DE3824670A1 - Dna-segment, plasmide, die dieses segment enthalten, transformierte bakterien, sowie transformiertes pflanzenmaterial - Google Patents

Abstract

DNA-Segment, dessen Genprodukt geeignet ist, eine oriV-Sequenz in cis oder trans replikationsfähig zu machen, wobei das Genprodukt ein Fusionspeptid aus trfB und trfA ist; rekombinante Plasmide, die dieses DNA-Segment enthalten sowie transformierte Bakterien und transformiertes Pflanzenmaterial sowie Saatgut aus diesem Pflanzenmaterial.

Description

• Die Erfindung betrifft ein DNA-Segment, dessen Genprodukt geeignet ist, eine oriV Sequenz in cis oder in trans replikationsfähig zu machen, sowie Plasmide, die dieses Segment enthalten, durch diese Plasmide transformierte Bakterien sowie transformiertes Pflanzenmaterial und Saatgut aus transformiertem Pflanzenmaterial.
• Das natürlich vorkommende Plasmid RK2, das identisch oder nahezu identisch ist mit den Plasmiden RP1, RP4, R18 und R86 der Inkompatibilitätsgruppe P1 ist ein broad host range Plasmid, das Resistenzgene gegen die Antibiotika Tetracyclin, Ampicillin und Kanamycin aufweist. Die Sequenz des vegetativen Origins (oriV) und das Genprodukt des transacting factor A Gens (trfA) ist für die Replikation hinreichend (Fig. 1). Die Basensequenz des trfA Gens wurde in Christopher A. Smith und Christopher M. Thomas, J. Mol. Biol. (1984), 175, pp 251-262 aufgeklärt. Es ermöglicht die Replikation des oriV in vielen Spezies von gramnegativen Bakterien. Das Plasmid besitzt jedoch ein kompliziertes Replikationssystem. Für die routinemäßige Anwendung ist aber auch seine Größe von 56 Kilobasenpaaren (Kb) ein großer Nachteil. Es wurde versucht, diese Nachteile durch Konstruktion kleinerer Plasmide ausgehend von RK2-Plasmid zu beheben. So ist aus Ditta et al, Proc. Natl. Acad-Sci. Vol 77 (12), Seiten 7347-7351, USA 1980 eine tetracyclinresistente Plasmidkomponente des RK2 Plasmids mit der Bezeichnung pRK 290 bekannt (Fig. 2). pRK 290 kann mit Hilfe eines Hilfsplasmids übertragen werden, besitzt aber selbst nicht die Fähigkeit, sich selbst oder andere Plasmide zu übertragen. Das Plasmid ist 20 Kb groß, es ist also ein relativ großes Plasmid, das außerdem schwer isolierbar ist und außerdem nur in niedrigen Kopierzahlen vorhanden ist (5-8 Kopien pro Chromosomenäquivalent in Eschericha coli).
• Es wurde nun gefunden, daß das in den Plasmiden RK2 und pRK 290 enthaltende trfA Gen, so mit dem trfB Gen, dessen Basensequenz in Nucleic Acid Res. 14 (11), 4453 beschrieben ist, unter Deletion dazwischenliegender Sequenzen fusioniert werden kann, daß eine DNA-Sequenz gebildet wird, deren Genprodukt die Replikation des oriV ermöglicht.
• Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein DNA-Segment, dessen Genprodukt geeignet ist, eine oriV Sequenz in cis oder in trans replikationsfähig zu machen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Segment eine Sequenz ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend folgende Nukleotidsequenz
  
