DE3875852T2 - Gereinigtes igm. - Google Patents

Description

• Diese Offenbarung betrifft allgemein gereinigte Immunglobuline und insbesondere ein hochgereinigte Immunglobulin der IgM-Klasse, welches im wesentlichen frei von Nukleinsäuren ist.
• IgM ist ein gut bekanntes 19S-Immunglobulin, welches ca. 7% der Immunglobuline im Menschen ausmacht. IgM-Antikörper haben eine Antikörpervalenz von mindestens fünf, und sind die Antikörper, die am frühesten während einer Immunantwort erzeugt werden. Obwohl IgM-Antikörper besonders bei der Bekämpfung bakterieller Infektionen sehr effektiv sind, haben sie eine relativ kurze Halbwertszeit in vivo von ca. 5 Tagen. Ferner sind IgM-Antikörper labil und sind insbesondere in gereinigter Form relativ schwierig zu stabilisieren.
• Es sind eine Reihe verschiedener Reinigungswege für aus Plasma gewonnenem IgM und, in jüngster Zeit, monoklonal hergestelltem IgM vorgeschlagen worden. Im Falle des IgM aus Plasma ist es seit den 40er Jahren bekannt, daß Alkoholfraktionierungstechniken eingesetzt werden können, um ein relativ konzentriertes IgM aus der als Cohn III bekannten Fraktion zu gewinnen. Siehe z. B. U.S.-Patent 4,318,902 (und die Literaturverweise) von W. Stephan, das die Verwendung von beta-Propriolacton zur Herstellung von konzentriertem IgM, welches zur intravenösen (IV) Verabreichung geeignet ist, betrifft. Zusätzlich siehe EPO-Anmeldung 0 038 667 von Miura et al (IgM-Acylierung). Siehe ebenfalls U.S.-Patent Nr. 4,272,521 von Zuffi, das allgemein die Reinigung von Immunserumglobulinen unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen bei einem alkalischen pH betrifft. Andere IgM-Reinigungs- oder -Herstellungsverfahren sind bei U. Sugg et al, Vox Sang. 36 : 25-28 (1979); M. Steinbach et al, Preparative Biochemistry 3(4), 363-373 (1973) und A. Wichman et al, Biochem. Biophys. Acta 490 : 363-69 (1977) offenbart. Verfahren zur Herstellung spezifischer monoklonaler Antikörper des IgM-Typs werden im U.S.-Patent 4,271,145 von Wands et al gezeigt. Ein spezifischer Immuntest unter Verwendung hochaffiner IgM-Antikörper ist in WO 82/01072, veröffentlicht von Wands et al, offenbart. Siehe ebenfalls I. A. Sampson et al, J. Immuno. Meth. 69, Seiten 9-15, 1984. Aus einer Vielzahl technischer Gründe ist IgM aus dem Plasma relativ schwierig zu reinigen, und die bis heute am höchsten bekannte Reinheit ist ca. 90 Gew.-% IgM. Ebenfalls wurde bislang der Nukleinsäuregehalt von solchem IgM aus dem Plasma im allgemeinen nicht als wichtig angesehen, da das IgM aus einer menschlichen Plasmaquelle gewonnen wird.
• Man nimmt an, daß typische Nukleinsäuregehalte für IgM aus dem Plasma im Bereich von 1 ng bis 10 ug pro mg liegen. Seit der Veröffentlichung von Köhler und Milstein, "Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity", Nature 256 : 495-497 (1975), ist die Gewinnung von monoklonalen Antikörpern bekannt. Monoklonale Antikörper mit einer gegebenen Spezifität werden nun routinemäßig unter Verwendung somatischer Zellhybride (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 4,172,124 von H. Koprowski et al), unter Verwendung von EBV transformierter Zellen (siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 4,446,465 von M. Lostrom), einer Kombination der beiden Verfahren, oder durch Elektrofusion von Zellen hergestellt. Monoklonale Antikörper von sowohl der IgG- wie der IgM-Klassen sind hergestellt, gereinigt und charakterisiert worden. Solche IgM-Präparationen werden von D. Nau, Biochromatography, 1, No. 2, Seiten 83-84 (95% reines IgM aus Gewebekulturen); M. Fishner, U.S.