DE3853120T2 - Schnelles Verfahren zur Identifizierung einer spezifischen Sequenz von Nukleinsäure. - Google Patents
Schnelles Verfahren zur Identifizierung einer spezifischen Sequenz von Nukleinsäure.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein rasches Verfahren zur Nukleinsäurehybridisierung, um eine spezifische Nukleinsäuresequenz zu identifizieren, insbesondere eine Sequenz, die für einen Mikroorganismus spezifisch ist. Bei dem Verfahren werden sehr geringe Volumen eines kon zentrierten Gensondenreagenzes verwendet, und es ist in der Forschung, für Testbestätigungen und diagnostische Zwecke verwendbar.
- Die genetische Information sämtlicher Organismen ist in spezialisierten Molekülen gespeichert, die DNA genannt werden. Die einzigartige Struktur der DNA wurde zuerst von Watson and Crick 1953 beschrieben. Das DNA-Molekül besteht aus zwei linearen polymeren Strängen, die so verschlungen sind, daß sie eine Doppelhelix bilden. Jeder Strang ist aus alternierenden Zucker- und Pbosphatgruppen zusammengesetzt, die durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Nukleotidbasenpaaren Adenin (A), Guanin (G), Cytosin (C) und Thymin (T) stabilisiert sind. Die beiden Stränge sind komplementär, wobei A stets an T an dem gegenüberliegenden Strang bindet und G stets an C bindet. Daher ist, wenn die Basensequenz in einem Strang bekannt ist, die Sequenz seines Partners ebenfalls bekannt. Die Zucker- und Phosphatgruppen erhalten die strukturelle Integrität des DNA-Moleküls aufrecht und bleiben in dem gesamten Molekül konstant. Lediglich die Anzahl der Basenpaare und die Sequenz, in der die Basenpaare auftreten, variiert. Durch die genaue Anzahl und Sequenz von Basen entlang des Stranges wird die gesamte genetische Information kodiert. Es ist also die physikalische und die biologische Natur sämtlicher Organismen durch die einzigartige Sequenz von Nukleotidbasen in ihrer DNA festgelegt. Die Identität eines Organismus kann festgestellt werden, und selbst geringfügige Unterschiede zwischen verwandten Organismen können nachgewiesen werden, wenn die Sequenz der veratwortlichen Basen bekannt ist und festgestellt werden kann.
- Das doppelsträngige DNA-Molekül ist normalerweise sehr stabil; die beiden komplementären Stränge können jedoch aufgetrennt (denaturiert) werden. In vivo ist es für natürliche Vorgänge, wie die DNA-Replikation (Synthese von identischen "Tochter"-Molekülen) und die Transkription (Synthese von messenger-RNA) notwendig, daß sich die beiden Stränge auftrennen und als Matrize dienen. In vitro kann DNA durch Wärmebehandlung oder extreme pH-Werte denaturiert werden. Diese einfachen Verfahren brechen die Wasserstoffbrückenbindungen, die die komplementären Paare zusammenhalten, während die Integrität der Basensequenzen in der relativ stabilen einzelsträngigen DNA erhalten bleibt. Unter geeigneten Bedingungen werden sich die Einzelstränge aufgrund der Nukleotidkomplementarität und der Wasserstoffbindungen neu winden (Reannealing). Dieses Verfahren, in dem ein doppelsträngiges Molekül durch eine spezifische sequenzabhängige Wechselwirkung von komplementären Einzelsträngen gebildet wird, wird Nukleinsäurehybridisierung genannt.
- Nukleinsäuregensonden sind spezifische, einzelsträngige Nukleinsäuresequenzen, die in einem Pool von einzelsträngigen Nukleinsäuren nach komplementären Sequenzen suchen. Unter den richtigen Bedingungen treffen die komplementären Stränge aufeinander, die komplementären Sequenzen erkennen einander und bilden doppelsträngige Moleküle. Die Nukleinsäuresonde kann markiert werden, wobei entweder ein Radioisotop oder einer von verschiedenen nicht radioaktiven Markern verwendet wird, wodurch die Reaktion der Nukleinsäurehybridisierung sichtbar gemacht werden kann.
- Hybridisierungstechniken mit Nukleinsäure-Gensonden sind bereits seit langem ein Werkzeug der Molekularbiologen. In letzter Zeit hat sich durch Verbesserungen in der Nukleinsäuretechnologie die Anwendung dieser Gensonden auf den klinischen Einsatz ausgedehnt. Mögliche Anwendungen dieser Technologie umfassen die direkte und die indirekte Diagnose von sowohl infektiösen aus auch genetisch vererbten Krankheiten. Im klinischen Mikrobiologielabor werden derzeit klassische biochemische Reaktionen und auf Antikörpern beruhende Agglutinationstechniken zum Identifizieren von Pathogenen angewendet. Diese Verfahren sind oftmals teuer, beschwerlich und zeitaufwendig. Die Technologie der Nukleinsäure-Gensonden im klinischen Mikrobiologielabor verspricht, kosteneffektiv, rasch und einfach zu sein. Weitere Vorteile dieser Technologie schließen die Möglichkeit mit ein, das Vorliegen des gesuchten Organismusses ungeachtet seines metabolischen Zustands nachzuweisen, die Möglichkeit, breite oder kleine Gruppen verwandter Spezies nachzuweisen, und das Potential, ein einziges rasches Verfahren zu entwickeln, bei dem für sämtliche Tests dieselbe Basisformatierung verwendet wird.
- Die Reexam des US-Patents Nr. 4,358,535 (Falkow et al.) lehrt ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines Pathogens in einer klinischen Probe, wobei Nukleinsäurehybridisierungstechniken angewendet werden. Das Verfahren umfaßt, daß man eine klinische Probe, die im wesentlichen aus physiologischem Fluid oder Exkreta besteht, auf einem inerten Träger, wie einem Filterpapier, ablegt und dann die Probe behandelt, um genetisches Material von dem Pathogen auf dem Träger in im wesentlichen einzelsträngiger Form zu fixieren. Das Filterpapier mit dem fixierten einzelsträngigen genetischen Material wird dann in eine markierte Sondenlösung eingebracht, wobei die Probe zu dem genetischen Material komplementär ist und mit dem genetischen Material hybridisiert.
