DE3850601T2 - Verfahren zur Herstellung von Phospholipidderivate. - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Phospholipidderivate.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen von Phospholipidderivaten.
- Lezithine, wie etwa Sojabohnen-Lezithin und Eigelb-Lezithin, sind wohlbekannt und sie sind bei der Herstellung von Lebensmitteln, Kosmetika, Farben, Schmiermitteln, magnetischen Materialien, Tierfutter und landwirtschaftlichen Chemikalien weitverbreitet als Rohmaterialien verwendet worden, indem von ihrer Oberflächenaktivität und physiologischen Aktivität Gebrauch gemacht wurde. Wir befassen uns hier mit einer großteils neuen Klasse von Phospholipidderivaten, die dadurch hergestellt werden, daß man Enzyme mit einer Transphosphatidylierungswirkung auf vorliegende Phospholipidderivate zusammen mit Verbindungen einwirken läßt, die eine Hydroxylgruppe enthalten - wobei diese großteils neue Klasse von Phospholipidderivaten, die in vielen Fällen brauchbare Substanzen sind, verglichen mit den wohlbekannten Phospholipidderivaten als Rohmaterialien vorteilhafte Eigenschaften besitzt. Diese Erfindung bezieht sich genauer auf ein Verfahren zum Herstellen dies er Klasse verhältnismäßig neuer Phospholipidderivate mit zwei Phosphatidylgruppen aus bekannten Phospholipidderivaten als Rohmaterialien durch die Transphosphatidylierungsreaktion.
- Diphosphatidylglycerin (oft auch Cardiolipin genannt) ist ein bekanntes Phospholipidderivat mit zwei Phosphatidylgruppen in seiner Molekülstruktur. Es ist in Tieren, Pflanzen und Bakterien weitverbreitet und die übliche Praxis zum Erhalten dieses Phospholipidderivates ist es daher gewesen, es aus einem Naturstoff, der es enthält, wie etwa dem Herzmuskel oder Rinderhirn oder der Zelle des Corynebakterium oder Brevibacteriums zu isolieren. Dieses bekannte Extraktionsverfahren ist jedoch kein vorteilhaftes, da welches Rohmaterial auch verwendet wird, sein Gehalt an dem gewünschten Phospholipidderivat so niedrig ist, daß das Isolieren der gewünschten Substanz aus dem Extrakt sehr mühsam ist. In jedem Fall kann diese Art Extraktionsverfahren wegen der Beschränkung der Menge verfügbaren Rohmaterial s nicht als Mittel zur Massenproduktion dienen. Es gibt ein alternatives Verfahren, bei dem ein Molekül Diphosphatidylglycerin aus zwei Molekülen Phosphatidylglycerin durch Verwenden der Transphosphatidylierungsaktivität von Phospholipase D erzeugt wird (Biochim. biophys. acta 210, 350, 1970), aber die Brauchbarkeit des Verfahrens ist vom Standpunkt der Verfügbarkeit des Rohmaterials darin beschränkt, daß es keine verläßliche Phosphatidylglycerinquelle gibt.
- Auf jeden Fall gibt es, wenn es der Anlaß erfordert, kein eingeführtes Verfahren zum Synthetisieren, irgendeines Phospholipidderivates mit zwei Phosphatidylresten dieses Typs, abgesehen von Diphosphatidylglycerin selbst.