-Patent Nr. 4,604,235 (90% reines IgM aus Mausascitesflüssigkeit, welches als im wesentlichen reiner Antikörper charakterisiert wurde), J. R. Wands et al, WO 82/01072 (Hochaffinititäts-IgM monoklonale Antikörper für Diagnostika, wie oben zitiert); S. Burchiel et al, J. Immuno. Meth., 69, S. 33, 1984 (IgG gereinigt aus Mausascitesflüssigkeit, J. Deschamps et al, Anal. Biochem. 147, S. 451, 1985 (IgG aus Mausascitesflüssigkeit); und T. Brooks et al, Amer. Lab., Oktober 1985 (Verwendung von Hydroxyapatit zur Reinigung von Maus und menschlichem IgG und IgM) beschrieben. Obwohl Anstrengungen unternommen wurden, IgM aus monoklonalen Quellen zu reinigen, liegt die bis heute am höchsten berichtete IgM-Reinheit bei ca. 95% (siehe Nau oben).
• Die Herstellung eines monoklonalen IgM gegen P. aeruginosa ist offenbart, und IgM aus einer menschlichen Lymphoblastoidgewebekultur und DEAE SephacelTM ist als erster Reinigungsschritt für IgM eingesetzt worden. Therapeutisch annehmbare isotonische Lösungen von IgM mit einer Konzentration von 0,005 bis 0,5 ug pro ml sind bekannt, es existieren jedoch keine Daten über die relative Reinheit des IgM-Produkts oder seiner Formulierung.
• Obwohl der Nukleinsäuregehalt von IgM aus Plasma keinen Anlaß zu erhöhter Sorge gibt, ist der Nukleinsäuregehalt von monoklonalem IgM sehr bedeutsam, daß die potentielle Gefahr des Einführens fremder (nichtmenschlicher) Nukleinsäure in den Menschen über ein parenteral verabreichtes Produkt besteht. Daher ist zusätzlich zu der Absicht, ein gereinigtes und konzentriertes IgM-Produkt zu erhalten, es auch wünschenswert, ein solches Produkt ohne oder mit sehr wenig Nukleinsaure zu gewinnen. Wir haben nun gefunden, daß ein solch gereinigtes Produkt durch sorgfältige Kontrolle der Verfahrensschritte und Lagerungsbedingungen hergestellt und stabilisiert werden kann. Einzelheiten unseres hochgereinigten IgM sind im folgenden beschrieben.
• Unsere Offenbarung betrifft ein im wesentlich reines und stabilisiertes IgM-Antikörperprodukt, das IgM-Antikörper mit einer Reinheit größer als ca. 98 Gew.-% und einen Nukleinsäuregehalt von weniger als ca. 200 pg pro mg IgM enthält. In bevorzugten Ausführungsformen ist die IgM-Reinheit größer als 98 Gew.-% und der Nukleinsäuregehalt weniger als 10 pg pro mg IgM, besonders bevorzugt ist eine IgM-Reinheit von größer als ca. 99 Gew.-%, ein Nukleinsäuregehalt von weniger als ca. 4 pg pro mg IgM, und Stabilisierung der Präparation durch Einhaltung eines pH-Wertes im Bereich von ca. 4 bis 10, vorzugsweise eines pH-Wertes von ca. 8 in Gegenwart von NaCl, Albumin, Aminosäuren oder Kohlenhydraten als Stabilisatoren. Eine typische Präparation mit den obigen Eigenschaften enthält einen oder mehrere IgM-Antikörper, die spezifisch gegen serotypische Determinanten, wie sie auf der Oberfläche von gramnegativen Mikroorganismen gefunden werden, sind. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Praparation IgM-Antikörper aus einem oder mehreren Klonen, und man nimmt an, daß sie geeignet zur Behandlung von P. aeruginosa-Infektionen ist. Die Präparation kann durch Kultur einer Quelle für monoklonale Antikörper, Gewinnung der monoklonalen Antikörper und anschließendem Unterwerfen der gewonnenen Antikörper einer sorgfältig kontrollierten Reihe von Verfahrensschritten, die Ionenaustausch- und Größenausschlußchromatographie umfassen, erhalten werden.
• Die Figur zeigt ein Flußdiagramm der allgemeinen Verfahrensschritte zur Herstellung einer Ausführungsform dieser Offenbarung. Ebenfalls gezeigt wird der allmähliche Anstieg der Reinheit und Abnahme des Nukleinsäuregehalts über die einzelnen Schritte des Gesamtprozesses.
