DE3873123T2

DE3873123T2 - Verfahren zur gleichzeitigen bestimmung von mindestens zwei untergruppen von in einem biologischen medium enthaltenen apolipoproteinen.

Info

Publication number: DE3873123T2
Application number: DE8888400555T
Authority: DE
Inventors: Guy Barouh; Franck Bellon; Jean-Charles Fruchart
Original assignee: SEBIA LAB
Current assignee: SEBIA LAB
Priority date: 1987-03-10
Filing date: 1988-03-09
Publication date: 1992-12-03
Anticipated expiration: 2008-03-10
Also published as: ATE78928T1; JPH0743377B2; FR2612298A1; EP0282412A1; JPS63265167A; EP0282412B1; FR2612298B1; GR3005318T3; DE3873123D1; ES2033445T3

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur simultanen Bestimmung des Gehalts an jeder von zwei oder mehreren Gruppen von unterschiedlichen und unabhängigen Teilchen in einem Teilchengemisch. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Kit zur Durchführung dieses Verfahrens.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein neues Verfahren zur simultanen Bestimmung von mindestens zwei Unterensembles von in einem biologischen Medium enthaltenen Apolipoproteinen.
Die Erfindung betrifft gleichfalls neue Trägerflächen (Platten oder Filme bzw. Folien), die fertig zum Gebrauch sind und die die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglichen.
Die Erfindung ist weiterhin auf Bestimmungskits oder -mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gerichtet.
Schließlich ist die Erfindung weiterhin auf ein Verfahren zur in-vitro-Erkennung von Arterioskleroserisiken gerichtet, die mit Spiegeln von bestimmten Apolipoproteinen korreliert sind, welche wiederum von Lipoproteinteilchen getragen werden und sich außerhalb eines durch einem physiologischen Zustand eines gesunden Individuums entsprechenden Extremwerten der vorgenannten Apolipoproteine begrenzten Bereiches befinden, bei dem das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren angewendet wird.
Es ist heute eindeutig bewiesen, daß die Dyslipoproteinämien den wesentlichen prädisponierenden Faktor für die Entwicklung und das Fortschreiten arterieller Läsionen bilden (Lipids Research Clinic Program. The lipid research clinics coronary primary prevention trial results. I. Reduction in incidence of coronary heart disease. II. The relationship of reduction in incidence of coronary heart disease to cholesterol lowering. JAMA, 1984, 251:351-374; Ducimetière P., Richard J.L., Claude J.R., Warnet J.M. Les cardiopathies ischémiques. Incidence et facteurs de risque. In: L'Etude Prospective Parisienne, Paris, INSERM 1981; Fruchart J.C., Bertrand M., Parra H., Gentilini J.L.. Boniface B., Lipoprotéines et apolipoprotéines plasmatiques. Intérêt de leur dosage dans le dépistage de l'athérosclérose coronarienne. Comparaison avec les informations fournies par la coronarographie. Nouv. Presse Méd., 1982, 111:3491-3494).
Die Bestimmungen von Cholesterol und von Triglyceriden, die seit langem Bestandteil des Arsenals der biologischen Analysen sind, haben ihre Unzulänglichkeit gezeigt, als man erkannte, daß das arterogene Risiko je nach der diese Lipide transportierenden Klasse von Lipoproteinen unterschiedlich ist (Gordon T., Kannel W.B., Castelli W.P., Dawber T.R. Lipoproteins, cardiovascular disease and death. The Framingham study. Arch. Intern. Méd., 1981, 141:1128-1131).
Die Anwendung der Klassifikation der Lipoproteine in Abhängigkeit von physikochemischen Kriterien wie der elektrischen Ladung, der Dichte, der Größe oder der Wechselwirkung mit Polyanionen ermöglichte es, herauszufinden, daß es im Plasma arterogene Lipoproteine (LDL), die die Ablagerung des Cholesterols im Gewebe begünstigen, und Schutzlipoproteine (HDL), die das Gewebscholesterol binden, um es zur Leber zum Zwecke seiner Ausscheidung zurückzubringen, gibt (Polonovski J., Beucler I. Structure et métabolisme des lipoprotéines plasmatiques. Pathol. Biol., 1983, 31:225-234).
Die Entdeckung von zahlreichen Apolipoproteinen, Proteinfraktionen von Lipoproteinen, hat zur Entwicklung von immunologischen Methoden geführt, die die Quantifizierung der Lipoproteine und ihre Klassifizierung in Abhängigkeit von ihrer Proteinzusammensetzung ermöglichen (Fruchart JC., Clavey V., Vanhoutte G. Méthodes d'exploration biochimique des hyperlipoprotéinémies. Pathol. Biol., 1983, 31:235-245). So sind die Bestimmungen von Apolipoprotein A-I, der Hauptproteinfraktion von HDL, und von Apolipoprotein B, der Hauptproteinfraktion von LDL, in die tägliche Praxis eingegangen.
Jedoch hat die Wichtigkeit der Proteinfraktion von Lipoproteinen (Apolipoproteinen) beim Transport der Lipide, bei den Lipoproteinrezeptorwechselwirkungen (Brown M.S., Goldstein J.L. Lipoproteins receptors in the liver. J. Clin. Invest., 1983, 72:743-747) und bei der Regulierung der Aktivität von in den Metabolismus einbezogenen Enzymen der Lipoproteine (Fielding C.J., Shore V.G., Fielding P.E. A protein cofactor of lecithin: cholesterol acyltransferase. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1972, 46:1493-1498; Jahn C.E., Osborne J.C., Shaefer E.J., Brewer H.B. Activation of the enzyme activity of hepatic lipase by apolipoprotein A-II. Eur. J. Biochem., 1983, 131:25-29; Assman G., Mensel H.J. Apolipoprotein disorders. Ric. Clin. Lab., 1982, 12:63-81; Catapano A.L. Apo C-II and LPL activity. Ric. Clin. Lab., 1982, 12:35-40; Polonovski J., Glangeaud D., Freundenthal M.C. La lipoprotéine lipase et son action sur les lipoprotéines de très basse densité. In: Exposés annuels de biochimie médicale, Ed. Masson, 1982, 35:13-37) viele Autoren (Fruchart J.C., Puchois P. Méthodes d'analyse des lipoprotéines. Ann. Biol. Clin., 1986, 44:551-555; Alaupovic P. The role of apolipoproteins in lipid transport processes. Ric. clin. Lab., 1982, 12:3-21; Atmeh R.F., Shepherd J., Packard C.J. Subpopulations of apolipoproteins A-I in human high density lipoproteins. Their metabolic properties and response to drug therapy. Biochim. Biophys. Acta, 1983, 751:175-188; Salmon S., Van Wanbeke A., Theron L., Ayrault-Jarrier M., Polonovski J. Apolipoprotéines associées aux lipoprotéines B dans les lipoprotéines des basse densité du sérum humain. Biochim. Biophys. Acta, 1982, 710:297-305) dazu veranlaßt, die Apolipoproteine als spezifische Marker zur Charakterisierung der Lipoproteine anzuwenden. Gemäß diesem Konzept sind die Lipoproteine tatsächlich ein Ensemble von Teilchen, die aus an ein Apolipoprotein (einfaches Teilchen) oder an mehrere Apolipoproteine (komplexes Teilchen) assoziierten Lipiden zusammengesetzt sind. Die so definierten Teilchen könnten die Grundeinheit des Metabolismus von Lipoproteinen darstellen, und jede Dyslipoproteinämie könnte durch ein unterschiedliches Profil von Lipoproteinteilchen charakterisiert werden.
Es ist eine gewisse Zahl von hochentwickelten immunologischen Analysen zur Quantifizierung der Apolipoproteine entwickelt worden.
Diese Methoden wenden die Immunoenzymologie an und sind nur in Forschungslabors anwendbar.
Sie ermöglichten es, die funktionelle Heterogenität von Lipoproteinen hoher und niedriger Dichte zu zeigen. Z.B. hat man nachweisen können, daß die HDL zwei Typen von Teilchen enthalten: solche, die das Apolipoprotein AI und das Apolipoprotein AII (LpAI:AII) enthalten, und solche, die das Apolipoprotein AI, aber nicht das Apolipoprotein AII (LpAI) enthalten.
Die an Zellkulturen ausgeführten Arbeiten haben gezeigt, daß nur die LpAI in der Lage sind, das Gewebscholesterol einzufangen und demnach Schutzmittel gegen die Arteriosklerose zu sein.
Eine retrospektive Studie an coronarographierten Versuchspersonen hat außerdem gezeigt, daß Versuchspersonen mit geschädigten Coronargefäßen eine signifikante Verminderung der Lipoproteine LpA-I zeigten, während die Lipoproteine LpA-I:A-II unverändert waren (Puchois P., Bertrand M., Lablanche J.M., Fruchart J.C. Decrease of plasma apo A-I in coronary artery disease is related to lipoprotein particles which contain apo A-I but not apo A-II. Circulation, 1985, 72:III-199).
Schließlich hat eine Studie an regelmäßig Alkohol konsumierenden Versuchspersonen, die gemäß ihrem wöchentlichen Alkoholkonsum in fünf Gruppen aufgeteilt waren, gezeigt, daß sich die Lipoproteine LpA-I proportional zum Alkoholkonsum vermindern, wahrend die Lipoproteine LpA-II:A-I ansteigen. Der herkömmlich festgestellte Anstieg des Cholesterols HDL beim Konsum von Alkohol steht also mit einem Anstieg der nicht-schützenden Fraktion LpA-I:A-II in Verbindung (Puchois P., Ghahim N., Demarquilly C., Zylberberg G., Fruchart J.C. Effect of alcohol consumption on lipoprotein particles which contain apo A-I and apo A-II (LpA-I:A-II) and apo A-I but not apo A-II (LpA-I). Circulation, 1986, 74:11-383).
Vergleichbare Untersuchungen sind über die Lipoproteine niedriger Dichte durchgeführt worden und haben die Arterogenizität der nur das Apolipoprotein B (LpB) enthaltenden Teilchen und der die Apolipoproteine B und C-III (LpB:C-III) oder B und E (LpB:E) enthaltenden Teilchen gezeigt (Fruchart J.C., Luyeye I., Parra H., Slimane M., Fievet C. Les lipoprotéines athérogènes et leur détection immunologique. Bull. Acad. Natle Méd., 1985, 169: 719-728).
Die Entwicklung von neuen Methoden der molekularen Analyse der Teilchen gestattet es somit, eine frühzeitigere und präzisere Diagnose der Arterioskleroserisiken in Betracht zu ziehen, als es die physikochemischen Kriterien erlauben. Parallel dazu erlauben diese neuen Techniken, die Wirkungsmechanismen von Normolipoproteinämiemedikamenten auf molekularem Niveau genauer anzugeben (Douste-Blazy P., Fievet C., Fruchart J.C., Slimane M., Drouin P., Puchois P., Bernadet P. Effect of fenofibrate on lipoprotein particles predictive of coronary. Arteriosclerosis, 1986, 6/5:564).
Die bislang vorgeschlagenen Methoden zur molekularen Analyse der Lipoproteinteilchen sind die folgenden.
Man hat das Verfahren der sequenziellen Immunopräzipitation vorgeschlagen (Alaupovic P. - Mapping of the lipoprotein particles of very low and low densities characterized by apolipoproteins B, C-I, C-II, C-III and E as their protein moieties. In: Journées du Gerli, Le Touquet, 19-21 juin 1984). Dieses Verfahren erlaubt es, die Lipoproteinpartikel direkt zu quantifizieren, aber es dauert lange und ist zu komplex, um für die klinische Biologie geeignet zu sein.
Man hat ebenfalls ein immunoenzymatisches Verfahren mit Doppelbestimmung der Antikörper entwickelt, das die quantitative Analyse der Teilchen auf molekularem Niveau erlaubt (Fruchart J.C., Puchois P. Méthodes d'analyse des lipoprotéines. Ann. Biol. Clin., 1986, 44:551-555; Puchois P., Bertrand M., Lablanche J.M., Fruchart J.C. - Decrease of plasma Apo A-I in coronary artery disease is related to lipoprotein particles which contain Apo A-I but not Apo A-II. In: 58th Scientific Session of the American Heart Association, Washington, 11-14 novembre 1985. Arteriosclerosis, 1985, 5-5, 513).
Diese Technik beruht auf der Tatsache, daß die spezifischen Antikörper eines gegebenen Apolipoproteins, fixiert auf einer Platte zur Mikrotitration, die Lipoproteinpartikel zurückhalten, die diese Apolipoproteine enthalten.
Die quantitative Analyse der anderen Apolipoproteine, die auf den zurückgehaltenen Partikeln zugegen sind, wird dann direkt auf der Platte durch Zufügen ihrer zugehörigen Antikörper, markiert durch ein Enzym, durchgeführt.
Diese Methode ist schnell und zuverlässig, aber sie erfordert die Anwendung einer Ausrüstung, über die nicht alle Labors verfügen.
Man weiß weiterhin, daß in einem plattenförmigen Gel, enthaltend gleichförmig einen spezifischen Antikörper eines bestimmten Antigens, wenn man das entsprechende Antigen diffundieren (radiale Immunodiffusion nach Mancini) oder in einem elektrischen Feld wandern läßt (Elektroimmunodiffusion nach Laurell), sich ein sichtbares Präzipitat, jeweils in Gestalt eines Rings oder eines Peaks bildet.
Die durch das Präzipitat bedeckten Oberflächen sind proportional zur Menge des eingesetzten Antigens, und durch Vergleichen der erhaltenen Resultate mit bekannten Konzentrationen desselben Antigens ist es möglich, daraus die Menge des zu bestimmenden Antigens abzuleiten.
Diese Techniken sind ebenfalls anwendbar zum Bestimmen zweier oder mehrerer unabhängiger, d.h. untereinander nicht gebundener Antigene durch Beimischen zweier oder mehrerer, gegenüber einem jeden der Antigene spezifischen Antikörper in diese Gele (Fruchart JC, Nora I, Cachera C, Clavey V, Duthilleul P, and Moschetto Y. Simultaneous measurement of plasma apolipoproteins A1 and B by electrimmunaoassay. Clin Chem 28/1 (1982) 59-62 et CB Laurell. A Screening test for α 1 antitrypsin deficiency. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 29 (1972) 247).
Es ist dann später erforderlich, daß man in der Lage ist, die Immunopräzipitate bezüglich eines jeden der Antigene zu unterscheiden. Diese Ermittlung kann beispielsweise durch Ausnutzen einer spezifischen Eigenschaft eines Antigens oder durch Markierung eines bestimmten Antikörpers ausgeführt werden; ebenso aber auch gemäß den relativen Intensitäten der Präzipitationslinien.
Man weiß auch, daß, wenn die Antigene nicht unabhängig sind (d.h. wenn eine Verbindung zwischen ihnen existiert), die simultane Bestimmung nicht möglich ist.
Ein zwischen den verbundenen Antigenen und den unabhängigen Antigenen liegender Fall liegt insbesondere bei denjenigen Apolipoproteinen vor, die so beschaffen sind, daß ein bestimmtes Apolipoprotein von Lipoproteinteilchen getragen ist, die sich untereinander durch ihre Ladung von anderen Apolipoproteinen unterscheiden.
Zwei Lipoproteinteilchen, die beide das gleiche bestimmte Apolipoprotein tragen, sind untereinander verschieden, wenn eines der Teilchen außerdem mindestens ein anderes Apolipoprotein enthält, das sich von eventuellen anderen Apolipoproteinen, die von den anderen Liproproteinteilchen getragen werden, unterscheidet.
Das vorstehend Gesagte kann verallgemeinert werden, um zu definieren, daß "n" Lipoproteinteilchen, die alle ein gleiches, bestimmtes Apolipoprotein tragen, untereinander unterschiedlich sind.
In diesem Fall sind die Lipoproteinteilchen unabhängig, nicht jedoch die Apolipoproteine.
Die Techniken zur Apolipoproteinbestimmung sind oben genannt, man kennt heute aber noch keine einfache und zuverlässige Labortechnik, die zur Anwendung bei der klinischen Routineanalytik geeignet ist und weder eine Vorbehandlung des die gebundenen Antigene, insbesondere die zu bestimmenden Apolipoproteine, enthaltenden biologischen Mediums noch eine hochentwickelte Ausrüstung erfordert.
Einer der Aspekte der Erfindung ist es, ein neues Verfahren zur simultanen Bestimmung einer oder mehrerer Unterensembles von Apolipoproteinen, die in einem biologischen Medium enthalten sind, vorzuschlagen, das keine vorherige Modifikation des biologischen Mediums zur Eliminierung der unerwünschten Teilchen benötigt.
Einer der weiteren Aspekte der Erfindung ist es, ein neues Verfahren der direkten Bestimmung eines oder mehrerer Unterensembles von Apolipoproteinen vorzuschlagen, das im Rahmen der klinischen Routineanalyse auf einfache Weise ausgeführt werden kann.
Einer der weiteren Aspekte der Erfindung ist es, ein schnelles und zuverlässiges Bestimmungsverfahren für eines oder mehrere Unterensembles von Apolipoproteinen vorzuschlagen.
Einer der weiteren Aspekte der Erfindung ist es, ein neues Bestimmungsverfahren für ein oder mehrere Unterensemble(s) von Apolipoproteinen vorzuschlagen, das keine Anwendung einer hochentwikkelten Ausrüstung erfordert.
Einer der weiteren Aspekte der Erfindung ist es, Trägerflächen wie gebrauchsfertige Platten oder Filme bzw. Folien zur Anwendung in der direkten Bestimmung eines oder mehrerer Unterensembles von in einem biologischen Medium enthaltenen Apolipoproteinen ohne Vorbehandlung dieses biologischen Mediums vorzuschlagen.
Einer der weiteren Aspekte ist es, ein Bestimmungskit oder -mittel vorzuschlagen, das eine einfache, schnelle und zuverlässige direkte Bestimmung eines oder mehrerer Unterensembles von Apolipoproteinen erlaubt.
Diese unterschiedlichen Aspekte der Erfindung beruhen auf der völlig unerwarteten Feststellung, daß zwei Gruppen von unterschiedlichen und unabhängigen Teilchen (a) und (b), (a) tragend ein Antigen I und (b) tragend das gleiche Antigen I und ein davon verschiedenes, anderes Antigen II, wobei diese Teilchen (a) und (b) in einem nicht vorbehandelten biologischen Medium enthalten sind, sich gegenüber der Präzipitation, wenn sie der Gegenwart eines Gemisches von Antikörpern anti I und Antikörpern anti II ausgesetzt werden, unter geeigneten Bedingungen in der gleichen Weise verhalten können, als wenn, in getrennter Weise, die Teilchen (b) der Gegenwart der Antikörper anti II und die Teilchen (a) der Gegenwart der Antikörper anti I ausgesetzt wären.
Man stellt also völlig unerwartet fest, daß, unter geeigneten Bedingungen, die Teilchen (b), die gleichzeitig das Antigen I und das Antigen II enthalten, nur durch die Antikörper anti II ausgefällt werden, und daß die Gegenwart von Antikörpern anti I nicht die Präzipitation von bestimmten Teilchen (b) mit sich bringt und die Präzipitation der Teilchen (b) durch die Antikörper anti II nicht stört; dies gestattet die jeweilige Bestimmung des von den Teilchen (a) getragenen Antigens I und des Antigens II.
Genauer gesagt, beruht diese Erfindung auf der völlig unerwarteten Feststellung, daß ausgehend von einem nicht vorbehandelten biologischen Medium, das zwei Gruppen von unterschiedlichen und unabhängigen Teilchen (a) und (b) enthält, wobei die Teilchen (a) ein Antigen I und die Teilchen (b) das gleiche Antigen I und ein anderes Antigen II tragen, und durch Beimischen eines Gemisches von Antikörpern anti I und Antikörpern anti II in ein Immunodiffusionsgel in den Verhältnissen, in denen die Antikörper anti II im Überschuß in bezug auf Antikörper anti I vorliegen, man zwei Präzipitationsfronten erhält, von denen diejenige, die diesseits der anderen liegt, zur Präzipitation der Teilchen (b) gehört.
