerto. El lípido puede ser ácido palmítico o ácido C24-pentacosadiinoico. La nanopartícula puede comprender de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 % (p/v) de moléculas de hemoglobina. La relación entre hemoglobina y efector alostérico y hemoglobina y agente reductor se puede seleccionar independientemente entre el grupo que consiste en 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 y 10:1. El diseño de las nanopartículas permite la liberación efectiva de O2 durante la perfusión en presencia de las tensiones/gradientes de O2 que existen en las condiciones fisiológicas humanas normales/anormales (p.ej., la pO2 del tejido oscila de 40 a 5 Torr). La nanopartícula puede secuestrar no sustancialmente óxido nítrico. La nanopartícula puede limitar la oxidación de la hemoglobina a aproximadamente 10 % o menos de la concentración total de hemoglobina en la nanopartícula.

En algunas realizaciones, una nanopartícula tiene una forma de disco sustancialmente bicóncavo, comprende un núcleo acuoso y una cubierta de dos capas que comprende un polímero anfífilo, y tiene una carga útil que comprende hemoglobina, 2,3-DPG y un agente reductor seleccionado del grupo que consiste en azul de leucometileno, ascorbato y glutatión. La carga útil está en el interior de la nanopartícula. El polímero anfífilo comprende un polímero que contiene aminas ramificadas con grupos reactivos y está unido a un lípido a través de los grupos reactivos, de manera que al menos aproximadamente el 55 % de los grupos reactivos libres están unidos a lípidos. Los grupos reactivos superficiales del polímero anfífilo que comprende la cubierta están reticulados con un enlazador bifuncional. El diámetro promedio de la nanopartícula puede ser de aproximadamente 130 nm a aproximadamente 300 nm, y la altura promedio de la nanopartícula es de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 80 nm. La nanopartícula puede comprender un orificio pasante o una depresión. El polímero ramificado puede ser un polímero ramificado de polietilenimina, un dendrímero PAMAM, un polímero de estrella o un polímero de injerto. El lípido puede ser ácido palmítico o ácido C24-pentacosadiinoico. La nanopartícula puede comprender de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 % (p/v) de moléculas de hemoglobina. La relación entre hemoglobina y efector alostérico y hemoglobina y agente reductor se puede seleccionar independientemente entre el grupo que consiste en 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 y 10:1. El diseño de las nanopartículas permite la liberación efectiva de O2 durante la perfusión en presencia de las tensiones/gradientes de O2 que existen en las condiciones fisiológicas humanas normales/anormales (p.ej., la pO2 del tejido oscila de 40 a 5 Torr). La nanopartícula puede secuestrar no sustancialmente óxido nítrico. La nanopartícula puede limitar la oxidación de la hemoglobina a aproximadamente 10 % o menos de la concentración total de hemoglobina en la nanopartícula.

En algunas realizaciones, una nanopartícula tiene una forma de disco sustancialmente bicóncavo, comprende un núcleo acuoso y una cubierta de dos capas que comprende un polímero anfífilo, y tiene una carga útil que comprende hemoglobina, 2,3-DPG y un agente reductor seleccionado del grupo que consiste en azul de leucometileno, ascorbato y glutatión. La carga útil está en el interior de la nanopartícula. El polímero anfífilo comprende PEI y está unido a un lípido a través de los grupos reactivos, de manera que al menos aproximadamente 40 % de las aminas primarias libres están unidas a lípidos. Los grupos reactivos superficiales del polímero anfífilo que comprende la cubierta están reticulados con un enlazador bifuncional. El diámetro promedio de la nanopartícula puede ser de aproximadamente 130 nm a aproximadamente 300 nm, y la altura promedio de la nanopartícula es de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 80 nm. La nanopartícula puede comprender un orificio pasante o una depresión. El PEI puede tener un PM de 10 kDa a aproximadamente 100 kDa o más. El lípido puede ser ácido palmítico o ácido C24-pentacosadiinoico. La nanopartícula puede comprender de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 % (p/v) de moléculas de hemoglobina. La relación entre hemoglobina y efector alostérico y hemoglobina y agente reductor se puede seleccionar independientemente entre el grupo que consiste en 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 y 10:1. El diseño de las nanopartículas permite la liberación efectiva de O2 durante la perfusión en presencia de las tensiones/gradientes de O2 que existen en las condiciones fisiológicas humanas normales/anormales (p.ej., la pO2 del tejido oscila de 40 a 5 Torr). La nanopartícula puede secuestrar no sustancialmente óxido nítrico. La nanopartícula puede limitar la oxidación de la hemoglobina a aproximadamente 10 % o menos de la concentración total de hemoglobina en la nanopartícula.

En algunas realizaciones, una nanopartícula tiene una forma de disco sustancialmente bicóncavo, comprende un núcleo acuoso y una cubierta de dos capas que comprende un polímero anfífilo, y tiene una carga útil que comprende hemoglobina, 2,3-DPG y un agente reductor seleccionado del grupo que consiste en azul de leucometileno, ascorbato y glutatión. La carga útil está en el interior de la nanopartícula. El polímero anfífilo comprende PEI y está unido a un lípido a través de los grupos reactivos, de manera que al menos aproximadamente 50 % de las aminas primarias libres están unidas a lípidos. Los grupos reactivos superficiales del polímero anfífilo que comprende la cubierta están reticulados con un enlazador bifuncional. El diámetro promedio de la nanopartícula puede ser de aproximadamente 130 nm a aproximadamente 300 nm, y la altura promedio de la nanopartícula es de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 80 nm. La nanopartícula puede comprender un orificio pasante o una depresión. El PEI puede tener un PM de 10 kDa a aproximadamente 100 kDa o más. El lípido puede ser ácido palmítico o ácido C24-pentacosadiinoico. La nanopartícula puede comprender de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 % (p/v) de moléculas de hemoglobina. La relación entre hemoglobina y efector alostérico y hemoglobina y agente reductor se puede seleccionar independientemente entre el grupo que consiste en 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 y 10:1. El diseño de las nanopartículas permite la liberación efectiva de O2 durante la perfusión en presencia de las tensiones/gradientes de O2 que existen en las condiciones fisiológicas humanas normales/anormales (p.ej., la pO2 del tejido oscila de 40 a 5 Torr). La nanopartícula puede secuestrar no sustancialmente óxido nítrico. La nanopartícula puede limitar la oxidación de la hemoglobina a aproximadamente 10 % o menos de la concentración total de hemoglobina en la nanopartícula.

En algunas realizaciones, una nanopartícula tiene una forma de disco sustancialmente bicóncavo, comprende un núcleo acuoso y una cubierta de dos capas que comprende un polímero anfífilo, y tiene una carga útil que comprende hemoglobina, 2,3-DPG y un agente reductor seleccionado del grupo que consiste en azul de leucometileno, ascorbato y glutatión. La carga útil está en el interior de la nanopartícula. El polímero anfífilo comprende PEI y está unido a un lípido a través de los grupos reactivos, de manera que al menos aproximadamente 55 % de las aminas primarias libres están unidas a lípidos. Los grupos reactivos superficiales del polímero anfífilo que comprende la cubierta están reticulados con un enlazador bifuncional. El diámetro promedio de la nanopartícula puede ser de aproximadamente 130 nm a aproximadamente 300 nm, y la altura promedio de la nanopartícula es de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 80 nm. La nanopartícula puede comprender un orificio pasante o una depresión. El PEI puede tener un PM de 10 kDa a aproximadamente 100 kDa o más. El lípido puede ser ácido palmítico o ácido C24-pentacosadiinoico. La nanopartícula puede comprender de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 % (p/v) de moléculas de hemoglobina. La relación entre hemoglobina y efector alostérico y hemoglobina y agente reductor se puede seleccionar independientemente entre el grupo que consiste en 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 y 10:1. El diseño de las nanopartículas permite la liberación efectiva de O2 durante la perfusión en presencia de las tensiones/gradientes de O2 que existen en las condiciones fisiológicas humanas normales/anormales (p.ej., la pO2 del tejido oscila de 40 a 5 Torr). La nanopartícula puede secuestrar no sustancialmente óxido nítrico. La nanopartícula puede limitar la oxidación de la hemoglobina a aproximadamente 10 % o menos de la concentración total de hemoglobina en la nanopartícula.

II. PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN DE NANOPARTÍCULAS QUE TRANSPORTAN OXÍGENO

Otro aspecto de la presente divulgación es un procedimiento para la preparación de una población de nanopartículas en forma de disco, sustancialmente bicóncavo, autoensambladas de acuerdo con la invención. En términos generales, un procedimiento comprende formar un polímero anfífilo; formar en un disolvente no polar una pluralidad de micelas invertidas que comprenden el polímero anfífilo; suspender una carga útil que comprende un agente transportador de oxígeno, un efector alostérico y un agente reductor en un disolvente polar y transferir la carga útil a la capa orgánica que comprende las micelas invertidas por agitación; y autoensamblaje de las micelas invertidas en nanopartículas en forma de disco sustancialmente bicóncavo. La nanopartícula puede estar pegilada. En otra alternativa, la nanopartícula puede estar reticulada. En otra alternativa más, la nanopartícula puede estar pegilada y reticulada.

