DE69106366T2

DE69106366T2 - Kompetitives pcr zur quantifizierung von dns.

Info

Publication number: DE69106366T2
Application number: DE69106366T
Authority: DE
Inventors: Mathias Uhlen
Original assignee: CEMU Bioteknik AB
Current assignee: CEMU Bioteknik AB
Priority date: 1990-07-24
Filing date: 1991-07-23
Publication date: 1995-05-11
Anticipated expiration: 2011-07-24
Also published as: AU648330B2; AU8238691A; EP0540585B1; ATE116376T1; CA2087982A1; JPH05508545A; JP3138471B2; GB9016163D0; WO1992001812A1; DK0540585T3; DE69106366D1; EP0540585A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von DNA, insbesondere ein Verfahren der Festphasendiagnose medizinischer Zustände durch die Identifikation einer speziellen DNA.
DNA-Zielmoleküle sind oft in Zellysaten oder in Materialien aus anderen Quellen in extrem geringen Mengen vorhanden, und um eine solche DNA selektiv zu amplifizieren, wurde die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) entwickelt. Bei dieser Technik wird ein Paar von Polymerisations-Primern, die für bekannte Sequenzen der Ziel-DNA spezifisch sind, ausgewählt, wobei einer am oder in der Nähe des 5'-Endes des codierenden Stranges hybridisiert und der andere an oder in der Nähe des 5'-Endes des nichtcodierenden Stranges hybridisiert, so daß in Gegenwart einer Polymerase jeder Primer eine DNA-Sequenz ergibt, die sich über die volle Länge der Matrize der Ziel-DNA erstreckt. Wenn die so erzeugte DNA dann einer Strangtrennung, typischerweise durch Schmelzen bei einer Temperatur von etwa 90ºC, unterworfen wird, hybridisieren die neugebildeten einzelsträngigen DNA-Sequenzen mit dem überschüssigen Primer, der in dem Gemisch vorhanden ist, üblicherweise nach Erniedrigen der Temperatur auf den für die Reassoziierung geeigneten Bereich, wonach in Gegenwart der Polymerase weitere DNA-Stränge synthetisiert werden, die sich dieses Mal nur zwischen den Enden der beiden Primer erstrecken. Die Polymerase kann bevorzugt die hohe Temperatur, die bei der Stufe der Strangtrennung verwendet wird, überleben, wobei eine geeignete thermophile Polymerase, d.h. Taq, jüngst verfügbar geworden ist. Wenn ein Überschuß der zwei Primer und der Nukleotide, die für die DNA-Synthese benötigt werden, in dem Medium aufrechterhalten wird, ist es möglich, einen wiederholten zyklischen Prozeß ablaufen zu lassen, in dem die getrennten Stränge synthetisiert werden, getrennt werden, an den Primer und die neuen synthetisierten Stränge assoziiert werden, indem nur die Temperatur zwischen den optimalen Temperaturen für jede der vorstehenden Stufen erhöht und erniedrigt wird. So wurde gefunden, daß die Amplifikation der ursprünglichen Ziel-DNA exponentiell sein kann, und millionenfache Erhöhungen der Konzentration in einer relativ kurzen Zeit durchgeführt werden können.
Jedoch ist dieses Verfahren nicht immer ausreichend selektiv, weil ein Prozentsatz an unspezifischer Bindung der Primer an andere DNA-Sequenzen eintritt, wodurch die zuletzt genannten zusätzlich zu der Ziel-DNA amplifiziert werden. Ferner muß festgestellt werden, wieviel Ziel-DNA in einer Probe vor der PCR-Amplifikation vorhanden war.
Beim Nachweis von beispielsweise Bakterien, wie Viren und Parasiten, besitzt die PCR mehrere Vorteile, verglichen mit herkömmlichen diagnostischen Verfahren, d.h. die Generalität und die Geschwindigkeit des Assays. Jedoch begrenzt die Tatsache, daß herkömmliche PCR-Assays nicht nur qualitativ sind, ihre Verwendung auf diagnostische Anwendungen, bei denen nur das Vorhandensein oder Fehlen des Pathogens festzustellen ist. Für viele Krankheiten wird eine quantitative Messung benötigt, um eine geeignete Diagnose zu stellen und vorteilhafterweise würde es nützlich sein, die Menge des Pathogens während der Behandlung zu messen, um eine relevante Prognose zu stellen. Wie vorstehend erwähnt, besteht eine Hauptsorge hinsichtlich der Nützlichkeit des PCR-Assays, weil dessen extreme Empfindlichkeit den Erhalt falsch-positiver Werte als Ergebnis einzelner Moleküle, die die Probe verunreinigen, ermöglicht. Es besteht eine Notwendigkeit eines quantitativen Assays, z.B. eines, der für klinische Assays geeignet ist, der die Nachteile in Zusammenhang mit den herkömmlichen PCR-Assays überwindet.
Jüngst wurden mehrere Systeme zur quantitativen Bestimmung der anfänglichen Matrizen-DNA/RNA beschrieben (A. C. Syvänen, M. Bengtström, J. Tenhunen und H. Söderlund Nucl. Acids Res., 16, 11327 (1988); G. Gilliland, S. Perrin und H. F. Bunn PCR protocols, S. 60-69, Academic Press, San Diego (1990); und M. Becker-Andre und K. Hahlbrock, Nucl. Acids. Res. 17, 9437 (1990)). Die Hybridgewinnung Isotopenmarkierter Produkte auf der Grundlage der Affinität wurde verwendet, um die Menge an nach verschiedenen PCR-Zyklen synthetisierte DNA zu bestimmen (A. C. Syvänen a.a.O.). Dieses Verfahren erlaubt die indirekte Bestimmung der anfänglichen Zahl der Ziel-Matrizen in der Probe. Da jedoch die Effizienz der PCR mit Veränderungen unter anderem bezüglich der Matrizen- und Nukleotidkonzentrationen, der Qualität der Polymerase etc. variiert, ist es schwierig, Standardbedingungen aufzustellen, die auf die Verwendung in einer automatischen oder halbautomatischen Ausrüstung anwendbar wären.