Gemäß ihrem allgemeinsten Aspekt schlägt die Erfindung ein Verfahren zur simultanen Bestimmung des Gehaltes an jeder von zwei oder mehreren Gruppen von unterschiedlichen und unabhängigen Teilchen in einem Teilchengemisch mittels differentieller Immunodiffusion der genannten Teilchengruppen an einem Gel vor, wobei die Teilchengruppen folgendes enthalten:
1. eine erste Gruppe von Teilchen, die jeweils ein erstes Antigen aufweisen und
2. mindestens eine zweite Gruppe von Teilchen, die jeweils ein zweites Antigen aufweisen und von denen mindestens einige das genannte erste Antigen tragen, wobei das genannte zweite Antigen nicht von den Teilchen der ersten Gruppe getragen wird,
mit den folgenden Verfahrensschritten:
- Behandlung des Teilchengemisches mit einem Gemisch von Antikörpern, welches einen ersten, gegen das erste Antigen gerichteten Antikörper und einen zweiten, gegen das zweite Antigen gerichteten Antikörper umfaßt, wobei das Antikörpergemisch den ersten Antikörper mindestens in einer zur Ausfällung der ersten Gruppe in dem Teilchengemisch ausreichenden Menge enthält, und wobei das Antikörpergemisch den zweiten Antikörper mindestens in einer zur Ausfällung der zweiten Gruppe in dem Teilchengemisch ausreichenden Menge und im Überschuß zu der genannten Menge des ersten Antikörpers enthält, so daß der jeweilige Gehalt an der jeweils ersten und zweiten Gruppe in dem genannten Teilchengemisch bestimmt werden kann.
Zur Ausführung dieses Verfahrens schlägt die Erfindung gleichermaßen ein Kit vor zur simultanen Bestimmung des Gehaltes an jeder von zwei oder mehreren Gruppen von unterschiedlichen und unabhängigen, Antigene tragenden Teilchen in einem Gemisch von Antigenen tragenden, vorstehend definierten Teilchen, der eine Gelplatte und ein vorbestimmte Mengen der die ersten und zweiten Antigene aufweisenden Teilchen enthaltendes Gemisch umfaßt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur simultanen Bestimmung durch differentielle Immunodiffusion an einem plattenförmigen Gel von Unterensembles von Apolipoproteinen, die jeweils zu Gruppen von in einem biologischen Medium enthaltenen Lipoproteinteilchen gehören, wobei diese Gruppen von Lipoproteinteilchen so beschaffen sind, daß sie ein "gemeinsames Apolipoprotein" einschließen und wie folgt definierbar sind:
- eine der im folgenden mit erste Gruppe bezeichneten Gruppen ist von Lipoproteinteilchen gebildet, die sämtlich das vorgenannte "gemeinsame Apolipoprotein" aufweisen, wobei das "gemeinsame Apolipoprotein" von sämtlichen der Lipoproteinteilchen der das erste Unterensemble bildenden ersten Gruppe getragen wird,
- die etwaige weitere Gruppe oder die etwaigen weiteren Gruppen, im folgenden als intermediäre Gruppen bezeichnet, sind so beschaffen, daß sie teilweise oder ganz von Lipoproteinteilchen gebildet sind, die das oben definierte gemeinsame Apolipoprotein tragen, wobei diese Lipoproteinteilchen außerdem alle mindestens ein Apolipoprotein tragen, das sich von etwaigen anderen, von den Lipoprotein teilchen der ersten Gruppe getragenen Apolipoproteinen unterscheidet, und, im Fall von mehreren intermediären Gruppen, tragen die Lipoproteinteilchen, die jeweils jede intermediäre Gruppe bilden, mindestens ein Apolipoprotein, das sich von denjenigen unterscheidet, die von den Lipoproteinteilchen der anderen intermediären Gruppe oder der anderen intermediären Gruppen getragen werden, dieses oder diese Apolipoproteine, die von den Lipoproteinteilchen einer jeden der intermediären Gruppen getragen werden und die sich von den das erste Unterensemble bildenden Apolipoproteinen unterscheiden, die von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen werden und sich von etwaigen anderen, von den Lipoproteinteilchen der anderen intermediären Gruppen, die das oder die intermediären Unterensembles bilden, Apolipoproteinen getragen werden, unterscheiden,
die letzte Gruppe, die folgendermaßen beschaffen ist,
-sie ist entweder von Lipoproteinteilchen gebildet, die alle das oben definierte "gemeinsame Apolipoprotein" und darüber hinaus mindestens ein Apolipoprotein enthalten, das sich von den gegebenenfalls vorhandenen, von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragenen Apolipoproteinen und von den gegebenenfalls vorhandenen, von den Lipoproteinteilchen der etwaigen intermediären Gruppen getragenen Apolipoproteinen unterscheidet, wobei das oder die Apolipoprotein(e), das oder die sich von etwaigen anderen, von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragenen Apolipoproteinen und von etwaigen, von den Lipoproteinteilchen etwaiger intermediärer Gruppen getragenen Apolipoproteinen unterscheidet bzw. unterscheiden, das letzte Unterensemble bilden;
-oder sie ist von Lipoproteinteilchen gebildet, von denen einerseits ein Teil das vorgenannte "gemeinsame Apolipoprotein" und darüber hinaus mindestens ein Apolipoprotein aufweist, das sich von gegebenenfalls vorhandenen, von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragenen Apolipoproteinen und von gegebenenfalls vorhandenen, von den Lipoproteinteilchen etwaiger intermediärer Gruppen getragenen Apolipoproteinen unterscheidet, und von denen andererseits der Rest der Lipoproteinteilchen nicht das vorgenannte, oben definierte gemeinsame Apolipoprotein aufweist, sondern mindestens eines der von dem Teil der oben definierten Lipoproteinteilchen getragenen Apolipoproteine aufweist, das sich von etwaigen anderen, von der ersten Gruppe von Lipoproteinteilchen getragenen Apolipoproteinen und von etwaigen, von Lipoproteinteilchen etwaiger intermediären Gruppen getragenen Apolipoproteinen unterscheidet, wobei dieses oder diese Apolipoproteine, die sich von etwaigen anderen, von Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragenen Apolipoproteinen und von etwaigen, von den Lipoproteinteilchen etwaiger intermediären Gruppen getragenen Apolipoproteinen unterscheiden, das letzte Unterensemble bilden;
ist dadurch gekennzeichnet, daß
- man das die zu bestimmenden Unterensembles enthaltende biologische Medium mit einem Antikörpergemisch zusammenbringt, das
. einerseits gegen das oder jedes der das letzte Unterensemble bildende(n) Apolipoprotein(e) gerichtete Antikörper, und zwar in einer für die Ausfällung der Lipoproteine der letzten Gruppe (tragend die das letzte Unterensemble bildenden Apolipoproteine) ausreichenden Menge,
. andererseits gegebenenfalls gegen das oder die das oder die intermediäre(n) Unterensemble bildende(n) Apolipoprotein(e) gerichtete Antikörper in einer zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen der etwaigen intermediären Gruppe(n) (tragend die die intermediären Unterensembles bildenden Apolipoproteine) ausreichenden Menge,
. andererseits gegen das das erste Unterensemble bildende, vorstehend definierte gemeinsame Apolipoprotein gerichtete Antikörper, und zwar in einer zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe (tragend das das erste Unterensemble bildende Apolipoprotein) ausreichenden Menge,
enthält;
- wobei die Menge der zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen der letzten Gruppe (tragend die das letzte Unterensemble bildenden Apolipoproteine) erforderlichen vorgenannten Antikörper im Überschuß gegenüber der Menge etwaiger vorgenannter, zur Ausfällung von Lipoproteinteilchen der etwaigen anderen intermediären Gruppe(n) (tragend die die etwaige(n) intermediäre(n) Gruppe(n) bildenden Apolipoproteine) vorhanden sind;
- wobei die zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen gegebenenfalls vorhandener intermediärer Gruppen erforderliche(n) Menge(n) von Antikörpern im Überschuß vorhanden ist bzw. sind gegenüber der Menge der vorgenannten Antikörper, die zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe (tragend das das erste Unterensemble bildende Apolipoprotein) erforderlich sind, und wobei im Falle von mehreren intermediären Gruppen die zur Ausfällung der intermediären Gruppen erforderlichen Mengen von Antikörpern jeweils im Überschuß gegenüber anderen gemäß einer vorbestimmten Reihenfolge vorhanden sind;
und zwar in einem Verhältnis, daß man nach der Immunodiffusion mindestens zwei diskrete Fronten erhält, wobei die Immunodiffusionsfront, die sich am nächsten zu dem Auftragsort des die zu bestimmenden Unterensembles enthaltenden Mediums befindet, der Ausfällung der Lipoproteinteilchen entspricht, die die das letzte Unterensemble bildenden Apolipoproteine tragen, wobei die Immunodiffusionsfront, die sich am weitesten von dem vorgenannten Auftragsort entfernt befindet, der Ausfällung der Lipoproteinteilchen entspricht, die das das erste Unterensemble bildende Apolipoprotein tragen, und wobei die gegebenenfalls vorhandene(n) Immunodiffusionsfront(en) mit einem Zwischenabstand zwischen der am nächsten liegenden vorgenannten Front und der am weitesten entfernten vorgenannten Front der Ausfällung von gegebenenfalls vorhandenen Lipoproteinteilchen entspricht/entsprechen, die das oder die die intermediären Unterensembles bildende(n) Apolipoprotein(e) tragen;
- und daß man die jeweils maximalen Abstände zwischen dem Auftragsort und jeder der Immunodiffusionsfronten mißt und jeden der Abstände mit denjenigen bei einem Eichmedium erhaltenen vergleicht, das bekannte Mengen an Apolipoproteinen der jeweiligen Unterensembles enthält.
Es wird nachfolgend in Erinnerung gerufen, daß ein Lipoproteinteilchen durch die Wirkung einer Antigen-Antikörperreaktion ausfällt, die zwischen einem der von dem Lipoproteinteilchen getragenen Apolipoproteine und dem gegen das vorgenannte Apolipoprotein gerichteten Antikörper stattfindet, und daß die Bestimmung das von dem vorgenannten Lipoproteinteilchen getragene Apolipoprotein betrifft.
Man hat völlig unerwartet festgestellt, daß die Immunodiffusionsfronten (entsprechend jeweils der Präzipitation der ersten Gruppe von Lipoproteinteilchen, der oder den etwaigen intermediären Gruppen von Lipoproteinteilchen und der letzten Gruppe von Lipoproteinteilchen, welche jeweils zum ersten Unterensemble von zu bestimmenden Apolipoproteinen, zu dem oder den etwaigen intermediären Unterensembles von zu bestimmenden Apolipoproteinen und zum letzten Unterensemble von zu bestimmenden Apolipoproteinen gehören), wenn das biologische Medium ohne Vorbehandlung mit einer Mischung von oben definierten Antikörpern zusammengebracht wird, mit denjenigen Immunodiffusionsfronten identisch sind, die man erhält, wenn man nach Trennung der oben definierten unterschiedlichen Gruppen von Lipoproteinteilchen
- einerseits die erste Gruppe von Lipoproteinteilchen mit gegen das gemeinsame Apolipoprotein, das das erste, oben definierte Unterensemble bildet, gerichteten Antikörpern zusammenbringt, und zwar in einer Menge, die mit der oben zum Ausfällen der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe, die nicht vom biologischen Medium getrennt sind und das das erste Unterensemble bildende Apolipoprotein tragen, angewendeten Menge übereinstimmt,
- andererseits die etwaige(n) intermediäre(n) Gruppe(n) von Lipoproteinteilchen mit gegen die Apolipoproteine, die das oder die etwaige(n) intermediäre(n) oben definierte(n) Unterensemble(s) bilden, gerichteten Antikörpern zusammenbringt, und zwar in der gleichen Menge, wie oben für die Ausfällung der Lipoproteinteilchen der etwaige(n) intermediäre(n) Gruppe(n), die nicht von dem biologischen Medium getrennt wurde(n) und die die das oder die etwaige(n) intermediäre(n) Unterensemble(s) bildenden Apolipoproteine tragen,
- andererseits die letzte Gruppe von Lipoproteinteilchen mit gegen die Apolipoproteine, die das letzte oben definierte Unterensemble bilden, gerichteten Antikörpern zusammenbringt, und zwar in der gleichen Menge wie die oben für die Ausfällung der Lipoproteinteilchen der letzten Gruppe angewendete, die nicht von dem bioiogischen Medium getrennt wurden und die die das letzte Unterensemble bildenden Apolipoproteine tragen.
Was die gegebenenfalls vorhandenen intermediären Immunodiffusionsfronten betrifft, so sind diese im Verhältnis zueinander in der Reihenfolge positioniert, die durch die Überschüsse der oben erwähnten Antikörper vorbestimmt ist, die intermediare Immunodiffusionsfront, die der der Präzipitation der letzten Gruppe entsprechenden Immunodiffusionsfront am nächsten liegt, ist diejenige, die der Präzipitation einer intermediären Gruppe durch die zugehörigen Antikörper entspricht, deren Menge im Überschuß gegenüber allen anderen Mengen von Antikörpern vorliegt, die zur Präzipitation der anderen intermediären Gruppen nötig sind.
Anders gesagt befindet sich ein der Präzipitation einer intermediären Gruppe von Lipoproteinteilchen entsprechender Peak diesseits von einem anderen Peak, der der Präzipitation einer anderen intermediären Gruppe von Lipoproteinteilchen entspricht, wenn die Menge der Antikörper, die die Präzipitation der ersten, oben in Frage stehenden Gruppe verursachen, im Überschuß vorliegt gegenüber der Menge der Antikörper, die die Präzipitation der anderen intermediären Gruppe verursachen.
Das Verfahren zur simultanen Bestimmung durch differentielle Immunodiffusion an einem Plattenförmigen Gel von mindestens drei Unterensembles von Apolipoproteinen, die jeweils zu Gruppen von in einem biologischen Medium enthaltenen Lipoproteinteilchen gehören, wobei diese drei Gruppen von Lipoproteinen so beschaffen sind, daß sie ein "gemeinsames Apolipoprotein" enthalten, und wobei
- eine der im folgenden mit erste Gruppe bezeichneten Gruppen von Lipoproteinteilchen gebildet ist, die sämtlich das vorgenannte "gemeinsame Apolipoprotein" und gegebenenfalls andere Apolipoproteine Xm aufweisen, wobei dieses "gemeinsame Apolipoprotein", das von samtlichen der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen wird, das erste Unterensemble bildet, und
- eine andere Gruppe, die im folgenden mit zweite Gruppe oder intermediäre Gruppe bezeichnet wird, so beschaffen ist, daß sie
- entweder von Lipoproteinteilchen gebildet ist, die sämtlich das oben definierte "gemeinsame Apolipoprotein" enthalten und darüber hinaus mindestens ein Apolipoprotein Yn aufweisen, das sich von den gegebenenfalls vorhandenen anderen Apolipoproteinen Xm, welche von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen werden, unterscheidet, wobei dieses bzw. diese Apolipoprotein(e) Yn das zweite Unterensemble oder intermediäre Ensemble bildet bzw. bilden;
- oder von Lipoproteinteilchen gebildet ist, von denen einerseits ein Teil das obengenannte "gemeinsame Apolipoprotein", das das erste Unterensemble bildet, und darüber hinaus mindestens ein Apolipoprotein Zp aufweist, das sich von den gegebenenfalls vorhandenen anderen Apolipoproteinen Xm, die von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen werden, unterscheidet, und von denen andererseits der Rest der Lipoproteinteilchen nicht das obengenannte "gemeinsame Apolipoprotein", sondern mindestens eines der Apolipoproteine Zp aufweist, die von dem Teil der oben definierten Lipoproteinteilchen getragen werden und sich von den gegebenenfalls vorhandenen anderen Apolipoproteinen Xm, die von der ersten Gruppe der Lipoproteinteilchen getragen werden, unterscheidet, wobei dieses bzw. diese Apolipoprotein(e) Zp das zweite oder intermediäre Unterensemble bilden,
- eine dritte oder letzte Gruppe, die so beschaffen ist, daß sie
- entweder von Lipoproteinteilchen gebildet ist, die alle das oben definierte "gemeinsame Apolipoprotein" enthalten und darüber hinaus mindestens ein Apolipoprotein Wq enthalten, das sich einerseits von den gegebenenfalls vorhandenen anderen Apolipoproteinen Xm, welche von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen werden, und andererseits von den von den Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe getragenen Apolipoproteinen unterscheidet, wobei dieses oder diese Apolipoprotein(e) Wq das dritte oder letzte Unterensemble bilden;
- oder von Lipoproteinteilchen gebildet ist, von denen einerseits ein Teil das vorgenannte "gemeinsame Apolipoprotein" aufweist und darüber hinaus mindestens ein Apolipoprotein T&sub1; aufweist, das sich gleichzeitig von etwaigen anderen Apolipoproteinen Xm, die von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen werden, und von Apolipoproteinen, die von den Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe getragen werden, unterscheidet, und von denen andererseits der Rest der Lipoproteinteilchen nicht das vorgenannte "gemeinsame Apolipoprotein" aufweist, sondern mindestens eines der Apolipoproteine T&sub1;, die von dem oben definierten Teil der Lipoproteinteilchen getragen werden, aufweist, wobei dieses oder diese Apolipoprotein(e) T&sub1; das dritte oder letzte Unterensemble bilden;
ist dadurch gekennzeichnet, daß man
- das die zu bestimmenden Unterensembles enthaltende biologische Medium mit einem Gemisch von Antikörpern zusammenbringt, das
. Antikörper enthält, die gegen das oder jedes der das dritte oder letzte Unterensemble bildenden Apolipoproteine gerichtet sind, und zwar in einer zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen der dritten oder letzten Gruppe ausreichenden Menge
. Antikörper enthält, die gegen das oder jedes der das zweite oder intermediäre Unterensemble bildende Apolipoproteine gerichtet sind, und zwar in einer zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten oder intermediären Gruppe ausreichenden Menge;