(a) formación de un polímero anfífilo

Un procedimiento para la preparación de una partícula de la divulgación comprende, en parte, formar un polímero anfífilo. En términos generales, un procedimiento comprende modificar hidrófobamente un polímero ramificado conjugando covalentemente un lípido anfífilo al polímero ramificado. Los polímeros ramificados adecuados y los lípidos anfífilos se detallan en Sección I anterior. Como se describió anteriormente, los polímeros ramificados comprenden grupos reactivos libres. Los grupos reactivos libres pueden ser grupos amina.

En términos generales, al menos el 25 % de los grupos reactivos libres del polímero están unidos a lípidos anfífilos.

Por ejemplo, aproximadamente 25 % a aproximadamente 55 % de los grupos reactivos libres de un polímero están unidos a lípidos, aproximadamente 30 % a aproximadamente 55 % de los grupos reactivos libres de un polímero están unidos a lípidos, aproximadamente 35 % a aproximadamente 55 % de grupos reactivos libres de un polímero están unidos a lípidos, aproximadamente 40 % a aproximadamente 55 % de los grupos reactivos libres de un polímero están unidos a lípidos, aproximadamente 45 % a aproximadamente 60 % de los grupos reactivos libres de un polímero están unidos a lípidos, aproximadamente 50 % a aproximadamente 65 % de los grupos reactivos libres de un polímero están unidos a lípidos, aproximadamente 55 % a aproximadamente 70 % de los grupos reactivos libres de un polímero están unidos a lípidos, aproximadamente 60 % a aproximadamente 75 % de grupos reactivos libres de un polímero están unidos a lípidos, aproximadamente 65 % a aproximadamente 80 % de los grupos reactivos libres de un polímero están unidos a lípidos, aproximadamente 70 % a aproximadamente 85 % de los grupos reactivos libres de un polímero están unidos a lípidos, aproximadamente 75 % a aproximadamente 90 % de grupos reactivos libres de un polímero están unidos a lípidos, aproximadamente 80 % a aproximadamente 95 % de los grupos reactivos libres de un polímero están unidos a lípidos, aproximadamente 85 % a aproximadamente 100 % de los grupos reactivos libres de un polímero están unidos a lípidos. En otra alternativa, aproximadamente 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 o más de los grupos reactivos libres de un polímero están unidos a lípidos. La relación molar entre polímero y lípido es generalmente de aproximadamente 1:0,4 a aproximadamente 1:0,8. En general, la relación molar entre polímero y lípido puede ser de aproximadamente 1:0,4, 1:0,45, 1:0,5, 1:0,55, 1:0,6, 1:0,65, 1:0,7, 1:0,75 o 1:0,8.

Los procedimientos para conjugar covalentemente un lípido a un polímero se conocen en la técnica y se detallan en los ejemplos. Brevemente, un grupo activo de un polímero forma un enlace covalente con un grupo activo de un lípido. Los grupos activos poliméricos adecuados se detallan más arriba. Un lípido puede comprender un grupo activo adecuado para formar un enlace con un grupo activo polimérico (es decir, conjugación directa), o puede tratarse con un enlazador para proporcionar un grupo activo adecuado (es decir, conjugación indirecta). Los ejemplos no limitantes de grupos activos pueden incluir epóxidos, carboxilatos, oxiranos, ésteres de N-hidroxisuccinimida, aldehídos, hidrazinas, maleimidas, mercaptanos, grupos amino, haluros de alquilo, isotiocianatos, carbodiimidas, compuestos diazo, cloruro de tresilo, cloruro de tosilo, propargilo, azida y tricloro S-triazina. En general, los grupos reactivos pueden ser grupos fotorreactivos, que cuando se ponen en contacto con la luz pueden activarse y pueden unirse covalentemente a los grupos reactivos del polímero. Los ejemplos de grupos fotorreactivos pueden incluir aril azidas, diazarenos, beta-carbonildiazo y benzofenonas. Las especies reactivas son nitrenos, carbenos y radicales. Estas especies reactivas generalmente son capaces de formar enlaces covalentes.

Preferentemente, los grupos reactivos son carboxilo y amina.

(b) formación de una pluralidad de micelas invertidas

Un procedimiento para la preparación de una nanopartícula comprende además, en parte, formar una pluralidad de micelas invertidas. En términos generales, las micelas invertidas unimoleculares (es decir, micelas invertidas) se forman agitando una mezcla de un polímero anfífilo de la Sección II(a) anterior con un disolvente no polar.

Generalmente, la concentración de polímero anfífilo en un disolvente no polar es de aproximadamente 10-7 a aproximadamente 10-5 M. En general, la concentración de polímero anfífilo es de aproximadamente 10-6 M.

El disolvente no polar puede ser orgánico. Los ejemplos no limitantes de disolventes no polares pueden incluir acetona, acetato de metilo, acetato de etilo, hexano, benceno, tolueno, dietil éter, diclorometano y cloroformo. Un ejemplo de disolvente puede ser cloroformo o diclorometano.

Una mezcla puede agitarse mediante inversión física, agitación vorticial, mezcla, agitación, sonicación, agitación u otros medios similares. Generalmente, una mezcla puede agitarse durante aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 10 minutos, aunque pueden ser posibles tiempos de agitación más largos. Una mezcla puede agitarse durante aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 minutos o más. En términos generales, la agitación se realiza de aproximadamente 4 °C a aproximadamente la temperatura ambiente.

(c) transferencia de la carga útil en la capa orgánica que comprende las micelas invertidas

Una nanopartícula comprende una carga útil, comprendiendo la carga útil un agente transportador de oxígeno, un efector alostérico y un agente reductor. Un agente transportador de oxígeno, un efector alostérico y un agente reductor pueden ser como se describe en la Sección I(f) anterior. Se mezcla una carga útil con un disolvente acuoso y la mezcla se añade a la mezcla de disolventes no polares de las micelas invertidas dando como resultado una mezcla bifásica. La mezcla bifásica se deja sedimentar, si es necesario, y luego la carga útil se transfiere a la capa orgánica que comprende las micelas invertidas mediante agitación. Generalmente, solo se requiere agitación mínima, y la inversión física y/o movimientos circulares o agitación es suficiente para transferir un agente transportador de oxígeno, un efector alostérico y un agente reductor al interior de las micelas inversas. La agitación también puede ser por mezcla de alto cizallamiento. Los ejemplos no limitantes de mezcla de alto cizallamiento pueden incluir microfluidización, sonicación, homogeneización o mezcla relacionada. Un disolvente acuoso puede ser el disolvente polar descrito en la Sección II(d).

(d) autoensamblaje de una nanopartícula en forma de disco bicóncavo

Después de la formación de una pluralidad de micelas invertidas que comprenden la carga útil en la Sección II(c) anterior, un procedimiento de la divulgación comprende el autoensamblaje de micelas invertidas en una nanopartícula en forma de disco sustancialmente bicóncavo. En términos generales, un procedimiento comprende agitar micelas invertidas en presencia de calor y un sistema disolvente.

La temperatura durante la agitación dicta, en parte, el tamaño de las nanopartículas resultantes. Generalmente, a medida que aumenta la temperatura, aumenta el tamaño de las nanopartículas. La temperatura durante la agitación puede variar de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 65 °C. Por ejemplo, la temperatura puede ser de aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 o 65 °C.

Una mezcla puede agitarse por medios físicos o acústicos. Por ejemplo, una mezcla puede agitarse mediante inversión física, agitación vorticial, mezcla, agitación, sonicación u otros medios similares. Preferentemente, una mezcla se puede agitar mediante mezcla de alto cizallamiento. Generalmente, las micelas invertidas se agitan durante aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 90 minutos, durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 60 minutos, o durante aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o 70 minutos. Las micelas invertidas generalmente se agitan, con calor, en presencia de un sistema disolvente. Un sistema disolvente comprende tanto un disolvente polar como un disolvente no polar. Por ejemplo, un disolvente polar es un disolvente acuoso y un disolvente no polar es un disolvente orgánico. A modo de ejemplo, un disolvente no polar puede ser el disolvente no polar utilizado en la Sección II(b) anterior, y se puede añadir un disolvente acuoso, con breve agitación, al disolvente no polar. Para lograr una relación apropiada entre un disolvente polar y no polar, se puede evaporar un disolvente no polar de la mezcla. La relación en peso entre un disolvente polar y no polar puede ser de aproximadamente 1:5. Un ejemplo de disolvente polar puede ser metanol y un ejemplo de disolvente no polar ejemplar puede ser cloroformo.