Die gleichzeitige Amplifikation von cDNA und chromosomaler DNA wurde ebenfalls durchgeführt, wenn die genomische DNA eine kleine Intron-Sequenz (G. Gilliland a.a.O.) einschließt. So wird ein Größenunterschied erhalten, der für die elektrophoretische Trennung verwendet werden kann, um das Verhältnis genomischer DNA gegenüber cDNA zu bestimmen. Während die Technik einige der mit Syvänen et al. assoziierten Probleme überwindet, kann das Verfahren nur für spezielle Amplifikationen verwendet werden, und die quantitative Bestimmung von Fragmenten mit verschiedener Größe wird benötigt.
Ein anderes quantitatives Verfahren ist der PCR-unterstützte Transkript-Titrationsassay (PATTY), bei dem die Menge an RNA durch Zugabe mutierter RNA zu der Probe gemessen wird, die eine Restriktions-Spaltstelle in der amplifizierten Region verglichen mit der Ziel-RNA enthält oder der sie fehlt (M. Becker-André a.a.O.). Nach der cDNA-Synthese durch reverse Transkriptase mit anschließender PCR wird das gleichzeitig amplifizierte Produkt danach einer Restriktionsspaltung unterworfen und durch Elektrophorese analysiert. Die relative Menge des gespaltenen Materials ergibt das Verhältnis der Ziel-RNA zu der als internen Standard verwendeten RNA. Dieses Verfahren besitzt die Nachteile, daß eine Elektrophorese oder eine Restriktionsanalyse benötigt werden.
Früher beschrieben die Erfinder ein Festphasenverfahren zum Nachweis immobilisierter amplifizierter Nukleinsäuren unter der Bezeichnung DIANA (PCT/EP90/00454), das beispielsweise in seiner bevorzugten Ausführungsform zur kolorimetrischen Detektion von in vitro-amplifizierter DNA verwendet wurde. Der Assay beruht auf der Verwendung eines biotinylierten oder sonstwie derivatisierten PCR-Primers, der zum Einfangen von in vitro-amplifiziertem Material, beispielsweise auf Streptavidin-beschichteten Magnetkugeln, verwendet wird. Der andere PCR-Primer enthält eine "Hantel", wie eine lac-Operatorsequenz, was die kolorimetrische Detektion der eingefangenen DNA unter Verwendung eines LacI-Repressor-β- Galactosidase-Fusionsproteins erlaubt. (J. Lundeberg, J. Wahlberg, M. Holmberg, U. Pettersson und M. Uhlen, DNA Cell Biol. 9 (4) 289 (1990). W. Zolg, E. Scott und M. Wendlinger, Am. J Trop. Med. Hyg. 39(1), 33 (1988)). Die bevorzugte Form des qualitativen DIANA-Assays kombiniert die Vorteile des PCR-Verfahrens mit der hohen Spezifität und Stabilität des Biotin-Streptavidin-Systems und der Einfachheit einer kolorimetrischen Bestimmung basierend auf β-Galactosidase. Die starke Wechselwirkung zwischen Biotin und Streptavidin (Kd=10&supmin;¹&sup5; M&supmin;¹) erhöht die Effizienz des Systems. Die Magnetkugeln als fester Träger gewährleisten, daß keine Zentrifugationen, Filtrationen oder Fällungen benötigt werden. (T. Hultman, S. Stahl, E. Hornes und M. Uhlen, Nucl. Acids Res. 17, 4937 (1989)).
Es wurde nun ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von DNA, insbesondere ein Verfahren zur Bestimmung der Menge an Ziel-DNA, die in einer Probe vor der PCR vorhanden war, entdeckt. Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf einer kompetitiven Titration, bei der Mengen an Ziel-DNA gleichzeitig mit bekannten Mengen einer Kompetitor-DNA amplifiziert werden, wodurch verschiedene Verhältnisse an Ziel- DNA: Kompetitor-DNA erzeugt werden, wobei die Kompetitor- DNA im wesentlichen die gleiche wie die Ziel-DNA ist, ausgenommen, daß sie eine Erkennungsstelle umfaßt, die direkt oder indirekt durch ein markiertes Teilchen nachgewiesen werden kann. Im Gegensatz zu dem Becker-André-Verfahren benötigt das erfindungsgemäße Verfahren keine Restriktionsspaltung und keine elektrophoretische Analyse.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Menge einer Ziel-DNA in einer Probe, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in Stufen
(a) die Probe in eine Vielzahl von Aliquote aufteilt,
(b) jedem Aliquot eine bekannte Menge einer Kompetitor-DNA zusetzt, die die gleiche wie die Ziel-DNA ist, ausgenommen, daß sie eine Erkennungsstelle init der Fähigkeit, spezifisch an ein Detektormolekül zu binden, umfaßt, welches direkt oder indirekt an einen Marker gebunden sein kann, wodurch das Verhältnis der Ziel-DNA zu der Kompetitor-DNA sich in den Aliquoten unterscheidet,
(c) die Ziel-DNA und die Kompetitor-DNA in jedem Aliquot durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gleichzeitig amplifiziert, wobei mindestens ein Primer verwendet wird, der die Immobilisierung der gleichzeitig amplifizierten DNA erlaubt, wobei die Assoziierungsstellen aller verwendeten PCR-Primer außerhalb der Erkennungsstelle liegen,
(d) das Detektormolekül an die amplifizierte Kompetitor-DNA bindet, wodurch die DNA markiert wird,
(e) vor oder nach Stufe (d) die gleichzeitig amplifizierte DNA, sofern nicht bereits immobilisiert, über mindestens einen PCR-Primer immobilisiert,