. Antikörper enthält, die gegen das "gemeinsame Apolipoprotein" in den Unterensembles gerichtet sind und die das erste Unterensemble bilden, und zwar in einer zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe ausreichenden Menge;
- wobei die Menge der für die Ausfällung der Lipoproteinteilchen der dritten oder letzten Gruppe erforderlichen Antikörper im Überschuß gegenüber der für die Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten oder intermediären Gruppe erforderlichen Menge der vorgenannten Antikörper vorhanden ist, wobei diese letzte Menge der vorgenannten, zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten oder intermediären Gruppe erforderlichen Antikörper selbst im Überschuß gegenüber der Menge der vorgenannten Antikörper, die zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen erforderlich sind, die das das erste Unterensemble bildende "gemeinsame Apolipoprotein" aufweisen, vorhanden sind, und zwar in einem Verhältnis, daß man nach der Immunodiffusion drei diskrete Fronten erhält, wobei die Immunodiffusionsfront, die sich am nächsten zu dem Auftragsort des die zu bestimmenden Unterensembles enthaltenden biologischen Mediums befindet, der Ausfällung der Lipoproteinteilchen der dritten oder letzten Gruppe, und die Immunodiffusionsfront, die sich am entferntesten von dem genannten Auftragsort befindet, der Ausfällung von Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe entspricht, und wobei die intermediäre Immunodiffusionsfront zwischen der vorgenannten, am nächsten liegenden Front und der vorgenannten, am weitesten entfernten Front der Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe entspricht;
- und daß man die jeweiligen maximalen Abstände zwischen dem Auftragsort und jeder der drei Immunodiffusionsfronten mißt und jeden der Abstände in bezug auf diejenigen vergleicht, die mit einem biologischen Eichmedium erhalten werden, das bekannte Mengen an den jeweiligen Apolipoproteinen der drei Unterensembles enthält.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die oben als zweite oder intermediäre Gruppe bezeichnete Gruppe vorzugsweise von Lipoproteinteilchen gebildet, die sämtlich das oben definierte "gemeinsame Apolipoprotein" tragen und die darüber hinaus mindestens ein Apolipoprotein Yn tragen, das sich von etwaigen anderen Apolipoproteinen Xm unterscheidet, die von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen werden, wobei das oder die Apolipoprotein(e) Yn das zweite oder intermediäre Unterensemble bilden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur simultanen Bestimmung durch differentielle Immunodiffusion an einem plattenförmigen Gel von mindestens zwei Unterensembles von Apolipoproteinen, die jeweils zu mindestens zwei Gruppen von Lipoproteinteilchen gehören, welche in dem biologischen Medium enthalten sind, wobei die zwei Gruppen von Lipoproteinteilchen so beschaffen sind, daß sie ein "gemeinsames Apolipoprotein" enthalten,
- wobei eine der Gruppen, die nachfolgend mit erste Gruppe bezeichnet wird, aus Lipoproteinteilchen gebildet ist, die sämtlich das obengenannte "gemeinsame Apolipoprotein" aufweisen und gegebenenfalls andere Apolipoproteine Xm tragen, wobei das "gemeinsame Apolipoprotein" von sämtlichen Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen wird und das erste Unterensemble bildet, und die andere Gruppe, die im folgenden mit zweite Gruppe bezeichnet wird, so beschaffen ist, daß sie:
- entweder von Lipoproteinteilchen gebildet ist, die sämtlich das oben definierte "gemeinsame Apolipoprotein" enthalten und darüber hinaus mindestens ein Apolipoprotein Yn aufweisen, das sich von den gegebenenfalls vorhandenen anderen Apolipoproteinen Xm, welche von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen werden, unterscheidet, wobei dieses bzw. diese Apolipoprotein(e) Yn das zweite Unterensemble bildet bzw. bilden;
- oder von Lipoproteinteilchen gebildet ist, von denen einerseits ein Teil das obengenannte, die das erste Unterensemble bildende "gemeinsame Apolipoprotein" der ersten Gruppe und darüber hinaus mindestens ein Apolipoprotein Zp aufweist, das sich von den gegebenenfalls vorhandenen anderen Apolipoproteinen Xm, die von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen werden, unterscheidet, und von denen andererseits der Rest der Lipoproteinteilchen nicht das obengenannte "gemeinsame Apolipoprotein", das das erste Unterensemble bildet, sondern mindestens eines der Apolipoproteine Zp aufweist, die von dem Teil der oben definierten Lipoproteinteilchen getragen werden und sich von den gegebenenfalls vorhandenen anderen Apolipoproteinen Xm, die von der ersten Gruppe der Lipoproteinteilchen getragen werden, unterscheidet, wobei dieses bzw. diese Apolipoprotein(e) Zp das zweite Unterensemble bilden,
ist dadurch gekennzeichnet, daß man
- das die zwei zu bestimmenden Unterensembles von Apolipoprotein enthaltende biologische Medium mit einem Gemisch von Antikörpern zusammenbringt, das
. einerseits Antikörper enthält, die gegen das oder jedes der das zweite Unterensemble (Yn oder Zp) bildende Apolipoproteine gerichtet sind, und zwar in einer zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe ausreichenden Menge;
. andererseits Antikörper enthält, die gegen das vorgenannte, das erste Unterensemble bildende "gemeinsame Apolipoprotein" gerichtet sind, und zwar in einer zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe ausreichenden Menge;
- wobei die Menge der für die Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe erforderlichen Antikörper im Überschuß gegenüber der für die Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe erforderlichen Menge der vorgenannten Antikörper vorhanden ist, und zwar in einem Verhältnis, daß man nach der Immunodiffusion zwei diskrete Fronten enthält, wobei die Immunodiffusionsfront, die sich am nächsten zu dem Auftragsort des die zwei zu bestimmenden Unterensembles enthaltenden biologischen Mediums befindet, der Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe und die Immunodiffusionsfront, die sich am entferntesten von den genannten Auftragsort befindet, der Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe entspricht, und wobei die zwei Fronten jeweils identisch sind mit denjenigen, die man unter Bedingungen erhält, unter denen man nach dem Trennen der zwei Gruppen von Lipoproteinteilchen, welche das erste bzw. das zweite Unterensemble von Apolipoproteinen enthalten, einerseits die erste Gruppe der Lipoproteinteilchen mit gegen das gemeinsame Apolipoprotein, das das erste, oben definierte Unterensemble bindet, gerichteten Antikörpern zusammenbringt, und zwar in der gleichen Menge wie die oben für die Ausfällung der nicht von dem biologischen Medium getrennten und das Apolipoprotein des ersten Unterensembles tragenden Lipoproteinteilchen, und daß man andererseits die zweite Gruppe von Lipoproteinteilchen in Kontakt mit den gegen die Apolipoproteine, die das oben definierte zweite Unterensemble binden, bringt, und zwar in der gleichen Menge zu der oben verwendeten, um die nicht aus dem biologischen Medium abgetrennten Lipoproteinteilchen, die die Apolipoproteine, die das zweite Unterensemble bilden, tragen, auszufällen,
- und daß man die jeweiligen maximalen Abstände zwischen dem Auftragsort und jeder der zwei Immunodiffusionsfronten mißt und jeden der Abstände in bezug auf diejenigen vergleicht, die mit einem biologischen Vergleichsmedium erhalten werden, das bekannte Mengen an den jeweiligen Apolipoproteinen der zwei Unterensembles enthält.
Man hat völlig unerwartet festgestellt, daß die Immunodiffusionsfronten, die der jeweiligen Präzipitation einer jeden der Gruppen der Lipoproteinteilchen entsprechen, welche jeweils einer der zu bestimmenden Unterensembles von Apolipoproteinen zuzuordnen sind, wie oben gezeigt ist.
Nachfolgend wird an einem Beispiel die Zusammensetzung von drei zu bestimmenden Unterensembles von Apolipoproteinen gezeigt, die zu drei Gruppen von Lipoproteinteilchen gehören.
Das erste Unterensemble ist von einem Apolipoprotein gebildet, das von allen Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen wird, und das gleichfalls von einem Teil der Lipoproteinteilchen mindestens der zweiten und dritten Gruppe getragen wird, oder das von allen Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe und von einem Teil mindestens der Lipoproteinteilchen der dritten Gruppe getragen wird.
Das zweite Unterensemble ist von einem Apolipoprotein gebildet, das sich von dem das erste Unterensemble bildenden Apolipoprotein unterscheidet, das aber von einem Teil mindestens der Lipoproteinteilchen der dritten Gruppe getragen wird.
Das dritte Unterensemble ist von Apolipoproteinen gebildet, die sich von jeweils das erste und das zweite Unterensemble bildenden Apolipoproteinen unterscheiden und die sich von etwaigen anderen Apolipoproteinen unterscheiden, die auf den Lipoproteinteilchen der ersten und der zweiten Gruppe getragen werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur simultanen Bestimmung durch differentielle Immunodiffusion an einem plattenförmigen Gel von zwei Unterensembles von Apolipoprotein, die jeweils zu zwei Gruppen von Lipoproteinteilchen gehören, welche in dem biologischen Medium enthalten sind, wobei die zwei Gruppen von Lipoproteinteilchen so beschaffen sind, daß sie ein "gemeinsames Apolipoprotein" enthalten,
- wobei eine der Gruppen, die nachfolgend mit erste Gruppe bezeichnet wird, aus Lipoproteinteilchen gebildet ist, die sämtlich das obengenannte "gemeinsame Apolipoprotein" aufweisen und gegebenenfalls andere Apolipoproteine Xm tragen, wobei das "gemeinsame Apolipoprotein" von sämtlichen Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen wird und das erste Unterensemble bildet, und die andere Gruppe, die im folgenden mit zweite Gruppe bezeichnet wird, so beschaffen ist, daß sie:
- entweder von Lipoproteinteilchen gebildet ist, die sämtlich das oben definierte "gemeinsame Apolipoprotein" enthalten und darüber hinaus mindestens ein Apolipoprotein Yn aufweisen, das sich von den gegebenenfalls vorhandenen anderen Apolipoproteinen Xm, welche von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen werden, unterscheidet, wobei dieses bzw. diese Apolipoprotein(e) Yn das zweite Unterensemble bildet bzw. bilden;
- oder von Lipoproteinteilchen gebildet ist, von denen einerseits ein Teil das obengenannte "gemeinsame Apolipoprotein" der ersten Gruppe und darüber hinaus mindestens ein Apolipoprotein Zp aufweist, das sich von den gegebenenfalls vorhandenen anderen Apolipoproteinen Xm, die von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen werden, unterscheidet, und von denen andererseits der Rest der Lipoproteinteilchen nicht das obengenannte "gemeinsame Apolipoprotein", das das erste Unterensemble bildet, sondern mindestens eines der Apolipoproteine Zp aufweist, die von dem Teil der oben definierten Lipoproteinteilchen getragen werden und sich von den gegebenenfalls vorhandenen anderen Apolipoproteinen Xm, die von der ersten Gruppe der Lipoproteinteilchen getragen werden, unterscheidet, wobei dieses bzw. diese Apolipoprotein(e) Zp das zweite Unterensemble bilden,
ist dadurch gekennzeichnet, daß man
- das die zwei zu bestimmenden Unterensembles von Apolipoprotein enthaltende biologische Medium mit einem Gemisch von Antikörpern zusammenbringt, das
. einerseits Antikörper enthält, die gegen das oder jedes der Apolipoproteine des zweiten Unterensembles (Yn oder Zp) gerichtet sind, und zwar in einer zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe ausreichenden Menge;
. andererseits Antikörper enthält, die gegen das vorgenannte "gemeinsame Apolipoprotein", der zwei Unterensembles gerichtet sind, und zwar in einer zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe ausreichenden Menge;
- wobei did Menge der für die Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe erforderlichen Antikörper im Überschuß gegenüber der für die Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe erforderlichen Menge der vorgenannten Antikörper vorhanden ist, und zwar in einem Verhältnis, daß man nach der Immunodiffusion zwei diskrete Fronten enthält, wobei die Immunodiffusionsfront, die sich am nächsten zu dem Auftragsort des die zwei zu bestimmenden Unterensembles enthaltenden biologischen Mediums befindet, der Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe und die Immunodiffusionsfront, die sich am entferntesten von dem genannten Auftragsort befindet, der Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe entspricht, und wobei die zwei Fronten jeweils identisch sind mit denjenigen, die man unter Bedingungen erhält, unter denen man nach dem Trennen der zwei Gruppen von Lipoproteinteilchen, welche das erste bzw. das zweite Unterensemble von Apolipoproteinen enthalten, einerseits die erste Gruppe der Lipoproteinteilchen mit gegen das gemeinsame Apolipoprotein der ersten Gruppe gerichteten Antikörpern zusammenbringt, und zwar in der gleichen Menge wie die oben für die Ausfällung der nicht von dem biologischen Medium getrennten und das Apolipoprotein des ersten Unterensembles tragenden Lipoproteinteilchen, und daß man andererseits die zweite Gruppe von Lipoproteinteilchen in Kontakt mit den gegen das bzw. die Apolipoprotein(e) des zweiten Unterensembles bringt, das bzw. die sich von dem bzw. den Apolipoprotein(en) des ersten Unterensembles und von den gegebenenfalls vorhandenen anderen, von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragenen Apolipoproteinen unterscheidet bzw. unterscheiden, und zwar in der gleichen Menge zu der oben verwendeten, um die nicht aus dem biologischen Medium abgetrennten Lipoproteinteilchen, die die Apolipoproteine des zweiten Unterensembles tragen, auszufällen,
- und daß man die jeweiligen maximalen Abstände zwischen dem Auftragsort und jeder der zwei Immunodiffusionsfronten mißt und jeden der Abstände in bezug auf diejenigen vergleicht, die mit einem biologischen Vergleichsmedium erhalten werden, das bekannte Mengen an den jeweiligen Apolipoproteinen der zwei Unterensembles enthält.
Das oben und auch im folgenden als erstes Unterensemble bezeichnete Unterensemble von Apolipoproteinen ist von einem einzigen Apolipoprotein gebildet, das tatsächlich das allen Lipoproteinteilchen der Teilchengruppe gemeinsame Apolipoprotein ist, die im vorhergehenden und im folgenden als erste Teilchengruppe bezeichnet ist. Das schließt nicht aus, daß die Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe gleichfalls andere Apolipoproteine enthalten.
Das im vorherigen und im folgenden als zweites Unterensemble bezeichnete Unterensemble von Apolipoproteinen ist von einem oder mehreren Apolipoproteinen gebildet, die sich einerseits von dem oben definierten gemeinsamen Apolipoprotein und andererseits von etwaigen anderen Apolipoproteinen unterscheiden, die von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen werden.
Jedoch sind das oder die Apolipoproteine des zweiten Unterensembles von den Lipoproteinteilchen getragen, von denen mindestens ein Teil das vorgenannte gemeinsaine Apolipoprotein aufweist.
Jedoch ist das vorgenannte gemeinsame Apolipoprotein, das von einem Teil mindestens der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe getragen wird, nicht Teil des zweiten Unterensembles von Apolipoproteinen.
Die zweite Gruppe von Lipoproteinteilchen kann vorteilhafterweise gebildet sein:
- entweder von Lipoproteinteilchen, die sämtlich das gemeinsame Apolipoprotein enthalten, und die mindestens ein Apolipoprotein enthalten, das sich von dem gemeinsamen Apolipoprotein und von etwaigen anderen Apolipoproteinen, die von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen werden, unterscheidet,
- oder von Lipoproteinteilchen, von denen ein Teil das vorgenannte gemeinsame Apolipoprotein enthält, und darüber hinaus mindestens ein Apolipoprotein, das sich von diesem gemeinsamen Apolipoprotein und von etwaigen anderen Apolipoproteinen, die von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen werden, unterscheidet, und von denen die Reste der Lipoproteinteilchen nicht das vorgenannte gemeinsame Apolipoprotein enthalten, aber mindestens ein Apolipoprotein enthalten, das mit demjenigen identisch ist, das in dem vorgenannten Teil als unterschiedlich gegenüber dem gemeinsamen Apolipoprotein und unterschiedlich gegenüber etwaigen anderen Apolipoproteinen, die von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen werden, definiert ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das erste Unterensemble von einem einzigen Apolipoprotein gebildet, das von freien und untereinander identischen Lipoproteinteilchen getragen wird, die die erste Gruppe bilden.
Man definiert als freies Lipoproteinteilchen ein Teilchen, das nur ein einziges Apolipoprotein enthält.
Gemäß einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die erste Gruppe einerseits von freien und untereinander identischen Lipoproteinteilchen gebildet, die das gemeinsame Apolipoprotein tragen und das erste Unterensemble bilden, und andererseits von komplexen Lipoproteinteilchen, die, außer dem vorgenannten gemeinsamen Apolipoprotein, mindestens ein Apolipoprotein tragen, das sich von dem vorgenannten gemeinsamen Apolipoprotein und von den das zweite Unterensemble bildenden Apolipoproteinen unterscheidet.
