JPS6028994A - 〔２１―ロイシン〕ヒトウロガストロン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、〔２１−ロイシン〕ヒトウロガストロン（以
下（２１−Ｌ　）　ｈＵＧと略記することがある。）お
よび遺伝子工学的方法による［２］−Ｌ″ｌ　ｈＵＧの
製造に関する。さらに具体的には、本発明は、化学的に
合成１〜たＣ　２１−　Ｌ　］　ｈＴＪＧ構造遺伝子、
対応プラスミド組換体および形質転換した細胞をも包含
するものである。

ヒトウロガストロン（ｈＵＧ）は１９７５年グレゴ’Ｊ
　（Ｇｒｅｇｏｒｙ）らが人尿中より発見した、胃酸分
泌抑制作用をもつ、アミノ酸５：３残基よりなるペゾチ
ドである（Ｎａｔｕｒｅ、　２５７．３２５（１９７５
））。

ｈＵＧは下記の構造を有するポリペプチドであり、分子
内に３つの・ジスルフィド結合を有する。

Ａｓｎ　−Ｓｅｒ　−Ａｓｐ　−Ｓｅｔ　−Ｇｌｕ　−
Ｃｙｓ　−Ｐｒｏ　−Ｌｅｕ　−Ｓｅｒ　−Ｈｌｓ　−
Ａｓｐ　−Ｇｌｙ　−Ｔｙｒ　−Ｃｙａ　−Ｌｅｕ　−
ｔ（ｉｓ　−Ａｓｐ　−Ｇｌｙ　−Ｖａｌ　−Ｃｙｓ　
−Ｍｅｔ　−Ｔｙｒ　−ＩＩｓ　−Ｇｌｕ　−Ａｌａ　
−Ｌｅｕ　−Ａｓｐ　−Ｌｙｓ　−Ｔｙｒ　−Ａｌａ　
−Ｃｙｓ　−Ａｓｎ　−Ｃｙｓ　−Ｖａｌ　−Ｖａｌ　
−Ｇｌｙ　−Ｔｙｒ　−１１ｅ　−Ｇａｙ　−Ｇｌｕ　
−Ａｒｇ　−Ｃｙｓ　−Ｇｌｎ　−Ｔｙｒ　−Ａｒｇ　
−Ａｓｐ　−Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ　−Ｔｒｐ　−Ｔｒｐ　
−Ｇｌｕ　−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ一方、同年コーエン（Ｃ
ｏｈｅｎ）　らは人尿中より、上皮組織の増殖角化を促
す成長因子であるヒト上皮細胞因子（ｈ　ＥＧＦ　）を
発見、単離精製した（Ｐｒｏｃ　。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７２．１
３１７（１９７５））。　ｈ　ＥＧＦの全アミノ酸構造
はなお解明されていないが、その後の研究により、その
ゲル電気泳動ノミターン、免疫交差反応などから現在で
はｈＥＧＦばｈＵＧと同一の構造を有するとされている
。

現在ではｈＵＧとｈ　ＥＧＦとは互いに共通するさまざ
まな生理作用が確認されており（Ａｎｎ、１ｌａｖ、　
Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、、　４８．１９３（１，９７９））
、またｈＵＧとは５３個のアミノ酸残基のうち３７個が
同一でかつ３個のＳ−Ｓ結合が同じ部位にあるマウス上
皮細胞成長因子（ｍＥＧＦ）との生理作用の比較によっ
て、ｈＵＱｚ勺方ＦあるいはｍＥＧＦの活性は種を越え
て見出されていることから、これらの作用は、その特有
の安定な三次元構造に由来するものと考えられている。

しかしながら、このｈＵＧ（ｈＥＧＦ）はヒト尿中から
微量しか単離することができず、したがって量産化が望
まれていることは言うまでもない。一方近年の遺伝子工
学の進歩は大腸菌等に異朴タン・ξりの産生を行なわせ
るという点で多くの成果をあげており、したがってｈＵ
Ｇの量産化を目的としてこの技術を用いることは当然考
えられるところであり、提案も既に行なわれている（特
開昭５７−１２２０９６号公報）。

ところで、遺伝子工学的手法をもってペプチドの合成を
行なう場合の最も有力な手段の一つとして、宿主由来の
他のタン、ｏりの構造遺伝子（例えば大腸菌におけるβ
−ガラクトシダーゼ、’［’　ｒ　ｐ　Ｆ：など）にＡ
ＵＧ　（メチオチンに対するコドン）を介して目的ペプ
チドをコードする遺伝子を結合させて宿主内でクローン
化し、生合成されるいわゆる融合タン・ξりを臭化シア
ンで処理して目的ペゾチｒを取り出ず方法（特開昭５６
−８４６０３号、同Ｉ−’１４５２２１号など）がある
が、この方法を用いる場合、’Ｍｅｔを含むペゾチｒの
合成はできないことＫなる。ｈＵＧＫおけるこの問題に
ついて言えば、ｈＵＧはそのアミノ酸残基のＮ端より数
えて２１番目にＭｅｔを有するので、この方法をそのま
ま用いることはできない。したがって、例えば、上記の
公報（特開昭５７−１２２０９６号）においては、ｈＵ
Ｇのトリプシン不感性を利用して目的ペプチドをＮ端の
上流にＬｙｓ−Ｌｙｓをつけた融合タン・ξりとして産
生させて、トリゾシン処理によって目的ペプチドを回収
することが開示されている。しかしながら、別の報告（
日本医師会雑誌、淵、８３３（１９８１））　によれば
、ｈＵＧはトリプシンによりＣ端から数えて５つのアミ
ノ酸が切断されて活性がなくなるということもあり、特
異的に切断できるかどうか疑関しも好便な方法とは言え
ない。

そこで本発明者はｈＵＧのＮ端から２１番目のアミノ酸
残基Ｍｅ　ｔはｈＵＧの生理活性に関与していないとの
推定をもとに、Ｍｅｔを構造類似のＬｅｕ　（ロイシン
）に替え、従来の融合タンパクからの臭化シアン処理を
可能にし、そして回収した［２１−Ｌ］ｈＵＧ′／Ｊ′
−ｈＵＧ（ｈＥＧＦ）と同等の活性を有することを確認
して本発明を完成するに到った。

ｈＵＧ（ｈＢＧＦ）の活性が３つのジスルフィド結合を
有するその三次元構造に関係していることは明らかにさ
れているけれども、具体的な活性部位およびメカニズム
が明らかＫされていない現状では、上記の工夫は当業者
にとって各易なことではないと言えよう。

発明の概要 要旨 本発明は、Ｎ端より数えて２１番目のアミノ酸残基がＭ
ｅｔでないＬｅｕからなるｈＵＧ誘２淳体、ずなわち（
２１−Ｌ　’］　ｈＵＧ、を表現する構造遺伝子が化学
合成可能であること、この遺伝子が適当プラスミドに組
込み可能であること、このプラスミド組換体による適当
宿主細胞の形質転換および形質転換体の培養による〔２
１−　Ｌ　１　ｈｔ＋Ｇの産生および回収が可能である
こと、ならびに生成（２１−Ｌ　’１　ｈＵＧカ’ｂｕ
＜；（ｈｚａＦ）と同様の活性を有すること、を確認し
てなされたものである。

従って、本発明による［２１−　Ｌ　］　ｈＵＧは、下
記のアミノ酸配列式で表わされるポリペプチドからなる
こと、を特徴とするものである。

Ａｓｎ　−Ｓｅｔ　−ＡｌｌＴｌ　−Ｓｅｒ　−Ｇｌｕ
　−Ｃｙｓ　−Ｐｒｏ　−Ｌｅｕ　−Ｓｅｔ　−１（ｉ
ｓ　−Ａｓｐ　−Ｇｌｙ　−Ｔｙｒ　−Ｃｙｓ　−Ｌｅ
ｕ　−Ｈｉｓ　−Ａｓｐ　−Ｇｌｙ　−Ｖａｌ　−Ｃｙ
ｓ　−Ｌｅｕ　−Ｔｙｒ　−１１ｅ　−Ｇｌｕ　−Ａｌ
ａ　−Ｌｅｕ　−Ａｓｐ　−Ｌｙｅ　−Ｔｙｒ　−Ａｌ
ａ　−Ｃｙｓ　−Ａｓｎ　−Ｃｙｓ　−Ｖａｌ　−Ｖａ
ｔ　−Ｇｌｙ　−Ｔｙｒ　−１１ｅ　−Ｇｌｙ　−Ｇｌ
ｕ　−Ａｒｇ　−Ｃｙｓ　−Ｇｌｎ　−’ｒｙｒ　−Ａ
ｒｇ−Ａｓｐ　−Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ　−Ｔｒｐ　−Ｔｒ
ｐ　−Ｇｌｎ　−Ｌｅａ　−Ａｒｇ（ただし、この構造
は一次構造の形式で便宜上表現したものである。） また、本発明による［：　２１　］　ｈＵＧの製造法は
、下記の工程からなること、を特徴とするものである。