- Unsere Aufmerksamkeit ist auf einen "Enzymatic Formation of Cardiolipin from Phosphatidylglycerol by the Transphosphatidylation Mechanism catalyzed by Phospholipase D" betitelter Artikel von N.Z. Stanacev in Canadian Journal of Biochemistry, Bd. 51 (1973), Seiten 747-753, gelenkt worden, der ein Verfahren zum Synthetisieren von Cardiolipin aus zwei Molekülen Phosphatidylglycerin durch eine enzymatische Reaktion beschreibt. Selbst wenn es sonst ausführbar ist, wird dieses Stanacev-Verfahren jedoch wirksam auf die Herstellung von Cardiolipin selbst eingeschränkt, da das Verfahren nur auf die Herstellung anderer Phospholipidderivate mit zwei Phosphatidylresten angewandt werden kann, wenn man zuerst ein geeignet substituiertes Phosphatidylglycerin zur Verwendung als Ausgangsmaterial synthetisiert - eine Notwendigkeit, die das Gesamtverfahren selbstverständlich ziemlich unpraktisch macht.
- Wir haben jetzt jedoch gefunden, daß es möglich ist, ein Verfahren zum Herstellen eines Phospholipidderivats mit zwei Phosphatidylresten unter Verwenden eines leicht verfügbaren, wohlfeilen Phospholipidderivates als Ausgangsmaterial bereitzustellen - und dadurch tatsächlich außer nur Diphosphatidylglycerin selbst derartige Phospholipidderivate mit zwei Phosphatidylresten herzustellen.
- Gemäß dieser Erfindung wird ein Verfahren zum Herstellen eines Phospholipidderivats mit zwei Phosphatidylresten in seinem Molekül bereitgestellt, bei welchem ein Phospholipidderivat der allgemeinen Formel
- (in welcher R&sub1; und R&sub2;, die gleich oder verschieden sein können, jeweils eine Alkanoyl- oder eine Alkylgruppe darstellen und X einen organischen Rest darstellt, der sich aus dem Entfernen einer Hydroxylgruppe aus einer hydroxylgruppenhaltigen Verbindung herleitet) mit einem mehrwertigen Alkohol der allgemeinen Formel
- (in welcher R&sub3; eine gegebenenfalls substituierte Alkylengruppe darstellt) in Anwesenheit von Phospholipase D mit einer Transphosphatidylierungsaktivität (E.C. 3.1.4.4) unter Herstellen eines Phospholipidderivats der allgemeinen Formel
- (worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und X alle die vorgenannten Bedeutungen besitzen) umgesetzt wird.
- Die Alkanoyl- und/oder Alkylgruppe(n) R&sub1; und/oder R&sub2; enthalten vorteilhafterweise jeweils 1 bis 6 Kohlenstoffatome, und vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatome.
- Die Alkylengruppe R&sub3; enthält vorteilhafterweise 1 bis 6 und vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatome und ist gegebenenfalls mit einer Hydroxylgruppe oder mit einer Alkoxy- oder Hydroxyalkylgruppe substituiert. Die Alkoxy- oder Hydroxyalkylsubstituenten an der Alkylengruppe R&sub3; enthalten vorteilhafterweise 1 bis 6 Kohlenstoffatome und vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatome.
- Das als Ausgangsmaterial verwendete Phospholipidderivat (I) kann wünschenswerterweise ein natürliches Lezithin, ein aus dem natürlichen Lezithin fraktioniertes Phospholipidderivat oder ein synthetisches Phospholipidderivat sein. Das natürliche Lezithin ist bequemerweise Sojabohnen-Lezithin, Eigelb-Lezithin oder Rapssamen-Lezithin.
- Der mehrwertige Alkohol (II) ist vorteilhafterweise Glycerin, Erythrit, Adonit, Mannit, Sorbit, Sedoheptylol und/oder 2-Hydroxymethyl-1,3-propandiol.
- Das Phospholipidderivat der allgemeinen Formel I wird bequemerweise in Wasser suspendiert zur Reaktion gebracht und die Phospholipase D wird üblicherweise in ein Gemisch der anderen Reaktionsteilnehmer eingebracht und damit gewünschtenfalls unter Rühren inkubiert.
- Die Transphosphatidylierungsaktivität der Phospholipase D wird sehr wünschenswert durch die Anwesenheit von Calciumionen gefördert und es wird empfohlen, daß das Calciumion in einer Konzentration von 1 bis 100 mM, vorzugsweise in dem Bereich von 4 bis 30 mM vorhanden ist.