  und Subfragmente und Mutanten davon, die im wesentlichen die gleiche Fähigkeit zur Replikation des oriV besitzen, enthält.
• Das Genprodukt dieser Sequenz und davon abgeleiteter Sequenzen ermöglicht die Replikation von Plasmiden, die den oriV enthalten in einer Reihe von Mikroorganismen, insbesondere in gramnegativen Bakterien.
• Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen DNA-Segments, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Plasmid pRK 290 mit der Restriktionsendonuklease SpH I schneidet, das DNA-Stück zwischen 17,8 kb und 8,3 kb mit Hilfe der T4-DNA-Ligase ligiert, erneut mit der Restriktionsendonuklease SpH I schneidet, in die Schnittstelle das Plasmid pUC 18 einfügt, mit Hilfe der T4-DNA-Ligase ligiert, dieses Plasmid mit der Restriktionsendonuklease Kpn I linearisiert und mit der Exonuklease Bal 31 von beiden Enden her verkürzt, wobei das Ausmaß der Verkürzung mittels Gelelektrophorese kontrolliert wird, worauf die Enden mit T4-DNA-Ligase ligiert werden.
• Das erfindungsgemäße DNA-Segment wird ausgehend von Plasmid pRK 290 durch verschiedene DNA-modifizierende Enzyme hergestellt. Dies sind zunächst Restriktionsendonukleasen, die doppelsträngige DNA im Bereich einer definierten Erkennungssequenz aufschneiden. Dabei entstehen Fragmente, an deren Enden entweder einzelsträngige Überhänge (cohäsive Enden, sticky ends) zurückbleiben oder es werden beide Stränge am selben Basenpaar durchschnitten und es entstehen sog. stumpfe Enden oder blunt ends. Mit Hilfe einer DNA-Ligase werden diese Fragmente anschließend in der gewünschten Weise wieder zusammengesetzt (ligiert). Dabei ist es möglich, blunt end Fragmente frei zu kombinieren, während bei sticky end Fragmenten Ligation nur möglich ist, wenn eine korrekte Basenpaarung der einzelsträngigen Überhänge gegeben ist.
• Zur Deletion größerer Bereiche der Plasmid DNA wird die Exonuklease Bal 31 verwendet, die einzel- oder doppelsträngige linearisierte DNA von den Enden her kontinuierlich etwa symmetrisch abbaut und dabei blunt ends hinterläßt. Das Ausmaß der Verkürzung wird mittels Gelelektrophorese kontrolliert und die Plasmid DNA anschließend wieder mit einer DNA-Ligase ligiert. Das erfindungsgemäße DNA-Segment ist ein Fusionsgen aus transacting factor B und transacting factor A, wobei jedoch nicht die vollständigen Basensequenzen der Strukturgene erhalten bleiben. In der im Anspruch 1 exemplarisch angegebenen Sequenz würden beispielsweise im Genprodukt dieser Sequenz die ersten 25 Aminosäuren des trf-A-Proteins, durch die ersten 117 Aminosäuren eines am trfB-Gen codierten Proteins IncC oder durch die ersten 12 Aminosäuren eines anderen Peptids (P 259) ersetzt (C. M. Thomas, C. A. Smith, Nucleic Acid Res. 14 (11), 4453 (1986)). An der Fusionsstelle ist die Nucleotidsequenz GTG, die für die Aminosäure Valin codiert, entstanden. Das erfindungsgemäße DNA-Segment ist jedoch nicht auf diese Nucleotidsequenz eingeschränkt, sondern umfaßt auch Subfragmente und Mutanten davon, deren Genprodukte im wesentlichen die gleiche Fähigkeit besitzen, eine oriV Sequenz in cis oder trans replikationsfähig zu machen.
• Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein rekombinantes Plasmid, enthaltend ein DNA-Segment nach Anspruch 1.
• Aus dem auf die oben beschriebene Weise hergestellten Plasmid, das ein erfindungsgemäßes DNA-Segment enthält, können durch den Fachmann bekannte Methoden Derivate hergestellt werden, die beispielsweise andere Resistenzgene wie Kanamycin- oder Ampicillinresistenzgene oder die Bordersequenzen von Ti (Tumorinducing) oder Ri (Rootinducing) Plasmiden enthalten. Agrobakterium tumefaciens und Agrobacterium rhizogenes enthalten natürliche Plasmide, Ti-Plasmide bzw. Ri-Plasmide, die auf Grund bestimmter funktioneller Bestandteile die Fähigkeit besitzen, DNA-Segmente in Pflanzen zu übertragen. Insbesondere enthalten diese Segmente Sequenzen, die Informationen zur Synthese von Wachstumshormonen enthalten. Für die Übertragung in die Pflanzenzelle werden die flankierenden Basenpaare dieser Sequenzen benötigt, die etwa 30 Basenpaare enthalten und beiderseits nahezu identisch sind. Diese Bordersequenzen sind das eigentliche Erfordernis für die Übertragung der dazwischenliegenden DNA-Stücke in die Pflanzenzelle. Zwischen den Bordersequenzen liegende beliebige DNA-Stücke können in die Pflanzenzelle übertragen werden.
• Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Mikroorganismen, insbesondere gram-negative Bakterien, die mit einem eine der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen enthaltenden Plasmid transformiert wurden.
• Zur Transformation wird in an sich bekannter Weise ein geeigneter Bakterienstamm, beispielsweise E coli HB 101, E coli JM 103, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes Pseudomonasarten u. dgl. mit einem geeigneten Transformationspuffer behandelt, und mit Plasmid-DNA versetzt. Die Transformanten werden anschließend beispielsweise durch Plattieren selektiert.
• Methoden zur Transformation von Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, sind dem Fachmann bekannt und beispielsweise in Meth. in Enzymology Vol. 101, p. 507 ff (1983), Mol, Gen. Gen. Vol 163, 181 (1978), J. Mol. Biol. 53, 159-162 (1970), Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69, 2110-2114 (1972) beschrieben. Da transformierte Bakterien eine mehr oder weniger ausgeprägte Tendenz aufweisen zu degenerieren, müssen die Bakterien unter günstigen Lebensbedingungen gehalten werden, um ihre künstlich erzeugten Fähigkeiten zu bewahren. Der Fachmann wird diese Bedingungen in Abhängigkeit vom verwendeten Bakterienstamm leicht bestimmen können.
• Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist Pflanzenmaterial, das durch Agrobakterien, die ein erfindungsgemäßen Plasmid enthalten, transformiert wurde sowie Saatgut aus diesem Pflanzenmaterial. Die Transformation von Pflanzenmaterial mittels Agrobakterien ist beispielsweise in Chilton M. D., Drummond M. J., Merlo D. J., Sciaky D., Montoja, A. L., Gordon M. P., Nester E. W., Cell 11, (1977) pp 263-271; Chilton M. D., Tepfer D. A., Davin C., Casse-Dellart F., Tempe J., Nature 295 (1982) pp 432-434 sowie Barton K. A., Chilton M. D., Methodes in Enzym. 101 (1983) pp 527-539 beschrieben.
• Es besteht, wie bereits beschrieben, die Möglichkeit, jede zwischen den Bordersequenzen der Ti- oder Ri-Plasmide liegende Sequenz auf die Pflanze übertragen und somit ihre Eigenschaften zu beeinflussen.
Beispiele 1. Konstruktion eines Plasmids enthaltend ein erfindungsgemäßes DNA-Segment (Fig. 2). (pPS 99)
• Das Plasmid pRK 290 wurde mit der Restriktionsendonucleose Sph I (aus Steptomycees phaeochromogenes) an den Schnittstellen Sp (Fig. 2) mit der Erkennungssequenz
  