（１）　ヒトウロガストロンの２１番目のアミノ酸がロ
イシンであるポリペブチＰに相当する〔２１−ロイシン
〕ヒトウロガストロンの構造遺伝子を化学的に合成する
こと。

（２）予定した宿主細胞内で増殖可能なシラスミドにこ
の遺伝子を組み込んで、この細胞内で増夕ＩＩＪ可能な
プラスミド組換体をつくること。

（３）このシラスミドによって、宿主細胞を形質転換さ
せること。

（４）得られる形質転換体を培養し、産生された〔２１
−ロイシン〕ヒトウロガストロンヲｌｏｌ収−すること
。

上記において、予定した宿主３．…脳内で増殖可能なプ
ラスミドはラクトースオペロンの発現系を利用できるも
のが代表的であり、ラクトースオペロンの発現系の由来
および形質転換法において使用する宿主細胞の代表的な
ものは、Ｅｓｃｈａｒｉｃｈｉａ属に属する大腸菌であ
る。

さらに、本発明は、［２１−Ｌ　］ｈＵＧを表現する構
造遺伝子を含む二本鎖ポリデオキシリゼヌクレオチド、
その構造遺伝子を含むプラスミド組換体およびそのシラ
スミド組換体によって形質転換さレタことを特徴とする
エシェリキア・コ’）　（ｇｓｃｈｅ−ｒｉｃｈｉａ　
ｃｏｌｉ）をも包含するものである。

効果 天然ｈＵＧ（ｈＥＧＦ）の抽出の場合に認められた抽出
および精製の際の問題は、本発明による遺伝子組換体の
抽出物を出発原料とした場合はこれを回避することがで
きる。

また、本発明による方法は、遺伝子工学的手法をもって
生合成したいわゆる融合タンノξりからの臭化シアンに
よる目的ペゾチＰの回収という最も有力な手段の一つの
方法の応用範囲を拡大できることを示唆するものに他な
らない。

本発明による［ｚｌ−ｔ、）ｂｕＧは、下記のアミノ酸
配、Ｖｌ１オｆ−云代引スゼ１】ペザ手ｐで九人Ａｓｎ
　−Ｓｅｒ　−Ａｓｐ　−Ｓｅｒ　−Ｇｌｕ　−Ｃｙｇ
　−Ｐｒｏ　−Ｌｅｕ　−Ｓｅｒ　−Ｈｉｓ　−Ａｇｐ
　−Ｇｌｙ　−Ｔｙｒ　−Ｃｙ＠　−Ｌｅｕ　−Ｈａｓ
　−Ａｓｐ　−Ｇｌｙ　−Ｖａｌ　−Ｃｙｓ　−Ｌｅｕ
　−Ｔｙｒ　−１１ｅ　−Ｇｌｕ　−Ａｌａ　−Ｌｅｕ
　−Ａｓｐ　−Ｌｙｓ　−Ｔｙｒ　−Ａｌａ　−Ｃｙｓ
　−Ａｓｎ　−Ｃｙｓ　−Ｖａｌ　−Ｖａｌ　−Ｇｌｙ
　−Ｔｙｒ　−１１ｅ　−Ｇｌｙ　−Ｇｌｕ　−Ａｒｇ
　−Ｃｙｓ　−Ｇｌｎ　−Ｔｙｒ　−Ａｒｇ　−Ａｓｐ
　−Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ　−Ｔｒｐ　−Ｔｒｐ　−Ｇｌｕ
　−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ上式中のＡｓｎ等は、いうまでも
なく、アス・ξラギン等のアミノ酸を示す、当業界で承
認されている記号である。

このポリペプチドは、Ｎ端から数えて２１番目のアミノ
酸がＭｅ　ｔではなくてＬｅ　ｕであるという点でｈＵ
Ｇと相違している。

なお、上式は本発明の（：２ｌ−Ｌｌｂｕｃを便宜上−
次構造としての表現方法を用いたものであり、厳密な意
味での本発明による［２１−Ｌ’：１ｈＵＧは上記式中
Ｎ端より数えて６番目のＣｙｓと別番目のＣｙｓ、１４
番目のＣｙｌＩと３１番目のＣｙｓおよび３３番目のＣ
ｙｓと４２番目のＣｙｓそれぞれがジスルフィＰ結合し
たものである。

ｒ２］−Ｌ′３ｈＵＧは、ｈＵＧ（ｈａＧＦ）　と同様
、同等の生理活性、たとえば潰瘍抑制作用、細胞増殖促
進作用を有するがら、それ自身でｈＵＧ様生理活性ポリ
ペゾチドとして使用することができる。

〔２］−ロイシン］ヒトウロガストロンの製造１）構造
遺伝子 （１）遺伝子の設計 ｈＵＧの構造遺伝子がどのような塩基配列のＤＮＡから
なっているかは不明である。

従って、このペゾチｒを構成するアミノ酸を指定するい
くつかのコドンのうちから、下記の条件を満たすものを
選んでＤＮＡを合成する。

（１）ｃ−ｃ塩基対に富む領域に続いてＡ−Ｔ塩基対処
富む領域が続かないようにする。

（１；）後記する各々の合成フラグメントが分子内ある
いは分子間で望まない相補性塩基配列を持たないように
する。

また、この構造遺伝子内には、形輩転換株の検索を容易
にするため、あるいは将来のペプチド変換修飾による構
造活性相関の研究のため必要な一つまたは二つ以上の制
限酵素認識塩基配列を含むように、かつ望まない制限酵
素認識塩基配列は含まないように設計することが望まし
い。［２］−ＬｌｈＵＧでは、制限酵素ＥｃｏＲＩ、Ｈ
ｉｎｆ　Ｉ、ＡＩ＋ｉ　Ｉ　ＸＲｓａ　ＩおよびＢｇｌ
　Ｉｔ　の認識塩基配列を設けることが好ましい。そし
て、コドンの選択は、宿主においてよく使われているも
のをできるだけ使用することが好ましい。

従って、本発明で使用する［２１−ＬｌｈＵＧの構造遺
伝子の好ましい具体例は、後記の実験例および遺伝子設
計図に示した塩基配列のものである（図中、この構造遺
伝子は、Ａｓｎに対応するＡＡＴからＡｒｇに対応する
ＣＧＴまでの部分であることは言うまでもない）。

この構造遺伝子を発現させる方法はたとえば特開昭５４
−９２６９６号公報に詳記されているが、この遺伝子を
発現させるために大腸閉由来のラフ）　−スオペロンを
利用する場合は、ラクトースオペロンの２遺伝子内にあ
る制限酵素ＦＡｏＲＩの認識部位にこの遺伝子を挿入し
てβ−ガラクトシダーぜと融合したタンパクの形で発現
させることが望ましい。すなわち、まず構造遺伝子の５
１−末端側には臭化シアンの攻撃部位となるＭｅ　ｔの
コドンＡＴＧを、３′−末端には一つまたは二つ以上の
停止コドンを設ける。続いて、必要ならばβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子の開始コドンで始まるフレームと同調さ
せるためにＡＴＧの５′−側に適当な任意の種類、数の
塩基配列を付加し、さらに上流側および停止コドンの下
流側には上記ＥｃｏＲＩ認識部位に挿入させるための塩
基配列（この場合後記実験例のようにいわゆるリンカ−
が介在してもよい）をそれぞれ付加する。一般には、両
粘着末端を露出さすたまま構造遺伝子を設計および合成
しているが（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　１９８．１０５６（１
９７７）など）、希望すれば両末端を鈍感末端としても
よい。

なお、ＡＴＧの５′側に設けるべき任意の塩基対は、一
般的にいえば３ｍ対、（３ｍ＋１）対または（３ｍ＋２
）対（ｍは０または１以上の整数）となる。

これらの考慮を払った、本発明で使用するのに適した（
２ｔ−ＬｌｈｕＧ用遺伝子の好ましい具体例は、後記実
験例に示したものである。

（２）合成 上記のように設計した遺伝子を合成するには、十−画鋲
のそれぞれについて、これをいくつかのフラグメントに
分けてこれらを化学的に合成し、各々のフラグメントを
結合する方法によればよい。