Als komplexe Lipoproteinteilchen bezeichnet man Teilchen, die mindestens zwei Apolipoproteine tragen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das zweite Unterensemble von einem Apolipoprotein gebildet, das von dem das erste Unterensemble bildenden gemeinsamen Apolipoprotein und von etwaigen anderen Apolipoproteinen verschieden ist, die von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen werden, wobei dieses das zweite Unterensemble bildende Apolipoprotein von komplexen Lipoproteinteilchen getragen wird, die außerdem sämtlich das vorgenannte, das erste Unterensemble bildende Apolipoprotein aufweisen.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das zweite Unterensemble von mindestens einem Apolipoprotein gebildet, das sich von dem das erste Unterensemble bildenden und von den gegebenenfalls vorhandenen anderen, von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragenen Apolipoproteinen unterscheidet, wobei das genannte Apolipoprotein einerseits von komplexen Teilchen, die darüber hinaus das das erste Unterensemble bildende Apolipoprotein aufweisen, und andererseits von einfachen oder komplexen Lipoproteinteilchen, welche nicht das das erste Unterensemble bildende Apolipoprotein aufweisen, getragen wird.
Bei dem biologischen Medium handelt es sich insbesondere um Blut.
Als Antikörper kann man monoklonale, polyklonale oder ebensogut oligoklonale Antikörper anwenden, d.h. Antikörper, die durch Immunisation mit synthetischen Peptiden, die die Struktur der Apolipoproteine kopieren, erhalten werden.
Was die Immunodiffusion betrifft, kann man die Methode der Elektroimmunodiffusion nach Laurell anwenden, wie sie beispielsweise in Clin. Chem. 1974, 20 (6), 676-681, beschrieben ist.
Die erhaltenen Immunodiffusionsfronten weisen die Konturen von Peaks auf. In Anbetracht der Tatsache, daß die von den ausgefällten Lipoproteinteilchen bedeckten Oberflächen proportional zu den Mengen der zu bestimmenden Apolipoproteine sind, und daß die Peaks alle etwa die gleiche Basis aufweisen, können die Mengen der Apolipoproteine, die durch Vergleich mit den ausgehend von einem biologischen Eichmedium erhaltenen Peaks bestimmt werden, aus der Höhe der Peaks abgeleitet werden.
Diese Methode ist besonders vorteilhaft, denn sie ist schnell.
Was die Immunodiffusion betrifft, kann man die Methode der Radialimmunodiffusion nach Mancini anwenden, die beispielsweise beschrieben ist in Mancini G. Carbonara AO, und Heremans JF. Immunochemical Quantitation of Antigens by Single Radial Immunodiffusion. Immunochemistry 1965, 2, 235.
Die Immunodiffusionsfronten sind Kreise, die den Konturen der Ringe entsprechen.
In Anbetracht der Tatsache, daß die von den ausgefällten Lipoproteinteilchen bedeckten Oberflächen proportional zu den Mengen der zu bestimmenden Apolipoproteine sind, werden die Mengen der Apolipoproteine, die durch Vergleich mit ausgehend von einem biologischen Eichmedium erhaltenen Ringen bestimmt werden, vom Quadrat des Durchmessers der entsprechenden Kreise abgeleitet.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Mindestmenge der einzusetzenden, gegen das bzw. die Apolipoprotein(e) des zweiten Unterensembles gerichteten Antikörper von dem Erscheinen von zwei diskreten Immunodiffusionsfronten bestimmt.
Im Rahmen der Erfindung wird die Menge der gegen das oder die Apolipoprotein(e) des zweiten Unterensembles gerichteten Antikörper, die zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe erforderlich ist, im Überschuß in bezug auf die Menge der gegen das Apolipoprotein des ersten Unterensembles gerichteten Antikörper, die zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe erforderlich sind, hinzugefügt, was zu einer Peakhöhe führt, die niedriger als die aus der Präzipitation der ersten Gruppe resultierenden Peakhöhe ist.
Die Menge der gegen das oder die Apolipoprotein(e) des zweiten Unterensembles gerichteten Antikörper, die zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe hinzugefügt wird, ist nicht auf einen Maximalwert begrenzt.
Indem man jedoch die Menge der gegen das oder die Apolipoprotein(e) des zweiten Unterensembles gerichteten Antikörper erhöht, verringert sich die Höhe des der Präzipitation der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe entsprechenden Peaks, und es gibt eine Menge von gegen die Apolipoproteine des zweiten Unterensembles gerichteten Antikörpern, von der ausgehend die Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe auf dem Auftragspunkt des biologischen Mediums ausgefällt werden.
Über diese Menge hinaus gibt es keine Diffusion von Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe mehr. In diesem Fall wird nur das Apolipoprotein des ersten Unterensembles bestimmt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt die Menge der gegen das oder die Apolipoprotein(e) des zweiten Unterensembles gerichteten Antikörper in einem Bereich, dessen Minimalwert von dem Erscheinen der zwei diskreten Immunodiffusionsfronten und dessen Maximalwert bestimmt wird, sobald die Lipoproteinteilchen, die die Apolipoproteine des zweiten Unterensembles tragen, nicht mehr diffundieren und an dem Auftragsort des biologischen Mediums ausgefällt werden, wobei die der Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe entsprechende Immunodiffusionsfront nicht verandert wird, wenn die Menge der gegen das bzw. die Apolipoproteine des zweiten Unterensembles gerichteten Antikörper größer ist als der Minimalwert, von dem ausgehend man das Erscheinen von zwei diskreten Immunodiffusionsfronten beobachtet.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Menge der gegen das bzw. die Apolipoprotein(e) des zweiten Unterensembles gerichteten Antikörper so bemessen, daß der maximale Abstand zwischen dem Auftragsort und der Immunodiffusionsfront, die der Ausfällung der die Apolipoproteine des zweiten Unterensembles enthaltenden Lipoproteinteilchen entspricht, zwischen etwa 1/2 bis etwa 1/8, vorzugsweise zwischen etwa 1/3 bis etwa 1/4, des maximalen Abstandes zwischen dem Auftragsort und der der Ausfällung der die Apolipoproteine des ersten Unterensembles enthaltenden Lipoproteinteilchen entsprechenden Immunodiffusionsfront beträgt.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Eichung ausgehend von einem Medium durchgeführt, in dem das erste Unterensemble eine bekannte Menge (A) an dem gleichfalls von einem Teil mindestens der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe getragenen Apolipoprotein und das zweite Unterensemble eine bzw. mehrere bekannte Menge(n) (B)i von Apolipoprotein(en), das bzw. die sich von dem Apolipoprotein des ersten Unterensembles sowie von den gegebenenfalls vorhandenen anderen, von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragenen Apolipoproteinen unterscheidet bzw. unterscheiden, enthält,
- indem man auf die Platte gegen jedes der Apolipoproteine des zweiten Unterensembles gerichtete Antikörper aufbringt, und zwar in einer für die Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe erforderlichen Menge, wobei jede dieser Mengen jeweils im Überschuß, bezogen auf zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe erforderliche Antikörper, eingesetzt wird, wobei der Überschuß der gegen die Apolipoproteine des zweiten Unterensembles gerichteten Antikörper, bezogen auf gegen das Apolipoprotein des ersten Unterensembles gerichtete Antikörper, durch die folgende Beziehung ausgedrückt werden kann:
in der V&sub1; und T&sub1; jeweils das Volumen und den Titer der gegen das Apolipoprotein des ersten Unterensembles sowie V2i und T2i jeweils die Volumina und die Titer der jeweils gegen jedes der Apolipoproteine des zweiten Unterensembles gerichteten Antikörper bedeuten.
Wenn man die Technik der Elektroimmunodiffusion anwendet, empfiehlt es sich, ausgehend davon, daß der relative Fehler der Messung der Höhe eines Peaks um so geringer ist, je größer die Höhe eines Peaks ist, bestmöglich von den nutzbaren Dimensionen der Platte für die Peaks zu profitieren.
Um so vorzugehen, bestimmt man:
1. die Menge von Antikörpern V&sub1; (bestimmt zur Ausfällung der das Apolipoprotein des ersten Unterensembles tragenden Lipoproteinteilchen (wobei dieses Apolipoprotein gleichfalls von einem Teil mindestens der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe getragen wird), damit die Höhe des erhaltenen Peaks H&sub1; ist; diese Bestimmung findet statt, indem man auf die Platte eine bekannte Menge der Antikörper v&sub1; entsprechend der Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe aufträgt, was eine Höhe h&sub1; ergibt, wobei die Menge V&sub1; anschließend nach der folgenden Formel berechnet wird:
wobei x % den Prozentsatz des den zwei Gruppen gemeinsamen, in dem ersten Unterensemble enthaltenen Apolipoproteins bedeutet, bezogen auf die Gesamtmenge dieses in dem Medium enthaltenen Apolipoproteins, und daß man bestimmt:
2. die Menge der Antikörper V&sub2; (bestimmt zur Ausfällung der das bzw. die Apolipoprotein(e) des zweiten Unterensembles, die verschieden von dem das erste Unterensemble bildenden Apolipoprotein und verschieden von gegebenenfalls vorhandenen anderen, von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragenen Apolipoproteinen sind, tragenden Lipoproteinteilchen), damit die Höhe des erhaltenen Peaks H&sub2; ist; diese Bestimmung findet statt, indem man auf die Platte eine bekannte Menge von Antikörpern v&sub2; entsprechend der Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe aufträgt, was eine Höhe h&sub2; ergibt, wobei die Menge V&sub2; anschließend nach der folgenden Formel berechnet wird:
Wenn man die Technik der radialen Immunodiffusion anwendet, ist man daran interessiert, daß der Ringdurchmesser so groß wie möglich ist, da der relative Fehler dieser Messung umso geringer ist, je größer dieser Durchmesser ist.
Um bestmöglich von den Abmessungen der Platte zu profitieren, geht man wie folgt vor.
Man bestimmt:
1. die Menge der Antikörper v&sub1; (bestimmt zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen, welche das Apolipoprotein des ersten Unterensembles tragen, wobei dieses Apolipoprotein gleichfalls von einem Teil mindestens der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe getragen wird), damit der Durchmesser des erhaltenen Ringes D&sub1; ist; diese Bestimmung findet statt, indem man auf die Platte eine bekannte Menge der Antikörper v&sub1;, entsprechend der Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe, aufbringt, was einen Durchmesser d&sub1; ergibt, wobei anschließend die Menge V&sub1; gemäß der folgenden Formel
berechnet wird, wobei x % den Prozentsatz des das erste Unterensemble bildenden Apolipoproteins bedeutet, bezogen auf die Gesamtmenge dieses in dem Medium enthaltenen Apolipoproteins,
und man bestimmt:
2. die Menge der Antikörper V&sub2;, (bestimmt zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen, welche das bzw. die Apolipoprotein(e) des zweiten Unterensembles tragen, die verschieden von dem das erste Unterensemble bildenden Apolipoprotein und verschieden von gegebenenfalls vorhandenen anderen, von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragenen Apolipoproteinen sind), damit der Durchmesser des erhaltenen Ringes D&sub2; ist; diese Bestimmung findet statt, indem man auf die Platte eine bekannte Menge von Antikörpern v&sub2; aufbringt, die der Ausfällung der Apolipoproteine des zweiten Unterensembles entspricht, was einen Radius d&sub2; ergibt, und anschließend die Menge V&sub2; nach der folgenden Formel
berechnet wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das erste Unterensemble von dem Apolipoprotein AI gebildet, das von den die erste Gruppe bildenden Lipoproteinteilchen LP AI und LP AI:E getragen wird, und das zweite Unterensemble von dem Apolipoprotein AII gebildet wird, das von den die zweite Gruppe bildenden Lipoproteinteilchen LP AI:AII und LPE:AII getragen wird, dadurch gekennzeichnet, daß man das die zwei zu bestimmenden Unterensembles enthaltende Medium mit einem Gemisch von Antikörpern zusammenbringt, die jeweils gegen das Apolipoprotein AII (Antikörper anti-AII) und gegen das Apolipoprotein AI (Antikörper anti-AI) gerichtet sind, und zwar unter solchen Bedingungen, daß die gegen das Apolipoprotein AII gerichteten Antikörper im Überschuß, bezogen auf die gegen das Apolipoprotein AI gerichteten Antikörper, vorliegen, wobei dieser Überschuß insbesondere der Tatsache entspricht, daß das Produkt des Wertes des Volumens der auf die Platte aufgetragenen Antikörper anti-AII durch den Wert des Titers der Antikörper anti-AII größer ist als das Produkt des Wertes des Volumens der auf die Platte aufgetragenen Antikörper anti-AI durch den Wert des Titers der Antikörper anti-AI, weil für eine normale Person die von den Teilchen LPAI und LPAI:E getragene Menge von Apolipoprotein AI etwa der Gesamtmenge von Apolipoprotein A&sub2; entspricht.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das erste Unterensemble von dem Apolipoprotein B gebildet, das von den die erste Gruppe bildenden Lipoproteinteilchen LPB getragen wird, und das zweite Unterensemble von den zwei Apolipoproteinen E und CIII gebildet wird, die von den die zweite Gruppe bildenden Lipoproteinteilchen LPB:E, LPB:CIII, LPE:CI:CII:CIII:B, LPAI:E und LPE:AII getragen werden, dadurch gekennzeichnet, daß man das die zwei zu bestimmenden Unterensemble enthaltende Medium mit einem Gemisch von Antikörpern zusammenbringt, die jeweils gegen das Apolipoprotein E (Antikörper anti-E) Apolipoprotein CIII (Antikörper anti-CIII) und Apolipoprotein B (Antikörper anti-B) gerichtet sind, und zwar unter solchen Bedingungen, daß einerseits die gegen das Apolipoprotein E gerichteten Antikörper im Überschuß, bezogen auf die gegen das Apolipoprotein B gerichteten Antikörper, und andererseits die gegen das Apolipoprotein CIII gerichteten Antikörper im Überschuß, bezogen auf die gegen das Apolipoprotein B gerichteten Antikörper vorliegen, wobei der Überschuß der Antikörper anti-CIII in bezug auf die Antikörper anti-B durch die Tatsache ausgedrückt werden kann, daß das Produkt des Wertes des Volumens der Antikörper anti-CIII durch den Wert des Titers der Antikörper anti-CIII größer als ein Sechstel des Produktes des Wertes des Volumens der Antikörper anti-B durch den Wert des Titers der Antikörper anti-B ist, und der Überschuß der Antikörper anti-E, bezogen auf Antikörper anti-B, durch die Tatsache ausgedrückt werden kann, daß das Produkt aus dem Wert des Volumens der Antikörper anti-E durch den Wert des Titers der Antikörper anti-E größer als ein Zwölftel des Produktes des Wertes des Volumens der Antikörper anti-B durch den Wert des Titers der Antikörper anti-B ist.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmt man drei Unterensembles von Apolipoproteinen, die jeweils zu drei Gruppen von Lipoproteinteilchen gehören, wobei das erste Unterensemble von dem zu den die erste Gruppe bildenden Lipoproteinteilchen LPB gehörenden Apolipoprotein B gebildet wird, das zweite Unterensemble von dem zu den die zweite Gruppe bildenden Lipoproteinteilchen LPB:E gehörenden Apolipoprotein E gebildet wird und das dritte Unterensemble von den zu den die dritte Gruppe bildenden Lipoproteinteilchen LPE:CI:CII:CIII:B, LPB:CIII, LPE:AII; LPAI:E, LPAI und LPAI:AII gehörenden Apolipoproteinen AI, AII und CIII gebildet wird, dadurch gekennzeichnet, daß man das die drei zu bestimmenden Unterensembles enthaltende Medium jeweils mit einem Gemisch von Antikörpern zusammenbringt, die gegen das Apolipoprotein CIII (Antikörper anti-CIII), gegen das Apolipoprotein AII (Antikörper anti-AII), gegen das Apolipoprotein AI (Antikörper anti-AI), gegen das Apolipoprotein E (Antikörper anti-E) und gegen das Apolipoprotein B (Antikörper anti-B) gerichtet sind, wobei die Antikörper anti-CIII, anti-AII und anti-AI jeweils im Überschuß, bezogen auf die Antikörper anti-E, und anti-B und die Antikörper E im Überschuß, bezogen auf die Antikörper anti-B, vorliegen.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmt man drei Unterensembles von Apolipoproteinen, die jeweils zu drei Gruppen von Lipoproteinteilchen gehören, wobei das erste Unterensemble von dem zu den die erste Gruppe bildenden Lipoproteinteilchen LPAI gehörenden Apolipoprotein A I gebildet wird, das zweite Unterensemble von dem zu den die zweite Gruppe bildenden Lipoproteinteilchen LPAI:AII gehörenden Apolipoprotein A II gebildet wird und das dritte Unterensemble von den zu den die dritte Gruppe bildenden Lipoproteinteilchen LPE:CI:CII: CIII:B, LPB:E, LPE:AII und LPAI:E gehörenden Apolipoprotein E gebildet wird, dadurch gekennzeichnet, daß man das die drei zu bestimmenden Unterensembles enthaltende Medium jeweils mit einem Gemisch von Antikörpern zusammenbringt, die gegen das Apolipoprotein E (Antikörper Anti E), gegen das Apolipoprotein A II (Antikörper Anti A II) und gegen das Apolipoprotein A I (Antikörper Anti A I) gerichtet sind, wobei die Antikörper Anti E jeweils im Überschuß, bezogen auf die Antikörper Anti A II und Anti A I vorliegen, und wobei die Antikörper Anti A II im Überschuß bezogen auf die Antikörper Anti E vorliegen.
Gegenstand der Vorliegenden Erfindung ist auch die Anwendung dieses neuen Bestimmungsverfahrens auf die in-vitro-Erkennung von Krankheiten, die insbesondere mit Apolipoproteinspiegeln korreliert sind, welche sich außerhalb eines durch allgemein einem physiologischen Zustand eines gesunden menschlichen Wesens oder Tieres entsprechende Extremwerte begrenzten Bereiches befinden.
Die Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur in-vitro-Erkennung der Risiken der Arteriosklerose, die mit Spiegeln des Apolipoproteins A I, des Apolipoproteins C II, oder des Apolipoproteins C III korreliert sind, welche sich außerhalb eines durch allgemein einem physiologischen Zustand eines gesunden Individuums entsprechende Extremwerte begrenzten Bereiches befinden.
Zur Erinnerung sei gesagt, daß die Konstitution von unterschiedlichen Lipoproteinteilchen eines Humanserums wie folgt schematisiert werden kann. (cf. Fruchart - Ann. Biol. Clin. 1986-44-116-121)
Nachfolgend wird die Konzentration üblicher physiopathologischer Werte der wichtigsten Apolipoproteine im Serum von erwachsenen Personen in Erinnerung gerufen.