• Ein sehr wichtiger Aspekt dieser Offenbarung ist die Gesamtreinheit, Stabilität und niedriger Nukleinsäuregehalt unserer IgM-Präparation. Hierin bedeutet der Ausdruck "im wesentlichen reines und stabilisiertes IgM" eine IgM-Präparation, die IgM-Antikörper mit einer Reinheit größer als ca. 98 Gew.-% und einem Nukleinsäuregehalt von weniger als ca. 200 pg pro mg IgM enthält. Eine "stabilisierte IgM-Präparation" bedeutet eine Präparation, für die eine Veränderung von weniger als 10% (+ oder -) in der Molekulargewichtsverteilung, gemessen durch Größenausschlußchromatographie über einen Zeitraum von 6 Monaten (z. B. Pharmacia FPLC - SuperoseTM 6 peak area) gefunden wird. Die IgM-Antikörper sind biologisch aktiv (fähig zur Bildung von Immunkomplexen) und werden stabilisiert durch Lagerung bei einem pH im Bereich von ca. 4 bis 10 in Gegenwart eines geeigneten Stabilisierungsmittels wie NaCl, Albumin, Kohlenhydraten oder Aminosäuren. Beispiele für einen Kohlenhydratstabilisator kann Dextrose, Saccharose oder Maltose sein. Obwohl ein verminderter Nukleinsäuregehalt angestrebt wird, um eine beinahe homogene IgM-Präparation unabhängig von der IgM-Quelle zu erhalten, ist dies besonders bei einem IgM-Produkt aus Kulturen (z. B. Hybridoma oder transformierten Zellen) erwünscht, da es wichtig ist, die Abwesenheit oder beinahe Abwesenheit von Nukleinsäuren (DNA oder RNA) aus einer fremden Quelle (tierischer Ursprung oder sogar menschliche, die genetisch verändert wurden, wie z. B. durch EBV-Transformation) sicherzustellen.
• Die erläuternden Beispiele im folgenden zeigen einen im wesentlichen reinen und stabilisierten IgM, der spezifisch gegen bestimmte Serotypen von Pseudomonas aeruginosa-Bakterien ist. Die IgM-Antikörper, die gereinigt und stabilisiert werden konnten, wurden aus den folgenden A.T.C.C.-Klonen gewonnen: Linie 6F11, Fisher Typ 2, A.T.C.C. Hinterlegungsnummer CRL 8562, Linie 5G2, Fisher Typ 6, A.T.C.C.-Hinterlegungsnummer CRL 8797, und Linie 13Cl, Fisher Typ 5, A.T.C.C.-Hinterlegungsnummer CRL 8796.
• Die folgenden Beispiele demonstrieren, daß monoklonale Antikörper der Klasse M und verschiedener Fisher Typen in einem hohen Grade aus Gewebekulturmedien gereinigt werden können.
Beispiel 1
• Zellinie 6F11, A.T.C.C.-Hinterlegungsnummer CRL-8562 ist eine menschliche Lymphoblastoidzelle, die monoklonale Antikörper der M-Klasse spezifisch gegen Fisher Typ 2 Pseudomonas aeruginosa produziert. Diese Linie wurde in einer Mischung von Hana Biologics Komplexmedien, ergänzt mit menschlichem Serumalbumin, Insulin und Transferrin, kultiviert. Der Fermenter war ein mit Rührer ausgerüsteter Tank.
• Ein Volumen von 40 l mit 50 mg/l IgM aus der obigen Kultur wurde durch ein 0,2 um-Filter (MicrogonTM) filtriert. Das Filtrat wurde auf einer tangentialen Flußmembran mit einem Molekulargewichtsausschluß von 100.000 (MilliporeTM) auf 1 Liter konzentriert. Das Konzentrat wurde auf 5ºC abgekühlt und der pH auf 7,4 eingestellt. Es wurden 100 g PEG zugegeben und 1 h gerührt. Die Lösung wurde bei 10.000·g 30 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Präzipitat bei -35ºC eingefroren.
• Das Präzipitat wurde in 1 l Puffer resuspendiert (0,05 M TRIS, 0,08 M NaCl, pH 8,0). Der pH wurde auf 4,5 abgesenkt. Die Lösung wurde bei 10.000·g 30 min zentrifugiert und das Präzipitat verworfen. Der Überstand wurde nochmals auf pH 8 eingestellt. Die Lösung wurde an eine Anionenaustauschersäule mit 1 l DEAE-SepharoseTM Fast-Flow (Pharmacia), die mit Puffer äquilibriert worden war (0,05 M TRIS, 0,08 M NaCl, 2% TWEENTM, pH 8,0) gebunden. Das IgM wurde durch einen linearen Gradienten mit einem Puffer (0,05 M TRIS, 1,0 M NaCl, pH 8,0) eluiert. Das Eluat wurde auf einer Membran mit einem Molekulargewichtsausschluß von 100.000 auf 0,5 l konzentriert. Das Konzentrat wurde auf einer Größenausschlußsäule mit SepharoseTM CL-6B (Pharmacia), die mit Puffer äquilibriert war (0,5 M NaCl, 0,05 M Tris, 0,01 M Glycin, pH 