６鎖は、１０〜１７塩基からなり、各々が７〜１０塩基
ずつ京なるように、加〜（９）個程度のフラグメントに
分けるのが好ましい。

各フラグメントの合成法としては、ジエステル法（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ、　２０３．６１４（１，９７９））、トリ
エステル法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、リヘ１０５６（１９７７
））　、あるいは固相法（Ｎｕｅｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓ
　Ｒｅ５７ｃｈ、　８．５４９１（１９８０））、液相
法、あるいは酵素を用いる方法（Ｊ、　１（ｉｏｌ、　
Ｃｈｅｍ、、２４１゜２０１４（１９６６））がある。

合成時間、収率、精製などの点からは、固相法でトリエ
ステル法によるものが最も適当である。

合成の具体的な事項に関しては、上記文献および後記実
験例を参照されたい。

（３）精製 オリゴヌクレオチドを化学合成した場合、一般に鎖長が
長くなるにしたがって最終成積体の分離精製がしだいに
困難となってくる。特に、固相合成法においては適当に
保強されたオリゴヌクレオチドブロックを段階的に縮合
させていくため、従来技術たとえばゲル濾過、ゲル電気
泳動、イオン交換カラム、高速液体クロマトグラフィー
なとでは、精製は容易でない。

ところで、逆相カラムでは、オリゴヌクレオチドに親油
性の保護基が一つあるなしでその保持時間が太きくずれ
る。そこで、他の保護基をはずす条件下で安定な別の保
護基を持つオリサヌクレ第１ドブロックを最終の縮合段
階に用い、ついで適当な脱保護の操作を行なえば、目的
の最終産物にのみその保護基のついたオリゴヌクレオチ
ドの混合物が得られる。この保護基の親油性を利用して
逆相カラムで目的とする最終産物を他の未反応混合物か
ら分離し、ついでこの保護基をはずせば、目的とするオ
リゴヌクレオチドを得ることができる。

この方法により、合成したオリゴヌクレオチドを未反応
混合物の中から効率よく分離精製することが可能である
。

（４）　リン酸化および結合 こうして得た合成フラグメントをＤＮＡリガーゼを用い
て順次結合していくのであるが、合成フラグメントなこ
の酵素の基質とするためには、フラグメントの５′−水
酸基をリン酸化しておく必要がある。

この目的のため（てはポリヌクレオチドキナーゼを用い
るのが一般的であるが、化学的なリン酸化も可能である
（Ｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ＋ｉ％”ａｈ、
　８．５７５コ３（１９８０））。また、フラグメント
の結合にはＤＮＡリガーゼを用いるのが一般的であるが
、５′−末端のリン酸基を適当な方法（例えばイミダゾ
ール化）で活性化し、対する側の鎖を鋳型として化学的
に結合する方法も可能である（Ｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍ
、　Ｂｕｌｌ、、２６．２３９６（１９７８）　）。

２）ラクトースオペロンをもつベクターの調製本発明に
おいては、大腸菌染色体ＤＮＡ由来のラクトースオペロ
ンの全部または一部を含みかつ大腸菌内で増殖可能なさ
まざまなプラスミドを用いることが可能であり、それら
のプラスミドを調製するにあたっては、分子生物学の分
野で公知の常法に従って行なうことができる。ラクトー
スオペロンを含むＤＮＡは大腸菌染色体から直接得るこ
とも可能であるが、すでに２クトースオペロンの全部ま
たは一部を含む形質導入ファージ（例えば、ＰｌｄＩ−
、Ｆ’−１ａｃ、φ８０ｄｐｌａｃ、λｈ８０ｄｌａｃ
、λｐｌａｃなど）が種々得られているので、これらの
ファージからラクトースオペロンの必要な部分をとり出
すのが好都合である。また、大腸菌内で増殖可能なシラ
スミｒとするために、本発明においては上記のラークト
ースオ（ロンの必要な部分と大腸菌由来の別のシラスミ
ド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐｓｃｌｏｌ、λｄＶｌ　
など）とを結合させて単一のプラスミドベクターとする
必要がある。

本発明の一具体例では、ラクトースオペロンを含むＤＮ
Ａとじ℃形質導入ファージλｐｌａ、ｃ５（Ｎａｔｕｒ
ｅ、　２２４．７６８（１９６９））　を用いている。

なお、λｐｌａｃ５　ＤＮＡは、例えば、λｐｌａｃ５
　溶原菌であるところのＥ、ｃｏｌｌ　ＰＫ１５１２か
ら公知の方法（別冊蛋白質核酸酵素、核酸実験法、下、
り、１９　（１９７３））により得ることができる。こ
のλｐｌａｃ　５はラクトースオペロンのｉ遺伝子の途
中からｙ遺伝子の途中までの領域を持っており、ラクト
ースオペロン以外の大腸菌遺伝子をもっていないという
利点を有しているので本発明において好ましい。また、
大腸菌由来のシラスミｒとしてはｐＢＲ３２２を用いて
いるが、これを選んだ理由は最も入手しやすいプラスミ
ドの一つであること、全塩基配列が決定されていること
、アンピシリン抵抗性およびテトラサイクリン抵抗性の
標識遺伝子を持っていること、等の理由によるものであ
る。そして、これらの遺伝子を結合させるにあたりそれ
ぞれ（λｐｌａｃ　５およびｐＢＲ３２２）を制限酵素
Ｆ、ｃｏＲＩおよび川ｎｄ　ＩＩＩで処理して、λｐｌ
ａｃ　５については３．８　Ｍｄのフラグメントを、ｐ
ＢＲ３２２については大きい方の７ラグメントをそれぞ
れ取り出し、これらを緊ぎ合ゎせて目的とするプラスミ
ドベクターをつくる（　ｎＲＥと命名）。

ところで、目的とする（：２ｌ−ＬｌｈＵＧを発現させ
るために大腸菌染色体由来のラクトースオペロンを選ん
だのは、ラクトースオペロン中の２遺伝子内にある制限
酵素Ｅｃｏ　Ｒ１の認識部位に外来遺伝子を挿入してβ
−ガラクトシダーゼと融合したタンパクの形で発現させ
ることができるということ（Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｘ１９８
、Ｈ１５６（１，９７７））、タンパク質を多量に産生
させ得ること、適当な宿主菌を用いれば誘導産生を行な
わせることができるということ、融きタンパクとして安
定Ｋまたほぼ純粋に回収することが容易であること、等
の理由によるものである。

したがって、本発明においては調製したベクターがただ
１か所だけ制限酵素ＥｃｏＲＩの認識部位を有している
ことが望ましく、その目的に合わせるために上記のよう
にλｐｌａｃ　５およびｐＢＲ３２２ゎをそれぞれＥｃ
ｏＲＩおよびＨｉｎｄ　ＩＩＩとで切断したＤＮＡ断片
を用い、それぞれを緊げている。

３）プラスミド組換体 （１）造成 上記のように外来遺伝子が発現するようにしくまれた４
クターの適当な位置に前述の［２］−Ｌ］ｈＵＧ構造遺
伝子を含む遺伝子を組込む。組込操作そのものは、分子
生物学の分野で公知の常法に従って行なうことができる
。具体的な方法については、後記の実験例を参照された
い。

本発明の一具体例では、ベクタープラスミ１″としてｐ
ＲＥ　１を使用しており、そのＥｃｏＲＩ認識部位に［
２１−Ｌ］ｈＵＧ構造遺伝子を含む遺伝子を組み込んで
シラスミド組換体としている。本発明ではこのプラスミ
ド組換体をｐＬＥと命名した。

（２）　リンカ− このシラスミド組換体を造成するにあたってば［１：２
１−Ｌ］ｈＵＧ構造遺伝子をよむ遺伝子の両端をＦＡｏ
ＲＩ認識部位を含む粘着末端としてもよいが、将来のＥ
ｃｏ　ＲＩ認識部位以外の認識部位への挿入すなわち別
の融合タンパクとして目的ペゾチドを産生させる目的、
あるいは別のシラスミドへの組換、その他の目的のため
Ｋは、鈍感末端としておくことも有利なことであり、そ
の−具体例が本発明におり“る後記実験例である。した
がってこの場合は、構造遺伝子を含む遺伝子とｐＲＥ　
１との緊ぎ手となる二本鎖ＤＮＡが必要である。すなわ
ち、この二本鎖ＤＮＡはＥｃｏＲＩおよびＳｍａ　Ｉの
二つの制限酵素の認識部位を有し、かつ最終的にβ−ガ
ラクトシダーゼの開始コドンで始まるフレームと［２１
−Ｌ’）ｈＵＧ構造遺伝子の読み取りフレームとが一致
するように設計すればよい。しかしながら、この緊ぎ手
となる部分は最終的に上記の機能を有すればよいのであ
り、例えば上記の構造遺伝子を合成した方法を用いて合
成して得ることが可能である。本発明の一具体例では、
このような合成法の一例として以下に述べる工夫を施し
てこの緊ぎ手を得た。