(f) die Menge des Markers auf der immobilisierten amplifizierten Kompetitor-DNA in jedem Aliquot bestimmt, um ein Anzeichen der Menge der Ziel-DNA in der Probe zu ergeben.
Die in der vorliegenden Beschreibung erfolgte Bezugnahme auf "Ziel-DNA" soll unter anderem cDNA, beispielsweise aus retroviraler RNA, genomische DNA, mitochondriale DNA etc. umfassen.
Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ergibt einen Satz Markerwerte, die bei Auftragung gegen die bekannten Mengen der zugesetzten Kompetitor-DNA eine charakteristische sigmoide Kurve ergeben (wie deutlicher aus den nachstehenden Beispielen hervorgeht). Der Wendepunkt auf der Kurve ist durch die scharfe Veränderung der Menge der markierten DNA zwischen denjenigen Aliquoten, in denen die zugesetzte Kompetitor-DNA vorherrscht, und denen, in denen die Ziel-DNA vorherrscht, definiert und ist in etwa der Menge der Ziel-DNA in der anfänglichen Probe proportional.
Im allgemeinen ist es bevorzugt, verschiedene bekannte Mengen der Kompetitor-DNA identischen Aliquoten der Probe zuzusetzen, so daß jede mögliche Wirkung von Inhibitoren unverändert ist. Die Kompetitor-DNA wird zweckdienlichsterweise den Aliquoten als eine Reihe gleicher Verdünnungsschritte zugesetzt, z.B. 1:3, oder für ein genaueres Ergebnis 1:1,5. Jedoch können viel höhere Verdünnungen nützlich sein, beispielsweise so hoch wie 1:100, für einige Zwecke. Etwa 6-10 derartige Verdünnungen ergeben normalerweise einen adäquaten Bereich und 8x12 Mikroliter Kavitäten können zu diesem Zweck verwendet werden. Für diagnostische Zwecke reicht es üblicherweise aus, zu folgern, daß die Menge der Ziel-DNA zwischen den Mengen der Kompetitor-DNA in zwei oder möglicherweise drei benachbarten Verdünnungen liegt. Das erfindungsgemäße Verfahren vermeidet somit die Notwendigkeit, die tatsächliche Menge der amplifizierten Ziel-DNA zu bestimmen, obwohl dies in einigen Fällen eine nützliche Information sein könnte.
Die zweistufige PCR (unter Verwendung ineinander angeordneter Primer), wie in der gleichzeitig anhängigen Anmeldung PCT/EP90/00454 der genannten Erfinder beschrieben ist, kann verwendet werden, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verstärken und dadurch die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zu erhöhen.
Unabhängig davon, ob die einstufige oder zweistufige PCR durchgeführt wird, ist die Effizienz der PCR nicht kritisch, da die Erfindung auf der scharfen Veränderung der Menge der markierten DNA zwischen verschiedenen Aliquoten beruht. Jedoch ist es bevorzugt, einen qualitativen DIANA als Test auf das Vorhandensein oder Fehlen der Ziel-DNA durchzuführen und bei Durchführung unter identischen Bedingungen erlaubt dies die Bestimmung der Gesamtmenge an amplifizierter DNA und die Bezugnahme auf den quantitativen DIANA-Assay.
Unter bestimmten Umständen kann es von einem diagnostischen Gesichtspunkt her betrachtet ausreichen, nur zu bestimmen, ob die Menge der Ziel-DNA über oder unter einem kritischen Wert liegt, beispielsweise dem abgeleitet von 1000 Ziel-Pathogenen. In diesem Fall kann die PCR an einer Einzelprobe durchgeführt werden, der eine bekannte Menge der Kompetitor-DNA in der bekannten kritischen Konzentration zugesetzt ist. Wenn die Menge der Ziel-DNA signifikant größer ist als die Menge der Kompetitor-DNA, ist das Signal der amplifizierten und markierten Kompetitor-DNA charakteristischerweise niedrig.
Die Immobilisierung der gleichzeitig amplifizierten DNA kann entweder als Teil der PCR-Amplifikation selbst, wobei ein oder mehrere Primer an einen Träger gebunden werden, oder alternativ ein oder mehrere Primer eine funktionelle Gruppe tragen, die die anschließende Immobilisierung erlaubt, beispielsweise eine Biotin- oder Thiolgruppe, durchgeführt werden. Wenn eine anschließende Immobilisierungsstufe benötigt wird, kann diese vor der Markierung, wodurch die Waschung der immobilisierten amplifizierten DNA vor der Markierung erlaubt wird, oder nach der Markierungsstufe durchgeführt werden. In beiden Fällen wird nichtgebundener Marker von der immobilisierten markierten DNA vor der Bestimmung entfernt.
Der feste Träger kann zweckdienlicherweise die Form von Mikrotiter-Kavitäten annehmen, die vorteilhafterweise im herkömmlichen 8 x 12-Format sind, oder die Form von Eintauchstäbchen annehmen, wie aus Polystyrol, das zur Bindung der Primer-DNA aktiviert wurde, bestehen (K. Almar, Doktorarbeit, Royal Institute of Technology, Stockholm, Schweden, 1988). Der Träger kann auch Teilchen, Fasern oder Kapillaren, die beispielsweise aus Agarose, Cellulose, Alginat, Teflon oder Polystyrol bestehen, umfassen. Der Träger kann auch magnetische Teilchen, z. B. superparamagnetische Teilchen, hergestellt von Dynal AS (Oslo, Norwegen) umfassen.
Bevorzugt werden ausreichende Zyklen der PCR durchgeführt, so daß ein Sättigungsspiegel erreicht wird. So enthält die amplifizierte DNA im wesentlichen das gleiche Verhältnis der Ziel-DNA zur Kompetitor-DNA wie es vor der PCR vorlag.