Para lograr una relación apropiada entre un disolvente polar y no polar, el disolvente no polar se puede evaporar de la mezcla. La evaporación puede realizarse a presión reducida. En términos generales, la presión seleccionada dependerá, en parte, del disolvente no polar. La presión reducida puede estar entre aproximadamente 350 mbar y 1000 mbar, o aproximadamente 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 o 950 mbar. Cuando un disolvente no polar es cloroformo, la presión reducida puede estar entre aproximadamente 400 y aproximadamente 500 mbar. Por ejemplo, la presión reducida puede estar entre aproximadamente 400 mbar y aproximadamente 450 mbar, o entre aproximadamente 420 mbar y aproximadamente 440 mbar.

(e) reticulación

Después del autoensamblaje de una nanopartícula, la cubierta puede estar reticulada. Como se detalla anteriormente, la reticulación se puede usar para alterar la tasa de liberación de oxígeno y moléculas terapéuticas. En otra alternativa, la reticulación se puede usar para aumentar la estabilidad de una nanopartícula. Las partículas pueden estar reticuladas en la superficie de la cubierta externa, o pueden estar reticuladas dentro de la cubierta externa. La reticulación puede ser reticulación química o reticulación fotoquímica. Los procedimientos de reticulación son conocidos en la técnica. Brevemente, los reticulantes adecuados reaccionarán con uno o más grupos activos del polímero anfífilo. Los reticulantes pueden ser homobifuncionales o heterobifuncionales. Los reticulantes pueden ser reticulantes químicos o reticulantes no químicos. Los reticulantes químicos adecuados pueden incluir glutaraldehído, espaciadores de ácido biscarboxílico o ésteres activos de ácido biscarboxílico. La reticulación fotoquímica puede lograrse mediante reticulación uv de enlaces polidiacetilínicos. Un experto en la materia reconocerá que un reticulante adecuado puede variar y variará dependiendo de la composición de una nanopartícula y el uso previsto.

(f) pegilación

Una partícula de la divulgación puede estar pegilada. Como se usa en el presente documento, “pegilación” se refiere a la adición de polietilenglicol a la cubierta externa. Los procedimientos de pegilación se conocen comúnmente en la técnica y se detallan en los ejemplos. La pegilación puede usarse para disminuir la carga de la superficie zeta de la nanopartícula. Dicho de otra manera, la pegilación puede usarse para impartir una superficie casi neutra de una nanopartícula. La pegilación puede usarse para alterar la circulación in vivo de una nanopartícula.

(g) esterilización y liofilización

La esterilidad de las composiciones de nanopartículas es importante para las aplicaciones in vivo. La esterilización se puede llevar a cabo a través de cualquier procedimiento conocido en la técnica, siempre que el procedimiento no afecte materialmente la estabilidad de las partículas y/o a la unión/liberación de O2. Por ejemplo, las composiciones o soluciones de nanopartículas se pueden esterilizar por filtración a través de membranas con un tamaño de poro de 0,22 |jm o menos. Los ejemplos no limitantes de membranas adecuadas incluyen politetrafluoroetileno hidrófobo, Durapore® hidrófilo (fluoruro de polivinilideno) y polietersulfona. La eficacia de la filtración puede determinarse para cada membrana comparando los volúmenes aplicados y recuperados, el tamaño de partícula y/o el potencial zeta. Las alícuotas de las nanopartículas en la suspensión tamponada se pueden secar hasta obtener un polvo y sellar bajo un gas inerte como el polvo liofilizado con o sin un crioprotector. Preferentemente, las suspensiones de alícuotas se liofilizan, aunque se pueden usar otros procedimientos conocidos en la técnica. Los gases inertes adecuados son conocidos en la técnica y pueden incluir, pero sin limitarse a, argón. De forma similar, los citoprotectores adecuados son conocidos en la técnica y pueden incluir, pero sin limitarse a, sorbitol. Las alícuotas reconstituidas se pueden evaluar para determinar el tamaño de partícula alterado, el potencial zeta, el pH, la viscosidad, la esterilidad y/o la disociación de O2 como se describe en el presente documento. Las condiciones de almacenamiento, fechas de caducidad y especificaciones de liberación aceptadas reflejarán menos de 20 %, más preferentemente menos de 15 %, incluso más preferentemente menos de 10 % de cambio respecto a las propiedades de referencia. El polvo liofilizado se puede reconstituir de una manera que se adapte para el uso previsto, y/o el estado del volumen de sangre circulante del paciente. Por ejemplo, una composición sustituta de la sangre que comprende una nanopartícula de la divulgación se puede componer de una manera más concentrada para administrar a pacientes normovolémicos con anemia o de una manera más diluida para administrar a pacientes hipovolémicos con hemorragia.

III. COMPOSICIONES DE SUSTITUTO DE LA SANGRE QUE COMPRENDEN NANOPARTÍCULAS

Un aspecto adicional de la divulgación abarca composiciones sustitutas de la sangre que comprenden nanopartículas de la divulgación. Generalmente, las nanopartículas se formulan como una composición para su uso como un sustituto de la sangre para su uso in vivo, in vitro, in situ o ex vivo.

Las nanopartículas sustitutivas de la sangre pueden formularse mezclando nanopartículas con excipientes opcionales y un diluyente adecuado. La concentración de nanopartículas en el diluyente puede variar de acuerdo con la aplicación. Preferentemente, la concentración de nanopartículas puede ser de aproximadamente 4x1012 -6x1012 nanopartículas/ml.

Una composición que comprende una pluralidad de nanopartículas puede ser un polvo seco tal como una composición liofilizada que comprende nanopartículas. En otra alternativa, una composición que comprende una pluralidad de nanopartículas puede ser una solución, una mezcla o una suspensión. Un ejemplo no limitante de una suspensión es un coloide. En términos generales, un coloide es una suspensión de partículas finas que no sedimentan fácilmente de la suspensión. Se puede formar un polvo seco de nanopartículas de acuerdo con técnicas conocidas tales como secado por congelación o liofilización. Un polvo seco que comprende nanopartículas puede reconstituirse a continuación mezclando con una solución acuosa para producir un sustituto de la sangre líquido. La composición puede formularse y administrarse a un sujeto por diferentes medios que complementarán la capacidad de transporte de oxígeno de la sangre de un sujeto. Tales composiciones se pueden administrar generalmente por vía intravascular en formulaciones de unidades de dosificación que contienen transportadores, adyuvantes, excipientes y vehículos farmacéuticamente aceptables no tóxicos convencionales según se desee. Las preparaciones inyectables, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles, se pueden formular de acuerdo con la técnica conocida usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están el agua, la solución de Ringer, las soluciones de lactato Ringer y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, los aceites fijos estériles se emplean convencionalmente como un disolvente o medio de suspensión. Para este fin, se puede emplear cualquier aceite fijo insípido, incluidos mono o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como el ácido oleico son útiles en la preparación de inyectables. Se pueden usar dimetilacetamida, tensioactivos que incluyen detergentes iónicos y no iónicos y polietilenglicoles. Las mezclas de disolventes y agentes humectantes tales como los descritos anteriormente también son útiles.

IV. PROCEDIMIENTOS DE USO DE NANOPARTÍCULAS TRANSPORTADORAS DE OXÍGENO

Otro aspecto de la divulgación abarca procedimientos para usar las nanopartículas transportadoras de oxígeno con forma bicóncava de la divulgación. En esencia, las nanopartículas transportadoras de oxígeno son capaces de suministrar oxígeno. Como tal, las nanopartículas transportadoras de oxígeno se pueden usar para suministrar oxígeno a un sujeto que necesita una restauración rápida de los niveles de O2 o un aumento del nivel de O2, o cuando está clínicamente indicado un reemplazo de los niveles de O2. Las nanopartículas transportadoras de oxígeno pueden usarse para complementar la capacidad de transporte de oxígeno de la sangre de un sujeto, para tratar a un sujeto que necesita sangre o para realizar una transfusión de sangre en un paciente. Por lo general, las nanopartículas se formulan como una composición para su uso in vivo, in vitro, in situ o ex vivo como se describe en la Sección III anterior.

Se puede administrar una composición de nanopartículas a un sujeto para administrar oxígeno a un tejido biológico. Los sujetos adecuados incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, anfibios, reptiles, aves y peces. Los mamíferos adecuados incluyen, pero no se limitan a, seres humanos, caballos, gatos y perros.

El tejido biológico, como se usa en el presente documento, puede referirse a células, órganos, tumores o material asociado con células, órganos o tumores, tales como coágulos de sangre. Los tejidos adecuados pueden incluir, entre otros, corazón, pulmones, cerebro, ojo, estómago, bazo, huesos, páncreas, vesícula biliar, riñones, hígado, intestinos, piel, útero, vejiga, ojos, ganglios linfáticos, vasos sanguíneos, y sangre y componentes linfáticos.