まず、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｍａ　Ｉの認識部位
を有する下記の一本鎖ＤＮＡを設計する。

”ＡＡＴ１’ＣＣＣＧＧＧ３′ この一本領ＤＮＡはそれ自体の相補性のために、多（の
ニック（ＤＮＡの二本鎖の一方に生じたすき間のない切
断点）を有する長鎖の二本鎖ＤＮＡ構造をとる。したが
って、ＤＮＡリガーゼにより、すき間のない二本鎖ＤＮ
Ａとすることができるのである。そしてこのようにして
得られた二本鎖ＤＮＡは、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳ
ｍａ　Ｉの認識部位を交互に有する二本鎖ポリＤＮＡで
ある。

（３）　方向性の判定 プラスミドに組込まれた［２１−　Ｌ　’］　ｈ　ＵＧ
遺伝子の方向性の判定は、構造遺伝子内に含まれる特定
の部位を認識する酵素（ＨｇｌＵ）でその部位を切断し
、構造遺伝子外の特定の位置に別の酵素で切断を入れ、
得られた断片のサイズを分析することにより行なうこと
ができる。

４）形質転換 （１）宿主菌 前記のような［２１−Ｌ］ｈＵＧ構造遺伝子を組込んだ
シラスミド組換体ｐＬＥ、たとえはｐＬＥ　６５２７、
を用いて形質転換させる宿主細胞の一具体例は、工シエ
リキア・コリに属する大腸菌株ＸＡ３５である。

大腸菌株ＸＡ３５は、公知株であるところの大腸菌に１
２株（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ
ｓ、　４４％　ＩＨ６（１９８０））の誘導体であり、
下記に示す性質を有し、他の性質についてはＫ１２株の
それと異なるところのない菌株である。

しＳｍｒ、　Ｌａｃ’　（１３−、ｚ）　〕本発明によ
る［２］−Ｉ、］ｈＵＧ構造遺伝子を組込んだプラスミ
ドによる形質転換は、あらゆる大腸菌株において可能で
ある。しかしながら、［２ｌ−Ｌ）ｈＵＧをβ−ガラク
トシダーゼとの融合タンノぐりとして回収するためには
正常なβ−ガラクトシダーぜの混在をふせぐために宿主
菌としてβ−ガラクトシダーゼの遺伝子を欠失している
株を用いるのが好ましい。また、一般的には、ラクトー
スオペロンのリプレッサー遺伝子（ｌ遺伝子）によって
タン・ξりの産生が制御されているのであるが、野生型
の大腸菌を用いる場合にはインデューサー（例えばＩＰ
ＴＧ）によって融合タン・ぞりを誘導産生させることが
でき、ｌ遺伝子の高温感受性株を用いる場合には温度を
上昇させることにより融合タンパクを誘導させることが
でき、ｌ遺伝子の欠損株を用いる場合には常に融合タン
・ξりを産生させることができる（Ｔｈｅ　ｏｐｅｒｏ
ｎ、　３１（１９８０））。

本発明による一具体例では、β−ガラクトシダーゼの遺
伝子を欠失しかつ１遺伝子の欠損株であるところの大腸
菌株ＸＡ３５を用いた。

（２）形質転換 形質転換操作そのものは、分子生物学の分野で公知の常
法に従って行なうことができる。具体的な方法について
は、後記の実験例を参照されたい。

（３）形質転換体 形質転換体の一具体例は、大腸菌株ＸＡ　３５をｐＬＥ
６５２７によって形質転換させて得た形質転換体であっ
て、本発明ではこれを大腸菌ＸＡ３５（ｐＬＥ　６５２
７　）と命名している。

この形質転換体大腸菌ＸＡ　３５　（ｐＬＦ；　６５２
７　）は後記に述べる実験例によって明らかなように前
記大腸菌株ＸＡ　３５とは下記の性質において異なる菌
株である。

［：　Ａｍ’、Ｌａｃ＋］ ５）　［２１−Ｌ’）ｈＵＧの産生 このように形質転換した菌を常法に従って培養すれば、
［２ｌ−Ｌ）ｈＵＧが産生される。具体的な方法につい
ては、後記の実験例を参照されたい。

添付の遺伝子設計図に示すように設計した遺伝子は鎖長
１０〜１７の長さのフラグメントに分け、それぞれＥＳ
Ｉ〜５、ＦＪ１〜Ｅ２１　とした。

設計の手順は、下記の通りである。

（１）コドンの選定 図面に示した通りにコドンを選ぶ。

（２）Ｎ末端にメチオニンのコドンＡＴＧを付加シ、合
成されたポリペプチドがこの場所で化学的処理（＋ＣＮ
Ｂｒ）により切断されるようにする。

（３）Ｃ末端には、余計なペゾチドが産生されないよう
に１個の転写終了コドン（ＴＡＧまたはＴＧＡ）を付加
する。

（４）　２１番目のアミノ酸（メチオニン）をロイシン
に変える。というのは、メチオニンが存在するとＣＮＢ
　ｒ処理で切断され、完全な形で［：２１−Ｌ’ｌｈ［
ＴＧが得られないからである。

（５）　ベゾチドの変換修飾のため適当な場所に制限酵
素認識部位ＥｃｏＲＩｓ　Ｆ（ｊｎｆＩ、　ＡｌｕＩ、
　ＲｓａＩおよびＢｇｌＵを１ケ所ずつ有するような塩
基配列とした。

（６）　この遺伝子のコドンは、大腸菌でよく使われる
ものをできるだけ使用した。

フラグメントの化学合成 １）合成 フラグメントの合成は文献記載の方法に従って固相法に
よって行なった。しかし、合成フラグメントの単離精製
は以下に示す改良法で行なった。

各フラグメントの合成収率は、２［）〜６Ｕ　％であっ
た。

ＥＳＩ　ＡＡＡＧＣＴＴＣＣＣ（１０）ＥＳ２　ＧＧＧ
ＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＧＴＡＡ　（１７）ＥＳ３　ＧＡ
ＴＡＣＣＣＴＴＴＴＴＡＣＧＴＧ　（１７）ＥＳ４　Ａ
ＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＣＡＡＴＧ　（１７）ＥＳ５　
ＴＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＴＧＴＣ（１５）Ｅ−４ＡＡＴ
ＴＣＣＧＡＣＡＧＣＧＡＧＴＧ　（１７）Ｅ−２ＴＣＡ
ＡＣＧＧＡＣＡＣＴＣＧＣＴＧ　（１７）Ｅ−３ＴＣＣ
ＧＴＴＧＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧ　（１７）Ｅ−４ＡＣＡ
ＧＴＡＧＣＣＧＴＣＧＴＧＡＣ（１７）Ｅ−５ＧＣＴＡ
ＣＴＧＴＣＴＧＣＡＣＧ　（１５）Ｅ−６ＡＣＧＣＣＡ
ＴＣＧＴＧＣＡＧ　（１４）Ｅ−７ＡＴＧＧＣＧＴＴＴ
ＧＣＣＴＧＴ　（１５）Ｅ−８ＴＣＡＡＴＡＴＡＣＡＧ
ＧＣＡＡ　（１５）Ｅ−９ＡＴＡＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴ
ＧＧＡＣ（１７）Ｅ−１０ＣＧＴＡＴＴＴＧＴＣＣＡＧ
ＡＧＣＴ　（１７）Ｅ−１１ＡＡＡＴＡＣＧＣＴＴＧＴ
ＡＡＣ（１５）Ｅ−１２ＡＡＣＡＡＣＡＣＡＧＴＴＡＣ
ＡＡＧ　（１７）Ｅ−１３ＴＧＴＧＴＴＧＴＴＧＧＣＴ
ＡＣＡＴ　（１７）Ｅ　−１４Ｔ　Ｔ　ＣへＣＣＧＡＴ
ＧＴＡＧＣＣ（１５）Ｅ−１５ＣＧＧＴＧＡＡＣＧＣＴ
ＧＣＣ（１４）Ｅ−１６ＴＣＴＧＴＡＣＴＧＧＣＡＧＣ
Ｇ　（１５）Ｅ−１７ＡＧＴＡＣＡＧＡＧＡＴＣＴＧＡ
ＡＡ　（１７）ｖニー１ｓ　ＴＣＣＣＡＣＣＡＴＴＴＣ
ＡＣ，ＡＴＣ（１７）Ｅ−１９ＴＧＧＴＧＧＧＡＡＣＴ
ＧＣＧＴ　（１５）Ｅ−２０ＧＧＧＴＣＧＡＣＴＡＡＣ
ＧＣＡＧＴ　（１７）Ｅ−２】　ＴＡＧＴＣＧＡＣＣＣ
（ｔｏ）２）精製 合成終了後の樹脂２０ｍｇに対し、０．５Ｍαピコリン
アルドキシムテトラメチルグアニ・ジン、およびジオキ
サン：水（１：１）混合物２００μｍ　を加え、室温−
夜装置し、ついで濃アンモニア水２ｍｌを加え、密栓し
て一夜５５℃で放置する。これを濾過して樹脂を分離し
、ｐ液を濃縮しゲル濾過を行なう。５０　ｍＭ　ＴＥＡ
Ｂ緩衝液ｐＨ７，５で溶出し、ゼイドゼリュームに溶出
してくるものを集める。これを濃縮し、逆相カラムＣ−
１８（ウォータース［ラジアル、８ツクＡ］径８ｅｍＸ
１０ｃｍ）のＨＰＬＣにアプライし、０．ＯＩＭ　エチ
レンジアミン・ジアセテートｐＨ７，８の緩衝液中、ア
セトニトリルの１０チから３２チまでの濃度勾配を２　
ｍｌ／ｍｉｎ　の流速で１６分かけて溶出させる。１１
〜１２分で溶出されるものを集める。このとき、トリチ
ル基のないオリゴヌクレオチドはインジェクションビー
クとして溶出される。溶出液を濃縮し、８０係酢酸１ｍ
ｌ　を加え、室温で１５分間放置する。トリタノールを
抽出除去し、水層を濃縮し、再び逆相カラムにかける。