Apolipoproteine

Apo A-I 1,10 bis 1,60 g/l
Apo A-II 0,27 bis 0,49 g/l
Apo B&sub1;&sub0;&sub0; 0,7 bis 1,3 g/l
Apo B&sub4;&sub8; vernachlässigbare Konzentration
Apo C-I 50 bis 110 mg/l
Apo C-II 10 bis 67 mg/l
Apo C-III 40 bis 140 mg/l
Apo E 35 bis 73 mg/l
Apo(a) 0,01 bis 2 500 mg/l
Die Erfindung betrifft vorteilhafterweise ein Verfahren zur in-vitro-Erkennung von Arterioskleroserisiken, die mit Spiegeln von von Lipoproteinteilchen LPAI und LPAI:E getragenen Apolipoproteinen AI korreliert sind, welche sich außerhalb eines durch einem physiologischen Zustand eines gesunden Individuums entsprechende Extremwerte der vorgenannten Apolipoproteine begrenzten Bereiches befinden, bei dem das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren angewendet wird.
Es ist tatsächlich gezeigt worden, daß die Bestimmung der Teilchen LPAI:E und LPAI signifikanter als die Bestimmung des Gesamtapolipoproteins AI ist.
Tatsächlich können diese Teilchen in die Zellen penetrieren und das Cholesterol binden, um es zur Leber zu transportieren, wo es metabolisiert wird.
Im Gegensatz dazu penetrieren die Teilchen LPAI:AII nicht in die Zellen und sind selbst Inhibitoren der Penetration von LPAI und LPAI:E.
Die Erfindung betrifft vorteilhafterweise ein Verfahren zur in-vitro-Erkennung der Arterioskleroserisiken, die mit Spiegeln von von Lipoproteinteilchen LPB getragenen Apolipoproteinen B korreliert sind, welche sich außerhalb eines durch einem physiologischen Zustand eines gesunden Individuums entsprechende Extremwerte der vorgenannten Apolipoproteine begrenzten Bereiches befinden, bei dem das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren angewendet wird.
Es ist gleichfalls gezeigt worden, daß die Bestimmung des Teilchens LPB charakteristischer für die Arterioskleroserisiken ist als die Bestimmung des Gesamtapolipoproteins B.
Die Erfindung betrifft gleichfalls Trägerflächen, insbesondere gebrauchsfertige Filme oder Platten für die Bestimmung wie auch zur in-vitro-Erkennung von Arterioskleroserisiken, die mit anomalen Spiegeln von Apolipoproteinen korreliert sind, welche ein Gemisch von Antikörpern enthalten, das jeweils der Erlangung eines Präzipitationsbereichs von Gruppen von Lipoproteinteilchen entspricht, die die Unterensembles von zu bestimmenden Teilchen aufweisen.
Die Erfindung betrifft gleichfalls Kits oder Mittel zur Bestimmung von Unterensembles von Apolipoproteinen, wie auch zur in-vitro-Erkennung der pathologischen Risiken, die mit anomalen Apolipoproteinspiegeln korreliert sind, wobei diese Kits oder Mittel umfassen:
- eine Trägerfläche, wie einen Film bzw. eine Folie oder eine Gelplatte, der bzw. die ein Gemisch von Antikörpern enthält, das der Präzipitation von Lipoproteinteilchen entspricht, die jeweils die Unterensembles von zu bestimmenden Apolipoproteinteilchen enthalten,
- eine Eichkurve oder vorzugsweise eine biologische Eichlösung in vorzugsweise mehreren bestimmten Verdünnungen, vorteilhafterweise drei oder vier bestimmten Verdünnungen, die eine bekannte Menge von Unterensembles von Apolipoproteinen enthalten, die man anderweitig in einem biologischen Medium bestimmen will.
Tatsächlich kann man zum Ausführen der Bestimmungen von Unterensembles von in einem biologischen Medium enthaltenen Apolipoproteinen auf eine Eichkurve zurückgreifen, die vorher anhand von Eichproben mit einem Gehalt an vorbestimmten Mengen an Unterensembles von Apolipoproteinen, welche anderweitig in einem biologischen Medium zu bestimmen sind, festgelegt wurde.
Es ist vorteilhaft, für jeden Film oder jede Gelplatte eine Eichkurve festzulegen, und um dies auszuführen, über Eichlösungen zu verfügen, die bekannte Mengen der Unterensembles von Apolipoproteinen enthalten, die man anderweitig in einem biologischen Medium bestimmen will, da bei der eigentlichen Analyse leichte Schwankungen auftreten können.
Im folgenden wird ein Ausführungsbeispiel gegeben, das sich auf die Bestimmungen von zwei Unterensembles von Apolipoproteinen AI und AII bezieht, wobei das erste Unterensemble von dem von den Teilchen LPAI:E und LPAI getragenen Apolipoprotein AI gebildet wird, das die erste Gruppe bildet, und wobei das zweite Unterensemble von dem Apolipoprotein AII gebildet wird, das von den Teilchen LPE:AII und LPAI:AII getragen wird.
Die Versuche werden auf Gelplatten der Dimension 10,3 x 8,3 cm mit einer Reihe von Reservoirs (Auftragsorte des biologischen Mediums), die 1,7 cm von der langen Seite und parallel dazu angeordnet ist, wobei 1 cm von jeder Seite mit Papierbrücken belegt sind. Es verbleiben 5,5 cm "nutzbare Höhe" oberhalb der Reservoirs.
Man legt willkürlich für eine normale Probe des biologischen Mediums eine Höhe von 3,5 cm für den Peak fest, der der Präzipitation der Lipoproteinteilchen LPAI:E und LPAI entspricht und eine Höhe von 1,5 cm für den Peak, der der Präzipitation der Lipoproteinteilchen LPE:AII und LPAI:AII entspricht.
Diese willkürlichen Werte der gewünschten Peakhöhe sind als Beispiel gegeben, um die Art und Weise zu zeigen, auf die man die Mengen der Antikörper Anti A I und Anti A II bestimmen kann, sie schränken die Technik in keiner Weise ein (soweit der der Präzipitation der Lipoproteinteilchen LPE:AII und LPAI:AII entsprechende Peak niedriger bleibt als der der Präzipitation der Lipoproteinteilchen LPAI:E und LPAI entsprechende Peak).
Man bestimmt zuerst die dem Gel beizumischende Menge von Antikörpern Anti A II, für die eine normnale Probe von biologischem Medium eine Peakhohe von 1,5 cm ergibt.
Die Probe wird auf eine Platte gebracht, die das Volumen v2 von Antikörpern Anti A II enthaält. Nach der Migration erhält man einen Peak der Höhe "h". Die Menge der beizumischenden Antikörper Anti A II ist dann:
Die Bestimmung der Menge der Antikörper Anti A I wird auf die gleiche Weise ausgeführt unter zusätzlicher Berücksichtigung der Tatsache, daß in der oben erwähnten biologischen Probe der Anteil von Antigen A I, das von den Lipoproteinteilchen LPAI:E und LPAI getragen wird, für eine Normalprobe ungefähr 25 % der Gesamtmenge des Antigens A I darstellt.
Wenn man auf einer Platte, die ein Volumen v1 des Antikörpers Anti A I enthält, einen Peak der Höhe "h'" erhält, ist die Menge von Antikörpern Anti A I, die auf eine Platte hinzuzufügen ist, die ein Volumen V2 von Antiköpern Anti A II enthält, die folgende:
Auf dieser Platte, die ein Volumen V1 von Antikörpern Anti AI und ein Volumen V2 von Antikörpern Anti II enthält, ergibt die Probe zwei Peaks:
. einen Peak, dessen Front dem Auftragsort der Probe am nachsten liegt und dessen Höhe 1,5 cm beträgt (erster Peak),
. einen Peak, dessen Front am weitesten entfernt vom Auftragsort der Probe liegt und dessen Höhe 3,5 cm beträgt (zweiter Peak).
Man kann bestätigen, daß die Höhe des ersten Peaks unabhängig von der Menge der Antikörper Anti A II ist, die in dem Gel zugegen ist (soweit der zweite Peak niedriger als der erste Peak bleibt).
Wenn man einem anderen Gel ein Volumen V1 von Antikörper Anti A I und zwei Volumina V2 von Antikörpern Anti A II beimischt, erhält man einen ersten Peak mit der gleichen Höhe und einen zweiten Peak, dessen Höhe der Hälfte desjenigen Peaks entspricht, der mit dem Volumen V2 erhalten wird.
In Fig. 1 ist schematisch eine Platte dargestellt, auf der die Bestimmung von zwei Unterensembles von Apolipoproteinen A I und A II durchgeführt worden ist, wie oben definiert.
Die Platte der Fig. 1 enthält eine Mischung von 0,8 ml von Antikörpern Anti AII (vom Titer 50) und 0,15 ml von Antikörpern Anti AI (vom Titer 175).
Die beiden ersten Peaks links und die beiden letzten Peaks rechts entsprechen denjenigen, die mit einem Eichserum bei der Verdünnung 1/20 erhalten werden (bezeichnet mit SE/20).
Die Versuche wurden mit 12 Eichseren durchgeführt, in denen man die Unterensembles der Apolipoproteine A-I und A-II bestimmen will, wie oben definiert. Diese 12 Proben werden in der Verdünnung 1/20 geprüft.
Fig. 2 entspricht einer Platte, die eine Mischung von Antikörpern Anti A-I und Anti A-II enthält, jeweils vom gleichen Titer wie auf der Platte Nr. 1, und auf der das volumen der Antikörper Anti A-I dem auf die Platte der Fig. 1 beigemischten entspricht, aber auf der das Volumen der Antikörper Anti A-II doppelt so groß wie das der Platte der Fig. 1 beigemischte ist.
Man stellt fest, daß für jedes der geprüften Seren die der Präzipitation der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe entsprechenden Peaks unverändert sind, während die der Präzipitation der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe entsprechenden Peaks halb so hoch sind wie die Peaks der zweiten Gruppe der ersten Platte.
Um die Gültigkeit des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens zu verifizieren, kann man zeigen, daß der erste Peak kein Apolipoprotein des zweiten Unterensembles enthält, während der erste und der zweite Peak das Apolipoprotein des ersten Unterensembles enthalten.
Um so vorzugehen, wendet man drei Gelplatten an, in die man eine Mischung von 0,15 ml von Antikörper Anti A I (Titer 220) und 1 ml von Antikörpern Anti A II (Titer 60) einbringt.
Die ersten drei Peaks links entsprechen einem Eichserum, das von links nach rechts jeweils auf 1/20, 1/10 und 1/5 verdünnt ist und die drei letzten Peaks rechts entsprechen einem Eichserum, das von rechts nach links jeweils auf 1/20, 1/10 und 1/5 verdünnt ist.
Die 10 anderen Peaks entsprechen den zu bestimmenden Seren, verdünnt auf 1/10.
Nach der Migration wird eine der Platten mit physiologischem Wasser gewaschen, dann getrocknet und mit einem Proteinfarbstoff wie Coomassie-Blau gefärbt. Man erhält zwei Peaks. Dies ist dargestellt auf der Platte der Fig. 3.
Die Fig. 4 entspricht einer der anderen Platten von den drei oben definierten Platten, die nach der Migration mit 300 ul einer Lösung von monoklonalen Antikörpern Anti A-II, markiert mit Peroxidase, inkubiert worden ist.
Das Entwickeln wird erreicht mit Hilfe eines chromogenen Substrats der Peroxidase, und nur der der Präzipitation der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe entsprechende Peak wird beobachtet.
Fig. 5 entspricht der letzten Platte, die nach der Migration mit 400 ul einer Lösung von monoklonalen Antikörpern Anti A-I inkubiert worden ist. Das Entwickeln wird erreicht mit Hilfe eines chromogenen Substrats der Peroxidase und die beiden jeweils der Präzipitation der Lipoproteinteilchen der ersten und der zweiten Gruppe entsprechenden Peaks werden beobachtet.
Man hat gleichfalls auf drei Platten die radiale Immunodiffusion durchgeführt. Jede Platte enthält ein Gemisch von 1 ml von Antikörper Anti A-II des Titers (60) und 0,12 ml von Antikörpern Anti A-I des Titers (220).
Fig. 6 entspricht der Färbung einer Platte mit Hilfe von Coomassie-Blau, was zwei Ringe ergibt.
Fig. 7 entspricht der Entwicklung einer der drei Platten, inkubiert mit 300 ul von monoklonalen Antikörpern Anti A-II, die mit Peroxidase markiert sind, und mit Hilfe eines chromogenen Substrats der Peroxidase entwickelt sind. Man entwikkelt so nur den Ring, der der Präzipitation der zweiten Gruppe von Lipoproteinteilchen entspricht.
Fig. 8 entspricht der Entwicklung einer der drei Platten, die mit 400 ul von monoklonalen, mit Peroxidase markierten Antikörpern Anti A-I inkubiert und mit Hilfe eines chromogenen Substrats der Peroxidase entwickelt worden sind. Man entwikkelt so die der Präzipitation der ersten und der zweiten Gruppe von Lipoproteinteilchen entsprechenden Ringe.