Es ist vorteilhaft, die Bedingungen so einzurichten, daß die Kompetitor- und Ziel-DNA mit gleicher Effizienz durch die PCR amplifiziert werden, und es ist daher wichtig, daß die Größe und der GC-Gehalt jedes Fragments im wesentlichen gleich gehalten werden und daß die Sequenzen, an die die Primer assoziieren, identisch sind. In einigen Fällen kann es notwendig sein, die Effizienz der Zellyse der Probe zu berücksichtigen, die einen Teil der genomischen DNA für die PCR weniger verfügbar machen kann. Zusätzlich kann die Ziel-DNA ein Teil der chromosomalen DNA in den Anfangszyklen sein, während die Kompetitor-DNA beispielsweise in der Form eines kleinen Plasmids vorliegen kann. So könnte es nötig sein, die relativen Amplifikaticns-Effizienzen dieser frühen PCR-Zyklen einzustellen. Das erfindungsgemäße quantitative Verfahren kann zur allgemeinen quantitativen Bestimmung von RNA und DNA sowohl für forschungsmäßige als auch für klinische Anwendungen einschließlich der Diagnose von viralen, bakteriellen und Protozoen-Pathogenen verwendet werden. Es kann auch in der forensischen Medizin Anwendung finden. Die Assaytechnik ist sehr einfach und rasch, wodurch sie unter Verwendung einer Robotervorrichtung, bei der eine große Anzahl von Proben rasch analysiert werden kann, leicht automatisiert werden kann. Da die bevorzugte Detektion und quantitative Bestimmung auf einer kolorimetrischen Reaktion beruhen, reicht eine visuelle Analyse oft zur Bewertung aus.
Jede geeignete Polymerase kann verwendet werden, obwohl es bevorzugt ist, ein thermophiles Enzym, wie die Taq-Polymerase, zu verwenden, um den wiederholten Temperaturzyklus zu erlauben, ohne eine weitere Polymerase, z.B. das Klenow- Fragment, in jedem Zyklus zusetzen zu müssen.
Wie vorstehend erwähnt, kann die Ziel-DNA von mRNA in der Probe synthetisierte cDNA sein, und das erfindungsgemäße Verfahren ist somit auf die Diagnose aufgrund der charakteristichen mRNA anwendbar. Eine solche einleitende Synthese kann durch eine einleitende Behandlung mit einer reversen Transkriptase zweckdienlicherweise in dem gleichen System von Puffern und Basen, die in den anschließenden PCR-Stufen verwendet werden, durchgeführt werden. Da das PCR-Verfahren Erhitzung zur Durchführung der Strangtrennung benötigt, wird die reverse Transkriptase in dem ersten PCR-Zyklus inaktiviert. Wenn mRNA die Ziel-Nukleinsäure ist, kann es vorteilhaft sein, die Ausgangsprobe, z.B. eine Serumprobe, der Behandlung mit einem immobilisierten polydT-Oligonukleotid zu unterwerfen, um die gesamte mRNA über die terminalen polyA-Sequenzen davon aufzufinden. Alternativ kann eine spezifische Oligonukleotidsequenz verwendet werden, um die RNA über eine spezifische RNA-Sequenz aufzufinden. Das Oligonukleotid kann dann als Primer für die cDNA-Synthese dienen, wie in der Internationalen Patentanmeldung WO-A- 90/11446 beschrieben ist.
Die Erkennungsstelle kann in die Kompetitor-DNA durch in vitro-Mutagense einer Probe der Ziel-DNA eingeführt werden, z.B. nach dem in der Internationalen Anmeldung WO-A- 90/06043 beschriebenen Verfahren.
Die Erkennungsstelle auf der Kompetitor-DNA ist bevorzugt klein und zeigt eine hohe Bindungsspezifität mit dem Detektormolekül, das direkt oder indirekt den Marker bindet. Beispielsweise könnte die Erkennungsstelle eine einzigartige Sequenz sein, die von einer DNA-Sonde erkannt wird. Eine solche Sonde könnte beispielsweise radioaktiv markiert sein oder am 5'-Ende unter Verwendung von Fluoreszens markiert sein. Es ist jedoch bevorzugt, eine Stelle in die Kompetitor-DNA einzuführen, die von einem Protein erkannt wird.
Es ist eine Anzahl von Proteinen bekannt, die an spezifische DNA-Sequenzen binden und die oft an genetischen Prozessen, wie An- und Abschalten von Operons, beteiligt sind. Ein derartiges Protein ist der lac-Repressor LacI, der mit dem lac-Operon (lacOP) reagiert, um die Transkription zu hemmen. So kann, wenn die Erkennungsstelle die DNA-Sequenz lacOP ist, der Marker über das Protein LacI angeknüpft werden. Es ist besonders zweckdienlich, ein Fusionsprotein aus einem DNA-bindenden Protein, wie LacI, und einem weiteren Protein zu entwickeln, das anschließend zum Nachweis verwendet werden kann, beispielsweise unter Verwendung von Methoden, basierend auf der Farbfluoreszens oder der Chemilumineszens. Beispiele für solche Proteine sind β-Galactosidase, alkalische Phosphatase und Peroxidase.
Es ist bevorzugt, als Marker ein LacI-β-Galactosidase-Fusionsprotein zu verwenden, das eine 21 Basenpaar-lange lac- Operatorsequenz erkennt, die in die Kompetitor-DNA, z.B. in der Nähe der Mitte, eingeführt wurde. Das Fusionsprotein bindet an die kompetitive DNA und die Zugabe von ONPG führt zu einer Farbbildung, die spektrophotometrisch bewertet werden kann. Die Verwendung dieses Fusionsproteins und von IPTG erlaubt einen raschen einfachen kolorimetrischen Assay, der nicht die im Zusammenhang mit der Verwendung radioaktiver Marker auftretenden Sicherheitsprobleme besitzt.