先と同じ条件下にアセトニトリルの０チから２０チまで
の濃度勾配で溶出を行ない、１２〜１３分で溶出される
もの（すなわちフラグメント）を集める。次にこの７ラ
ダメント１０　ｐｍｏｌ　（０，００１Ａ２６ｏ）を加
ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、１０　ｍＭ　Ｍ
ｇＣ１２，１０ｍＭ　ＤＴＴ　１０　、５　ｒｒＭ　Ａ
ＴＰの混合物に溶解し、〔γ５２ｐ″ＩＡＴＰＩ（ｌμ
ｃｌ　（３，３ｐｍｏｌ　）およびＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼ１μｍ（４，５単位）を加え、全量をα〕μ
ｌとし、３７℃で加分加温した後、１００℃で２分加熱
して反応を止める。

以上のようにして精製された各７ラグメントは、２０％
ゲル′亀気泳動及び２次元ホモクロマトグラフィー塩基
配列決定法（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄａ　Ｒｅａ、　、　１
　、３３１（１９７４）、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ａｇ、、　６　、２０６９（１９７９）　）により確認
した。

フラグメントの結合反応 合板したフラグメントは、下記のように４つのブロック
に分けて結合反応を行なった。

ブロック　フラグメント Ａ　Ｅａ−１、Ｅ＋ｓ−２、Ｅｓ−３、Ｅｓ−４、Ｅｓ
−５、Ｅ−ＩＢ　Ｋ−２、Ｅ−３、Ｅ−４、Ｔ’、−５
、ＦＪ−６、Ｅ−７、Ｗ−Ｆ２ＯＥ−９、Ｅ−ＩＱＩＥ
−１１、Ｆ’、−１λＥ−１λＥ−１爪Ｅ−１５Ｄ　Ｆ
Ｊ−１６％ｖ−ｘ′７１ｇ−１ａ、　Ｅ−１９，Ｅ４１
．　Ｅ−２］ブロツクＡの場合は、Ｅｓ−１、Ｅｓ−２
、Ｂｓ−３、Ｅｓ−４、Ｅｓ−５およびＥ−１各１００
　ｐｍｏｌ　（０，０１１２６０）を２０ｍＭ　）リス
塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、１０　ｍＭ　ＭｇＣ１２，
１０ｍＭ　ＤＴＴ　、　０．５　ｍＭＡＴＰの混合液に
溶解し全量を刃μｌとしＴ４−ポリヌクレオチｒキナー
ゼ（８単位）を加えて３７℃で１時間反応を行なった後
、リン酸化を行ない、次いでＴ４−ＤＮＡリガーゼ（９
００単位）を加え１４℃で一夜（結合）反応を行なって
ブロックＡの２量体を得た。

ブロックＤについてもブロックＡと同様の方法で合成を
行ない１．同様に２量体を得た。ブロックＢ１Ｃについ
ては、同様の方法でそれぞれ単量体を得た。

次いでブロックＡの２量体およびブロックＢの反応液を
混合し、０．５　ｍＭ　ＡＴＰを１／１ｏ容、Ｔ４−Ｄ
ＮＡリガーゼ（９００単位）を加え、１４℃で一夜反応
を行った。反応終了後３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５
）を１７１Ｏ容加え、３倍容のエタノールを加え、−７
０℃で１５分間冷却した後、１２０００　ｒｐｍで遠心
を行ない沈澱を得た。この沈澱について１゜チポリアク
リルアミド電気泳動を行ないフラグメント［Ａ＋Ｂ］の
２量体を分離し、フラグメント［：Ａ＋Ｂ　］の２量体
に相当するバンドを切り出した後さらに１．５チ低融点
アガロースゲルを用いてフラグメント［Ａ＋Ｂ　］を回
収した。ブロックＣおよびブロックＤについても同様の
操作を行ないフラグメン）［Ｃ−１−Ｄ’ｌの２量体を
回収した。以上のようにして得られたフラグメント［Ａ
＋Ｂ］およびフラグメン）［Ｃ＋Ｄ］を１：１の割合で
混合し上記と同様の方法で両フラグメントの結合反応を
行なった。この反応混合液についてエタノール沈澱を行
ない高度に重合した遺伝子ＤＮＡを得た。沈澱物を１０
ｍＭ）！Ｊス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）、７　ｍＭ　Ｍ
ｇＣｌ２および２０　ｍＭ　ＫＣＩの混合液に溶解し、
ＳｍａＩ（５単位）で３７℃、１時間反応を行ない、さ
らＫこの反応混合液に１７１０容の１００ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０）、７０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．６
００　ｍＲＩＩ　ＮａＣ１の混合液を加え、■ｎｃｌｌ
（５０単位）で３７℃、１時間処理を行なう。これＫよ
り目的の長さの遺伝子の両端がＳｍａ　Ｉ　、Ｊ（ｉｎ
ｃ　Ｉｆからなる鎖長１９８の遺伝子が得られる。これ
について８〜ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない
上記と同様の方法で回収した。

ｐＲＥｌの調製 λｐｌａｃ　５　ＤＮＡ　（％Ｍ（５７−１６７３４参
照）１０μｇを１００ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７，５
，７ｍＭ　ＭｇＣｌ２および５０　ｍＭ　ＮａＣ１の混
合物（全ｉ２０μ、ｌ）　に加え、制限酵素ＥｃｏＲＩ
　１０羊位および制限酵素用ｎｄｌｌｌ　ｌ（１単位を
用いて３７℃で２時間反応させた。ついで１係アガロー
スゲル電気泳動で３．８メガダルトンのＤＮＡ断片を精
製した。

ｐＢＲ３２２ＤＮＡ　１量ｇを上記と同様の混合物（全
量１０μｌ）に加え、制限酵素ＥｃｏＲＩ　１単位およ
び制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌｌ単位を用いて３７℃で２時
間反応させた。ついで１チアガロースゲル電気泳動で２
．６メガダルトンのＤＮＡ断片を精製した。

得られたそれぞれの断片を５０ｍＭ　）　ＩＪス塩酸緩
衝液ｐＨ７，８，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．２０　ｍＭ　
ＤＴＴ　％　および１ｍＭＡＴＰの混合物（全量１０μ
ｌ）に加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼよ）単位を用いて１４
℃、ｕ時間反応させた。

この反応混合液を用いて大腸菌株ＸＡ３５の形質転換を
行なった。形質転換はクシュナーの方法（Ｇｅｎｅｔｉ
ｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　１９７８．１７（１９
７８））にしたがい、実験はＰ−１物理的封じ込め設備
内で行なった（組み換えＤＮＡ実験指針）。