- Die molare Menge des eingesetzten mehrwertigen Alkohols (II) sollte geringer als die 50-fache molare Menge Phospholipidderivat (I) sein und wünschenswerterweise im Bereich der 2- bis 40-fachen molaren Menge des Phospholipidderivats (I) liegen.
- Die eingesetzte Phospholipase D ist vorteilhafterweise eine von Streptomyces stammende und die Reaktion wird wünschenswerterweise bei einer Temperatur im Bereich von 200 bis 60ºC und bei einem größeren pH als 4 ausgeführt wird. In den meisten Fällen wird die Reaktion bei einer Temperatur von 350 bis 50ºC und bei einem pH von 5 bis 8,4 ausgeführt.
- Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, dem Reaktionssystem eine zum Erleichtern der Dispersion des Phospholipidderivats (I) und der aktiven Phospholipase D und dadurch dem Erhöhen der Reaktionsausbeute ausreichende Menge organisches Lösungsmittel zu zusetzen und nach unserer Erfahrung ist das organische Lösungsmittel vorzugsweise oder schließt Essigsäureethylester ein, welcher in einer Menge von 1% bis 6% (Vol./Vol.) zugesetzt wird.
- Es kann hier angemerkt werden, daß nachdem die vorgenannte Enzymreaktion stattgefunden hat, das sich daraus ergebende Reaktionsgemisch ferner die Verbindung der folgenden allgemeinen Formel einschließt:
- (worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; dieselben Bedeutungen wie an anderer Stelle angegeben besitzen) in der eine Phosphatidylgruppe des Phospholipidderivats der allgemeinen Formel (I) auf den mehrwertigen Alkohol der allgemeinen Formel (II) überführt worden ist.
- Wir nehmen daher an, daß das Gesamtherstellungsverfahren dieser Erfindung zum Herstellen des gewünschten Phospholipidderivats (III) als Zweistufen-Transphosphatidylierungsreaktion anzusehen ist, bei der zuerst die Verbindung der allgemeinen Formel (IV) gebildet wird und anschließend eine zweite Transphosphatidylierung stattfindet, bei der die sich daraus ergebende Verbindung mit einer alkoholischen Hydroxylgruppe am Molekülende als Phosphatidylrestakzeptor dient.
- Es kann hier auch angemerkt werden, daß bei der bereits wohlbekannten Transphosphatidylierungsreaktion, die aus einem Phospholipidderivat desselben Tips wie die Verbindungen des Typs der allgemeinen Formel (I) und einer eine Hydroxygruppe tragenden Verbindung ausgehend ein neues Phospholipidderivat mit einer einzigen Phosphatidylgruppe erzeugt, es übliche Praxis ist, die Reaktion mittels einer großen Überschußmenge der eine Hydroxylgruppe tragenden Verbindung (mehr als die 100-fache Menge der molaren Menge Phospholipidderivat) auszuführen, um das Äquilibrium zur Bildung eines Phospholipidderivats (III) zu verschieben und die Hydrolysereaktion zu unterdrücken.
- Bei dem Verfahren dieser Erfindung zum Herstellen eines Phospholipidderivats mit zwei Phosphatidylresten durch die vorgenannte Zweistufen-Überführungsreaktion muß jedoch im Gegenteil die Verwendung jeglicher überschüssiger Menge eine Hydroxylgruppe enthaltender Verbindung oder des mehrwertigen Alkohols der allgemeinen Formel (II) eingeschränkt werden.
- Wir nehmen an, daß der Grund dafür in der Möglichkeit zu finden ist, daß außer der zweiten Phosphatidylierung auch eine weitere Gleichgewichtsreaktion wie folgt stattfinden kann:
- (worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; dieselben Bedeutungen wie an anderer Stelle angegeben besitzen), an welcher der mehrwertige Alkohol der allgemeinen Formel (II) teilnimmt, und deshalb die Erzeugung des Phospholipidderivats (III) unter Erhöhen der Menge des mehrwertigen Alkohols (II) unterdrückt wird.