Los numerosos contextos en los cuales se puede aplicar el suministro de oxígeno usando nanopartículas transportadoras de oxígeno de la divulgación incluyen las siguientes:

Traumatismo. Una pérdida aguda de sangre completa puede dar como resultado un cambio de fluido desde los espacios intersticiales e intracelulares para reemplazar el volumen perdido de sangre mientras se desvía la sangre de los órganos de baja prioridad, incluida la piel y el intestino. La derivación de sangre lejos de los órganos reduce y a veces elimina los niveles de O2 en estos órganos y tiene como resultado la muerte progresiva del tejido.

Isquemia. En la isquemia, un órgano (u órganos) particulares son “privados de oxígeno”. Pequeñas secciones del órgano, conocidas como infartos, comienzan a morir como resultado de la falta de O2. La restauración rápida de los niveles de O2 es crítica para detener la formación del infarto en los tejidos críticos. Las afecciones que producen isquemia incluyen infarto de miocardio, accidente cerebrovascular o traumatismo cerebrovascular. Hemodilución: En esta aplicación clínica, se requiere un sustituto de la sangre para reemplazar la sangre que se extrae preoperatoriamente. Se contempla que se produzca la extracción de sangre del paciente para evitar el requisito de transfusiones alogénicas postoperatoriamente. En esta aplicación, el sustituto de la sangre se administra para reemplazar (o sustituir) los niveles de O2 de la sangre autóloga extraída. Esto permite el uso de la sangre autóloga extraída para las transfusiones necesarias durante y después de la cirugía. Una de esas cirugías que requieren extracción de sangre preoperatoria sería un procedimiento de derivación cardiopulmonar. Choque séptico. En la sepsis generalizada, algunos pacientes pueden volverse hipertensos a pesar de la fluidoterapia masiva y el tratamiento con agentes vasocontrictores. En este caso, la sobreproducción de óxido nítrico (NO) da como resultado la disminución de la presión sanguínea. Por lo tanto, la hemoglobina es un agente ideal para el tratamiento de estos pacientes porque la hemoglobina se une al NO con una avidez similar a la del O2.

Cáncer. El suministro de O2 al núcleo interno hipóxico de una masa tumoral aumenta su sensibilidad a la radioterapia y la quimioterapia. Debido a que la microvasculatura de un tumor es diferente a la de otros tejidos, la sensibilización a través del aumento de los niveles de O2 requiere la descarga de O2 dentro del núcleo hipóxico. En otras palabras, la p50 debe ser muy baja para evitar la descarga temprana del O2, aumentando los niveles de O2, para asegurar la sensibilización óptima del tumor a los tratamientos posteriores de radiación y quimioterapia. Anemia crónica. En estos pacientes, la sustitución de la hemoglobina perdida o metabolizada está comprometida o está completamente ausente. Se contempla que el sustituto de la sangre reemplace o aumente efectivamente los niveles de O2 en el paciente.

Anemia de células falciformes. En la anemia de células falciformes, el paciente se ve debilitado por una pérdida de los niveles de O2 que se produce durante el proceso de desarrollo de la anemia falciforme, así como por una tasa de recambio de eritrocitos muy alta. El proceso de desarrollo de la anemia falciforme es una función de la pO2 donde cuanto menor es la pO2, mayor es la tasa de desarrollo falciforme. Se contempla que el sustituto de la sangre ideal restaure los niveles de O2 del paciente hasta un rango normal durante una crisis falciforme.

Cardioplegia. En ciertos procedimientos quirúrgicos cardíacos, el corazón se detiene mediante soluciones apropiadas de electrolitos y se reduce la temperatura del paciente. La reducción de la temperatura reducirá significativamente la p50, impidiendo posiblemente la descarga de O2 en cualquier condición fisiológica ordinaria. La sustitución de los niveles de O2 niveles se contempla como potencialmente reductora del daño tisular y la muerte durante dichos procedimientos.

Hipoxia. Los soldados, los habitantes que viven a gran altitud y los atletas de clase mundial en condiciones extremas pueden sufrir una reducción de los niveles de O2 porque la extracción de O2 del aire en el pulmón es limitada. La extracción limitada de O2 limita aún más el transporte de O2. Se contempla que un sustituto de la sangre pueda reemplazar o aumentar los niveles de O2 en tales individuos.

Perfusión orgánica. Durante el tiempo que se mantiene un órgano ex vivo, el mantenimiento del contenido de O2 es esencial para preservar la integridad estructural y celular y minimizar la formación de infarto. Se contempla que un sustituto de la sangre pueda soportar los requisitos de O2 para dicho órgano.

Cultivo de células. Este requisito es prácticamente idéntico al de la perfusión de órganos, excepto que la tasa de consumo de O2 puede ser mayor.

Hematopoyesis. Se contempla que el sustituto de la sangre sirva como fuente de hemo y hierro para su uso en la síntesis de nueva hemoglobina durante la hematopoyesis.

La presente divulgación también se puede usar en personas no humanas. Los procedimientos y composiciones de la presente divulgación se pueden usar con animales domésticos, como ganado y animales de compañía (por ejemplo, perros, gatos, caballos, aves, reptiles), así como con otros animales en acuarios, zoológicos, oceanarios y otras instalaciones que albergan animales. Se contempla que la presente divulgación tenga utilidad en el tratamiento de emergencia de animales domésticos y salvajes que sufren una pérdida de sangre debido a lesiones, anemias hemolíticas, etc. Por ejemplo, se contempla que las realizaciones de la presente divulgación sean útiles en condiciones tales como anemia infecciosa equina, anemia infecciosa felina, anemia hemolítica debido a productos químicos y otros agentes físicos, infección bacteriana, fragmentación del factor IV, hiperesplenismo y esplenomegalia, síndrome hemorrágico en aves de corral, anemia hipoplásica, anemia aplásica, afecciones hemolíticas inmunitarias idiopáticas, deficiencia de hierro, anemia hemolítica isoinmunitaria, anemia hemolítica microangiopática, parasitismo, etc. En particular, la presente divulgación se puede utilizar en áreas donde son difíciles de encontrar donantes de sangre para animales de especies raras y/o exóticas.

DEFINICIONES

Como se usa en el presente documento, el término “efector alostérico” se refiere a una molécula que modula la velocidad o cantidad de oxígeno que se une o libera de un transportador de oxígeno.

La frase “exterior de una nanopartícula”, como se usa en el presente documento, se refiere a la capa externa de la cubierta de nanopartículas y a cualquier componente o componentes unidos covalentemente o no covalentemente a la capa externa de la cubierta de nanopartículas, o a cualquier componente o componentes dentro la capa externa de la capa de nanopartículas. Por ejemplo, el exterior de una nanopartícula también puede comprender una molécula opcional.

El término “hemoglobina” se usa en el presente documento para referirse en general a una proteína que puede estar contenida dentro de un glóbulo rojo que transporta oxígeno. Cada molécula de hemoglobina tiene 4 subunidades, 2 cadenas a y 2 cadenas p, que están dispuestas en una estructura tetramérica. Cada subunidad también contiene también un grupo hemo, que es el centro que contiene hierro que se une al oxígeno. Por lo tanto, cada molécula de hemoglobina puede unir 4 moléculas de oxígeno. “Hemoglobina” se refiere a hemoglobina de origen natural o sintética. La hemoglobina puede aislarse y purificarse de un ser humano o de un animal, o puede producirse mediante síntesis química y técnicas recombinantes.

La expresión “hemoglobina libre de estroma”, como se usa en el presente documento, se refiere a la hemoglobina a partir de la cual se han eliminado todas las membranas de los eritrocitos.

La expresión “parámetros hemodinámicos”, como se usa en el presente documento, se refiere en sentido amplio a mediciones indicativas de presión sanguínea, flujo y estado volumétrico, que incluyen mediciones tales como presión sanguínea, gasto cardíaco, presión auricular derecha y presión diastólica final del ventrículo izquierdo.

La frase “interior de una nanopartícula”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier porción de la nanopartícula que no sea el exterior de la nanopartícula. El interior de una nanopartícula comprende la capa interna de la capa de nanopartícula, la región hidrófoba entre la capa interna y externa de la capa de nanopartícula, el núcleo acuoso y la carga útil. El interior de una nanopartícula también puede comprender una molécula opcional. El término “metahemoglobina”, como se usa en el presente documento, se refiere a una forma oxidada de hemoglobina que contiene hierro en estado férrico y no puede funcionar como un transportador de oxígeno.