形質転換株を、Ａｐ（２０μｇ／ｆｎｌ　）を含有する
Ｌ−プレート（１チパクトトリプトン、０．５％バクト
イ−スト抽出物、０．５％ＮａＣ１，１，５％バクトア
ガー）上で選択し、得られた形質転換株をＥＭＢ　−１
ａｃのプレート（２，２，’５％ｄクトＥＭＢブロース
、１．５チパクトアガー）にレプリカし、ＩＡｃ＋（赤
色のコロニー）となった株をさらに選択した。これらの
株のうち任意に５株を選びシラスミドを調製し、数種の
制限酵素で解析したところ、４株のプラスミドがλｐｌ
ａｃ　５　ＤＮＡ　の３．８メガダルトン断片とｐＢＲ
３２２ＤＮＡのＥｃｏ　ＲＩ　−Ｈｉｎｄ　ＩＩ断片が
結合しているものであることが確かめられた。これらの
うち１株を大腸菌ＸＡ３５（ＰＲＥＩ）と命名した。

即ち、この形質転換体大腸菌ＸＡ　３５　（ｐＲＥ　１
　）は前述の大腸菌株ＸＡ３５とは下記の性質において
異る菌株である。

［Ａｍｒ、Ｌａｃ＋］ ｐＨ８２３の調製 ｐＲＥｌ（３０μｇ）を１００ｍ１）リス塩酸緩衝液（
ｐＨ７，５）、７　ｎＭ　ＭｇＣｌ２．５０　ｍＭ　Ｎ
ａＣ１の混合溶液中で制限酵素ｇｃｏＲＩ（４単位）を
用い３７℃、１時間反応を行った後、さらに／々クチリ
アルアルカラインホスファターゼ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ
　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓ−ｐｈａｔａｓｅ）　５
単位を用い３７℃で加分反応を行なう。

反応終了後、等量のフェノール（これはｌ（１ｍＭ　）
リス塩酸、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）の混合
溶液で飽和させたもの）で２回抽出を行ない、さらにエ
タノール沈澱を行なう。このとき得られた沈澱を加ｍＭ
　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）、１０　ｍＭ　Ｍｇ
Ｃ１２，５ｍＭ　ＤＴＴ　、　０．５　ｍＭ　ＡＴＰの
混合溶液に溶解し、２等量のＥｃｏ　ＲＩ　−Ｓｍａ　
Ｉリンカ−（ＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧ）を加え、Ｔ４−Ｄ
ＮＡ　リガーぜ（３００単位）を用いて１４℃で一夜反
応を行なう。この反応混液を用いて大腸菌ＸＡ−３５の
形質転換をクシュナーの方法（Ｇｅｎｅｎｔｉｃ　Ｔｈ
ｇｉｎｅｒｒｉｎｇ１９７８．１７（１９７８））　に
従って行ない、アンピシリン（２０μｇ／ｍｌ）を含有
す７）Ｌ−プレート上で形質転換株を選択した。ここで
得られた形質転換株をＥＭＢ−１ａｃのプレートにレプ
リカし、Ｌａｃ＋、Ａｍｐ＋の株をさらに選択した。

これらの株からシラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素Ｓ
ｍａ　Ｉおよび＆ｏ　ＲＩで切断されるプラスミドＤＮ
Ａを得た。

ｐＬＥ６５２７の調製およびクローニングｐＲ８２３（
６，８１１ｇ）　１０　ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ
８，０）、７　ｒｎＭ　ＭｇＣｌ２．２０　ｍＭ　ＫＣ
Ｉの混合液中で制御ｌｌ８Ｉ酵素Ｓｍａ　ｒ　（５０単
位）を３７℃で１時間作用させた。

その後さらにバクチリアルアルカラインホスファターゼ
（５単位）を加え４２℃で（９）分反応を行なう。反応
終了後、フェノール（上記）で抽出を行ない、さらにエ
タノール沈澱を行なった。沈澱を２０ｍＭ　）リス塩酸
緩衝液（ｐＨ７，５）、］ＯｍＭＭｇＣ１２，５ｎＭ　
ＤＴＴ　、　０．５　ｍＭ　ＡＴＰ混合液に溶解し、こ
の溶液に（２］−Ｌ）ｈＵＧフラグメント（６ｐｍｏｌ
）を加えた後、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（１８００単位）
を用いて１４℃で一夜反応を行なった。この反応混合液
を用いて上記と同様に大腸菌ＸＡ　３５の形質転換（上
記のクシュナー法）を行ない、次いで形質転換株（アン
ぎシリン耐性のもの）を選択した。

この株からシラスミドＤＮＡを調製し制限酵素Ｂｇｌ　
Ｉｆにより切断される株を選択した（プラスミド中にＥ
ＧＦの構造遺伝子が入っていればこの制限酵素認識部位
を有するので目的とするプラスミドを選択する場合の指
標となる）。次に組み込んだ遺伝子の方向性を確認する
為、出ｎｄ　ｍ　−ｐｓｔＩ処理を行ない正しい方向性
をもつと思われる株を選択した。

次いでこの株からプラスミＰＤＮＡを調製し、制限酵素
用ｎｄ　ｍ　−Ｈｌｎｃ　Ｉｆ消化により１４１塩基対
のフラグメントを生じていることを確認した。このフラ
グメント（Ｈｉｎｄ川−Ｈ４ｎｃ　ＩＩにより生じた１
４１塩基対のもの）をファージＭ−１３ｍｐ　８のＨｉ
ｎｄ　ｍ　−Ｈｌｎｅ　Ｉｔ部位にクローニングし、ｄ
ｉｄｅｏｘｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｍｅｔｈｏｄ　’
　（Ｓａｎｇｅｒ法；　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７４．５４６３（１９７７）
）により配列を調べ正しい方向に入っていることを再確
認した。

菌の培養 （２１−Ｌ′３ｈＵＧ　遺伝子を挿入したプラスミド組
換体ｐＬＥ　６５２７を含む大腸菌ＸＡ　３５　（ｐＬ
Ｅ６５２７　）を０．４係グリセロール、加μｇ／　ｍ
　ｌアンピシリンを添加した１６リツトルのルリア（１
，、ｕｒｔａ）培地（１チパクトートリゾトン、０．５
％バクトーイーストエクストラクト、０．５％ＮａＣ１
）　中で３７℃４．５時間通気下に培養し、対数期後期
あるいは定常期初期（Ａ４ｏｏ＝　１．４　）　まで生
育させる。その後遠心により菌体を集め１７０　ｍｌの
１０　ｍＭ　）　！Ｊス塩酸緩衝液（ｐＨ８）　／　１
０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２　／　５　ｍＭ　β−メルカプト
エタノールで２回洗浄する。以上の操作により、最終的
に湿重量３２．６ｇの菌体が得られた。

［：２１−　Ｉ、１　ｈ　ＵＧの部分精製３２．６ｇの
菌体を１４０　ｍｌの１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ
８）　／　１　ｍＭ　ＭｇＣｌ２　／　１　ｍＭ　ＰＭ
ＳＦ　（フェニルメチルスルホニルフルオライド）１５
ｍＭβ−メルカプトエタノールに懸濁し、インソネータ
ー２００　Ｍ　（久保田）を用い水冷下に超音波処理を
行なうことにより菌体を破砕した。得られた溶菌液を２
７０００　ｇで（資）分遠心し、ベレットを集め、１２
０ｍ１の１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＴ（８）　／１
０ｍＭＭｇＣ１２／　１　ｒｎＭ　ＰＭＳＦ　／　５　
ｍＭ　β−メルカプトエタノールで２回洗浄する。ペレ
ットを１５０　ｍｌ　の８Ｍグアニジンを含む５０ｍＭ
）リス塩酸緩衝液／１ｒｒＭ　ＥＤＴＡ／　５　ｍＭ　
β−メルカプトエタノール中、４℃で一夜撹拌すること
により）汀濁液、水に対して透析する。６５０００　ｇ
　、　３０分の遠心により透析によって生じた啄レット
を集め、１１００ｒｎの７Ｍ尿素を含む２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８）／１＋ｙＭ　ＭｇＣｌ２　／　５
　ｍＭβ−メルカプトエタノールに懸濁し、再び２７０
００　ｇで関分遠心を行ない上清を得る。β−ガラクト
イダーゼと［：２１−Ｌ］ｈＵＧの融合蛋白質はこの上
清部分に含まれていることがＳＤＳゲル電気泳動で確認
され、蛋白質定量の結果２．６６ｇの蛋白が存在すると
見積もられた。