Die Spezifität des Verfahrens für die Ziel-DNA wird durch Einschluß einer PCR-Amplifikationsstufe als erste Stufe stark erhöht. Durch eine solche einleitende Amplifikation wird die Konzentration der Ziel-DNA bezüglich der anderen DNA, die in der Probe vorhanden sein kann, stark erhöht, und eine Amplifikation in der zweiten Stufe mit mindestens einem für eine andere Sequenz der Ziel-DNA spezifischen Primer, wie in der WO-A-9011369 beschrieben, erhöht signifikant das auf die Ziel-DNA zurückzuführende Signal, bezogen auf das "Untergrundrauschen".
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders vorteilhaft bei der Diagnose pathologischer Zustände, die durch das Vorhandensein von spezifischer DNA gekennzeichnet sind, insbesondere bei der Diagnose latenter infektiöser Erkrankungen, wie virale Infektionen durch Herpes, Hepatitis oder HIV. So kann das Verfahren vorteilhafterweise zur Charakterisierung oder Serotypisierung und quantitativen Bestimmung von Infektionen durch Bakterien, Protozoen und Pilze verwendet werden, bei denen Proben des infizierenden Organismus schwierig zu erhalten sein können oder bei denen ein isolierter Organismus schwierig in vitro für die anschliessende Charakterisierung zu züchten ist, wie im Falle von P. falciparum oder von Chlamydia-Arten. Infolge der Einfachheit des Verfahrens und der Geschwindigkeit kann es auch verwendet werden, um andere pathologische Erreger nachzuweisen, die Erkrankungen, wie Gonorrhoea und Syphilis, hervorrufen. Selbst in Fällen, in denen Proben des infizierenden Organismus leicht erhalten werden können, macht die Geschwindigkeit der PCR-Technik, verglichen mit der Inkubation einer Kultur über Nacht das erfindungsgemäße Verfahren zum bevorzugten Verfahren gegenüber herkömmlichen mikrobiologischen Techniken.
Der feste Träger kann funktionelle Gruppen, wie Hydroxyl-, Carboxyl-, Aldehyd- oder Aminogruppen, oder andere Einheiten, wie Avidin oder Streptavidin, zur Befestigung von Primern tragen. Diese können im allgemeinen durch Behandlung des Trägers unter Bereitstellung eines Oberflächenüberzugs eines Polymeren, das eine von diesen funktionellen Gruppen trägt, hergestellt werden, z.B. Polyurethan zusammen mit einem Polyglykol, wodurch Hydroxylgruppen bereitgestellt werden, oder ein Cellulosederivat, wodurch Hydroxylgruppen bereitgestellt werden, ein Polymeres oder Copolymeres aus Acrylsäure oder Methacrylsäure, wodurch Carboxylgruppen bereitgestellt werden, oder ein aminoalkyliertes Polymeres, wodurch Aminogruppen bereitgestellt werden. Das U.S. Patent Nr. 4 654 267 beschreibt die Einführung vieler solcher Oberflächenüberzüge.
Die Erfindung umfaßt auch Kits zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Diese umfassen normalerweise mindestens die folgenden Komponenten:
(a) Kompetitor-DNA, umfassend eine Erkennungsstelle, die spezifisch an ein Detektormolekül binden kann, das direkt oder indirekt an einen Marker gebunden sein kann;
(b) ein Detektormolekül zur Bindung an die amplifizierte Kompetitor-DNA, wobei die DNA markiert wird;
(c) ein Paar von Primern für die PCR, wobei mindestens ein Primer Mittel für die Immobilisierung des Primers besitzt;
(d) eine Polymerase, die bevorzugt hitzestabil ist, beispielsweise die Taq1-Polymerase;
(e) Puffer für die PCR-Reaktion; und
(f) gegebenenfalls einen festen Träger.
Sofern ein enzymatischer Marker verwendet wird, enthält das Kit vorteilhafterweise ein Substrat für das Enzym und andere Komponenten eines Detektionssystems.
Die Erfindung wird nun anhand nichtbeschränkender Beispiele unter Bezugnahme auf die Figuren beschrieben:
die Figur 1 zeigt schematisch einen Unterschied zwischen einem bevorzugten Verfahren der qualitativen DIANA und einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren der quantitativen DIANA;
die Figur 2 ist ein Diagramm, das verschiedene Primersequenzen, ihre Bezeichnungen und ihre Beziehung zu einer Zielsequenz zeigt; und
die Figur 3 zeigt graphisch die Ergebnisse der nachstehend beschriebenen Versuche.
Die Figur 1 zeigt schematisch eine bevorzugte Ausführungsform des Prinzips des erfindungsgemäßen quantitativen DIANA, worin ein fester Träger verwendet wird, um ein biotinyliertes DNA-Fragment, das nach der PCR erhalten worden ist, zu immobilisieren, und wobei ein LacI-Repressor-β-Galactosidase-Fusionsprotein für die anschließende kolorimetrische Detektion verwendet wird. Bei dem qualitativen DIANA-Assay wird eine lac-Operatorsequenz in das in vitro- amplifizierte Material unter Verwendung einer "Hantel"-Sequenz in einen der PCR-Primer eingeschleust. Bei dem quantitativen DIANA-Assay wird stattdessen eine lac-Operatorsequenz in eine clonierte Version der Zielsequenz, die die Kompetitor-DNA ist, eingeschleust, und eine bekannte Menge dieser clonierten DNA wird gleichzeitig mit der Ziel-DNA amplifiziert. In beiden Fällen beruht die Detektion auf der spezifischen Wechselwirkung des LacI-β-Galactosidase-Fusionsproteins (J. Wahlberg et al., a.a.O.) mit der lac-Operatorsequenz und der anschließenden Hydrolyse des Substrats Orthonitrophenyl-β-D-Galactosid (ONPG), wodurch die kolorimetrische Antwort erhalten wird.