- Das Verfahren von Falkow et al. hat den Nachteil, daß es ein zeitaufwendiges und langwieriges Protokoll notwendig macht. Die Zeit, die für den Hybridisierungsschritt alleine erforderlich ist, liegt in der Größenordnung von 24 Stunden, und die Zeit, die für den gesamten Test erforderlich ist, beträgt 48 Stunden oder mehr. Bei dem Verfahren nach Falkow et al. sind große Volumina an Gensondenlösung erforderlich, und es müssen andere Lösungen verwendet werden, da der Filter, auf dem die DNA fixiert ist, in die Gensondenlösung getaucht werden muß. Dies erfordert 1 bis 10 ml Gensondenlösung. Da die Gensondenlösung das teuerste Reagenz ist, das in dem Verfahren verwendet wird, erhöht die Verwendung von großen Volumina an Gensondenreagenz die Durchführungskosten des Verfahrens und jedes darauf basierende kommerzielle Produkt beträchtlich.
- Bei dem vorliegenden Verfahren werden die Nachteile des Verfahrens von Falkow et al. vermieden, indem man die Verfahrensschritte direkt auf einer isolierten Reaktionsoberfläche durchführt. Die Reaktionsoberfläche braucht nicht in ein Gensondenreagenz getaucht werden. Statt dessen werden geringe Volumina (etwa 2 bis 30 Mikroliter) dieser Reagenzien und Lösungen direkt auf die Reaktionsoberfläche gegeben. Prähybridisierungsschritte und zahlreiche Waschschritte, die man auf diesem Gebiet normalerweise erwarten würde, sind nicht länger notwendig. Auf diese Weise erspart das Verfahren wesentliche Kosten an Reagenzien und Zeit. Am bedeutendsten ist, daß das Verfahren rasche Ergebnisse liefert, da eine sehr hohe Konzentration von Gensondenreagenz verwendet werden kann (bei niedrigen Kosten), um die Hybridisierungsreaktion zur Vollständigkeit zu bringen. Ergebnisse können in weniger als 10 Minuten erhalten werden.
- Gootz et al. beschreiben in "Antimicrobial Agents and Chemotherapy", 28, 1, 69 - 73, 1985, einen DNA-Punkt-Hybridisierungstest, um die Dissemination spezifischer Aminoglycosid-Resistenzgene in klinischen Isolaten von Bakterien zu identifizieren und zu verfolgen. Zum Durchführen des von Gootz beschriebenen Tests ist ein Minimum von 66 Stunden erforderlich.
- Die vorliegende Erfindung stellt in einem ersten Aspekt ein Verfahren bereit, um zu bestimmen, ob eine Probe eine für einen speziellen Mikroorganismus spezifische Nukleinsäuresequenz enthält, umfassend:
- a) das Auftragen einer begrenzten Menge der Probe auf eine isolierte Nukleinsäure-bindende Oberfläche mit einer Breite oder einem Durchmesser von 2 mm bis 5,0 mm, die an einem inerten Träger befestigt ist;
- b) das Behandeln der Probe mit einem Lysereagenz, um Nukleinsäuren freizusetzen und um die Nukleinsäuren an den Träger in im wesentlichen einzelsträngiger Form zu binden;
- c) das Auftragen von 5 ul bis 30 ul eines Reagenzes, das mindestens eine nachweisbar markierte Nukleinsäuresonde enthält, wobei die Sonde in dem Reagenz bei einer Konzentration von 0,2 bis 5000 pM/ml vorliegt, direkt auf die bindende Oberfläche unter Hybridisierungsbedingungen und in einem Zeitraum, der für eine Hybridisierung ausreicht;
- d) das Waschen der bindenden Oberfläche; und
- e) das Nachweisen der Hybridisierung der Sonde mit der Nukleinsäure auf der bindenden Oberfläche mittels des nachweisbaren Markers, wodurch festgestellt wird, ob die spezifische Nukleinsäuresequenz vorliegt.
- In einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung auch eine Vorrichtung zum Ausführen des zuvor beschriebenen Verfahrens bereit, umfassend:
- a) einen im wesentlichen steifen inerten Träger; und
- b) eine Mehrzahl von isolierten Nukleinsäure-bindenden Oberflächen mit einer Breite oder einem Durchmesser von 2 mm bis 5 mm, wobei die Oberflächen an einer Oberfläche des Trägers haftend befestigt sind und voneinander mindestens 1 mm getrennt sind.
- In einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung darüber hinaus einen Kit zum Ausführen des zuvor beschriebenen Verfahrens bereit, der umfaßt:
- a) einen im wesentlichen steifen inerten Träger;
- b) eine Mehrzahl von isolierten Nukleinsäure-bindenden Oberflächen mit einer Breite oder einem Durchmesser von 2 mm bis 5 min, wobei die Oberflächen an einer Oberfläche des Trägers haftend befestigt sind und voneinander mindestens 1 mm getrennt sind; und
- c) einen Behälter, der ein Reagenz einer nachweisbar markierten Nukleinsäuresonde enthält, wobei die Sonde in dem Reagenz in einer Konzentration von 0,2 bis 5000 pM/ml vorliegt, wobei die Sonde für einen zu identifizierenden Mikroorganismus spezifisch ist und eine Nukleotidsequenz aufweist, die zu mindestens einem Teil der Nukleinsäure in dem Mikroorganismus komplementär ist.
- Bevorzugte Merkmale der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
- Die Figur stellt eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testverfahrens und eine Vorrichtung dar, die drei isolierte Nukleinsäurebindende Oberflächen aufweist.
- Die Nukleinsäure-Hybridisierungsreaktion ist konzentrationsabhängig und ist normalerweise eine Reaktion zweiter Ordnung. Eine Reaktion zweiter Ordnung ist eine solche Reaktion, in der die Reaktionsgeschwindigkeit proportional zu dem Produkt der Konzentrationen von zwei Reaktanten oder zur zweiten Potenz eines einzelnen Reaktanten ist. In der Nukleinsäure-Hybridisierungsreaktion ist die Reaktionsgeschwindigkeit direkt proportional zum Produkt der Konzentrationen der zwei Nukleinsäuresequenzen, die zu hybridisieren sind.