El término “perfluorocarbonos”, como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas sintéticas, inertes, que contienen átomos de flúor, y que consisten en su totalidad en halógeno (Br, F, Cl) y átomos de carbono. En la forma de emulsiones, están en desarrollo como sustancias sanguíneas, porque tienen la capacidad de disolver muchas veces más oxígeno que cantidades equivalentes de plasma o agua.

La expresión “hemoglobina modificada” incluye, pero no se limita a, hemoglobina alterada por una reacción química tal como entrecruzamiento intra e intermolecular, manipulación genética, polimerización y/o conjugación con otros grupos químicos (por ejemplo, poli(óxidos de alquileno), por ejemplo polietilenglicol, u otros aductos tales como proteínas, péptidos, carbohidratos, polímeros sintéticos y similares). En esencia, la hemoglobina está “modificada” si alguna de sus propiedades estructurales o funcionales ha sido alterada respecto a su estado nativo. Como se usa en el presente documento, el término “hemoglobina” en sí mismo se refiere tanto a la hemoglobina nativa, no modificada, como a la hemoglobina modificada.

Los términos “nanopartícula” y “nanopartícula transportadora de oxígeno” se usan indistintamente en toda la solicitud.

La expresión “afinidad por el oxígeno” se refiere a la avidez con la que un transportador de oxígeno como la hemoglobina se une al oxígeno molecular. Esta característica se define por la curva de equilibrio del oxígeno que relaciona el grado de saturación de las moléculas de hemoglobina con el oxígeno (eje Y) con la presión parcial del oxígeno (eje X). La posición de esta curva se indica mediante el valor, p50, la presión parcial de oxígeno a la cual el transportador de oxígeno está medio saturado con oxígeno, y está inversamente relacionado con la afinidad por el oxígeno. Por lo tanto, cuanto menor sea la p50, mayor será la afinidad por el oxígeno. La afinidad por el oxígeno de la sangre completa (y los componentes de la sangre completa, tales como los eritrocitos y la hemoglobina) se puede medir mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. (Ver, por ejemplo, Winslow et al., J. Biol. Chem. 252 (7):2331-37 (1977)). La afinidad por el oxígeno también se puede determinar usando un Analizador HEMOX™ disponible comercialmente (TCS Scientific Corporation, New Hope, Pa.). (Ver, por ejemplo, Vandegriff y Shrager en “Methods in Enzymology” (Everse et al., Eds.) 232:460 (1994)).

La expresión “capacidad de transporte de oxígeno” o simplemente “capacidad de oxígeno” se refiere a la capacidad de un sustituto de la sangre para transportar oxígeno, pero no se correlaciona necesariamente con la eficiencia con la que suministra oxígeno. La capacidad de transporte de oxígeno generalmente se calcula a partir de la concentración de hemoglobina, ya que se sabe que cada gramo de hemoglobina se une a 1,34 ml de oxígeno. Por lo tanto, la concentración de hemoglobina en g/dl multiplicada por el factor 1,34 da la capacidad de oxígeno en ml/dl. La concentración de hemoglobina se puede medir mediante cualquier procedimiento conocido, tal como mediante el uso del fotómetro de p- hemoglobina (HemoCue, Inc., Angelholm, Suecia). De manera similar, la capacidad de oxígeno puede medirse por la cantidad de oxígeno liberado de una muestra de hemoglobina o sangre utilizando, por ejemplo, un instrumento de pila de combustible (por ejemplo, Lex-O2-Con, Lexington Instruments).

La expresión “componente transportador de oxígeno” se refiere en sentido amplio a una sustancia capaz de transportar oxígeno en el sistema circulatorio del cuerpo y suministrar al menos una porción de ese oxígeno a los tejidos. El componente transportador de oxígeno puede ser hemoglobina nativa o modificada, y también se puede denominar en la presente memoria “transportador de oxígeno a base de hemoglobina” o “HBOC”.

La expresión “carga útil” se refiere a los componentes contenidos en el interior de una nanopartícula. Una carga útil comprende un agente transportador de oxígeno, un agente efector y un agente reductor. Una carga útil puede comprender además moléculas opcionales.

Los términos “cubierta” y “cubierta de dos capas” se usan indistintamente, y generalmente se refieren a la cubierta de una nanopartícula. Una cubierta tiene dos capas, comprendida por una capa externa hidrófila, una capa interna hidrófila y una región hidrófoba entre las capas.

Habiendo descrito la divulgación en detalle, será evidente que son posibles modificaciones y variaciones sin apartarse del alcance de la divulgación definida en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar la divulgación. Los expertos en la materia apreciarán que las técnicas desveladas en los siguientes ejemplos representan técnicas descubiertas por los inventores que funcionan bien en la práctica de la divulgación. Los expertos en la materia deberían, sin embargo, a la luz de la presente divulgación, apreciar que podrían hacerse muchos cambios en la divulgación y aun así obtener un resultado parecido o similar sin apartarse del ámbito de la divulgación, por lo tanto, todo el asunto expuesto debe ser interpretado como ilustrativo y no en un sentido limitante.

Ejemplo 1. Preparación de nanopartículas.

La preparación y carga de nanopartículas bicóncavas se lleva a cabo como se describe en Pan et al., 2008 J Am Chem Soc 130:9186-9187, Solicitud PCT N.° PCT/US2008/079414 y Publicación de los Estados Unidos N.° 2010/0297007. Una representación esquemática de las partículas y la preparación de las nanopartículas se muestra en la FIG. 1.

Los polímeros de polietilenimina se injertaron con grupos alquilo hidrófobos por medios covalentes. El ácido palmítico se activó con la carbodiimida EDAC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, hidrocloruro) seguido de la adición del polímero para lograr una funcionalización superior al 50 % de los grupos amina primaria libres. El polímero anfífilo supone una estructura micelar invertida unimolecular de 7-10 nm de tamaño en disolvente orgánico después de la agitación vorticial.

En las nanopartículas se cargó hemoglobina, hemoglobina y 2,3-DPG, o hemoglobina, 2,3-DPG, y azul de leucometileno o azul de leucobencil metileno. Las nanopartículas se cargan añadiendo soluciones que comprenden hemoglobina, hemoglobina y 2,3-DPG, o hemoglobina, 2,3-DPG, y azul de leucometileno o azul de leucobencil metileno a una suspensión acuosa de nanopartículas, seguido de agitación/movimientos circulares breve.

La hemoglobina era hemoglobina humana extraída y purificada de eritrocitos expirados. La hemoglobina se estabilizó como carboxihemoglobina (HbCO), se purificó por cromatografía de intercambio iónico y se concentró usando ultrafiltración a 4,0 g/dl. La concentración de la hemoglobina utilizada para generar las nanopartículas fue de 10 mg/ml. La concentración de 2,3-DPG fue de 10 mg/ml. La concentración de azul de leucometileno o azul de leucobencil metileno fue de 5 mg/ml. Las nanopartículas comprendían un promedio de 3488 moléculas de hemoglobina por nanopartícula.

El tamaño, la forma y la morfología de las nanopartículas se midieron mediante TEM, DLS y AFM, entre otros procedimientos. Las nanopartículas tenían un diámetro hidrodinámico de 150-180 nm, o 173 ± 10 nm después de la resuspensión, con una polidispersidad de 0,26 ± 0,01 y un potencial zeta de ~ 12 ± 2 mV. Los ensayos se realizaron como se describe en Pan D, Caruthers SD, Hu G, Senpan A, Scott MJ, Gaffney PJ, Wickline SA, Lanza GM. Liganddirected nanobialys as theranostic agent for drug delivery and manganese-based magnetic resonance imaging of vascular targets. J Am Chem Soc. 2008; 130:9186-9187.

Después del autoensamblaje, la reticulación química de la superficie se logra utilizando Sulfo-EGS (bis[sulfosuccinimidilsuccinato de etilenglicol], PBS, pH 8,5) en combinación con hidroxilamina durante 5 ha 37 °C. La reticulación tiene un efecto limitado sobre el tamaño de partícula y el potencial zeta: 167 ± 56 nm, 7 ± 2 mV, respectivamente.

Ejemplo 2. Características de unión al oxígeno de nanopartículas marcadas y no marcadas.

Las nanopartículas producidas marcadas con azul de leucobencil metileno o nanopartículas no marcadas se resuspendieron en agua y se usaron para la caracterización de las características de unión al oxígeno. Las nanopartículas se produjeron generalmente como se describe en el Ejemplo 1. La solución resultante tenía una concentración total de 5x1012 nanopartículas/ml y 2 g/l de hemoglobina glicosilada.

Se usó un Analizador Hemox para caracterizar la unión-disociación del oxígeno de las nanopartículas a pH 10, 8, 6 y pH 8,5. Todas las mediciones se generaron a 37,3 °C. En general, las partículas no marcadas exhibieron una p50 significativamente mayor (menor afinidad por el oxígeno) a pH bajo que las nanopartículas marcadas (FIG. 2 y Tabla 1).