Beispiel I

Bestimmung der absoluten Menden des Parasiten Plasmodium falciparum in klinischen menschlichen Blutproben

Das Pf155-Gen wurde als Ziel-DNA ausgewählt, da gezeigt worden war, daß die Ainplifikation dieses Gens akurat das Vorhandensein des Parasiten in klinischem Material nachwies (J. Lundeberg, J. Wahlberg, M. Holmberg, U. Pettersson und M. Uhlen, DNA Cell Biol. 9 (4), 289 (1990)). Die zur Clonierung und zum Assay auf das Pf155-Gen verwendeten Primer sind in Figur 2 gezeigt. Die Primer RIT52, 53, 54 und RIT55 wurden verwendet, um das gesamte Fragment durch die PCR zu clonieren. Die Matrize für die Clonierung der kompetitiven DNA war eine klinische Probe aus Gambia (M. Holmberg et al., Trans R. Soc. Trop. Med. Hyg. 84, 202 (1990)) und eine 21 Basenpaar-lange lac-Operatorsequenz wurde gleichzeitig in das clonierte Fragment eingeschleust, wodurch 21 Nukleotide von 1519 bis 1539 dieses Gens ersetzt wurden.
Die Figur 2 zeigt die Struktur des Pf155/RESA-Zielgens von P. falciparum und die zur Detektion, quantitativen Bestimmung und Clonierung verwendeten Primer. Die Ziffern beziehen sich auf die publizierte Sequenz nach J.M. Favaloro et al., Nucl. Acids Res. 14, 8265 (1986). Die Primer wurden mit der Phosphoamiditchemie in einem automatisierten DNA- Synthesegerät (Gene Assembler Plus, Pharmacia, Schweden) synthetisiert. Die PCR-Clonierung und in vitro-Mutagenese wurden durch Subclonieren des stromaufwärtigen Fragments des Pf155/RESA-Gens, das durch die PCR erzeugt worden war, mit den Primern RIT52 und RIT54 und Spaltung mit BamHI und EcoRI und Ligierung in pUC8, das mit den gleichen Enzymen gespalten worden war, durchgeführt. Die so erhaltene Konstruktion wurde mit BamHI und HindII gespalten, wodurch die Ligierung mit dem stromabwärtigen Fragment, das durch die PCR erzeugt worden war, und RIT53 und RIT55, die mit BamHI und HindIII gespalten wurden, ermöglicht wurde. Der mutierte Clon wurde durch DNA-Sequenzierung, wie von T. Hultman et al., Nuc. Acids Res. 17, 4937 (1989) beschrieben, bestätigt. Für den qualitativen Assay wurden RIT48 und RIT36 verwendet, während die Primer RIT48 und RIT61 für den quantitativen DIANA verwendet wurden. Die in Kursivschrift gezeigten Nukleotide entsprechen der durch in vitro-Mutagenese eingeschleusten Sequenz.
Für den quantitativen DIANA wurde eine zweistuf ige PCR mit ineinandergeordneten Primern durchgeführt, wobei die äußeren Primer RIT25 und RIT53 für anfängliche 35 Zyklen verwendet wurden und dann nach Verdünnung der amplifizierten Substanz weitere 25 Zyklen mit den inneren Primern RIT48 und RIT61 durchgeführt wurden. Die clonierte Kompetitor-DNA wurde in stufenweisen Verdünnungen vor dem ersten PCR-Zyklus Reagensgläsern, die die gleiche Menge der anfänglichen Ziel-DNA enthielten, zugesetzt. Ein qualitativer Standard- DIANA wurde parallel ohne Zugabe der Kompetitor-DNA durchgeführt. In diesem Falle wurde der stromabwärtige Primer RIT61 durch den Primer RIT36 (Figur 2), der eine lac-Operator-"Hantel"-Sequenz erhielt, ersetzt. So wird ein qualitativer Assay zum Nachweis des Vorhandenseins oder Fehlens des Pf155-Gens parallel mit dem quantitativen Assay durchgeführt.
Ein Lysegemisch nach W. Zolg, E. Scott und M. Wendlinger, Am. J. Trop. Med. Hyg. 39 (1) 33 (1988) entsprechend 0,2 ul Vollblut von Patienten aus Gambia wurde verwendet, und die Menge der Parasiten wurde unabhängig durch mikroskopische Bestimmung bestimmt.
Die in vitro-Amplifikation wurde unter Verwendung eines programmierbaren Techne Dri-Block PHC-2 durchgeführt (Techne, U.K.). Die Amplifikation wurde in zwei aufeinanderfolgenden Stufen durchgeführt. Zuerst 35 Zyklen mit RIT52 und RIT53, anschließend eine 1/100-Verdünnung und eine zweite Amplifikation für 25 Zyklen mit RIT48 und RIT61 für den quantitativen DIANA-Assay und RIT48 und RIT36 für den qualitativen DIANA-Assay. Der verwendete PCR-Puffer enthielt 20 mM TAPS (3-[Tris(hydroxymethyl)methylamino]-1- propansulfonsäure) (pH 9,3), 8 mM MgCl&sub2;, 50 mM KCl und 0,1% Tween 20. Die Probe und eine abnehmende Menge der Kompetitor-DNA, jeweils 1 ul, wurden in PCR-Röhrchen mit 10 ul PCR-Puffer gegeben. Die Röhrchen wurden anschließend auf 99ºC 5 Minuten lang erhitzt, um die Zellen zu lysieren und dann rasch auf 0ºC abgekühlt. Das lysierte Gemisch wurde mit 40 ul eines PCR-Puffers mit 0,2 mM dNTP, 0,2 uM jedes Primers und 1,0 Einheiten der AmpliTaq-Polymerase (Perkin Elmer, Schweden) versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde mit einer Schicht leichtem Mineralöl (Sigma, USA) bedeckt. Ein Temperaturzyklus in der PCR war: Denaturierung der Matrize 96ºC, 0,5 Minuten; Reassoziierung der Primer 59ºC, 1 Minute, Extension der Primer 72ºC, 1 Minute. Das PCR-Gemisch wurde auf 300 ug Magnetkugeln mit covalent gekoppeltem Streptavidin, Dynabeads M280-Streptavidin (Dynal AS, Norwegen) immobilisiert und 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Kugeln mit der immobilisierten DNA wurden mit 200 ul Fusionsprotein (LacI-β-Galactosidase,0,2 mg/ml) und 200 ug beschallter DNA aus Heringssperma in einem Eppendorf-Röhrchen 20 Minuten lang vermischt. Die Kugeln wurden viermal mit 250 ul TST-Puffer (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Tween 20), enthaltend 10 mM β-Mercaptoethanol, gewaschen. Das Substrat, ortho-Nitrophenyl-β-D- Galactosid (ONPG) wurde zugesetzt (200 ul), und die Veränderung der Absorption bei Raumtemperatur wurde gemessen. Die Reaktion wurde durch Abnehmen der Hälfte des Reaktionsgemisches in einer Mikrotiterplatte mit einer Stopplösung gestoppt. Das Ergebnis bietet sich als die Veränderung der Absorption pro Minute bei 405 nm dar.