- Die Menge an Nukleinsäure, die in einer Probe vorliegt, insbesondere einer Probe eines Mikroorganismusses, kann relativ niedrig sein. Daher wird die Geschwindigkeit einer Hybridisierungsreaktion zum Nachweis dieser Nukleinsäure niedrig sein. Die Verwendung einer sehr hohen Konzentration des Gensondenreagenzes kann jedoch die Reaktion zu einer Pseudoreaktion erster Ordnung machen und so die Reaktionsgeschwindigkeit signifikant erhöhen. Eine Reaktion erster Ordnung ist eine solche Reaktion, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit exakt proportional zu der Konzentration eines Reaktanten ist. Verwendet man eine überschüssige Konzentration an Gensondenreagenz, kann die Hybridisierungsreaktion innerhalb von Minuten anstatt von Stunden, wie in den früheren Verfahren, zur Vollständigkeit gebracht werden. Wenn ein Überschuß an Gensondenreagenz verwendet wird, bleibt seine Konzentration im wesentlichen während der gesamten Reaktion unverändert.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein kosteneffektives Verfahren zur Verwendung einer hohen Konzentration eines Gensondenreagenzes bereit, um eine hohe Reaktionsgeschwindigkeit zu erhalten. Bislang war es aufgrund der relativ großen benötigten Volumina und der hohen Kosten der Sonden nicht wirtschaftlich durchführbar, hohe Konzentrationen an Gensondenreagenzien zu verwenden. Frühere Verfahren benötigen etwa 1 bis 5 ml an Gensondenreagenzlösung, da die Filter, auf denen die Hybridisierungsreaktion stattfand, in das Gensondenreagenz getaucht wurden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das vorliegende Verfahren beispielsweise mit einer Sondenlösung durchgeführt werden, die eine Könzentration von 0,02 Pikomol/Mikroliter aufweist. Durch punktweises Auftragen bzw. Tüpfeln von 10 Mikroliter eines solchen Reagenzes auf die Nukleinsäure-bindende Oberfläche würden dann 0,2 Pikomole der Sonde auf die Oberfläche aufgebracht. Würde die Nukleinsäure-bindende Oberfläche eingetaucht, wie in den früheren Verfahren, dann würden mindestens 1 ml der Sondenlösung erforderlich sein. Wenn dieselbe Konzentration wie in dem vorliegenden Verfahren verwendet werden würde, dann wären 20 Pikomole der Sonde erforderlich. Das ist die 100-fache Sondenmenge, die in dem vorliegenden Verfahren benötigt wird. Da das Gensondenreagenz in einem Nukleinsäure-Hybridisierungstest ein teures Reagenz ist, ist ohne weiteres ersichtlich, daß das vorliegende Verfahren beträchtliche Kosten spart.
- Das erfindungsgemäße Verfahren wird auf einer Oberfläche anstatt in einem Behälter durchgeführt. Eine "isolierte Nukleinsäure-bindende Oberfläche", die an einen im wesentlichen steifen Träger befestigt ist, wird als Bereich für die Hybridisierungsreaktion verwendet. Der hier verwendete Ausdruck "isolierte Nukleinsäure-bindende Oberfläche" bezeichnet einen diskreten Materialbereich, der in der Lage ist, Nukleinsäuren zu binden. Eine oder mehrere dieser bindenden Oberflächen sind auf einem Träger befestigt, und zwar separat und von jeder anderen Oberfläche, die auf dem Träger vorliegt, getrennt. Die bindende Oberfläche kann jede Form auf weisen, sie ist jedoch bevorzugt kreisförmig. Die bindende Oberfläche weist eine kleine Oberfläche und eine relativ geringe Größe auf, z. B. in der Größenordnung eines Tropfens einer wäßrigen Flüssigkeit. Wenn sie kreisförmig ist, kann die bindende Oberfläche vorzugsweise einen Durchmesser von etwa 1 bis 5 mm aufweisen und kann als ein "Punkt" bezeichnet werden, und wenn sie rechteckig oder quadratisch ist, weist sie eine Breite von etwa 1 bis 5 mm auf. Die Verwendung einer isolierten Nukleinsäure-bindenden Oberfläche stellt einen Reaktionsbereich bereit, der eine kleine Oberfläche aufweist. Dies ermöglicht es der Zielsequenz der Nukleinsäure, in direktem Kontakt mit sämtlichen Reagenzien und Lösungen zu sein, die auf den Bereich getüpfelt sind. Man sollte sich jedoch bewußt sein, daß die bindende Oberfläche in kostengünstige Lyse- und Waschlösungen eingetaucht werden kann, anstatt diese Lösungen auf die Oberfläche aufzutüpfeln. Die Verwendung isolierter bindender Oberflächen verhindert auch eine Kreuzkontamination, vorausgesetzt, daß Probe und Reagenzien der Oberfläche in einer Menge zugegeben sind, die ihre Grenzen nicht überschreitet, worauf hier bereits hingewiesen worden ist. Demgemäß können viele verschiedene Proben in demselben Test auf das Vorliegen einer bestimmten Zielnukleinsäure geprüft werden. Proben, die für eine bestimmte Nukleinsäure positiv sind, können direkt neben denjenigen liegen, die nicht positiv sind. Umgekehrt konnen verschiedene unterschiedliche Gensondenreagenzien auf die einzelnen bindenden Oberflächen getüpfelt werden, wobei jede dieselbe Probe enthält, um das Vorliegen von verschiedenen unterschiedlichen Nukleinsäuren in einer vorgegebenen Probe zu testen.
- Das limitierte oder beschränkte Volumen des in dem vorliegenden Verfahren verwendeten Gensondenreagenzes kann im Bereich von Aliquoten von etwa 1 bis 30 Microliter liegen. Vorzugsweise liegt das limitierte Volumen in dem Bereich von etwa 5 bis 20 Mikroliter für eine bindende Oberfläche von etwa 2 mm bis 5 mm. Die Konzentration der Sonde in dem Reagenz kann in dem Bereich von etwa 0,2 bis 5000 Pikomole/ml liegen. Vorzugsweise beträgt die Konzentration etwa 2,0 bis 200 Pikomole/ml.