En todas las mediciones de pH, la p50 de las nanopartículas es generalmente más baja que la p50 de sangre humana, que generalmente es de 26,6 mm Hg (53,2 mm Hg en estas lecturas). Una p50 generalmente más baja indica una mayor afinidad por el oxígeno. Se observó un efecto de Bohr (desplazamiento a la derecha con disminución del pH) para las nanopartículas no marcadas, pero no para las nanopartículas marcadas. Además, se midieron las curvas de unión-disociación del oxígeno usando nanopartículas recién preparadas, y partículas que se almacenaron durante aproximadamente un mes. En resumen, la hemoglobina más vieja genera curvas de unión y disociación del oxígeno con más ruido en los registros (FIG. 2).

Ejemplo 3. Caracterización de nanopartículas del Ejemplo 1.

La afinidad por el O2 y la unión reversible se caracterizaron usando un analizador de gases en sangre. La p50 (tensión de O2 en HbSO2 = 50 %) se basó en la n de Hill (log [HbSO]²/(1 - HbSO2)]/log pO2) y se determinó a 37 °C. Con una pO2 de 720 mmHg y un pH de 7,3, la HbSO2 fue 99,99 % con [log [pO²(7,4)] = 2,807332496; 1/k = 3800,503808]; como tal, se calculó que la p50 era 21,18 mmHg (en eritrocitos normales, p50 para HbAO es 26,5 y para HbF es 20,0 mmHg).

La eliminación de NO y la vasoconstricción inapropiada han sido problemáticas para los HBOC y parece aumentar las complicaciones cardiovasculares después del uso de HBOC. En un experimento preliminar de unión a NO, se burbujeó NO gaseoso a través de una suspensión de nanopartículas (RT, 15 min). El análisis de absorbancia UV-Vis no reveló picos espectrales correspondientes al aducto de hemo que generalmente se observa después de la eliminación (Fe(II)NO, con picos a 415, 479, 542, 610 nm).

Las propiedades reológicas de un transportador de O2 son de vital importancia ya que el volumen previsto administrado altera la viscosidad sanguínea y la hemodinámica. La influencia de las nanopartículas sobre la reología plasmática se estudió después de la suspensión en plasma de conejo NZW, revelando ese efecto limitado sobre la viscosidad del plasma (FIG. 3A) La menor reducción en la viscosidad de la suspensión se relacionó con la dilución del plasma por los medios acuosos de las nanopartículas. La ausencia de aumento de la viscosidad por la composición de nanopartículas sugiere que las nanopartículas no se agregan en presencia de proteínas plasmáticas y ejercerán una influencia mínima sobre los parámetros reológicos del plasma.

El perfil farmacocinético (pK) de las nanopartículas se determinó en ratas mediante la incorporación de Hb radiomarcado (trazador 99mTc, dosis 50 pCi/kg). La actividad del marcador se midió en serie y se ajustó para la descomposición (FIG. 3B). Los parámetros PK se determinaron mediante modelado compartimental no lineal de rutina, como hemos descrito. El modelado estándar de dos compartimentos dio como resultado un buen ajuste, con distribución t i/2 = 26,2 ± 3,6 min y eliminación t i/2 = 300 ± 12 min (r2 > 0,96).

Ejemplo 4. Optimización de nanopartículas para las características de unión/liberación de O ² .

La síntesis de nanopartículas puede optimizarse para la capacidad y cinética de liberación de O2, según corresponda para aliviar la hipoxia tisular en el contexto de una anemia grave. Como se señaló en el Ejemplo 3, se han producido nanopartículas con una p50 de 21,18 mmHg (la p50 para la HbAo (hemoglobina no glicosilada) es 26,5; para la HbF (hemoglobina fetal) es 20,0 mmHg). De manera similar, se pueden generar nanopartículas que tienen formulaciones con p50 de ~ 20 (alta afinidad, formulación actual), 25 (afinidad normal) y 30 (baja afinidad).

Por ejemplo, la mezcla de Hb y polímero anfífilo (precargada/no con 2,3-DPG y LMB) se someterá al autoensamblaje en tampón de fosfato (PB) a pH 7,3. La [Hb] en el tampón se puede valorar a diferentes concentraciones, por ejemplo, entre 100, 150, 200, 250 y 300 mg/ml. La reticulación química de la superficie de las nanopartículas puede utilizar Sulfo-EGS, en combinación con hidroxilamina (tampón PB, pH 8,5, 5 h, 37 °C), seguido de diálisis frente a PB 50 mM para eliminar el subproducto sulfo-EGS. Se puede evaluar el tamaño de partícula, la polidispersidad y el potencial zeta para cada formulación de nanopartículas, como se describe en el Ejemplo 3.

El desarrollo puede ser seguido mediante un análisis de la afinidad por el O2. Las curvas de disociación se pueden determinar para cada formulación de nanopartículas en función de la temperatura, pCO2 y pH y se puede hacer referencia a los valores de eritrocitos (RBC) humanos frescos obtenidos de voluntarios, después del lavado y la resuspensión en tampón Krebs, como se describe en Rogers SC, Said A, Corcuera D, McLaughlin D, Kell P, Doctor A. La hipoxia limita la capacidad antioxidante en los eritrocitos al alterar el dominio de la vía glucolítica. Las curvas de histéresis de disociación y asociación del O2 en toda la gama de tensiones de gas presentes en la fisiología humana se pueden medir usando un analizador HEMOX como se describe en Guarnone R, Centenara E, Barosi G. Performance characteristics of hemox-analyzer for assessment of the hemoglobin dissociation curve. Haematologica.

1995; 80:426-430; la p50 y los coeficientes de cooperatividad (Hill) se pueden calcular de acuerdo con la ecuación de Adair como se describe en Kobayashi M, Ishigaki K, Kobayashi M, Imai K. Shape of the haemoglobin-oxygen equilibrium curve and oxygen transport efficiency. Respir Physiol. 1994; 95:321-328 o Kobayashi M, Satoh G, Ishigaki K. Sigmoid shape of the oxygen equilibrium curve and the p50 of human hemoglobin. Experientia. 1994; 50:705-707. Las suspensiones de nanopartículas y eritrocitos se pueden combinar con [Hb] equimolar. Las relaciones molares absolutas [Hb] y Hb:2,3DPG se pueden manipular para crear formulaciones con p50 (torr) de ~ 20 (alta afinidad), 25 (afinidad normal) y 30 (baja afinidad) para las pruebas de eficacia. La eficacia de la lanzadera/reservorio 2,3-DPG puede evaluarse determinando el desplazamiento dependiente del pH en p50 y, si es necesario, la disponibilidad de amina de la cubierta interna de PEI puede variarse para maximizar el cambio de p50 entre pH 7,2 (tejido) y 7,8 (pulmón).

El desarrollo de tales nanopartículas también puede ser seguido mediante la medición de la liberación de O2 en toda la gama de tensiones fisiológicas de gases. El pulmón murino aislado perfundido (IPL) es ideal para evaluar la cinética de carga y descarga de O2 de la nanopartícula durante la perfusión a velocidades fisiológicamente relevantes en un lecho vascular intacto. El IPL puede prepararse como se describe en Doctor A, Platt R, Sheram ML, Eischeid A, McMahon T, Maxey T, Doherty J, Axelrod M, Kline J, Gurka M, Gow A, Gaston B. Hemoglobin conformation couples erythrocyte s-nitrosothiol content to O2 gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2005; 102:5709-5714; Maxey TS, Enelow RI, Gaston B, Kron IL, Laubach VE, Doctor A. Tumor necrosis factor-alpha from resident lung cells is a key initiating factor in pulmonary ischemia-reperfusion injury. J.Thorac.Cardiovasc.Surg. 2004; 127:541-547; o zhao M, Fernandez LG, Doctor A, Sharma AK, Zarbock A, Tribble CG, Kron IL, Laubach VE. Alveolar macrophage activation is a key initiation signal for acute lung ischemiareperfusion injury. AJP - Lung Cellular and Molecular Physiology. 2006;291:L1018-L1026. Las formulaciones de nanopartículas o las suspensiones de eritrocitos humanos lavados (equimolares para Hb, 2 mM) se pueden perfundir a tiempos de tránsito pulmonar de 2, 4 y 8 segundos, y luego se recogen como eflujo auricular izquierdo (sin exposición al aire). Las tensiones de los gases de eflujo y el contenido de HbO2 se puede controlar (analizador de gases en sangre RapidLab 840 y cooxímetro, Siemens AG, GDR). Las tasas de carga de O2 y la eficiencia se pueden determinar perfundiendo suspensiones desoxigenadas a través del pulmón mientras se ventila con 21 % de O2, 5 % de CO2, bal. N2; las tasas de descarga de O2 y la eficiencia se pueden determinar perfundiendo suspensiones oxigenadas a través del pulmón mientras se ventila con 0 % de O2, 10 % de CO2, bal. N2. Se pueden determinar y evaluar las tasas de carga/descarga de nanopartículas con p50 baja, normal y alta (como se describió anteriormente) para determinar su capacidad de respuesta al pH, la temperatura y la pCO2 en comparación con los valores obtenidos para eritrocitos humanos.