  geschnitten. Die Reaktion wird mit Plasmid-DNA in einem Inkubationspuffer aus 10 mmol/l TrisHCl, 50 mmol/l NaCl, 10 mmol/l MgCl&sub2; und 1 mmol/l Dithiothreit (pH 7,5) bei 37°C durchgeführt. Anschließend wird das große Fragment mit Hilfe der T4-DNA Ligase in 40 µl 50 mM Tris/HCL pH 7,8, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreit 1 mM Adenosintriphosphat wieder zu einem Plasmid geschlossen, das die Region zwischen 17,8 Kb und 8,3 Kb des ursprünglichen Plasmids pRK 290 aufweist (Plasmid I in Fig. 2).
• In einem weiteren Schritt wurde das 2,7 Kb große Plasmid pUC18 (beschrieben in Vieira J., Messing J., 1982, Gene 19 S. 259) in das Plasmid I an der Schnittstelle Sp eingesetzt. Dazu werden Plasmid I und pUC18 unter den oben beschriebenen Bedingungen mit Sph I linearisiert und anschließend wieder mit T4 DNA-Ligase ligiert. (Plasmid II in Fig. 2.) Das so hergestellte Plasmid enthält aus dem pUC18 Fragment eine einzige KpnI Restriktionsstelle (K) mit der Erkennungssequenz
  