- Der nachweisbare Marker kann jeder Ligand oder Hapten sein, das direkt oder indirekt nachgewiesen werden kann, und dadurch anzeigen, daß eine Hybridisierung stattgefunden hat. Der Marker ist bevorzugt ein Enzym, das in der Lage ist, eine Farbveränderung in einer Substratlösung zu verursachen, oder ein Ligand, der an ein solches Enzym binden kann. Es ist anzumerken, daß geeignete Enzyme solche sind wie Meerrettichperoxidase (HRP) und alkalische Phosphatase. Ein geeigneter Ligand kann ein Hapten sein, wie Fluorescein, Iminobiotin und Biotin, das in der Lage ist, an einen Avidin- oder Streptavidin-Enzymkomplex zu binden. Wenn eine biotinmarkierte Sonde verwendet wird, wird ein Avidin- oder Streptavidin-Enzymkomplex auf die bindende Oberfläche aufgetragen und dann auf die Oberfläche eine Enzymsubstratlösung gegeben. Der Nachweis einer Farbänderung der Oberfläche zeigt an, daß Hybridisierung stattgefunden hat. Alternativ kann der Marker ein radioaktives Molekül sein, wie ³²P, ¹²&sup5;I oder ³H; ein fluoreszierendes Molekül, wie Fluorescein und Rhodamin; ein chemilumineszentes Molekül, wie Luciferin und Luminol; oder ein lichtstreuendes Teilchen, wie kolloidales Gold. Geeignete Nachweisverfahren sind Szintillationszählung, Autoradiographie, Fluoreszenzmessung, kolorimetrische Messung, Lichtemission und dergleichen.
- Die zu identifizierende Nukleinsäuresequenz kann entweder DNA oder RNA sein. Die Sonde sollte mindestens 15 Basen aufweisen, um eine wirksame Hybridisierung zu gewährleisten, und sie wird üblicherweise etwa 15 bis 100 Basen aufweisen. Die Sonde kann durch organische Synthese, rekombinante DNA-Techniken oder Isolieren aus genomischen Nukleinsäuren hergestellt werden.
- Mikroorganismen, die durch das vorliegende Verfahren identifiziert werden können, sind Bakterien, einschließlich Pathogenen; Viren; Pilze, wie Hefe und Schimmelpilze; und Protozoen. Die Nukleinsäure von dem Mikroorganismus, der zu identifizieren ist, ist für den spezifiscken Organismus, von dem sie abstammt, charakteristisch. Daher entspricht der Nachweis der spezifischen Nukleinsäuresequenz dem Nachweis des Organismusses in der geprüften Probe.
- In dem ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Probe, die die nachzuweisende Nukleinsäure enthält, auf die Nukleinsäurebindende Oberfläche gegeben, indem eine geringe Menge auf die Oberfläche aufgetragen wird, und zwar etwa innerhalb ihrer Abgrenzungen. In manchen Fällen kann die Nukleinsäure in Lösung vorliegen, und man läßt die auf die Nukleinsäure-bindende Oberfläche aufgetragene Menge einfach trocknen. Es sollte sorgfältig darauf geachtet werden, daß die aufgetragene Menge nicht über die Grenzen der bindenden Oberfläche fließt.
- In anderen Ausführungsformen muß die Nukleinsäure-Zielsequenz (d. h. die Sequenz, die mit der Sonde zu hybridisieren ist) von einem die Sequenz enthaltenden Organismus, wie einer Zelle, entfernt werden, und die Sequenz muß dann in einzelsträngiger Form bereitgestellt werden. Die Zielsequenz wird aus einem sie enthaltenden Organismus durch Lyse des Organismusses mit einem geeigneten Detergens oder proteolytischem und/oder hydrolytischem Enzym entfernt. Falls notwendig, kann die einzelsträngige Form durch Denaturieren der DNA unter Verwendung von Standardtechniken, wie Wärmeexposition, extreme pH-Werte, Herabsetzen der Dielektrischen Konstante des wäßrigen Mediums oder der Exposition auf Harnstoff, Amiden oder ähnlichen gelösten Stoffen, erreicht werden. Die Denaturierung ist die Trennung von komplementären Strängen einer doppelsträngigen Nukleinsäure. Es kann das gesamte oder ein Teil des Nukleinsäuremoleküls denaturiert werden, solange Mengen bereitgestellt werden, die ausreichen, um eine Hybridisierung mit der Sonde zu gestatten. Liegt die Nukleinsäure bereits in im wesentlichen einzelsträngiger Form vor, wie als einzelsträngige ribosomale RNA, messenger-RNA und Transfer-RNA, dann ist ein spezieller Denaturierungsschritt nicht erforderlich. Vorzugsweise wird diese Zellyse und/oder Denaturierung erreicht, indem die Nukleinsäure mit verdünntem wäßrigen Alkali (z. B. 0,1 bis 1,0 M NaOH) in Kontakt gebracht wird, das sowohl Zellen lysieren als auch Nukleinsäure denaturieren kann. Es ist bevorzugt, eine solche Lyselösung auf eine solche Weise und in einer Menge auf die bindende Oberfläche zu tropfen, daß sie etwa in ihre Abgrenzungen paßt. Jegliches überschüssiges Lysereagenz kann bequem durch einfaches Abtupfen des Bereichs, der die bindenden Oberflächen umgibt, entfernt werden. Die bindende Oberfläche kann dann unter Verwendung von herkömmlichen Reagenzien neutralisiert werden.
- Ein Prä-Hybridisierungsschritt, um ein nicht-spezifisches Binden zu blockieren (wie mit der Verwendung von Denhardt's Lösung, Dextransulfat, BSA und dergleichen) ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht erforderlich. Obwohl die Erfinder der vorliegenden Erfindung nicht durch eine Theorie gebunden sein möchten, nehmen sie an, daß die zuvor genannte Zugabe eines Lysereagenzes auf die Grenzen der bindenden Oberflächen sowohl die zelluläre Lyse als auch die Blockierung von nicht-spezifischen Bindungsstellen erreicht wird, und zwar möglicherweise mit den zellulären Bruchstücken von der Lyse des Organismusses.