- Die Natur des Phospholipidderivats (I) und des mehrwertigen Alkohols (II), die als Ausgangsmaterialien zur Herstellung des Phospholipidderivats (III) gemäß dem Herstellungsverfahren dieser Erfindung verwendet werden, muß hinsichtlich der Struktur des gewünschten Produkts ausgewählt werden und ist sonst nicht eingeschränkt. Spezifische Beispiele der zur Verwendung als derartige Ausgangsmaterialien geeignete Rohmaterialien können jedoch wie folgt angeführt werden. Die Phospholipidderivate (I) als Rohmaterial können sowohl Sojabohnen-Lezithin, Eigelb-Lezithin, Rapssaat-Lezithin, fraktioniertes Lezithin, das von einem dieser natürlichen Lezithine stammt, als auch synthetische Phospholipidderivate oder dergleichen sein, während der mehrwertige Alkohol (II) Glycerin, Erythrit, Adonit, Mannit, Sorbit, Sedoheptylol oder 2-Hydroxymethyl-1,3-propandiol usw. sein kann.
- Während die zum Herbeiführen der Transphosphatidylierungsreaktion verwendeten Phospholipasen D irgendeine aus Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen stammende sein können, haben wir gefunden, daß eine aus einem Mikroorganismus stammende und insbesondere eine aus einem Actinomyzeten stammende im allgemeinen vom Standpunkt der Aktivität und der Ökonomie am besten ist und diese kann als geeignetes Enzym zur Verwendung bei dem Herstellungsverfahren der Erfindung empfohlen werden.
- Ein typisches Verfahren zum Herbeiführen der Zweistufen-Phosphatidylierung aus dem vorgenannten Rohmaterial ist wie folgt.
- Nachdem das Phospholipidderivat (I) als Rohmaterial in Wasser suspendiert worden ist, wird der mehrwertige Alkohol (II) zugesetzt, gefolgt von der Zugabe einer Phospholipase D und Calciumionen, um sie zu aktivieren und auf diese Weise die Phospholipase D zum Ausüben einer Transphosphatidylierungsaktivität zu veranlassen, und darauf dem Ausführen der Inkubation. Die des zugesetzten mehrwertigen Alkohols (II) sollte aus den vorgenannten Gründen vorzugsweise weniger als das 50-fache der molaren Menge des Phospholipidderivats betragen und eine geeignete Menge ist üblicherweise das 2- bis 40-fache der molaren Menge. Die Phospholipidderivatkonzentration kann wie gewünscht gewählt werden, vorausgesetzt, daß die Suspension gerührt werden kann. Die Calciumionenkonzentration sollte 1 bis 100 mM betragen, und beträgt vorzugsweise 4 bis 30 mM. Die Reaktionstemperatur und der pH werden gemäß den Eigenschaften des verwendeten Enzyms bestimmt. Wo die verwendete Phospholipase D eine von Streptomyces stammende ist, liegt die bevorzugte Temperatur zwischen 20 und 60ºC (bevorzugter 35 bis 50ºC) und ein geeigneter pH liegt über 4 (bevorzugter 5 bis 8,4).