  die der Startpunkt für eine anschließende Deletion mit der Exonuclease Bal 31 ist. Die Sequenzen des trfB und des trfA liegen durch die Insertion des pUC18 etwa gleich weit von dieser KpnI Restriktionsstelle entfernt.
• Plasmid II wurde also vorerst mit der Restriktionsendonuclease Kpn I (aus in einem Inkubationspuffer bestehend aus 10 mmol/l Tris HCl (pH 7,5) 10 mmol/l MgCl&sub2; und 1 mmol/l Dithiothreit linearisiert und anschließend mit der Exonuklease Bal 31 (aus Alteromonas espeijiani) von beiden Enden her verkürzt.
• Das Ausmaß der Verkürzung wurde mittels Gelelektrophorese auf 1% Agarosegel kontrolliert. Mit Hilfe der T4-DNA Ligase wurde schließlich ein 6,6 Kb großes Plasmid, das ein DNA Segment des Anspruchs 1 enthält, ligiert.
2. Transformation des E. coli HB 101
• Die Transformation des E-coli Stammes kann in an sich bekannter Weise beispielsweise in Mandel M., und Higa A. J. Mol. Biol. 53 159-162 (1970), und Cohen, S. N., Chang, A. C. Y., and Hsu, L. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69, 2110-2114 (1972) angegebenen Vorschrift erfolgen.
• Dazu werden 5 ml Lurea Broth - ein Nährmedium bestehend aus Fleischextrakt, Hefeextrakt und Salz - mit 1 ml Vorkultur von E. coli HB 101 inokuliert und bei 37°C geschüttelt, bis ein Viertel der maximalen Zelldichte (Extinktion im Photometer ca. 0,4-0,6) erreicht ist.
• Die Zellen werden durch Zentrifugieren bei 5000 rpm geerntet und in 25 ml Transformationspuffer, bestehend aus 150 mmol KCl, 50 mmol CaCl&sub2;, 5 mmol MgCl&sub2; und 1 mmol Tris HCl (pH 7,5), in Eis suspendiert. Nach erneuter Zentrifugation werden die Zellen in 2 ml Transformationspuffer resuspendiert. Von dieser Suspension werden 0,1 ml mit Plasmid DNA (pPS 99) unter Eiskühlung versetzt, nach 1 Stunde auf 42°C erwärmt und nach 90 Sekunden 1,2 ml Lurea Broth bei 37°C zugesetzt. Nach 5-15 Minuten wird auf Selektionsagar (Lurea Broth mit 1,5% Agar und geeignetem Antibiotikum plattiert). Die Transformanten sind nach 15-24 Stunden sichtbar.
• Ein auf diese Weise erhaltener transformierter E. coli HB 101 Stamm wurde am 16. Juni 1988 bei Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH unter der Nummer DSM 4673 hinterlegt.
3. Transformation von Agrobakterien
• Unter anderem wurden die Konstruktionen, die in Fig. 3 dargestellt sind, auf ihre Replikationsfähigkeit in Agrobakterien getestet.
• Es wurden 100 ml YEP (1% Hefeextrakt, 1% Pepton, 0,5% NaCl) mit 2 ml Vorkultur bei 30°C 4-6 h lang inokuliert. Die Zellen wurden 4-6 h bei 30°C gezüchtet und durch Zentrifugation bei 5000 rpm für 10 Minuten geerntet. Anschließend wurden die Zellen in 10 mM NaCl suspendiert und wiederum zentrifugiert. Dann wurde in 1 ml YEP resuspendiert.
• 0,2 ml dieser Suspension wurden mit 1 µg Plasmid-DNA versetzt und sofort bei -80°C in einem EtOH-Bad eingefroren. Nach 5 min wurden die Zellen aufgetaut und 25 Minuten bei 37°C gehalten. Danach wurde mit 0,5 ml YEP verdünnt und 1-2 h bei 30°C inkubiert.
• Danach wurden die Zellen auf Selektionsagar Nutrient broth (0,8%, 1,5% Agar) oder YEP (mit 1,5% Agar) mit dem gewünschten Antibiotikum plattiert.
• Auf diese Weise wurden Agrobakterien mit den in Fig. 3 dargestellten Plasmiden transformiert und in jedem Fall Transformanten erhalten, die den gewünschten Phaenotyp (Antibiotikumresistenz(en)) aufwiesen. Aus diesen Transformanten konnten die eingesetzten Plasmide wiedergewonnen werden, was durch Transformation von Escherichia coli mit dieser DNA und anschließender Restriktionsanalyse bewiesen werden konnten.
• Die in Fig. 3 angeführten Abkürzungen bedeuten:
• Amp^r Ampicillinresistenzgen, Tet^r Tetracyclinresistenzgen, NPT: Neomycinphosphotransferasegen, kodiert für Kanamycinresistenz, Pnos: Promotor der Nopalinsynathetase, SNPT: Strukturgen des NPT, Tnos: Terminator des Nopalinsynthethetasegens, ori (pUC) origin of Replication des Plasmids pUC18, oriV: origin of replication des Plasmids RK2, trfBA das beschriebene Fragment-essentiell für die Replikation des oriV, F: Fusionsstelle des trfA Strukturgens mit der trfB Region, recl: Stück der T-DNA des Ti-Plasmids als linkes Rekombinationsfragment. EcoRI, BgIII, PvuII, BamHI, AvaI, HindIII, KpnI: Restriktionsenzyme. Die Einheit PnosSNPTTnos kann in Pflanzen Neomycin und Kanamycin-Resistenz bewirken.