Beispiel 1:

In einen 50ml-Erlenmeyerkolben gibt man 29 ml demineralisiertes Wasser. Man fügt 250 mg Agarose der Marke HGT (vertrieben von der Société MCI) und 60 mg Agarose der Marke HEEO (Agarose hoher Elektroendosmose, vertrieben von MCI) hinzu. Man erhitzt auf 95-100ºC bis zum Erhalt einer vollkommen klaren Lösung. Man äquilibriert diese dann in einem thermostatisierten Bad bei 52-55ºC und fügt 3 ml Trisglycinpuffer, Veronal, Veronal- Na pH 9,2 der Ionenstärke 0,1 (Leitfähigkeit des Puffers) hinzu, dann 4 ml Antikörper Anti A-II (Titer 60) und 0,6 ml Antikörper Anti A-I (Titer 220).
Die homogenisierte Lösung wird auf einen Kunststoffilm der Marke Gel bondR (vertrieben von FMC) mit den Abmessungen 10,1 x 8,3 cm in einer Menge von 9 ml/Film gegossen. Wenn sich das Gel bildet, schneidet man mit einer Lochzange entlang einer Linie parallel zur Längsseite 16 Löcher mit einem Durchmesser von 3 mm aus.
Man erhält einen Film bzw. eine Folie, die für die Bestimmung des Apolipoproteins AI (getragen von den Lipoproteinteilchen LPAI:E und LPAI) und des Apolipoproteins A II (getragen von den Lipoproteinteilchen LPAI:AII und LPE:AII) mittels der Technik der Elektroimmunodiffusion vorbereitet ist.
Die zu bestimmenden Proben, ebenso wie die Standardreihe, werden in einer Verdünnung von 1/10 und in einer Menge von 3 ul pro Loch aufgebracht. Nach drei Stunden Migration bei 150 V, Waschen mit physiologischem Wasser, Trocknen und Einfärben mit Coomassie-Blau erhält man für jede Probe zwei Peaks, von denen der größere und weniger eingefärbte dem Apolipoprotein A I (getragen von den Lipoproteinteilchen LPAI:E und LPAI) und der kleinere und stärker eingefärbte dem Apolipoprotein A II (getragen von den Lipoproteinteilchen LPAI:AII und LPE:AII) entspricht.

Beispiel 2:

Man geht vor wie beim Beispiel 1, mit dem Unterschied, daß man 6 ml von Antikörpern Anti A-II (Titer 60) hinzufügt. Nach Migration der gleichen Proben wie im Beispiel 1 erhält man einen Peak entsprechend dem Apolipoprotein A I (getragen von den Lipoproteinteilchen LPAI:E und LPAI) der selben Höhe wie im Beispiel 1 und einen Peak entsprechend dem Apolipoprotein A II (getragen von den Lipoproteinteilchen LPAI:AII und LPE:AII) mit einer im Vergleich zum Beispiel 1 durch 1,5 geteilten Höhe.

Beispiel 3:

Man geht vor wie im Beispiel 1, mit dem Unterschied, daß man 4 ml von Antikörpern Anti A-II des Titers 120 und 0,6 ml von Antikörpern Anti A-I des Titers 330 hinzufügt.
Nach der Migration ergeben die gleichen Proben wie im Beispiel 1 einen Peak entsprechend dem Apolipoprotein A I (getragen von den Lipoproteinteilchen LPAI:E und LPAI) mit einer um den Faktor 1,5 im Vergleich zum Beispiel 1 niedrigeren Höhe und einen dem Apolipoprotein A II (getragen von den Lipoproteinteilchen LPAI:AII und LPE:AII) entsprechenden Peak, dessen Höhe im Vergleich zum Beispiel 1 um den Faktor 2 niedriger ist.

Beispiel 4:

Man geht wie im Beispie 1 vor. Nach der Migration wird das Gel während 3 Stunden mit einem Filterpapier bedeckt, das mit einer Lösung von monoklonalen, mit Peroxidase markierten Antikörpern Anti A-II getränkt ist.
Nach dem Waschen mit physiologischem Wasser während einer Nacht und der Entwicklung der Peroxidase-Aktivität ist nur der kleine Peak gefärbt, der dem Apolipoprotein A II (getragen von den Lipoproteinteilchen LPAI:AII und LPE:AII) entspricht.

Beispiel 5:

Man geht vor wie in Beispiel 3, aber das Filterpapier ist mit einem monoklonalen, mit Peroxidase markierten Antikörper Anti A-I getränkt. Die Entwicklung der Peroxidase-Aktivität färbt in diesem Fall die beiden Peaks, die jeweils dem Apolipoprotein A I (getragen von den Lipoproteinteilchen LPAI:E und LPAI) und dem Apolipoprotein A II (getragen von den Lipoproteinteilchen LPAI:AII und LPE:AII) entsprechen.

Beispiel 6:

Man geht vor wie in Beispiel 1, mit dem Unterschied, daß man 12 ml auf jeden Film gießt. Man schneidet 12 äquidistante und über die Gesamtheit der Geloberfläche verteilte Löcher mit einem Durchmesser von 3 mm aus. Man erhält so einen gebrauchsfertigen Film bzw. eine Folie der bzw. die für die Bestimmung des Apolipoproteins A I (getragen von den Lipoproteinteilchen LPAI:E und LPAI) mittels der Technik der Radialimmunodiffusion anwendbar ist.
5 ul der Proben und der Standards werden in einer Verdünnung von 1/10 aufgebracht. Nach 48 Stunden Diffusion, Waschen mit physiologischem Wasser während einer Nacht, Trocknung und Einfärbung mit Amidschwarz erhält man für jede Probe zwei Ringe, von denen der größere und weniger eingefärbte dem Apolipoprotein A I (getragen von den Lipoproteinteilchen LPAI:E und LPAI) und der kleinere und stärker eingefärbte dem Apolipoprotein A II (getragen von den Lipoproteinteilchen LPAI:AII und LPE:AII) entspricht.

Beispiel 7:

Man geht vor wie in Beispiel 1, mit dem Unterschied, daß man in die Agaroselösung 1 ml von Antikörpern Anti E (Titer 60), 2,8 ml von Antikörpern Anti CIII (Titer 40) und 0,11 ml von Antikörpern Anti B (Titer 2000) hinzufügt. Man erhält so einen gebrauchsfertigen Film für die Bestimmung des von den Lipoproteinteilchen LPB getragenen Apolipoproteins B mittels Immunodiffusion.

Beispiel 8:

Man stellt eine dehydratisierte und rehydratisierbare Platte gemäß dem amerikanischen Patent Nr. 2 086 541 vom 1.4.1970 und dem französischen Patent Nr. 76 22 802 vom 27.7.1976 her.
In einen 50ml-Erlenmeyerkolben gibt man 30 ml demineralisiertes Wasser und fügt unter Magnetrühren 1,8 g D-Sorbitol, 90 mg Separan NP 10R, vertrieben von der Société MCi (Marine Colloids Incorporation), und 45 mg Separan MGLR, vertrieben von der Société MCi, zu. Nach vollständiger Lösung fügt man 250 mg Agarose HGT und 70 mg Agarose HEEO zu.
Man erhitzt die Lösung auf 95-100ºC bis zur vollständigen Lösung. Nach dem Abkühlen auf 53ºC fügt man 4 ml von Antikörpern Anti A-II (Titer 60) und 0,6 ml von Antikörpern Anti A-I (Titer 220) zu. Die Lösung wird in einer Menge von 9 ml pro Film verteilt. Nach der Gelbildung schneidet man mit einer Lochzange 28 Löcher mit einem Durchmesser von 2 mm aus.
Man legt den Film für eine Nacht in einen laminaren Luftstrom. Man erhält so einen trockenen und rehydratisierbaren Film, der für die Bestimmung des Apolipoproteins A I (getragen von den Lipoproteinteilchen LPAI:E und LPAI) und des Apolipoprotein A II (getragen von den Lipoproteinteilchen LPAI:AII und LPE:AII) anwendbar ist.

Beispiel 9:

Man geht vor wie in Beispiel 8, mit dem Unterschied, daß man die 250 mg HGT und die 70 mg HEEO durch 300 mg Agaragar und das basische Heteropolymer durch Separan CP35R, vertrieben von der Société MCi, ersetzt. Man verteilt die Lösung in einer Menge von 12 ml pro Film. Man schneidet 12 äquidistante und über die Gesamtheit der Geloberfläche verteilte Löcher mit einem Durchmesser von 2,5 mm aus.
Nach der Dehydratisierung erhält man einen trockenen und rehydratisierbaren Film, der für die Bestimmung des Apolipoproteins A I (getragen von den Lipoproteinteilchen LPAI:E und LPAI) und des Apolipoproteins A II (getragen von den Lipoproteinteilchen LPAI:AII und LPE:AII) mittels der Technik der Radialimmunodiffusion anwendbar ist.

Claims

1. Verfahren zur simultanen Bestimmung des Gehaltes an jeder von zwei oder mehreren Gruppen von unterschiedlichen und unabhängigen Teilchen in einem Teilchengemisch mittels differentieller Immunodiffusion der genannten Teilchengruppen an einem Gel, wobei die Teilchengruppen folgendes enthalten:

1. eine erste Gruppe von Teilchen, die jeweils ein erstes Antigen aufweisen und

2. mindestens eine zweite Gruppe von Teilchen, die jeweils ein zweites Antigen aufweisen und von denen mindestens einige das genannte erste Antigen tragen, wobei das genannte zweite Antigen nicht von den Teilchen der ersten Gruppe getragen wird,

mit den folgenden Verfahrensschritten:

- Behandlung des Teilchengemisches mit einem Gemisch von Antikörpern, welches einen ersten, gegen das erste Antigen gerichteten Antikörper und einen zweiten, gegen das zweite Antigen gerichteten Antikörper umfaßt, wobei das Antikörpergemisch den ersten Antikörper mindestens in einer zur Ausfällung der ersten Gruppe in dem Teilchengemisch ausreichenden Menge enthält, und wobei das Antikörpergemisch den zweiten Antikörper mindestens in einer zur Ausfällung der zweiten Gruppe in dem Teilchengemisch ausreichenden Menge und im Überschuß zu der genannten Menge des ersten Antikörpers enthält, so daß der jeweilige Gehalt an der jeweils ersten und zweiten Gruppe in dem genannten Teilchengemisch bestimmt werden kann.