Ejemplo 5. Sustentación de la liberación de O ² de las nanopartículas reduciendo la tasa de formación de metHb.

La acumulación de Met-Hemoglobina (MetHb) durante la carga/descarga cíclica de O2 puede cuantificarse usando un tonómetro giratorio de película delgada en presencia de tampón fisiológico (por ejemplo, Krebs) o plasma humano. Un objetivo de la acumulación de metHb puede ser limitar la acumulación al 10 % después de tres horas de circulación simulada, con un ciclo de pO2 entre 120 a 50 Torr. Las nanopartículas de la divulgación comprenden un reductor, y la variación de la relación molar entre reductor y hemoglobina (por ejemplo, entre aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 relaciones molares) es un medio para afectar a la acumulación de metHb. Las muestras se pueden obtener a los 0, 10 min, 30 min, 1 hora, 3 horas y se determinará el porcentaje relativo de oxi, desoxi y metHb (analizador de gases en sangre RapidLab 840 y cooxímetro, Siemens AG, RDA).

Ejemplo 6. Mantenimiento de la esterilidad de las formulaciones de nanopartículas durante la producción y almacenamiento prolongado en forma liofilizada.

La producción estéril, la estabilidad prolongada de las nanopartículas en forma liofilizada y la recuperación reconstituida de las propiedades de unión/liberación de O2 se puede demostrar. Además, la filtración aséptica de nanopartículas puede optimizarse. Se puede confirmar la recuperación de las funcionalidades de nanopartículas (<10 % de cambio desde la línea base) después de la liofilización y el almacenamiento (hasta 12 meses) a 4 °C, 25 °C y 40 °C.

Ejemplo 7. Evaluar y limitar el secuestro del NO y la vasoactividad de las nanopartículas.

Las nanopartículas transportadoras de oxígeno de la divulgación pueden optimizarse para una unión mínima de NO a lo largo de toda la carga/descarga cíclica del O2. La velocidad y el consumo total de NO para las formulaciones de nanopartículas pueden determinarse empleando un ensayo de consumo de óxido nítrico (NO) validado. La carga de hemoglobina y las características de la membrana pueden variarse para limitar el secuestro de NO dentro del 10 % de los eritrocitos normales. Las nanopartículas pueden optimizarse para la vasoactividad mínima a lo largo de los ciclos de carga/descarga del O2. Estos experimentos pueden correlacionar las tasas de secuestro de NO con la vasoactividad en una matriz de anillo vascular estándar (VRA), ambos como una función del contenido de O2. El cambio en el tono del vaso se puede comparar (dentro del 10 %) con los valores de eritrocitos normales para confirmar que cualquier captura de NO está por debajo de los niveles fisiológicamente significativos.

Para evaluar mejor esta característica, las formulaciones de nanopartículas se produjeron con diversos empaquetamientos de hemoglobina y reticulación de la cubierta (Tabla 2) y se cuantificó la eliminación de NO y se comparó con la de los eritrocitos intactos y la Hb libre. Los resultados de estos experimentos (FIG. 4-7) demuestran:1) el secuestro total de NO por formulaciones de nanopartículas es menor que el de los eritrocitos y la Hb libre y varía más en función del carácter de la cubierta y la densidad de empaquetamiento de Hb (FIG. 6); y 2) la tasa de secuestro de NO por formulaciones de nanopartículas varía principalmente como una función de la reticulación de la cubierta y puede reducirse por debajo de la tasa de los eritrocitos intactos (Figs. 5 y 7).

Tabla 2. Formulaciones de nanopartículas probadas

Ejemplo 8. Determinación de la eficacia del suministro de O ² de las nanopartículas.

La demostración de la estabilización de HIF-1a es la medida estándar de un suministro inadecuado de O2 al tejido. Para lograr esto, se puede usar un nuevo modelo dinámico de notificación HIF de animales completos para caracterizar la capacidad de las nanopartículas transportadoras de oxígeno de la divulgación para mantener el suministro de O2 al tejido durante una reducción gradual de la Hb nativa. La hemodilución normovolémica es un medio para simular la pérdida de sangre traumática aguda y la reanimación con líquidos en el campo; este enfoque controlará la hipotensión, eliminando la hipoperfusión como un factor de confusión para la disminución del contenido de O2 de la sangre. Los resultados primarios de interés son:1) supervivencia; 2) PO2 del tejido y 3) señal de HIF (ODD)-luciferasa. Se han descrito y validado medios para monitorizar la expresión/estabilización de HIF de forma no invasiva durante la anemia aguda y su resolución, cuantificando la bioluminiscencia de animales enteros en ratones HIF-a (ODD)-luciferasa. Ver, por ejemplo, Safran M, Kim WY, O'Connell F, Flippin L, Gunzler V, Horner JW, Depinho RA, Kaelin WG, Jr. Mouse model for noninvasive imaging of hif prolyl hydroxylase activity: Assessment of an oral agent that stimulates erythropoietin production. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006; 103:105-110; o Tsui AK, Marsden PA, Mazer CD, Adamson SL, Henkelman RM, Ho JJ, Wilson DF, Heximer SP, Connelly KA, Bolz SS, Lidington D, El-Beheiry MH, Dattani ND, Chen KM, Hare GM. Priming of hypoxia-inducible factor by neuronal nitric oxide synthase is essential for adaptive responses to severe anemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011; 108:17544-17549.

Como tal, se observa un aumento gradual en la bioluminiscencia del cuerpo entero en tiempo real a medida que disminuye la Hb; la evaluación por pares de los niveles de proteína HIF (transferencia Western) y la expresión de ARN dependiente de HIF en múltiples tejidos confirman la evaluación in vivo no invasiva de la señalización HIF (FIG.

8). En este modelo, el aumento en la expresión de HIF-luciferasa se produce ya a las 6 horas después de la inducción de la anemia con una expresión máxima en ~ 24 horas, y es proporcional a la disminución aguda en el nivel de Hb y pO2. A medida que la [Hb] se recupera por el mecanismo fisiológico (eritropoyetina endógena) durante 7 días, los niveles de HIF vuelven a la línea base (FIG. 8E). La exposición a la hipoxia sirve como un control positivo para la expresión de HIF en este modelo.

Usando el modelo de ratón de luciferasa HIF-1a (ODD), la capacidad de las nanopartículas transportadoras oxígeno para restaurar el suministro de O2 al tejido se puede caracterizar después de la reducción en la [Hb] nativa. Se puede realizar una transfusión de intercambio con nanopartículas (hemoglobina total normalizada) o pentastarch (anemia normovolémica, control) para estudiar el suministro de O2 /- estrés hipóxico mediante imágenes bioluminiscentes in vivo y extinción con Oxyphor de los tejidos. En un grupo de hemodilución separado, la hemoglobina puede normalizarse reinyectando eritrocitos murinos obtenidos para establecer la actividad HIF-luciferasa y Oxyphor de referencia; la extinción de las nanopartículas puede estar dentro del 10 % que se logra al volver a infundir los eritrocitos murinos. También se puede determinar la farmacocinética (PK) de la partícula de las nanopartículas. Las nanopartículas pueden marcarse con 99mTc y administrarse como se describió anteriormente. La actividad se puede medir en serie y se pueden calcular los parámetros PK. Puede esperarse una retención del 75 % a las 3 horas, con la duración de la circulación ajustada a la duración de la eficacia usando HIF-luciferasa y extinción con Oxyphor.

Ejemplo 9. Evaluación de la eficacia de las nanopartículas en un modelo de choque hemorrágico en roedores.

Los polímeros de polietilenimina se injertaron con grupos alquilo hidrófobos por medios covalentes. El ácido palmítico se activó con la carbodiimida EDAC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, hidrocloruro) seguido de la adición del polímero para lograr una funcionalización superior al 50 % de grupos amina primaria libres y una funcionalización parcial de las aminas secundarias . El polímero anfífilo se dispersó en cloroformo anhidro y se sometió a agitación vorticial durante 2 - 5 minutos. La medición del diámetro hidrodinámico de esta construcción confirma la formación de una estructura micelar invertida (IM) unimolecular de 7-10 nm de tamaño.