8,0) fraktioniert. Das IgM-Eluat betrug 6 Liter. Es wurden 0,5 g menschliches Serumalbumin zugegeben und die Fraktion auf 0,1 l mit einer Membran mit einem Ausschlußmolekulargewicht von 10.000 konzentriert. Die Lösung wurde mit 0,5 l Puffer (0,15 M NaCl, 0,05 M TRIS, 0,01 M Glycin, pH 8,0) diafiltriert. Die Lösung wurde steril filtriert. Ein Aliquot wurde eingefroren und in einem 80 h-Zyklus lyophilisiert (10 h bei -40ºC, 20 h bei -20ºC, 20 h bei 00, 10 h bei 200 und 20 h bei 37ºC). Die kumulative Ausbeute ist 30-35%. Die Flüssigkeit bleibt klar ohne Präzipitation über mehr als ein Jahr bei 5ºC. Das lyophilisierte Produkt ist weiß und rekonstituiert sich innerhalb 3 min mit Wasser. Die Reinheit nach SDS-PAGE und Pharmacia FPLC-SepharoseTM 6 ist größer als 98%. Der Nukleinsäuregehalt nach Hybridisierungssondentest ist geringer als 67 pg/mg IgM.
Beispiel 2
• Die Zellinie 5G2, A.T.C.C.-Hinterlegungsnummer CRL 8797 ist eine menschliche Lymphoblastoidzelle, die monoklonale Antikörper der M-Klasse spezifisch gegen Fisher Typ 6 vom Pseudomonas aeruginosa produziert. Die Linie wurde nach im wesentlichen denselben Methoden kultiviert wie die Linie im Beispiel 1.
• Der Kulturüberstand wurde zu einem Endprodukt nach im wesentlichen identischen Methoden wie in Beispiel 1 gereinigt, mit der Ausnahme, daß das ursprüngliche 0,2 um-Filtrat auf pH 4,0 eingestellt wurde und 2 h dort belassen wurde. Der pH der Lösung wurde auf neutral eingestellt und die übrigen Schritte weitergeführt (z. B. Konzentrierung usw.). Das Volumen des Kulturüberstandes betrug jedoch 10 l mit 80 mg/l und andere Volumina wurden entsprechend skaliert. Der Endformulierungspuffer war 0,15 M NaCl, 0,01 M Glycin, pH 8,0.
• Die kumulative Ausbeute ist 30-35%. Die Flüssigkeit bleibt klar ohne Präzipitation über mehr als 6 Monaten bei 5ºC. Das lyophilisierte Produkt ist weiß und rekonstituiert sich innerhalb 3 min mit Wasser. Die Reinheit nach SDS-PAGE und Pharmacia FPLC-SepharoseTM 6 ist größer als 98%. Der Nukleinsäuregehalt nach Hybridisierungssondentest ist weniger als 8,5 Picogramm/mg IgM.
Beispiel 3
• Die Zellinie 13C1. A.T.C.C.-Hinterlegungsnummer 8796 ist eine menschliche Lymphoblastoidzelle, die monoklonale Antikörper der Klasse M spezifisch gegen Fisher Typ 5 Pseudomonas aeruginasa produziert. Die Linie wurde nach im wesentlichen identischen Verfahren wie im Beispiel 1 kultiviert.
• Der Kulturüberstand wurde zu einem Endprodukt nach im wesentlichen identischen Verfahren wie in Beispiel 2 gereinigt. Das Volumen des Kulturüberstands betrug jedoch 10 Liter mit 100 mg/l und andere Volumina wurden entsprechend skaliert. Der Endformulierungspuffer war 0,15 M NaCl, 0,01 M Glycin, pH 8,0.
• Die kumulative Ausbeute ist 30-35%. Die Flüssigkeit bleibt klar ohne Präzipitation über mehr als 6 Monaten bei 5ºC. Das lyophilisierte Produkt ist weiß und rekonstituiert sich innerhalb 3 min mit Wasser. Die Reinheit nach SDS-PAGE und Pharmacia FPLC-SepharoseTM 6 ist größer als 98%. Der Nukleinsäuregehalt nach Hybridisierungssondentest ist geringer als 4 Picogramm/mg IgM.
• Unser allgemeines Verfahren ist in der Figur dargestellt. Es wurde gefunden, daß das hochgereinigte Produkt durch Einstellung auf eine Konzentration im Bereich von 0,01 mg/ml bis 50 mg/ml und einen pH im Bereich von 4 bis 10, vorzugsweise in Gegenwart von NaCl, Albumin, Aminosäuren oder Kohlenhydraten besonders bevorzugt in Gegenwart von ca. 0 bis 5 Gew.-% menschlichem Serumalbumin, ca. 0 bis 10% Maltose, ca. 0,0 bis 0,5 M NaCl und ca. 0 bis 0,01 M Glycin stabilisiert werden konnte. Das Endprodukt kann eine Flüssigkeit (siehe oben) sein oder lyophilisiert sein und den üblichen Verfahren zur Inaktivierung infektiöser Erreger unterworfen werden.