- Der Nukleinsäure-Hybridisierungsschritt kann nun durchgeführt werden, indem einfach konzentriertes, nachweisbar markiertes Nukleinsäure- Gensondenreagenz auf die bindende Oberfläche getüpfelt wird, und zwar in einer Menge, die etwa in ihre Grenzen paßt und die nicht über diese Grenzen fließt. Geeignete Mengen liegen typischerweise im Bereich von etwa 5 bis 30 Mikroliter, wenn die Grenzen der bindenden Oberfläche in der Größenordnung von 2 bis 5 mm liegen.
- Nach einem angemessenen Zeitraum, in dem die Hybridisierung stattfinden kann, kann das Auftreten einer Hybridisierung durch den nachweisbaren Marker der Sonde nachgewiesen werden.
- Eine Vorrichtung zur Verwendung bei der Durchführung einer Nukleinsäurehybridisierung mit limitiertem Volumen umfaßt einen im wesentlichen starren inerten Träger, der eine flache Oberfläche aufweist und mindestens eine isolierte Nukleinsäure-bindende Oberfläche aufweist, die an einer Seite der Trägeroberfläche haftend befestigt ist. Der inerte Träger kann eine längliche oder paddelartige Form aufweisen. Die isolierte Nukleinsäure-bindende Oberfläche kann aus jedem Material konstruiert sein, das zum Binden von Nukleinsäuren geeignet ist, und zwar vorzugsweise Cellulose, Nylon und positiv geladenes Nylon oder Nitrocellulose. Die Nukleinsäurebindende Oberfläche kann an den inerten Träger durch jedes herkömmliche Mittel angeklebt werden, insbesondere durch hydrophobe Klebstoffe. In den bevorzugten Ausführungsformen liegt die inerte Oberfläche in Form eines Paddels vor, wie in der Figur gezeigt ist. Eine Mehrzahl von bindenden Oberflächenpunkten sind relativ zueinander entlang der Längsachse des Paddelstiels angeordnet, und zwar mit einem räumlichen Abstand von mindestens etwa 1 mm voneinander. Die Basis des Paddels enthält einen Bereich für Markierungen.
- Ein Kit zum Identifizieren von Nukleinsäuresequenzen umfaßt die erfindungsgemäße Vorrichtung und ein Gefäß, das ein nachweisbar markiertes Nukleinsäure-Gensondenreagenz enthält. Die Sonde ist für die nachzuweisende Sequenz spezifisch. In bevorzugten Ausführungsformen ist diese Sequenz für einen bestimmten Mikroorganismus spezifisch. Das Nukleinsäüre-Gensondenreagenz enthält dann mindestens eine Nukleotidsequenz, die zu mindestens einem Teil der Nukleinsäure in dem Mikroorganismus komplementär ist. Das vorliegende Verfahren kann verwendet werden, um beliebige Mikroorganismen zu identifizieren, solange mindestens ein Teil der Nukleinsäure dieses Mikroorganismusses zur Hybridisierung mit dem Gensondenreagenz verfügbar ist. Ein solcher Mikroorganismus ist Neisseria gonorrhoeae. N. gonorrhoeae verursacht die sexuell übertragene Krankheit Gonorrhoe. Da eine durch N. gonorrhoeae verursachte Infektion eine meldepflichtige Krankheit darstellt, ist es normalerweise erforderlich, daß von verdächtigen Kulturen Bestätigungstests durchgeführt werden. Eine nachfolgende Bestätigung kann vorgenommen werden in Form von Tests, in denen Kohlehydrate verwendet werden, schnellen Fermentationstests, Schnelltests, die auf Aminopeptidaseaktivität beruhen, oder Immunoassaytechniken. Das vorliegende Verfahren, bei dem Gensonden zur Nukleinsäurehybridisierung verwendet werden, weist gegenüber sämtlichen dieser früheren Verfahren Vorteile auf.
- Der Genus Neisseria umfaßt zwei Spezies, die für den Menschen pathogen sind: N. gonorrhoeae und N. meningitidis. Obwohl N. gonorrhoeae von vielen Patienten mit asymptomatischen Infektionen isoliert wird, wird er immer als ein Pathogen angesehen. Andererseits kann N. meningitidis aus dem Rachen und dem Nasopharynx bei einem kleinen Teil gesunder Individuen wie auch bei Patienten mit einer Meningokokkenerkrankung isoliert werden. Andere Neisseria-Spezies (d. h. sicca, lactamica und cinerea) sowie auch Branhamella catarrhalis, verursachen selten eine Erkrankung, sie können jedoch ein Teil der normalen Flora sein und dürfen daher nicht mit Gonokokkus oder Meningokokkus verwechselt werden.
- Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die folgenden Beispiele ausführlicher beschrieben, soll dadurch jedoch nicht als eingeschränkt betrachtet werden.
- Kulturen von Neisseria gonorrhoeae wurden auf einem selektiv angereicherten Medium gezüchtet, wie einfaches Thayer-Martin-Medium (TM), modifiziertes Thayer-Martin-Medium (MTM), New York City Medium (NYC) oder Martin-Lewis Medium, um die Isolation von pathogenen Neisseria-Spezies zu gewährleisten. Inokulierte Medien wurden bei 35 bis 36 ºC in einer feuchten Atmosphäre, die 3 bis 7 % Kohlenstoffdioxid enthielt, inkubiert, bis bakterielles Wachstum sichtbar war (16 bis 24 Stunden). Die Kulturen wurden visuell auf ihre Koloniemorphologie untersucht. Die Isolate waren nicht älter als 96 Stunden (4 Tage). Verdächtige Organismen wurden von den Platten abgehoben, indem die Bakterienkolonie sanft mit dem abgeflachten Ende eines Applikatorstäbchens berührt wurde. Der Applikator wurde dann dazu benutzt, die Bakterien auf den Testpunkt zu tupfen. Eine einzelne 1-mm-Kolonie reichte aus, um diesen Test durchzuführen, so daß der Testpunkt nicht überladen wurde. Die Bakterien wurden so gleichmäßig wie möglich aufgetragen, und eine Beschädigung des Testpunkts durch Kratzen, Reißen oder übermäßigen Druck wurde vermieden. Das inokulierte Testpaddel wurde dann auf einen Heizblock bei 37 ºC gegeben. Ein kleines Tröpfchen (etwa 10 ul) von Lysereagenz (0,5 N alkalihaltiges Detergens) wurde direkt auf den Testpunkt aufgetragen. Das Paddel wurde 1 Minute lang bei 37 ºC inkubiert. Das Paddel wurde dann von dem Heizblock entfernt und für 1 Minute in ein neutralisierendes Reagenz (0,5 M TRIS/HCl enthaltendes Detergens) gegeben. Das Paddel wurde dann direkt ohne Verzögerung auf den Heizblock zurückgelegt, überschüssiges Reagenz wurde mit absorbierendem Papier unter direktem Druck abgetupft.