- Eine geringe Menge organisches Lösungsmittel kann dem Reaktionssystem zugesetzt werden, um die Dispersion des Phospholipidderivats und der aktiven Phospholipase D zu erleichtern und dadurch die Reaktionswirksamkeit zu erhöhen. Wirksame organische Lösungsmittels schließen Essigsäureethylester, n-Propionsäuren-propylester, 4-Heptanon, Isobutylketon, Pentan, Hexan, Benzol, Xylol und Chloroform usw. ein. Falls jedoch die Menge eines derartigen zugesetzten Lösungsmittels zu stark erhöht wird, neigt die Zweit-Stufen-Transphosphatidylierung dazu, erschwert zu werden, obschon die Erst-Stufen-Transphosphatidylierung beschleunigt wird. Während im Fall von Essigsäureethylester zum Beispiel der Zusatz von 1 bis 2% (Vol./Vol) ein gutes Ergebnis liefert, führt der Zusatz von mehr als etwa 6% (Vol./Vol.) zu einer verringerten Produktausbeute.
- Alle geeigneten Trennungs- und Reinigungsverfahren können zum Extrahieren des gewünschten Phospholipidderivats (III) aus dem Reaktionsgemisch verwendet werden, wie etwa Verfahren der Lösungsmittelextraktion, die Aceton, Ethanol oder dergleichen einsetzen, die Säulenchromatographie, die Kieselgel, Aluminiumoxidgel, Umkehrphasenträger oder dergleichen einsetzt, oder die Dünnschichtchromatographie verwendet werden.
- Phospholipidderivate mit zwei Phosphatidylresten können leicht gemäß der vorliegenden Erfindung durch Einstufen- und einfache, aber wirkungsvolle Verfahren hergestellt werden, indem als Rohmaterial Phospholipidderivate verwendet werden, die leicht und wohlfeil erhältlich sind. Obschon früher ein Verfahren zum Herstellen von Cardiolipin, das ein besonderes Phospholipidderivat mit zwei Phosphatidylresten ist, aus zwei Molekülen Phosphatidylglycerin durch eine Enzymreaktion zur Verfügung gestanden hat, ist das Rohmaterial Phosphatidylglycerin für das Verfahren nicht leicht verfügbar gewesen ist, so daß das Verfahren in der Praxis bei der Synthese von Phosphatidylglycerin zu beginnen hatte. Die vorliegende Erfindung besitzt jedoch darin einen sehr großen Nutzen, daß sie ein allgemeines und einfaches Herstellungsverfahren bereitstellt, durch welches es möglich ist, nicht nur Cardiolipin, sondern auch eine große Anzahl anderer Phospholipidderivate mit zwei Phosphatidylresten zu synthetisieren.
- Die vorliegende Erfindung wird nun mittels der folgenden Beispiele in größerer Einzelheit beschrieben.
- Ein Gemisch von 1 bis 20 mg mehrwertigem Alkohol der allgemeinen Formel (II), 20 ul 20 mM Acetatpuffer (pH 5,5), 1 ul 500 mM CaCl&sub2;-Lösung, 5 ul Essigsäureethylester, 5 ul einer 0,24 Einheiten von Actinomyzeten stammende Phospholipase D enthaltende Enzymlösung und 2 mg handelsübliches Sojabohnen-Lezithin (Unimills Inc.), das 80% (Gew./Gew.) Phosphatidylcholin enthielt, wurde 60 Minuten bei 50ºC inkubiert, während das Reaktionsgemisch geschüttelt wurde. Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, wurde die gewünschte Substanz mit Chloroform/Methanol (2/1) extrahiert und anschließend wurde der Extrakt durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie entwickelt. Ein Nachweisreagenz für Phosphor wurde auf den entwickelten Extrakt gesprüht, wodurch er der quantitativen Analyse unterzogen wurde.