In Figur 3 ist A eine Titrationskurve mit einer stufenweisen 1:1,5-Verdünnung der Kompetitor-DNA unter Verwendung einer 500 Parasiten enthaltenden Probe und B,C,D,E zeigen jeweils die quantitative DIANA von Proben unter Verwendung einer stufenweisen 1:3-Verdünnung der Kompetitor-DNA, wobei die Menge der Parasiten pro Probe durch das angegebene mikroskopische Verfahren bestimmt wurde. Die Bahn "+/-" zeigt die Detektion durch qualitativen DIANA der jeweiligen Probe.
Zuerst wurde eine Probe, die etwa 500 Parasiten enthielt, als Matrize bei dem quantitativen DIANA verwendet, und stufenweise 1:1,5-Verdünnungen der Kompetitor-DNA, die die lac-Operatorsequenz enthielten, wurden durchgeführt, wobei mit etwa 16.000 Kompetitor-Plasmidmolekülen in der ersten Stufe begonnen wurde (Verdünnung 1). Es wird darauf hingewiesen, daß, da der Parasit in seinem asexuellen Stadium haploid ist, es nur eine chromosomale Zielregion pro Parasit gibt. Nach einem zweistufigen PCR-Verfahren wurden das biotinhaltige Material von den Magnetkugeln immobilisiert. Die Kugeln wurden gewaschen und das Fusionsprotein und das chromogene Substrat wurden zugesetzt. Die Ergebnisse, die in Figur 3A gezeigt sind, zeigen, daß die Verdünnungen 1 bis 6 eine starke kolorimetrische Antwort ergeben, welche zeigt, daß die meisten DNA-Fragmente aus dem lac-Operator enthaltenden Kompetitor dazu stammen. Im Gegensatz dazu wurde eine niedrige Aktivität für die Verdünnungen 9 bis 10 beobachtet, was zeigt, daß die Ziel-DNA, der der lac-Operator fehlt, im Überschuß vorliegt. Eine mittlere Antwort wird für die Verdünnungen 7 und 8 erhalten, die etwa 1400 bzw. 950 Kompetitormoleküle enthalten. Dies zeigt, daß der quantitative DIANA-Assay eine Titrationskurve mit der erwarteten sigmoiden Form ergibt, obwohl die Plasmid-Ziel-DNA mit einer etwa zweifach niedrigeren Effizienz, verglichen mit der genomischen Ziel-DNA, amplifiziert wird.
Um die quantitative Bestimmung über einen relativ breiten Bereich (20 bis 150.000 Parasiten/Probe) ohne mehr als neun stufenweise Verdünnungen zu erlauben, wurde der Assay durch Durchführen von 1:3-Verdünnungen modifiziert. Infolge der zweifach niedrigeren Effizienz für die Plasmid-Ziel-DNA, verglichen mit der genomischen DNA (Figur 3A) wurden 300.000 Plasmidmoleküle der Probe zugesetzt (Verdünnung 0). Mehrere klinische menschliche Blutproben aus Gambia (Holmberg, a.a.O.) wurden untersucht und durch ein mikroskopisches Verfahren unabhängig bestimmt (Holmberg, a.a.O.). Die Ergebnisse für vier unabhängige und repräsentative Proben sind in der Figur 3B, C, D und E gezeigt. Der qualitative DIANA zeigt, daß die Proben B, C und D Parasiten enthalten, während die Probe E negativ ist. Der quantitative DIANA für Probe B zeigt einen Ausschlußpunkt zwischen den Verdünnungen 3 und 4, die 5550 bzw. 1850 Parasiten wiedergeben. Dieses Ergebnis entspricht gut dem mikroskopischen Verfahren, das nahelegt, daß die Probe etwa 2600 Malariaparasiten enthält. Die Probe C besitzt einen Ausschlußpunkt zwischen den Verdünnungen 4 und 5, entsprechend 1850 bzw. 620 Molekülen, was den 900 Parasiten, die gemäß dem mikroskopisch Verfahren detektiert wurden, gut entspricht. Die Probe D, die 40 Parasiten enthält, besitzt einen Ausschlußpunkt bei Verdünnung 7 und 8, enthaltend Kompetitormoleküle entsprechend 70 bzw. 20 Parasiten. Dies zeigt, daß nur 40 Parasiten mit dem Assay nachgewiesen werden können. Im Gegensatz dazu zeigen alle Verdünnungen für die Probe E ein starkes kolorimetrisches Ansprechen, was erwartet wird, da diese Probe keine Parasiten enthält. Es wird darauf hingewiesen, daß die absoluten Werte für die individuellen positiven Signale beträchtlich variieren, und dies wahrscheinlich eine Folge von Variationen bezüglich der Effektivitäten während des letzten Teils des PCR-Verfahrens ist. Jedoch begrenzt diese Variation den Assay nicht, da nur der Wendepunkt für jede Probe bestimmt werden muß, und somit ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis ausreichend ist. In Figur 3B, C und 3D ist das Signal an jedem positiven Punkt in der Tat hoch, während das Untergrundrauschen sehr niedrig ist. Die absoluten Werten zwischen den qualitativen und quantitativen Punkten unterscheiden sich auch, wahrscheinlich in Folge der Variationen der PCR-Effizienz mit den beiden unterschiedlichen Primern (RIT61 und RIT36).
Für die Routineanalyse sollte eine positive Kontrolle, z.B. das β-Globingen, parallel laufengelassen werden, um nachzuweisen, daß die Amplifikationseffizienzen infolge des Vorhandenseins von Inhibitoren in der Probe nicht verringert wurden.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Menge an Ziel-DNA in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufen

(a) die Probe in eine Vielzahl von Aliquoten teilt;

(b) jedem Aliquot eine bekannte Menge einer Kompetitor-DNA zusetzt, die die gleiche wie die Ziel-DNA ist, ausgenommen, daß sie eine Erkennungsstelle umfaßt, die spezifisch an ein Detektormolekül binden kann, das direkt oder indirekt an einen Marker gebunden sein kann, wodurch das Verhältnis der Ziel-DNA zu der Kompetitor-DNA sich in den Aliquoten unterscheidet;

(c) die Ziel-DNA und die Kompetitor-DNA in jedem Aliquot durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gleichzeitig amplifiziert, wobei mindestens ein Primer verwendet wird, der die Immobilisierung der gleichzeitig amplifizierten DNA erlaubt, wobei die Reassoziierungsstellen aller verwendeter PCR-Primer außerhalb der Erkennungsstelle liegen;

(d) das Detektormolekül an die amplifizierte Kompetitor-DNA bindet, wodurch die DNA markiert wird;

(e) vor oder nach Stufe (d) die gleichzeitig amplifizierte DNA, sofern noch nicht bereits immobilisiert, über mindestens einen PCR-Primer immobilisiert;

(f) die Menge des Markers an der immbolisierten amplifizierten Kompetitor-DNA in jedem Aliquot bestimmt, wodurch eine Angabe der Menge der Ziel-DNA in der Probe erhalten wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin verschiedene Mengen der Kompetitor-DNA den Aliquoten der Probe, die sich alle im gleichen Verdünnungszustand befinden, zugesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Kompetitor-DNA den Aliquoten als eine Verdünnungsreihe zugesetzt wird.

4. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, worin zusätzlich ein qualitativer DIANA-Assay durchgeführt wird, um zu bestimmen, ob die Ziel-DNA in der Probe vorhanden ist oder nicht, und/oder um die Gesamtmenge der amplifizierten DNA zu bestimmen.

5. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, worin die Ziel-DNA cDNA, produziert in einer vorangehenden Stufe aus RNA, oder genomische oder mitochondriale DNA ist.

6. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, worin die Erkennungsstelle in die Kompetitor-DNA durch in vitro-Mutagenese eingeschleust wird.

7. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, worin die Kompetitor-DNA durch Kontakt mit einem markierten DNA-bindenden Protein markiert wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin das DNA-bindende Protein der mit einem Enzym markierte lac-Repressor ist.

9. Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche zur Diagnose von Infektionen durch Viren, Bakterien, Protozoen oder Pilze.

10. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, umfassend mindestens die folgenden Komponenten:

(a) Kompetitor-DNA, umfassend eine Erkennungsstelle, die spezifisch an ein Detektormolekül binden kann, das direkt oder indirekt an einen Marker gebunden sein kann;

(b) ein Detektormolekül zur Bindung an die amplifizierte Kompetitor-DNA, wodurch die DNA markiert wird;

(c) ein Paar von Primern für die PCR, wobei mindestens ein Primer Mittel zur Immobilisierung des Primers besitzt;

(d) eine Polymerase, die bevorzugt hitzestabil ist, beispielsweise die Taq1-Polymerase;

(e) Puffer für die PCR-Reaktion; und

(f) gegebenenfalls einen festen Träger.