- Ein kleiner Tropfen (etwa 10 Mikroliter) des Gensondenreagenzes (biotinylierte N. gonorrhoeae-spezifische Gensonde und ein Puffer, der 50 % Formamid, 10 % Hybridisierungsbeschleuniger, Triton X-100* und Carrier-DNA enthält) wurde direkt auf den Testpunkt gegeben. Das Paddel wurde 1 Minute lang bei 37 ºC inkubiert und wie zuvor abgetupft. Dann wurde ein kleiner Tropfen (etwa 10 Mikroliter) Konjugatreagenz (Streptavidin-Meerrettichperoxidasekomplex, der 1 % Trägerproteine und Stabilisatoren und Konservierungsmittel, 0,15 % Thimerosal enthielt) direkt auf den Testpunkt gegeben und 1 Minute lang bei 37 ºC inkubiert. Das Paddel wurde von dem Heizblock entfernt, und überschüssiges Reagenz wurde abgetupft. Das Paddel wurde dann in ein Waschreagenz gegeben, um überschüssige Gensonde und Enzymkonjugat abzuwaschen. Das Waschreagenz enthielt ein Reduzierungsmittel und Detergens. Das Paddel wurde 2 Minuten lang eingetaucht und zeitweilig bewegt. Das Paddel wurde auf den Heizblock zurückgelegt und wie zuvor abgetupft. (*Triton X-100 ist ein eingetragenes Warenzeichen.)
- Ein schmaler Tropfen (etwa 10 Mikroliter) einer Substrat lösung (Puffer, der Wasserstoffperoxid und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzadin (TMB) enthält) wurde direkt auf den Testpunkt aufgegeben. Das Paddel wurde 1 Minute lang bei 37 ºC inkubiert. Das Paddel wurde von dem Heizblock entfernt und für etwa 10 Sekunden in ein Stopreagenz (1 % Natriumazid) gegeben. Das Paddel wurde dann entfernt, abgetupft und visuell abgelesen, um das Vorliegen von N. gonorrhoeae zu bestätigen. Ein positiver Test für N. gonorrhoeae erzeugt ein charakteristisches blaues Signal. Das negative Ergebnis reicht von einem nicht wahrnehmbaren Signal zu einer schwach blauen Hintergrundfärbung.
- Positive Testproben wurden mit positiven und negativen Kontrollen verglichen. Im Idealfall wäre die positive Kontrolle ein frisches klinisches Isolat (weniger als 49 Stunden alt), das definitiv als N. gonorrhoeae identifiziert worden ist. Alternativ kann ein vorrätiger Stamm von N. gonorrhoeae von einer anerkannten Hinterlegungsstelle erhalten werden, wie der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, 20850. Im Idealfall wäre die negative Kontrolle ein frisches klinisches Isolat (weniger als 48 Stunden alt) von einer Neisseria-Spezies, die nachweislich keine Gonorrhoe verursacht (z. B. N. meningitidis). Alternativ könnte von ATCC ein vorrätiger Stamm erhalten werden.
- Dieses Nachweisverfahren wurde mit dem klassischen Kohlenhydrate-Abbautest zum Identifizieren von N. gonorrhoeae und anderen Neisseria-Spezies verglichen. Insgesamt wurden 361 genitale und pharyngeale Isolate getestet. Das zuvor beschriebene Verfahren ergab positive Ergebnisse für 174/174 nachgewiesene N. gonorrhoeae-Isolate und ergab negative Ergebnisse für 157/158 Nicht-N. gonorrhoeae-Isolate.
- Das Vorkommen von Penicillinase-erzeugenden Neisseria gonorrhoeae (PPNG) hat sich in den Vereinigten Staaten in den letzten paar Jahren signifikant erhöht. Die von Neisseria gonorrhoeae erzeugte Penicillinase ist vom TEM-β-Lactamase-Typ. Es wurden DNA-Sonden synthetisiert, wobei die Sequenzinformation von der veröffentlichten Sequenz des TEM-1-Gens verwendet wurde, und diese Sonden wurden mit biotinylierten Nukleotiden markiert, wobei das Enzym terminale Transferase verwendet wurde. Durch Verwenden dieser Gensonden wurde ein schneller, nicht radioaktiver DNA-Sondentest zum Nachweis von PPNGs direkt aus einer Primärkultur entwickelt. Der Test folgte derselben Formatierung wie der Test für Neisseria gonorrhoeae, der in dem vorherigen Beispiel 1 beschrieben wurde. Die Durchführung des Tests dauerte etwa 8 bis 10 Minuten, und das endgültige Testergebnis wurde visuell abgelesen. Mit 43 PPNGs aus primären Kulturplatten wurden keine falsch negativen Ergebnisse erhalten.
- Es wird ein Test entsprechend den Beispielen 1 und 2 durchgeführt, wobei gleichzeitig eine DNA-Gensonde für die Nukleinsäure von N. gonorrhoeae und eine separate Gensonde für PPNG verwendet werden. Bakterienproben werden auf die Testpunkte aufgetragen. Auf bestimmte Punkte wird Gensonden-Reagenz für N. gonorrhoeae aufgetragen und auf andere PPNG- Gensondenreagenz. Es können auch negative Kontrollen verwendet werden. Wie in den vorherigen Beispielen erhält man bei positiven Ergebnissen eine Blaufärbung. Diese Beispiele zeigen, daß eine Probe auf mehr als eine Zielnukleinsäure auf demselben inerten Paddelträger getestet werden kann. Es muß jedoch sorgfältig darauf geachtet werden, daß nichts über die Grenzen der bindenden Oberflächen fließt, um eine Kreuzkontamination der Reagenzien zu vermeiden. 4. Tests mit variierenden Nachweissystemen In manchen Fällen ist das zuvor beschriebene Avidin/Biotin-Nachweissystem aufgrund des Vorliegens von endogenem Biotin in den zu prüfenden Organismen nicht geeignet (z. B. Campylobactor). Es können andere Nachweissysteme in der beschriebenen Testformatierung verwendet werden.