Claims (10)

1. DNA-Segment, dessen Genprodukt geeignet ist, eine oriV Sequenz in cis oder in trans replikationsfähig zu machen, dadurch gekennzeichnet, daß das Segment eine Sequenz ausgewählt aus einer Gruppe enthaltend folgende Nukleotidsequenz

und Subfragmente und Mutanten davon, die im wesentlichen die gleiche Fähigkeit zur Replikation des oriV besitzen, entfällt.

2. Verfahren zur Herstellung eines DNA-Segmentes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Plasmid pRK 290 mit der Restriktionsendonuklease SpH I, schneidet, das DNA-Stück zwischen 17,8 kb und 8,3 kb mit Hilfe der T4-DNA-Ligase ligiert, erneut mit der Restriktionsendonuklease SpH I schneidet, in die Schnittstelle das Plasmid pUC 18 einfügt, mit Hilfe der T4-DNA-Ligase ligiert, dieses Plasmid mit der Restriktionsendonuklease Kpn I linearisiert und mit der Exonuklease Bal 31 von beiden Enden her verkürzt, wobei das Ausmaß der Verkürzung mittels Gelelektrophorese kontrolliert wird, worauf die Enden mit T4-Ligase ligiert werden.

3. Rekombinantes Plasmid, enthaltend ein DNA-Segment nach Anspruch 1.

4. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Resistenzgen gegen mindestens ein Antibiotikum enthält.

5. Rekombinantes Plasmid nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß es die Bordersequenzen von Ti oder Ri-Plasmiden aufweist.

6. Transformierte Bakterien, enthaltend ein Plasmid nach einem der Ansprüche 3 bis 5.

7. Transformierte Bakterien nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Bakterien aus der Gruppe der gramnegativen Bakterien ausgewählt sind.

8. Transformierte Bakterien nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus der Gruppe der Agrobakterien ausgewählt sind.

9. Pflanzenmaterial, das durch Bakterien nach Anspruch 8 transformiert wurde.

10. Saatgut aus Pflanzenmaterial nach Anspruch 9.