2. Kit zur simultanen Bestimmung des Gehaltes an jeder von zwei oder mehreren Gruppen von unterschiedlichen und unabhängigen, Antigene tragenden Teilchen in einem Gemisch von Antigenen tragenden, im Anspruch 1 definierten Teilchen, der eine Gelplatte und ein vorbestimmte Mengen der die ersten und zweiten Antigene aufweisenden Teilchen enthaltendes Gemisch umfaßt.

3. Verfahren zur simultanen Bestimmung durch differentielle Immunodiffusion an einem plattenförmigen Gel von mindestens drei Unterensembles von Apolipoproteinen, die jeweils zu Gruppen von in einem biologischen Medium enthaltenen Lipoproteinteilchen gehören, wobei diese drei Gruppen von Lipoproteinteilchen so beschaffen sind, daß sie ein "gemeinsames Apolipoprotein" einschließen und wie folgt definierbar sind:

- eine der im folgenden mit erste bezeichneten Gruppen ist von Lipoproteinteilchen gebildet, die sämtlich das vorgenannte "gemeinsame Apolipoprotein" und gegebenenfalls andere Apolipoproteine Xm aufweisen, wobei das "gemeinsame Apolipoprotein" von sämtlichen der Lipoproteinteilchen der das erste Unterensemble bildenden ersten Gruppe getragen wird,

- eine weitere, im folgenden mit zweite Gruppe oder intermediäre Gruppe bezeichnete Gruppe, die so beschaffen ist,

- daß sie entweder bevorzugt von sämtlich das vorgenannte "gemeinsame Apolipoprotein" tragenden Lipoproteinteilchen gebildet ist und darüber hinaus mindestens ein Apolipoprotein Yn aufweist, das sich von den gegebenenfalls vorhandenen, von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragenen, weiteren Apolipoproteinen unterscheidet, wobei dieses bzw. diese Apolipoprotein(e) Yn das zweite oder intermediäre Unterensemble bildet bzw. bilden,

- oder von Lipoproteinteilchen gebildet ist, von denen einerseits ein Teil das vorgenannte, "gemeinsame Apolipoprotein" aufweist und das erste Unterensemble bildet sowie darüber hinaus mindestens ein Apolipoprotein Zp aufweist, das sich von den gegebenenfalls vorhandenen, anderen Apolipoproteinen Xm, die von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen werden, unterscheidet, und von denen andererseits der Rest der Lipoproteinteilchen das vorgenannte "gemeinsame Apolipoprotein" nicht aufweist, jedoch mindestens eines der Apolipoproteine Zp trägt, die von dem Teil der zuvor definierten Lipoproteinteilchen getragen werden und sich von den gegebenenfalls vorhandenen anderen Apolipoproteinen Xm, die von der ersten Gruppe der Lipoproteinteilchen getragen werden, unterscheiden, wobei dieses bzw. diese Apolipoprotein(e) Zp das zweite oder intermediäre Unterensemble bildet bzw. bilden,

- eine dritte oder letzte Gruppe, die wie folgt beschaffen ist:

- sie ist entweder von Lipoproteingruppen gebildet, die sämtlich das oben definierte "gemeinsame Apolipoprotein" und darüber hinaus mindestens ein Apolipoprotein Wq enthalten, welches sich einerseits von gegebenenfalls vorhandenen, von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragenen Apolipoproteinen Xm und sich andererseits von den von den Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe getragenen Apolipoproteinen unterscheidet, wobei das bzw. die Apolipoprotein(e) Wq das dritte oder letzte Unterensemble bildet bzw. bilden;

- oder sie ist von Lipoproteinteilchen gebildet, von denen einerseits ein Teil das vorgenannte "gemeinsame Apolipoprotein" und darüber hinaus mindestens ein Apolipoprotein T&sub1; aufweist, welches sich gleichzeitig von den gegebenenfalls vorhandenen weiteren, von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragenen Apolipoproteinen Xm und den von den Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe getragenen Apolipoproteinen unterscheidet, und von denen andererseits der Rest der Lipoproteinteilchen nicht das vorgenannte "gemeinsame Apolipoprotein", sondern mindestens eines der von dem Teil der oben definierten Lipoproteinteilchen getragenen Apolipoproteine T&sub1; aufweist, wobei dieses bzw. diese Apolipoproteine T&sub1; das dritte oder letzte Unterensemble bildet bzw. bilden; dadurch gekennzeichnet, daß

- man das die zu bestimmenden Unterensembles enthaltende biologische Medium mit einem Antikörpergemisch zusammenbringt, das

. gegen das oder jedes der das dritte oder letzte Unterensemble bildende(n) Apolipoprotein(e) gerichtete Antikörper, und zwar in einer für die Ausfällung der Lipoproteine der dritten oder letzten Gruppe ausreichenden Menge;

. gegen das oder jedes der das zweite oder intermediäre Unterensemble bildende(n) Apolipoprotein(e) gerichtete Antikörper, und zwar in einer für die Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten oder intermediären Gruppe ausreichenden Menge;

. gegen das bei den Unterensembles vorhandene und das erste Unterensemble bildende "gemeinsame Apolipoprotein" gerichtete Antikörper, und zwar in einer für die Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe ausreichenden Menge,

enthält;

- wobei die für die Ausfällung der Lipoproteinteilchen der dritten oder letzten Gruppe erforderliche Menge der Antikörper im Überschuß gegenüber der für die Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten oder intermediären Gruppe erforderlichen Menge der Antikörper vorhanden ist, und wobei die letztgenannte, für die Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten oder intermediären Gruppe erforderliche Menge der obengenannten Antikörper ihrerseits im Überschuß gegenüber der für die Ausfällung der das erste Unterensemble bildende "gemeinsame Apolipoprotein" tragenden Lipoproteinteilchen erforderlichen Menge der Antikörper vorhanden ist, und zwar in einem Verhältnis, daß man nach der Immunodiffusion drei diskrete Fronten erhält, wobei die Immunodiffusionsfront, die sich am nächsten zu dem Auftragsort des die zu bestimmenden Unterensembles enthaltenden Mediums befindet, der Ausfällung der Lipoproteinteilchen der dritten oder letzten Gruppe entspricht, die Immunodiffusionsfront, die sich am weitesten von dem genannten Auftragsort befindet, der Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe entspricht, und die intermediäre Immunodiffusionsfront zwischen den obengenannten nächsten und entferntesten Fronten der Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe entspricht;

- und daß man die jeweils maximalen Abstände zwischen dem Auftragsort und jeder der drei Immunodiffusionsfronten mißt und jeden der Abstände mit denjenigen bei einem Eichmedium erhaltenen vergleicht, das bekannte Mengen an Apolipoproteinen der jeweiligen drei Unterensembles enthält.

4. Verfähren nach Anspruch 3 zur simultanen Bestimmung durch differentielle Immunodiffusion an einem plattenförmigen Gel von mindestens zwei Unterensembles von Apolipoproteinen, die jeweils zu mindestens zwei Gruppen von in einem biologischen Medium enthaltenen Lipoproteinteilchen gehören, wobei diese zwei Gruppen von Lipoproteinen so beschaffen sind, daß sie ein "gemeinsames Apolipoprotein" enthalten, und wobei

- eine der im folgenden mit erste Gruppe bezeichneten Gruppen von Lipoproteinteilchen gebildet ist, die sämtlich das vorgenannte "gemeinsame Apolipoprotein" und gegebenenfalls andere Apolipoproteine Xm aufweisen, wobei dieses gemeinsame Apolipoprotein, das von sämtlichen der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen wird, das erste Unterensemble bildet, und

- die andere Gruppe, die im folgenden mit zweite Gruppe bezeichnet wird, so beschaffen ist, daß sie

- entweder von Lipoproteinteilchen gebildet ist, die sämtlich das oben definierte "gemeinsame Apolipoprotein" enthalten und darüber hinaus mindestens ein Apolipoprotein Yn aufweisen, das sich von den gegebenenfalls vorhandenen anderen Apolipoproteinen Xm, welche von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen werden, unterscheidet, wobei dieses bzw. diese Apolipoprotein(e) Yn das zweite Unterensemble bildet bzw. bilden;

- oder von Lipoproteinteilchen gebildet ist, von denen einerseits ein Teil das obengenannte "gemeinsame Apolipoprotein", das das erste Unterensemble bildet, und darüber hinaus mindestens ein Apolipoprotein Zp aufweist, das sich von den gegebenenfalls vorhandenen anderen Apolipoproteinen Xm, die von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen werden, unterscheidet, und von denen andererseits der Rest der Lipoproteinteilchen nicht das obengenannte "gemeinsame Apolipoprotein", das das erste Unterensemble bildet, sondern mindestens eines der Apolipoproteine Zp aufweist, die von dem Teil der oben definierten Lipoproteinteilchen getragen werden und sich von den gegebenenfalls vorhandenen anderen Apolipoproteinen Xm, die von der ersten Gruppe der Lipoproteinteilchen getragen werden, unterscheidet, wobei dieses bzw. diese Apolipoprotein(e) Zp das zweite Unterensemble bilden, dadurch gekennzeichnet, daß man

- das die zwei zu bestimmenden Unterensembles von Apolipoprotein enthaltende biologische Medium mit einem Gemisch von Antikörpern zusammenbringt, das

. einerseits Antikörper enthält, die gegen das oder jedes der das zweite Unterensemble (Yn oder Zp) bildenden Apolipoproteine gerichtet sind, und zwar in einer zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe ausreichenden Menge;

. andererseits Antikörper enthält, die gegen das vorgenannte "gemeinsame Apolipoprotein", das das erste Unterensemble bildet, gerichtet sind, und zwar in einer zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe ausreichenden Menge;

- wobei die Menge der für die Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe erforderlichen Antikörper im Überschuß gegenüber der für die Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe erforderlichen Menge der vorgenannten Antikörper vorhanden ist, und zwar in einem Verhältnis, daß man nach der Immunodiffusion zwei diskrete Fronten enthält, wobei die Immunodiffusionsfront, die sich am nächsten zu dem Auftragsort des die zwei zu bestimmenden Unterensembles enthaltenden biologischen Mediums befindet, der Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe und die Immunodiffusionsfront, die sich am entferntesten von dem genannten Auftragsort befindet, der Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe entspricht, und wobei die zwei Fronten jeweils identisch sind mit denjenigen, die man unter Bedingungen erhält, unter denen man nach dem Trennen der zwei Gruppen von Lipoproteinteilchen, welche das erste bzw. das zweite Unterensemble von Apolipoproteinen enthalten, einerseits die erste Gruppe der Lipoproteinteilchen mit gegen das gemeinsame Apolipoprotein, das das erste, oben definierte Unterensemble bildet, gerichteten Antikörpern zusammenbringt, und zwar in der gleichen Menge wie die oben für die Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten, nicht von dem biologischen Medium getrennten und das das erste Unterensemble bildende Apolipoprotein tragenden Gruppe, und andererseits die zweite Gruppe von Lipoproteinteilchen mit gegen die Apolipoproteine, die das zweite oben definierte Unterensemble bilden, gerichteten Antikörpern zusammenbringt, und zwar in der gleichen Menge wie die oben für die Ausfällung der zweiten Gruppe der Lipoproteinteilchen, die nicht von dem biologischen Medium getrennt wurden und die die das zweite Unterensemble bildenden Apolipoproteine tragen.

- und daß man die jeweiligen maximalen Abstände zwischen dem Auftragsort und jeder der zwei Immunodiffusionsfronten mißt und jeden der Abstände in bezug auf diejenigen vergleicht, die mit einem biologischen Vergleichsmedium erhalten werden, das bekannte Mengen an den jeweiligen Apolipoproteinen der zwei Unterensembles enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 3 zur simultanen Bestimmung durch differentielle Immunodiffusion an einem plattenförmigen Gel von zwei Unterensembles von Apolipoprotein, die jeweils zu zwei Gruppen von Lipoproteinteilchen gehören, welche in dem biologischen Medium enthalten sind, wobei die zwei Gruppen von Lipoproteinteilchen so beschaffen sind, daß sie ein "gemeinsames Apolipoprotein" enthalten,

- wobei eine der Gruppen, die nachfolgend mit erste Gruppe bezeichnet wird, aus Lipoproteinteilchen gebildet ist, die sämtlich das obengenannte "gemeinsame Apolipoprotein" aufweisen und gegebenfalls andere Apolipoproteine Xm tragen, wobei das "gemeinsame Apolipoprotein" von sämtlichen Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen wird und das erste Unterensemble bildet, und die andere Gruppe, die im folgenden mit zweite Gruppe bezeichnet wird, so beschaffen ist, daß sie:

- oder von Lipoproteinteilchen gebildet ist, von denen einerseits ein Teil das obengenannte "gemeinsame Apolipoprotein" der ersten Gruppe und darüber hinaus mindestens ein Apolipoprotein Zp aufweist, das sich von den gegebenenfalls vorhandenen anderen Apolipoproteinen Xm, die von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragen werden, unterscheidet, und von denen andererseits der Rest der Lipoproteinteilchen nicht das obengenannte "gemeinsame Apolipoprotein", das das erste Unterensemble bildet, sondern mindestens eines der Apolipoproteine Zp aufweist, die von dem Teil der oben definierten Lipoproteinteilchen getragen werden und sich von den gegebenenfalls vorhandenen anderen Apolipoproteinen Xm, die von der ersten Gruppe der Lipoproteinteilchen getragen werden, unterscheidet, wobei dieses bzw. diese Apolipoprotein(e) Zp das zweite Unterensemble bilden, dadurch gekennzeichnet, daß man

. einerseits Antikörper enthält, die gegen das oder jedes der Apolipoproteine des zweiten Unterensembles (Yn oder Zp) gerichtet sind, und zwar in einer zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe ausreichenden Menge;

. andererseits Antikörper enthält, die gegen das vorgenannte "gemeinsame Apolipoprotein", der zwei Unterensembles gerichtet sind, und zwar in einer zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe ausreichenden Menge;

- wobei die Menge der für die Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe erforderlichen Antikörper im Überschuß gegenüber der für die Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe erforderlichen Menge der vorgenannten Antikörper vorhanden ist, und zwar in einem Verhältnis, daß man nach der Immunodiffusion zwei diskrete Fronten enthält, wobei die Immunodiffusionsfront, die sich am nächsten zu dem Auftragsort des die zwei zu bestimmenden Unterensembles enthaltenden biologischen Mediums befindet, der Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe und die Immunodiffusionsfront, die sich am entferntesten von dem genannten Auftragsort befindet, der Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe entspricht, und wobei die zwei Fronten jeweils identisch sind mit denjenigen, die man unter Bedingungen erhält, unter denen man nach dem Trennen der zwei Gruppen von Lipoproteinteilchen, welche das erste bzw. das zweite Unterensemble von Apolipoproteinen enthalten, einerseits die erste Gruppe der Lipoproteinteilchen mit gegen das gemeinsame Apolipoprotein der ersten Gruppe gerichteten Antikörpern zusammenbringt, und zwar in der gleichen Menge wie die oben für die Ausfällung der nicht von dem biologischen Medium getrennten und das Apolipoprotein des ersten Unterensembles tragenden Lipoproteinteilchen, und daß man andererseits die zweite Gruppe von Lipoproteinteilchen in Kontakt mit den gegen das bzw. die Apolipoprotein(e) des zweiten Unterensembles bringt, das bzw. die sich von dem bzw. den Apolipoprotein(en) des ersten Unterensembles und von den gegebenenfalls vorhandenen anderen, von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragenen Apolipoproteinen unterscheidet bzw. unterscheiden, und zwar in der gleichen Menge zu der oben verwendeten, um die nicht aus dem biologischen Medium abgetrennten Lipoproteinteilchen, die die Apolipoproteine des zweiten Unterensembles tragen, auszufällen,

6. Verfahren zur Bestimmung nach Anspruch 5, bei dem das Apolipoprotein des ersten Unterensembles zu den freien und identischen, die erste Gruppe bildenden Lipoproteinteilchen gehört.