- Demgemäß wurde ein System entwickelt, wobei die DNA-Gensonde mit FITC markiert wurde und die Reaktionsendprodukte mit einem an ein Enzym konjugierten Antikörper, der für das FITC-Molekül spezifisch ist, nachgewiesen. Verdächtige Organismen wurden von den Kulturplatten durch vorsichtiges Berühren der Bakterienkolonie mit dem abgeflachten Ende eines Applikatorstäbchens hochgehoben. Der Applikator wurde dann dazu verwendet, die Bakterien auf die Testpunkte zu tupfen. Eine einzelne 1-mm-Kolonie war ausreichend, um diesen Test durchzuführen, so daß der Testpunkt nicht überladen wurde. Die Bakterien wurden so gleichmäßig wie möglich aufgetragen, und eine Beschädigung des Testpunkts durch Kratzen, Reißen oder übermäßigen Druck wurde vermieden. Das inokulierte Testpaddel wurde dann auf einen Heizblock bei 37 ºC gelegt. Ein kleines Tröpfchen (etwa 10 ul) von Lysereagenz (0,5 M alkalihaltiges Detergens) wurde direkt auf den Testpunkt gegeben. Das Paddel wurde dann 1 Minute bei 37 ºC inkubiert. Das Paddel wurde dann von dem Wärmeblock entfernt und für 1 Minute in ein neutralisierendes Reagenz gegeben (0,5 M Tris/HCl enthaltendes Detergens und 2 mg/ml Proteinase K). Das Paddel wurde dann direkt ohne Verzögerung auf den Heizblock zurückgelegt, überschüssiges Reagenz wurde mit absorbierendem Papier abgetupft, wobei fester direkter Druck verwendet wurde.
- Ein kleines Tröpfchen (etwa 10 Mikroliter) des Gensondenreagenzes, das FITC-markierte Gensonde enthält, die spezifisch für den zu untersuchenden Organismus ist (0,02 pmol/ul in einem Puffer, der 50 % Formamid, 10 % Hybridisierungsbeschleuniger, Triton X-100* und Carrier-DNA enthält) wurde direkt auf den Testpunkt gegeben. Das Paddel wurde 1 Minute bei 37 ºC inkubiert und wie zuvor abgetupft. Dann wurde ein kleiner Tropfen (etwa 10 Mikroliter) Konjugatreagenz (10 ug/ml von monoklonalem anti-FITC-Konjugat an Meerrettichperoxidase, 200 Mole Hepes, 1 % BIgG, 0,025 m EDTA, 0,02 % Thimerasol, 1 mN K&sub3;[Fe(CEN)&sub6;]) direkt auf den Testpunkt gegeben und 1 Minute lang bei 37 ºC inkubiert. Das Paddel wurde von dem Heizblock entfernt, und überschüssiges Reagenz wurde abgetupft. Das Paddel wurde dann von überschüssiger Gensonde und Enzymkonjugat gewaschen, indem es 2 Minuten lang mit zeitweiligem Bewegen in einer herkömmlichen Detergens-Waschflüssigkeit getränkt wurde. Das Paddel wurde dann in ein Waschreagenz gegeben, das Detergens und 1 M NaCl enthielt. Das Paddel wurde auf den Heizblock zurückgelegt und wie zuvor abgetupft. [*Triton X-100 ist ein eingetragenes Warenzeichen.]
- Ein kleiner Tropfen (etwa 10 Mikroliter) Substratlösung (Puffer, der Wasserstoffperoxid und TMB enthält) wurde direkt auf den Testpunkt gegeben. Das Paddel wurde 1 Minute bei 37 ºC inkubiert. Das Paddel wurde von dem Heizblock entfernt und für etwa 10 Sekunden in ein Stopreagenz (1 % Natriumazid) gegeben. Das Paddel wurde dann entfernt, geblottet und visuell abgelesen. Ein positives Testergebnis erzeugte ein charakteristisches blaues Signal. Das negative Ergebnis reichte von einem nicht wahrnehmbaren Signal bis zu einer schwach blauen Hintergrundfärbung.
- Das zuvor beschriebene Experiment wurde für den Nachweis mehrerer anderer Spezies wiederholt, nämlich Shigella, Salmonella, Campylobacter und N. gonorrhea. Auch hier ergaben positive Testergebnisse ein charakteristisches blaues Signal. Bei negativen Ergebnissen erhielt man eine schwach blaue Farbe oder keine Farbentwicklung.
- Die zuvor beschriebenen Testsysteme sind auch verwendet worden, um das Vorliegen einer spezifischen DNA-Sequenz zu testen, ob diese Sequenz von einem Mikroorganismus ist oder nicht. In diesen Systemen wurde die Proben-DNA in Lösung zu dem Testpunkt gegeben und auf dem Punkt trocknen gelassen. Die Tests wurden dann wie in den Beispielen 1 und/oder 3 beschrieben durchgeführt. Nachweis der spezifischen Sequenz ergab ein charakteristisches blaues Signal.