Claims (15)

1. Hochgereinigte Antikörperpräparation, enthaltend Antikörper vom IgM-Typ mit einer Reinheit größer als 98 Gew.-% und einem Nukleinsäuregehalt von weniger als 200 pg/mg IgM.

2. Präparation nach Anspruch 1, worin die Menge an Nukleinsäuren weniger als ca. 10 pg/mg IgM ist.

3. Präparation nach Anspruch 1, worin die Menge an Nukleinsäuren weniger als ca. 4 pg/ml IgM ist.

4. Präparation nach Anspruch 1, worin die IgM-Antikörper spezifisch gegen Antigene auf pathogenen gramnegativen Mikroorganismen gerichtet sind.

5. Hochgereinigte monoklonale Antikörperpräparation, enthaltend monoklonale Antikörper vom IgM-Typ mit einer Reinheit größer als ca. 98 Gew.-% und einem Nukleinsäuregehalt von weniger als ca. 200 pg/mg IgM.

6. Präparation nach Anspruch 5 mit einem Nukleinsäuregehalt von weniger als ca. 10 pg/mg IgM.

7. Präparation nach Anspruch 5 mit einem Nukleinsäuregehalt von weniger als ca. 4 pg/mg IgM.

8. Präparation nach Anspruch 5 mit einer IgM-Reinheit größer als ca. 99 Gew.-%.

9. Präparation nach Anspruch 5, worin der Antikörper spezifisch gegen Antigene von gramnegativen Mikroorganismen gerichtet ist.

10. Präparation nach Anspruch 5, worin der Antikörper spezifisch gegen Antigene vom Pseudomonas aeruginosa-Bakterien gerichtet ist.

11. Präparation nach Anspruch 5, die stabilisierende Mengen von humanem Serumalbumin enthält.

12. Präparation nach Anspruch 5, die stabilisierende Mengen eines Kohlenhydrats enthält.

13. Präparation nach Anspruch 5 in einer wäßrigen Form mit einem pH im Bereich von ca. 4 bis ca. 10.

14. Präparation nach Anspruch 5, worin das Kohlenhydrat ausgewählt ist aus Dextrose, Saccharose und Maltose.

15. Präparation nach Anspruch 5 in wäßriger Form mit einem pH im Bereich von ca. 4 bis ca. 10,0 bis 5 Gew.-% menschlichem Serumalbumin, ca. 0 bis 10% Maltose, ca. 0,0 bis 0,5 M NaCl und ca. 0 bis 0gen Form mit einem pH im Bereich von ca. 4 bis ca. 10.

14. Präparation nach Anspruch 5, worin das Kohlenhydrat ausgewählt ist aus Dextrose, Saccharose und Maltose.

15. Präparation nach Anspruch 5 in wäßriger Form mit einem pH im Bereich von ca. 4 bis ca. 10,0 bis 5 Gew.-% menschlichem Serumalbumin, ca. 0 bis 10% Maltose, ca. 0,0 bis 0,5 M NaCl und ca. 0 bis 0,01 M Glycin.