7. Verfahren zur Bestimmung nach Anspruch 5, bei dem die erste Gruppe einerseits von freien und untereinander identischen Lipoproteinteilchen, die das das erste Unterensemble bildende gemeinsame Apolipoprotein aufweisen, und andererseits von komplexen Lipoproteinteilchen, die außer den obengenannten gemeinsamen Apolipoproteinen mindestens eines von den genannten gemeinsamen Apolipoproteinen und von den das zweite Unterensemble bildenden Apolipoproteinen verschiedenes Apolipoprotein aufweisen, gebildet ist.

8. Verfahren zur Bestimmung nach einem beliebigen der Ansprüche 5 bis 7, bei dem das zweite Unterensemble von einem Apolipoprotein gebildet ist, das von dem das erste Unterensemble bildenden gemeinsamen Apolipoprotein und von gegebenenfalls vorhandenen anderen, von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragenen Apolipoproteinen verschieden ist, wobei das genannte Apolipoprotein von den komplexen Lipoproteinteilchen getragen wird, die darüber hinaus sämtliche das erste Unterensemble bildenden Apolipoproteine aufweisen.

9. Verfahren zur Bestimmung nach einem beliebigen der Ansprüche 5 bis 7, bei dem das zweite Unterensemble von mindestens einem Apolipoprotein gebildet wird, das sich von dem das erste Unterensemble bildenden und von den gegebenenfalls vorhandenen anderen, von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragenen Apolipoproteinen unterscheidet, wobei das genannte Apolipoprotein einerseits von komplexen Teilchen, die darüber hinaus das das erste Unterensemble bildende Apolipoprotein aufweisen, und andererseits von einfachen oder komplexen Lipoproteinteilchen, welche nicht das das erste Unterensemble bildende Apolipoprotein aufweisen, getragen wird.

10. Verfahren zur Bestimmung nach einem beliebigen der Ansprüche 3 bis 9, bei dem die differentielle Immunodiffusion als Elektroimmunodiffusion nach der Methode von Laurell durchgeführt wird, wodurch mindestens drei Peaks erhalten werden.

11. Verfahren zur Bestimmung nach einem beliebigen der Ansprüche 3 bis 9 durch Radialimmunodiffusion nach der Methode von Mancini, wodurch mindestens drei Ringe erhalten werden.

12. Verfahren zur Bestimmung nach einem beliebigen der Ansprüche 5 bis 11, bei dem die Mindestmenge der einzusetzenden, gegen das bzw. die Apolipoprotein(e) des zweiten Unterensembles gerichteten Antikörper von dem Erscheinen von zwei diskreten Immunodiffusionsfronten an bestimmt wird und bevorzugt in einem Bereich liegt, dessen Minimalwert von dem Erscheinen der zwei diskreten Immunodiffusionsfronten und dessen Maximalwert bestimmt wird, sobald die Lipoproteinteilchen, die die Apolipoproteine des zweiten Unterensembles tragen, nicht mehr diffundieren und an dem Auftragsort des biologischen Mediums ausgefällt werden, wobei die der Ausfällung der die Apolipoproteine des ersten Unterensembles tragenden Lipoproteinteilchen entsprechende Immunodiffusionsfront nicht verändert wird, wenn die Menge der gegen das bzw. die Apolipoproteine des zweiten Unterensembles gerichteten Antikörper größer ist als der oben definierte Minimalwert.

13. Verfahren zur Bestimmung nach einem beliebigen der Ansprüche 5 bis 12, bei dem die Menge der gegen das bzw. die Apolipoprotein(e) des zweiten Unterensembles gerichteten Antikörper so bemessen ist, daß der maximale Abstand zwischen dem Auftragsort und der Immunodiffusionsfront, die der Ausfällung der die Apolipoproteine des zweiten Unterensembles enthaltenden Lipoproteinteilchen entspricht, zwischen etwa 1/2 bis etwa 1/8, vorzugsweise zwischen etwa 1/3 bis etwa 1/4, des maximalen Abstandes zwischen dem Auftragsort und der der Ausfällung der die Apolipoproteine des ersten Unterensembles enthaltenden Lipoproteinteilchen entsprechenden Immunodiffusionsfront beträgt.

14. Verfahren zur Bestimmung nach einem beliebigen der Ansprüche 5 bis 13, bei dem die Eichung ausgehend von einem Medium durchgeführt wird, in dem das erste Unterensemble eine bekannte Menge (A) an dem beiden Gruppen gemeinsamen Apolipoprotein und das zweite Unterensemble eine bzw. mehrere bekannte Menge(n) (B)i von Apolipoprotein(en), das bzw. die sich von dem den zwei Gruppen gemeinsamen Apolipoprotein sowie von den gegebenenfalls vorhandenen anderen, zu den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe gehörenden Apolipoproteinen unterscheidet bzw. unterscheiden, enthält,

- indem man auf die Platte gegen jedes der Apolipoproteine des zweiten Unterensembles gerichtete Antikörper aufbringt, und zwar in einer für die Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe erforderlichen Menge, wobei jede dieser Mengen jeweils im Überschuß, bezogen auf zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe erforderliche Antikörper, eingesetzt wird, wobei der Überschuß der gegen die Apolipoproteine des zweiten Unterensembles gerichteten Antikörper, bezogen auf gegen das Apolipoprotein des ersten Unterensembles gerichtete Antikörper, durch die folgende Beziehung ausgedrückt werden kann:

in der V&sub1; und T&sub1; jeweils das Volumen und den Titer der gegen das Apolipoprotein des ersten Unterensembles sowie V2i und T2i jeweils die Volumina und die Titer der jeweils gegen jedes der Apolipoproteine des zweiten Unterensembles gerichteten Antikörper bedeuten.

15. Verfahren zur Bestimmung durch Elektroimmunodiffusion gemäß einem beliebigen der Ansprüche 5 bis 10 und 12 bis 14, bei dem man bestimmt:

- die Menge von Antikörpern V&sub1;, die zur Ausfällung der das Apolipoprotein des ersten Unterensembles tragenden Lipoproteinteilchen bestimmt sind, wobei das genannte Apolipoprotein beiden Gruppen gemeinsam ist, damit die Höhe des erhaltenen Peaks H&sub1; ist, indem man auf die Platte eine bekannte Menge der Antikörper v&sub1; entsprechend der Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe aufträgt, was eine Höhe h&sub1; ergibt, wobei die Menge V&sub1; anschließend nach der falgenden Formel berechnet wird:

wobei x % den Prozentsatz des den zwei Gruppen gemeinsamen, in dem ersten Unterensemble enthaltenen Apolipoproteins bedeutet, bezogen auf die Gesamtmenge dieses in dem Medium enthaltenen Apolipoproteins, und daß man bestimmt:

- die Menge der Antikörper V&sub2;, die zur Ausfällung der das bzw. die Apolipoprotein(e) des zweiten Unterensembles, die verschieden von den den zwei Gruppen gemeinsamen und verschieden von gegebenenfalls vorhandenen anderen, von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragenen Apolipoproteinen sind, tragenden Lipoproteinteilchen bestimmt ist, damit die Höhe des erhaltenen Peaks H&sub2; ist, indem man auf die Platte eine bekannte Menge von Antikörpern v&sub2; entsprechend der Ausfällung der Lipoproteinteilchen der zweiten Gruppe aufträgt, was eine Höhe h&sub2; ergibt, wobei die Menge V&sub2; anschließend nach der folgenden Formel berechnet wird:

16. Verfahren zur Bestimmung durch Radialimmunodiffusion gemäß einem beliebigen der Ansprüche 5 bis 9 und 11 bis 14, in dem man bestimnit:

- die Menge der Antikörper V&sub1;, die zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen bestimmt ist, welche das Apolipoprotein des ersten Unterensembles tragen, wobei dieses Apolipoprotein beiden Gruppen gemeinsam ist, damit der Durchmesser des erhaltenen Ringes D&sub1; ist, indem man auf die Platte eine bekannte Menge der Antikörper v&sub1; entsprechend der Ausfällung der Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe, aufbringt, was einen Durchmesser d&sub1; ergibt, wobei anschließend die Menge V&sub1; gemäß der folgenden Formel

berechnet wird, wobei x % den Prozentsatz des den zwei Gruppen gemeinsamen und in dem ersten Unterensemble enthaltenen Apolipoproteins bedeutet, bezogen auf die Gesamtmenge dieses in dem Medium enthaltenden Apolipoproteins,

- die Menge der Antikörper V&sub2;, die zur Ausfällung der Lipoproteinteilchen, welche das bzw. die Apolipoprotein(e) des zweiten Unterensembles tragen, die verschieden von dem den zwei Gruppen gemeinsamen Apolipoprotein und verschieden von gegebenenfalls vorhandenen anderen, von den Lipoproteinteilchen der ersten Gruppe getragenen Apolipoproteinen sind, bestimmt sind, damit der Durchmesser des erhaltenen Ringes D&sub2; ist, wird bestimmt, indem man auf die Platte eine bekannte Menge von Antikörpern v&sub2; aufbringt, die der Ausfällung der Apolipoproteine des zweiten Unterensembles entspricht, was einen Durchmesser d&sub2; ergibt, und anschließend die Menge V&sub2; nach der folgenden Formel berechnet wird.

17. Verfahren zur Bestimmung gemäß einem beliebigen der Ansprüche 5 bis 16, bei dem das erste Unterensemble von dem Apolipoprotein AI gebildet wird, das von den die erste Gruppe bildenden Lipoproteinteilchen LP AI und LP AI:E getragen wird, und das zweite Unterensemble von dem Apolipoprotein AII gebildet wird, das von den die zweite Gruppe bildenden Lipoproteinteilchen LP AI:AII und LPE:AII getragen wird, dadurch gekennzeichnet, daß man das die zwei zu bestimmenden Unterensembles enthaltende Medium mit einem Gemisch von Antikörpern zusammenbringt, die jeweils gegen das Apolipoprotein AII (Antikörper anti-AII) und gegen das Apolipoprotein AI (Antikörper anti-AI) gerichtet sind, und zwar unter solchen Bedingungen, daß die gegen das Apolipoprotein AII gerichteten Antikörper im Überschuß, bezogen auf die gegen das Apolipoprotein AI gerichteten Antikörper, vorliegen, wobei dieser Überschuß insbesandere der Tatsache entspricht, daß das Produkt des Wertes des Volumens der auf die Platte aufgetragenen Antikörper anti-AII durch den Wert des Titers der Antikörper anti-AII größer ist als das Produkt des Wertes des Volumens der auf die Platte aufgetragenen Antikörper anti-AI durch den Wert des Titers der Antikörper anti-AI.

18. Verfahren zur Bestimmung nach einem beliebigen der Ansprüche 5 bis 16, bei dem das erste Unterensemble von dem Apolipoprotein B gebildet wird, das von den die erste Gruppe bildenden Lipoproteinteilchen LPB getragen wird, und das zweite Unterensemble von den zwei Apolipoprateinen E und CIII gebildet wird, die von den die zweite Gruppe bildenden Lipoproteinteilchen LPB:E, LPB:CIII, LPE:CI:CII:CIII:B, LPAI:E und LPE:AII getragen werden, dadurch gekennzeichnet, daß man das die zwei zu bestimmenden Unterensemble enthaltende Medium mit einem Gemisch von Antikörpern zusammenbringt, die jeweils gegen das Apolipoprotein E (Antikörper anti-E) Apolipoprotein CIII (Antikörper anti-CIII) und Apolipoprotein B (Antikörper anti-B) gerichtet sind, und zwar unter solchen Bedingungen, daß die gegen das Apolipoprotein E gerichteten Antikörper im Überschuß, bezogen auf die gegen das Apolipoprotein B gerichteten Antikörper, und die gegen das Apolipoprotein CIII gerichteten Antikörper im Überschuß, bezogen auf die gegen das Apolipoprotein B gerichteten Antikörper vorliegen, wobei der Überschuß der Antikörper anti-CIII in bezug auf die Antikörper anti-B durch die Tatsache ausgedrückt werden kann, daß das Produkt des Wertes des Volumens der Antikörper anti-CIII durch den Wert des Titers der Antikörper anti-CIII größer als ein Sechstel des Produktes des Wertes des Volumens der Antikörper anti-B durch den Wert des Titers der Antikörper anti-B ist, und der Überschuß der Antikörper anti-E, bezogen auf Antikörper anti-B, durch die Tatsache ausgedrückt werden kann, daß das Produkt aus dem Wert des Volumens der Antikörper anti-E durch den Wert des Titers der Antikörper anti-E größer als ein Zwölftel des Produktes des Wertes des Volumens der Antikörper anti-B durch den Wert des Titers der Antikörper anti-B ist.

19. Verfahren zur Bestimmung nach Anspruch 3, bei dem man drei Unterensembles von Apolipoproteinen bestimmt, die jeweils zu drei Gruppen von Lipoproteinteilchen gehören, wobei das erste Unterensemble von dem zu den die erste Gruppe bildenden Lipoproteinteilchen LPB gehörenden Apolipoprotein B gebildet wird, das zweite Unterensemble von dem zu den die zweite Gruppe bildenden Lipoproteinteilchen LPB:E gehörenden Apolipoprotein E gebildet wird und das dritte Unterensemble von den zu den die dritte Gruppe bildenden Lipoproteinteilchen LPE:CI:CII:CIII:B, LPB:CIII, LPE:AII; LPAI:E, LPAI und LPAI:AII gehörenden Apolipoproteinen AI, AII und CIII gebildet wird, dadurch gekennzeichnet, daß man das die drei zu bestimmenden Unterensembles enthaltende Medium jeweils mit einem Gemisch von Antikörpern zusammenbringt, die gegen das Apolipoprotein CIII (Antikörper anti-CIII), gegen das Apolipoprotein AII (Antikörper anti-AII), gegen das Apolipoprotein AI (Antikörper anti-AI), gegen das Apolipoprotein E (Antikörper anti-E) und gegen das Apolipoprotein B (Antikörper anti-B) gerichtet sind, wobei die Antikörper anti-CIII, anti-AII und anti-AI jeweils im Überschuß, bezagen auf die Antikörper anti-E, und anti-B und die Antikörper E im Überschuß, bezogen auf die Antikörper anti-B, vorliegen.

20. Verfahren zur in-vitro-Erkennung von Krankheiten, die insbesondere mit Apolipoproteinspiegeln korreliert sind, welche sich außerhalb eines durch allgemein einem physiologischen Zustand eines gesunden menschlichen Wesens oder Tieres entsprechende Extremwerte begrenzten Bereiches befinden, bei dem das Bestimmungsverfahren gemäß einem beliebigen der Ansprüche 3 bis 19 angewendet wird.

21. Träger, insbesondere Platte oder Film bzw. Folie, der mit einem Gel beschichtet und zur Verwendung in einem Bestimmungs- oder Erkennungsverfahren gemäß den Ansprüchen 3 bis 20 zugerichtet ist, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Gemisch von Antikörpern umfaßt, die jeweils dem Erreichen eines Bereiches der Ausfällung von die zu bestimmenden Apolipoproteine tragenden Lipoproteinteilchen entsprechen.

22. Bestimmungskit oder -mittel, enthaltend einen Träger, insbesondere eine Gelplatte oder einen gelbeschichteten Film bzw. eine ebensolche Folie gemäß Anspruch 21 und mindestens eine Eichkurve, die vorher anhand von Eichproben mit einem Gehalt an vorbestimmten Mengen an Unterensembles von Apolipoproteinen, welche anderweitig in einem biologischen Medium zu bestimmen sind, festgelegt wurde, oder vorzugsweise eine biologische Eichlösung, bevorzugt mit mehreren vorbestimmten Verdünnungen, bevorzugt 3 oder 4 vorbestimmten Verdünnungen, enthaltend eine bekannte Menge von Unterensembles von anderweitig in einem biologischen Medium zu bestimmenden Apolipoproteinen.