- Ein Blatt Gene-Screen-Plus (New England Nuclear) wurde in Streifen geschnitten. Ein Ende eines jeden Streifens wurde auf einen Membranstreifen zum Einführen in eine Paddelherstellungsvorrichtung befestigt, die Kunststoffpaddel enthält, die mit Markierungen vorbedruckt waren. Klebstoff (RTV 732 oder Silastic medizinisches Haftsilikon Typ A- Dow Corning) wurden dann auf die Kunststoffpaddel aufgetragen, wobei eine mit Öffnungen versehene Schablone verwendet wurde. Die Paddel wurden dann aus der Paddelform entfernt, und innerhalb von 20 Minuten nach Auftragen des Klebstoffs wurden drei Membranpunkte angebracht, indem Löcher aus den Membranstreifen mit einem Lochstanzer gestanzt wurden. Die gestanzten Öffnungen oder "Punkte" hafteten auf dem Kunststoffpaddel mit Klebstoff, der mit der schablone aufgetragen worden war. Man ließ die Paddel mindestens 10 Stunden lang trocknen. Jedes Paddel enthielt drei Membranpunkte, die direkt unter Nummernindices und im Zwischenraum zwischen den Seiten des Paddels angebracht waren. Die Punkte waren frei von Klebstoff und jeder anderen Fremdsubstanz, um einen nachfolgenden Test und das Ablesen der Endergebnisse nicht zu stören. Die erhaltene Paddeltestvorrichtung sieht im wesentlichen wie die in der Figur dargestellte aus.
- Mehrere Membranpunkte, die variierende Durchmesser aufweisen, wurden gebildet, wobei das in Beispiel 6 erwähnte Lochstanzverfahren verwendet wurde. Es wurde versucht, Reagenzvolumina auf die Punkte zu pipettieren, um die Oberfläche zu bedecken, jedoch die Grenzen nicht überfließen zu lassen.
- Die Ergebnisse sind wie folgt: Durchmesser des Membranpunkts in mm Volumen in Mikroliter (Ca.-Angaben)
Claims (16)
1. Verfahren zum Bestimmen ob eine Probe eine für einen bestimmten
Mikroorganismus spezifische Nukleinsäuresequenz enthält, umfassend:
a) das Auftragen einer begrenzten Menge der Probe auf eine isolierte
Niikleinsäure-bindende Oberfläche mit einer Breite oder einem Durchmesser
von 2 mm bis 5,0 mm, die an einem inerten Träger befestigt ist;
b) das Behandeln der Probe mit einem Lysereagenz, um Nukleinsäuren
freizusetzen und um die Nukleinsäuren an den Träger in im wesentlichen
einzelsträngiger Form zu binden;
c) das Auftragen von 5 ul bis 30 ul eines mindestens eine nachweisbar
markierte Nukleinsäure-Sonde enthaltenden Reagenzes, wobei die Sonde in dem
Reagenz bei einer Konzentration von 0,2 bis 5000 pM/ml vorliegt, direkt auf
die bindende Oberfläche unter Hybridisierungsbedingungen in einem Zeitraum,
der für eine Hybridisierung ausreicht;
d) das Waschen der bindenden Oberfläche; und
e) das Nachweisen der Hybridisierung der Sonde mit der Nukleinsäure
auf der bindenden Oberfläche mittels des nachweisbaren Markers, wodurch
festgestellt wird, ob die spezifische Nukleinsäuresequenz vorliegt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure-Sonde eine
Nukleotidsequenz aufweist, die zu mindestens einem Teil der Nukleinsäure
des Mikroorganismusses komplementär ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Volumen des
auf die bindende Oberfläche aufgetragenen Reagenzes 5 bis 20 ul beträgt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3. wobei der nachweisbare
Marker chemisch, radioaktiv, fluoreszent oder chemilumineszeiit ist oder ein
lichtstreuendes
Partikel ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der nachweisbare
Marker ein Enzym ist, das in der Lage ist, in einer Substratlösung eine
Farbänderung zu verursachen, oder ein Ligand ist, der an ein solches Enzym
binden kann.
6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Ligand Biotin ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, das darüber hinaus nach Schritt (c) und
vor Schritt (d) den Schritt umfaßt, daß ein Avidin- oder Streptavidin-
Enzym-Komplex auf die bindende Oberfläche aufgebracht wird, und dann den
nachfolgenden Schritt umfaßt daß eine Enzym-Substrat-Lösung auf die
Oberfläche aufgebracht wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Sonde DNA
ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprache 1 bis 7. wobei die Sonde RNA
ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei mindestens zwei
verschiedene Reagenzien von nachweisbar markierten Nukleinsäure-Sonden auf
verschiedene bindende Oberflächen in Schritt (c) gegeben werden, um auf
mindestens zwei verschiedene spezifische Nukleinsäuresequenzen in derselben
Probe zu testen.
11. Vorrichtung zum Ausführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche
1 bis 10, umfassend:
a) einen im wesentlichen steifen inerten Träger; und
b) eine Mehrzahl von isolierten Nukleinsäure-bindenden Oberflächen mit
einer Breite oder einem Durchmesser von 2 mm bis 5 mm, wobei die
Oberflächen an einer Oberfläche des Trägers haftend befestigt sind und voneinander
mindestens 1 mm getrennt sind.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei der inerte Träger eine
längliche Form aufweist und sich die isolierten Nukleinsäure-bindenden
Oberflächen entlang einer Längsachse des Trägers befinden.
13. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, wobei die
Nukleinsäure-bindenden Oberflächen aus Cellulose, Nylon, positiv geladenem Nylon,
Nitrocellulose oder einem Gemisch davon gebildet sind.
14. Kit zum Ausführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis
10, umfassend:
a) einen im wesentlichen steifen inerten Träger:
b) eine Mehrzahl vor isolierten Nukleinsäure-bindenden Oberflächen mit
einer Breite oder einem Durchmesser von 2 mm bis 5 mm, wobei die
Oberflächen an einer Oberfläche des Trägers haftend befestigt sind und voneinander
mindestens 1 mm getrennt sind: und
c) einen Behälter der ein Reagenz einer nachweisbar markierten
Nukleinsäure-Sonde enthält, wobei die Sonde in dem Reagenz bei einer
Konzentration von 0,2 bis 5000 pM/ml vorliegt, wobei die Sonde fuhr einen zu
identifizierenden Mikroorganismus spezifisch ist und eine Nukleotidsequenz
aufweist, die zu mindestens einem Teil der Nukleinsäure in dem
Mikroorganismus komplementär ist.
15. Kit nach Anspruch 14, wobei die Sonde mit Biotin, Iminobiotin oder
Fluorescein markiert ist.
16. Kit nach Anspruch 14 oder Anspruch 15, wobei die Sonde für
N. gonnorhoeae spezifisch ist.
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