- Die folgende Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse (Prozentwerte der Produkte und von unumgesetztem Phosphatidylcholin), die durch Verwenden von Glycerin, Erythrit, Sorbit beziehungsweise Mannit als mehrwertiger Alkohol (II) auf dieselbe beispielhafte Weise wie in Beispiel 1 erhalten wurden. Tabelle 1 Glycerin Sorbit Mannit Zusatz mehrwertiger Alkohol Gewicht Molverhältnis gegenüber Phosphatidylcholin Reaktionsgemisch-Extraktzusammensetzung Phospholipidderivat Phosphatidsäure unumgesetztes Phospholipidderivat andere * Erythrit
- Einer Suspension, die sowohl 2,7 g desselben Sojabohnen-Lezithins (Unimills Inc.), wie das in Beispiel 1 verwendete, als auch 240 ml Wasser enthält, wurden 60 ml Glycerin, 160 ml 50 mM CaCl&sub2;-Lösung, 265 ml 20 mM Acetatpuffer (pH 5,5) und 5 ml einer Enzymlösung zugesetzt, die 24 Einheiten von Actinomyzeten stammende Phospholipase D enthält. Anschließend wurden 10 ml Essigsäureethylester zugesetzt und das Gemisch wurde 60 Minuten bei 50ºC umgesetzt, während es geschüttelt wurde, wodurch 902 mg Cardiolipin hergestellt wurden.
- Wenn die Reaktion in sonst identischer Weise ausgeführt wurde, außer daß kein Essigsäureethylester zugesetzt wurde, betrug die Cardiolipinausbeute 695 mg.
- 1470 ul 50 mM CaCl&sub2;-Lösung, 3897 ul 20 mM Acetatpuffer (pH 5,5), 441 ul Glycerin und 73 ul einer Enzymlösung, die 0,35 Einheiten von Actinomyzeten stammende Phospholipase D enthält, wurden 1470 ul wäßrige Suspension zugesetzt, die 20 mg synthetisches Lezithin oder Dopalmitoylphosphatidylcholin (Sigma Inc.) enthielt, und wurde 2 Stunden bei 45ºC umgesetzt, während das Gemisch gerührt wurde. Das gewünschte Produkt wurde anschließend mit Chloroform-Methanol (2/1) extrahiert und der Extrakt wurde durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie getrennt. Die Flecke des gewünschten Tetrapalmitoyl-diphosphatidylglycerins wurden danach abgekratzt und die Extraktflüssigkeit wurde verdampft und getrocknet, wodurch 6 mg des gewünschten Phospholipidderivats hergestellt wurden.
Claims (22)
1. Verfahren zum Herstellen eines Phospholipidderivats mit
zwei Phosphatidylresten in seinem Molekül, bei welchem ein
Phospholipidderivat der allgemeinen Formel
(in welcher R&sub1; und R&sub2;, die gleich oder verschieden sein können,
jeweils eine Alkanoyl- oder eine Alkylgruppe darstellen und X
einen organischen Rest darstellt, der sich aus dem Entfernen
einer Hydroxylgruppe aus einer hydroxylgruppenhaltigen
Verbindung herleitet) mit einem mehrwertigen Alkohol der allgemeinen
Formel
(in welcher R&sub3; eine gegebenenfalls substituierte Alkylengruppe
darstellt) in Anwesenheit von Phospholipase D mit einer
Transphosphatidylierungsaktivität unter Herstellen eines
Phospholipidderivats der allgemeinen Formel
(worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und X alle die vorgenannten Bedeutungen
besitzen) umgesetzt wird.
2. Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, bei welchem die
Alkanoyl- oder eine Alkylgruppe(n) R&sub1; und/oder R&sub2; 1 bis 6
Kohlenstoffatome enthält.
3. Verfahren wie in Anspruch 2 beansprucht, bei welchem R&sub1;
und/oder R&sub2; 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält (enthalten).
4. Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, bei welchem die
Alkylengruppe R&sub3; 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält und
gegebenenfalls mit einer Hydroxylgruppe oder mit einer Alkoxy- oder
Hydroxyalkylgruppe substituiert ist.
5. Verfahren wie in Anspruch 4 beansprucht, bei welchem die
Alkylengruppe R&sub3; 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält.
6. Verfahren wie in Anspruch 1 beansprucht, bei welchem die
Alkoxy- oder Hydroxyalkylsubstituenten an der Alkylengruppe R&sub3;
1 bis 6 Kohlenstoffatome enthalten.