La hemoglobina concentrada y purificada y la mezcla de 2,3-DPG, y el azul de metileno se suspendieron en medio acuoso y se añadieron a la mezcla de disolvente orgánico del IM. Esta mezcla bifásica se dejó sedimentar e invertir varias veces hasta que todas las cargas útiles se transfirieron a la capa orgánica que comprende IM. La transferencia se puede lograr sacudiendo/girando brevemente e invirtiendo o un procedimiento de combinación. La hemoglobina era hemoglobina humana extraída y purificada de eritrocitos expirados. La hemoglobina se estabilizó como carboxihemoglobina (HbCO), se purificó mediante cromatografía de intercambio iónico y se concentró usando ultrafiltración a 4,0 g/dl. La concentración de hemoglobina utilizada para generar las nanopartículas fue de 10 mg/ml. La concentración de 2,3-DPG fue de 10 mg/ml. La concentración de azul de leucometileno fue de 5 mg/ml. La IM incorporada en la carga útil se transfirió a un tubo de vidrio de cuello largo y se añadió a este volumen igual de agua nanopura (0,2 j M). La mezcla se sonicó brevemente durante 1-2 minutos seguido de una evaporación lenta del disolvente orgánico a presión reducida siguiendo un protocolo de evaporación del disolvente en fase inversa. La eliminación del disolvente orgánico se confirmó mediante la evaporación rotatoria prolongada y la diálisis. En una preparación típica, las nanopartículas comprendían un promedio de 4000 moléculas de hemoglobina por nanopartícula. Después del autoensamblaje y la evaporación del disolvente en fase inversa, las nanopartículas se sometieron a reticulación química superficial usando Sulfo-EGS (etilenglicol bis[sulfosuccinimidilsuccinato], PBS, pH 8,5) en combinación con hidroxilamina durante 5 ha 37 °C. La etapa de reticulación intramolecular está desprovista del uso de cualquier reticulante químico. El tamaño, la forma y la morfología de las nanopartículas se midieron mediante TEM, DLS y AFM, entre otros procedimientos. Las nanopartículas tenían un diámetro hidrodinámico de 150-180 nm, o 173 ± 10 nm después de la resuspensión, con una polidispersidad de 0,26 ± 0,01 y un potencial zeta de ~ 12 ± 2 mV. La reticulación tiene un efecto limitado sobre el tamaño de partícula y el potencial zeta: 167 ± 56 nm, 7 ± 2 mV, respectivamente. Los ensayos se realizaron como se describe en Pan D, Caruthers SD, Hu G, Senpan A, Scott MJ, Gaffney PJ, Wickline SA, Lanza GM. Ligand-directed nanobialys as theranostic agent for drug delivery and manganese-based magnetic resonance imaging of vascular targets. J Am Chem Soc. 2008; 130:9186-9187.

Ejemplo 10. Evaluación de la eficacia de las nanopartículas en un modelo de choque hemorrágico en roedores.

La eficacia de las nanopartículas se evaluó en un modelo de choque hemorrágico en roedores. Las nanopartículas se produjeron como se describe en el Ejemplo 9. Las ratas (Sprague Dawley, 400 g, N = 3) se anestesiaron (isoflurano) y se sometieron a traqueotomía con instauración de ventilación mecánica (AR) y canulación de las venas yugular y femoral y las arterias carótida y femoral. Después de establecer los valores de la línea base para el contenido de O2 de la sangre y la diferencia AV O2, se eliminó el 25 % del volumen de sangre, se obtuvieron nuevos valores y los animales se resucitaron con un volumen igual del sustituto de la sangre (N = 2) o solución salina normal (N = 1). Las nanopartículas (NP) se suspendieron a 40 % p/vol, con una suspensión [Hb] de 4 mM. La FIG. 9 muestra el resultado del experimento. La gráfica ilustra un incremento sorprendente y esperado en la diferencia de AV O2 con la extracción de sangre (que pasa del 24 al 67 %), que (A) persistió después de la reanimación con solución salina normal y (B) se resolvió después de la reanimación con el sustituto de la sangre (normalización del 67 al 31 %). En (C), no se observó ninguna diferencia en el efecto hemodinámico proporcionado por ninguno de los líquidos de resucitación, lo que sugiere que el beneficio en el suministro de O2 del sustituto de la sangre se debe a un mayor contenido de O2, además de la restauración de la presión arterial. Además, a diferencia de otros sustitutos de la sangre a base de hemoglobina, que se sabe que causan vasoconstricción e hipertensión por el secuestro de NO, el sustituto de la sangre a base de NP reconstituyó la hemodinámica normal. Esto apoya adicionalmente los datos in vitro de que la NP no induce un secuestro significativo de NO.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Una nanopartícula que tiene una forma de disco sustancialmente bicóncavo, en la que la nanopartícula comprende un núcleo acuoso, una cubierta de dos capas que comprende un polímero anfífilo cargado positivamente, y una carga útil; en la que

la cubierta de dos capas tiene una capa externa hidrófila, una capa interna hidrófila y una región hidrófoba entre las capas;

el polímero anfífilo comprende un polímero ramificado que contiene amina, unido a un lípido; y

la carga útil comprende un agente transportador de oxígeno seleccionado de hemoglobina sintética o hemoglobina de origen natural, un efector alostérico heterotrópico que modifica la afinidad por el O2 del agente transportador de oxígeno, y un agente reductor.

2. La nanopartícula de la reivindicación 1, en la que el polímero anfífilo que comprende la capa externa hidrófila de la cubierta se obtiene con polietilenglicol, de modo que la partícula tiene un potencial zeta de -15 mV a 15 mV.

3. Una nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el diámetro promedio de la nanopartícula es de 150 nm a 300 nm, y la altura promedio de la nanopartícula es de 30 nm a 80 nm, y la nanopartícula comprende opcionalmente un orificio pasante o una depresión.

4. Una nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el efector alostérico se selecciona del grupo que consiste en 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG), inositol hexafosfato (IHP), piridoxal-fosfato (PLP) y ácido 2-[4-[[(3,5-dimetilanilinocarbonil]metil]-fenoxi]-2-metilpropiónico, y/o en la que el agente reductor se selecciona del grupo que consiste en azul de leucometileno, glutatión y ascorbato.

5. Una nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la nanopartícula comprende (a) de 3.000 a 10.000 moléculas de hemoglobina, (b) de 20 % a 60 % (p/v) de hemoglobina y/o (c) de 30 % a 60 % (p/v) de hemoglobina.

6. Una nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la nanopartícula no secuestra sustancialmente óxido nítrico y/o en la que la nanopartícula limita la oxidación de la hemoglobina al 10 % o menos de la concentración total de hemoglobina en la nanopartícula.

7. Una nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el polímero ramificado que contiene amina se selecciona del grupo que consiste en un polímero ramificado de polietilenimina, un dendrímero PAMAM, un polímero en estrella y un polímero de injerto; y/o en el que el lípido es un ácido graso.

8. La nanopartícula de la reivindicación 7, en la que el lípido es un ácido graso seleccionado del grupo que consiste en ácido 10,12- pentacosadiinoico, ácido hexadeciloctadecanoico, ácido colánico, ácido linoleico, ácido C24-pentacosadiinoico y ácido palmítico.

9. Una composición sustituta de la sangre, comprendiendo la composición una nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

10. La composición de la reivindicación 9, en la que la composición es una solución o un polvo liofilizado.

11. Una nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para su uso como un medicamento.

12. Una nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 adecuada para su uso para complementar la capacidad de transporte de oxígeno de la sangre de un sujeto.

13. La nanopartícula de la reivindicación 1, en la que

el polímero anfífilo comprende un polímero ramificado que contiene amina con grupos reactivos y está unido a un lípido a través de los grupos reactivos, de modo que al menos el 25 % de los grupos reactivos libres están unidos a lípidos; y

los grupos reactivos superficiales del polímero anfífilo que comprende la cubierta están reticulados con un enlazador bifuncional.

14. La nanopartícula de la reivindicación 1, en la que

el polímero anfífilo comprende un polímero ramificado que contiene amina con grupos reactivos y está unido a un lípido a través de los grupos reactivos, de modo que al menos el 40 % de los grupos reactivos libres están unidos a lípidos; y

los grupos reactivos superficiales del polímero anfífilo que comprende la cubierta están reticulados con un enlazador bifuncional.

15. La nanopartícula de la reivindicación 1, en la que

el polímero anfífilo comprende un polímero ramificado que contiene amina con grupos reactivos y está unido a un lípido a través de los grupos reactivos, de modo que al menos el 55 % de los grupos reactivos libres están unidos a lípidos; y

los grupos reactivos superficiales del polímero anfífilo que comprende la cubierta están reticulados con un enlazador bifuncional.

16. Un procedimiento para proporcionar oxígeno para mantener un órgano ex vivo, que comprende administrar una nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

17. Un procedimiento in vitro para complementar la capacidad de transporte de oxígeno de la sangre de un sujeto, que comprende administrar una nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones 1-8.