〔２１−Ｌ〕ｂｔ＋Ｇ融合蛋白質を含む上清（１ｇ蛋白
相当量）を２０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８）／１　
ｍＭ　ＭｇＣｌ２　／　５　ｍＭβ−メルカゾトエタノ
ール１５０　ｍＭ　ＮａＣ１で平衡化したＤＢＡＥ−セ
ルロースカラムに添加し、６０ｍ１　の上記緩衝液で洗
浄し非吸着蛋白質を溶出させた後、食塩濃度を５０ｍＭ
から３００　ｍＭ　に直線的に上昇（各々５００　ｍｌ
　の緩衝液を用いた直線的濃度勾配）させることにより
（２１−Ｌ）ｈＵＧ融合蛋白質を溶出させた。融合蛋白
質を含む両分を集め、透析を行ない尿素を除くことによ
り融合蛋白を不溶化し、遠心により（６５０００ｇ　、
　３０分）集めた。得られた１４３　ｒｉｇ　の部努精
製融合蛋白質を７０　ｍ　ｌの７０％ギ酸に溶解後１．
８ｇの臭化シアンを加え、室温で加時間振とうしながら
反応させた。反応液をエバポレーターを用いて濃縮後５
０ｍ１　の蒸留水を加え凍結乾燥な行なって、ギ酸、未
反応の臭化シアンおよび副生成物のシアン化メチル、臭
化水素などを完全に除去した。臭化シアン処理により得
られた残渣を水で抽出後透析を行ない最終的に１４．１
　ｍｇのペプチドを得た。

［２ｌ−Ｌ）ｈｕＧの同定および生物検定角膜細胞、ヒ
ト繊維芽細胞、ヒト類表皮癌細胞、マウス３Ｔ３細胞、
ヒト絨毛細胞ではじめ多くの細胞膜表面にはマウスＥＧ
Ｆ（ｍＥＧＦ）およびｈＥＧＦ／ｈＵＧと特異的に結合
するりセゾターが存在することが明らかにされている。

ＥＧＦは膜表面上のりセゾターと結合した後、エンドサ
イト−シスにより細胞内にリセプターとの複合体の形で
取り込まれ、上皮細胞、繊維芽細胞の増殖、分化の促進
、マウスの眼瞼開裂・切歯出現の促進、胃酸分泌抑制、
ＤＮＡ・蛋白合成促進、カリウムイオン・デオキクグル
コースなどのイオン輸送、低分子物質輸送の促進などの
種々の生理作用を示すことが報告されている。（ＡｒＩ
ｎ、効ｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　４８％１９３（１９７
９））　これらの知見に基づいて［２１−Ｌ’１ｈＵＧ
の同定および生物検定を行なった。

（１）　ラジオリセプターアツセイ（ＲＲＡ）［２］−
Ｉ、）ｈＵＧのＲＲＡはヒト鼻咽腔上皮癌細胞由来のＫ
Ｂ細胞（ＡＴＣＣＮｏ　、ＣＣＬ１７）を用い、Ａ、キ
ング（Ｋｉｎｇ）もの方法（Ｊ、Ｂ、Ｃ，、２５７，３
０５３（１９８２））を参考にして行なった。すなわち
、８００ｍ１　のフラスコを用いＤＭＥ培地中で単層培
養する。培地を除き０．０５％のＥＤＴＡを含むリン酸
平衡化塩溶液（ＰＢＳ）を用いて細胞をはがし細胞懸濁
液をつくる。その後２０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　（ｐＨ７
，４）を含むＨａｎｋｓ平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で２
回細胞を洗浄する。細胞をＢｉｎｄｉｎｇ　５ｏｌｕｔ
ｉｏｎ　（ＤＭＥ培地・２１ＪｍＭ　Ｈｅａｅｓ　（ｐ
Ｈ７，４）　・０．３５　ｇ／ｌ　ＮａＨＣＯ３・１０
０μｇ／　ｍｌ　ストレフ０トマイシン）Ｋ懸濁後、細
胞数を計算し加万〜４０万／　０．２　ｍｌ　Ｂｉｎｄ
ｉｎｇ　５ｏｌｕｔｉｏｎとなる様調製し、チューブに
０．２　ｍｌずつ分注する。

種々の濃度の［２ｌ−Ｌ）ｈＵＧおよび　Ｉ　−ｍＥＧ
Ｆ（マウスＥＧＦ）を含む試料液０．２ｍｌをチューブ
に加え３７℃で１時間インキュベートする。細胞を氷冷
したＨＢＳＳで３回洗浄後１０チのＴＣＡに懸濁し、グ
ラスフィルターを用いて細胞を固定する。

アセトンでＴＣＡを除いた後、液体シソチレーションカ
ウンターを用いて計数する。

比較のため、ｍＥＧＦ　（東洋紡）およびβ−ガラクト
シダーぜを臭化シアン処理して得られたベプチｒ画分に
ついても同様な実験を行なった。第２図にその結果を示
す。図から明らかなように（２１−Ｌ″］ｈＵＧを含む
ペプチド画分は　Ｉ　−ｍＥＧＦとＫＢ細胞ＥＧＦリセ
ゾターとの結合を拮抗的に阻害し、その用量−反応曲線
はｍＥＧＦのそれとよく一致している。

マウス３Ｔ３細胞を用いたＲＲＡについてもＣ０す（−
ジ（３ａｖａｇｅ）らの方法（Ａｎａｌ　、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、。

υ１．１９５（１９８１））に基づいて行ない、ＫＢ細
胞を用いたＲＲＡを同様の結果を得た。

（２）マウス３Ｔ３細胞を用いた増殖促進活性を指標と
した生物検定 細胞増殖促進活性の測定は以下の操作によって行なった
。すなわち、マウス３Ｔ３細胞を２５　ｃｍ２フラスコ
に単層培養後０．０２％ＥＤＴＡ・０．０５　％トリゾ
シンを含むカルシウム、マグネシウムフリー−ＨＢＳＳ
（ＣＭＦ−ＨＢＳＳ）で処理し細胞浮遊液を作る。

細胞をＣＭＦ−ＨＢＳＳで洗浄した後、０．５チ牛脂仔
血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥ培地に懸濁し生細胞数を測
定する。細胞浮遊液を２Ｘ１０’細胞数／ｍｌとなる様
０．５％ＦＢＳ−ＤＭＥ培地で希釈後１ｍｌ　の＆ｎｌ
胞浮遊液を直径３５ｍｍのディシュにまき一夜炭酸ガス
インキュベークー中でインキュベートする。

種々の濃度の［２１−Ｌ　’］　ｈ　ＵＧを含むペプチ
ド画分あるいは標品のｍＥＧＦを０．５％ＦＢＳ−ＤＭ
Ｅ培地に溶かし、ミリポアフィルタ−（ｔｙｐｅ　ＧＶ
、　ｗｐｏ　２５００）を用いて沖過し、１ｍｌずつ上
記細胞浮遊液中に加える。炭酸ガスインキュベーター中
（５１Ｃｏ２−９５係空気、３７℃）で４日間インキュ
ベートした後、トリノ七ンブルーで生細胞を染色し血球
計算板を用いて生４１１胞数を計数する。得られた結果
を第３図に示′す一０図から明らかな様に、その用量−
反応曲線はｍＥＧ　Ｆのそれとよく一致している。なお
対照として行なったβ−ガラクトシダーゼの臭化シアン
ペプチド画分は増殖促進活性を全く示さなかつた。

（３）チミジンの取り込みを指標とした生物検定チミジ
ンの取り込みはＡｈｎｒｏｎ　Ａｈａｒｏｎｏｖらの方
法（Ｊ、Ｂ、Ｃ，、２５３，３９７０（１９７８））、
Ｊｉｍｅｎｅｚ　ｄｅ　Ａｓｕａらの方法（ＰＮＡＳ、
路、２７２４（１９７５’））などを改変して行なった
。すなわち、０．５　ｍｌ　の５％ＦＢＳ−ＤＭＥ培地
をいれたあマルチウェルディシュに６Ｘ１０３個のマウ
ス３Ｔ３細胞をまき５日間培養し、コンフルーエンドモ
ルツアー細胞を作成する。培地を捨てｐＢｓで洗浄後０
．５ｍｌの０．５　％ＦＢＳ−ＤＭＥ培地を加え一夜イ
ンキュ（−トする。種々の濃度の（２］−ＬｌｈＵＧあ
るいはｒｎＥＧＦを含む０．５ｍｌの０．５チＦＢＳ−
Ｄ！ｌ／ＩＥ培地を加え１８時間インキュベートする。