7. Verfahren wie in Anspruch 6 beansprucht, bei welchem R&sub3;
mit einer Alkoxy- oder Hydroxyalkylgruppe substituiert ist, die
1 bis 4 Kohlenstoffatome enthält.
8. Verfahren wie in einem der vorangehenden Ansprüche
beansprucht, bei welchem das Phospholipidderivat (I) ein
natürliches Lezithin, ein aus dem natürlichen Lezithin
fraktioniertes Phospholipidderivat oder ein synthetisches
Phospholipidderivat ist.
9. Verfahren wie in Anspruch 8 beansprucht, bei welchem das
natürliche Lezithin Sojabohnen-Lezithin, Eigelb-Lezithin oder
Rapssamen-Lezithin ist.
10. Verfahren wie in einem der vorangehenden Ansprüche
beansprucht, bei welchem der mehrwertige Alkohol (II) Glycerin,
Erythrit, Adonit, Mannit, Sorbit, Sedoheptylol und/oder
2-Hydroxymethyl-1,3-propandiol ist oder einschließt.
11. Verfahren wie in-einem der vorangehenden Ansprüche
beansprucht, bei welchem das Phospholipidderivat der allgemeinen
Formel I in Wasser suspendiert zur Reaktion gebracht wird.
12. Verfahren wie in einem der vorangehenden Ansprüche
beansprucht, bei welchem die Phospholipase D in ein Gemisch der
anderen Reaktionsteilnehmer eingebracht und damit
gewünschtenfalls unter Rühren inkubiert wird.
13. Verfahren wie in Anspruch 12 beansprucht, bei welchem die
Transphosphatidylierungsaktivität der Phospholipase D durch die
Anwesenheit von Calciumionen gefördert wird.
14. Verfahren wie in Anspruch 13 beansprucht, bei welchem das
Calciumion in einer Konzentration von 1 bis 100 mM vorhanden
ist.
15. Verfahren wie in Anspruch 14 beansprucht, bei welchem das
Calciumion in einer Konzentration von 4 bis 30 mM vorhanden
ist.
16. Verfahren wie in einem der vorangehenden Ansprüche
beansprucht, bei welchem die molare Menge des eingesetzten
mehrwertigen Alkohols (II) geringer als die molare Menge
Phospholipidderivat (I) ist.
17. Verfahren wie in Anspruch 16 beansprucht, bei welchem die
molare Menge des mehrwertigen Alkohols (II) das 2- bis 40-fache
der molaren Menge des Phospholipidderivats (I) beträgt.
18. Verfahren wie in einem der vorangehenden Ansprüche
beansprucht, bei welchem die eingesetzte Phospholipase D eine von
Streptomyces stammende ist und die Reaktion bei einer
Temperatur im Bereich von 20º bis 60ºC und bei einem größeren pH als 4
ausgeführt wird.
19. Verfahren wie in Anspruch 18 beansprucht, bei welchem die
Reaktion bei einer Temperatur von 350 bis 50ºC ausgeführt wird.
20. Verfahren wie in Anspruch 18 oder Anspruch 19 beansprucht,
bei welchem die Reaktion bei einem pH von 5 bis 8,4 ausgeführt
wird.
21. Verfahren wie in einem der vorangehenden Ansprüche
beansprucht, bei welchem dem Reaktionssystem eine zum Erleichtern
der Dispersion des Phospholipidderivats (I) und der aktiven
Phospholipase D und dadurch dem Erhöhen der Reaktionsausbeute
ausreichende Menge organisches Lösungsmittel zugesetzt wird.
22. Verfahren wie in Anspruch 21 beansprucht, bei welchem das
organische Lösungsmittel Essigsäureethylester ist oder
einschließt, welcher in einer Menge von 1% bis 6% (Vol./Vol.)
zugesetzt wird.
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