２００　ｎｃｉの〔５Ｈ〕−チミジンをカロえ、二）５
℃でＩ分インキュ４−トした後、細胞をａ）ｍＭＨｅｐ
ｅｓ　（ｐＨ７，４）を含む冷ＨＢＳＳで２回洗浄し、
５％ＴＣＡで更に２回洗浄する。２００μｍのＩＮＮａ
ＧＨを加え、５５℃で（資）分インキュベートするこジ
ンの放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定
する。

得られた結果を次表に示す。

無添加　４，６３９．５ ｍＥＧＦ　１０％ｇ／ｒｒ１１　１４，０９４．６　９
，４５５．１５％ｇ／ｎ１１　１４，６９５．２　１０
，０５５．７２％ｇ／ｍ１　１３，３８７，４　８，７
４７．９１％ｇ／ｉｎ１　１４，５１０．５　９，８７
１．０１．４６μｇ／ｍｔ　１１，７６１．７　７，１
２２．２０．７３μｇ／ｒｒ＋１　１７，１７０．８　
１２，５３１．３この表から明らかなように、［２ｌ−
Ｌ）ｈＵＧペプチＰ画分はチミジンの取り込みを著しく
促進した。

（４）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用い
た［２１−ＬｌｈＵＧの精製および同定（：２］−Ｌ）
ｈＵＧを含むペプチド画分および（ｚｌ−Ｌ）ｈＵＧ遺
伝子の挿入のないベクターシラスミＰのみを含む大腸菌
ＸＡ　３５　（ｐＲＥｌ）　から同様な処理により得ら
れたペプチド画分をマイクロｉンダノぞツクＣ−１８カ
ラム（Ｑ　、４　Ｘ　３０　ｃｍ　Ｎウォーターズ）を
用いたＨＰＬＧにより分析した。クロマトグラフィーは
５０’Ｃで０．１　％　）リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中
でアセトニトリル濃度を２０％から５０％に毎分０．７
５％、２　ｍ１７分の流速で上昇させることにより行な
った。

得られた溶出曲線は第４図に示す。図から明らかなよう
に大腸菌ＸＡ　３５　（ｐＲＥｌ　）から得られたベプ
チＰ画分には存在せず、［２１−Ｌ″］ｈＵＧを含むペ
プチド画分のみに認められる２本のピーク（保持時間１
８．４分、１９．３分）が検出された。この両分を分取
し、ＲＲＡおよび３Ｔ３細胞増殖促進活性を指標として
生物検定を行なったところ、両方の両分に活性が認めら
れた。この２本のピークはその保持時間の差から完全な
構造を持つ［２］−ＬｌｈＵＧおよびＣ末端のＡｒｇ、
　Ｌｅｕ　の欠損したｅ２Ｊ−Ｌ″］ｈＵＧ、−、。

あるいは末端の５つのアミノ酸の欠けた〔２Ｊ−Ｌ〕ｈ
ＵＧ１．−４８ではないかと推定される（Ａｎａｌ　、
Ｂｉｏｅｈｅｍ、　。

思、１９５（１９８１）、Ｊ、Ｂ、Ｃ９川、７６０９（
１９７２））。

また、以上のことがら逆相ＨＰＬＣを用いることにより
、［２１−Ｌ］ｈＵＧの精製が可能であることが示され
たことになる。

幽門結紮潰瘍に対する（２１−　Ｌ　）　ｈ　ＵＧの効
果ＥＧＦの抗ガス）　ＩＪン胃酸分泌抑制作用（Ｃｕｔ
。

■、８８７（１，９７５））に基づき（２１−Ｌ　’］
　ｈ　ＵＧの潰瘍に対する効果を検討した。

７週令のウィスター系雄性ラット（体重２３０ｇ前後）
を予備飼育し、Ｍ門結紮前３４時間絶食した後、１７時
間幽門結紮し絶食糖水することにより潰瘍を生じさせる
。幽門結紮処置の加分前に［２ｌ−Ｌ）ｈＵＧを含むペ
ゾチド画分（５００μｇ蛋白相当量）及び対照として生
理食塩水を皮下注射により投与した。１群５匹で実験を
行ない、抗潰瘍作用の評価は潰瘍係数を算出して行なっ
た。すなわち、幽門結紮によって生じた潰瘍性のエロ・
クオンの長径と短径を解剖顕微鏡下で測定し、各々乗じ
たものの総和を１匹のラットあたりの係数とする。

得られた結果を次表に示す。

〔２１−Ｌ″：１ｈＵＧ　４４．５±１ｓ７）表から明
らかなように、［：２］−Ｌ’：１ｈＵＧ画分は潰瘍を
抑制する傾向が認められた。

以上の結果から［：２１．−Ｌ″１ｈＵＧの活性が確認
された訳であるが、同時に本発明によって回収された〔
２１−ｔ、１ｈｕＧが天然のｈＵＧあるいはｍＥＧＦと
同様の位置に三つのジスルフィド結合を有することも実
質的に確認されたことになる。というのは、三つのジス
ルフィド結合は生理活性に必須のものであり、すなわち
文献（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　４８
．１９３−２１６（１９７９）およびＪ、Ｈｉｏｌ、　
Ｃｈｅｍ、、　２４７．５９２８（１９７２））からも
明らかなように、ｍｇＧＦにおいてジスルフィド結合を
還元すると活性が全く消失し、ひき続き再酸化するとそ
の酸化の程度に応じて活性が回復することが知られてい
るからである。

第５図は、［２］、−Ｌ″］ｈＵＧのアミノ酸配列およ
びその構造遺伝子を含む遺伝子の塩基配列をブロックＡ
、Ｂ、ＣおよびＤに分けて示すものである。

ａ　：　Ｈｉｎｄ　ｍ部位、ｂ　：　ＴａｇＩ部位、ｃ
　：　ＥｃｏＲＩ部位、ｄ　：　’Ｉ（ｉｎｆ　１部位
、ｅ　：　Ａｌｕ　ｍ部位、ｆ　：　Ｒｓａ　ｍ部位、
ｇ　：　Ｂｇｌ　Ｉｆｍ部位ｈ　：　Ｈｉｎｃ　１１部
位Ｆ；、　ｃｏｌ　ｉ　Ｋ１２Ｃ６００ｎ間ＢＰ−１１
５昭和５６羊６月９日Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２Ｃ６（１０
（ｐＢＲ３２２）　ＦＥＲＭ　ＢＰ−２３５昭和隔年６
月９日Ｅ、ｃｏｌｔ　ＸＡ３５　ＦＥ博ＨＰ−１１６昭
和５７年１月７日Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ　ＸＡ３５（ｐＲＥ
ｌ）　ＦＥＢｈＡ　ＢＰ−１１７昭和５７年１月７日Ｅ
、ｃｏｌｉＸＡ３５（ｐＸＥ６５２７）　）”ＥＲＭＰ
−７１３３昭和団年７月２日Ｅ、ａｏｌｉ　ＰＫ１５１
２　ＡＴＣＣ３９（１４４１９８２年２月８日

【図面の簡単な説明】

第１図は、［：２１−Ｌ′３］ｈＵＧ構造遺伝子を含む
グラスミ１組換体の構簗を示す図である。 第２図は、ＲＲＡの結果を示す図である。 第３図は、細胞増殖活性を示す図である。 第４図は、［：２１−Ｌ］ｈＵＧ画分の逆相ＨＰＬＣの
溶出曲線を示す図である。 第５図は、遺伝子設計図である。 出願人代理人　猪　股　清 迅　１　図 ＥｃｏＲＩ　ＳｍａＩ　ＥｃｏＲＩ ５２　図 手続補正書 昭和５９年８月、０日 特許庁長官　志賀　学　殿 １　事件の表示 昭和５８年　特許願　第１２３５２０号２　発明の名称 ［２１−ロイシン］ヒトウロガストロン、対応遺伝子、
対応プラスミド組換体、 形質転換したｌ胞およびその製造法 ３　補正をする者 事件との関係　特πＦ出願人 湧　水　製　薬　株　式　会　社 ４　代　理　人 東京都千代田区丸の内三丁目２番３号 電話東京（２１１）２３２１大代表 ８を補正の内容 １）明細書を、下記の通りに補正する。 （１）第Ｕ頁第２行 「緊けている。」を、「繋げている。」と補正。 （２）第四頁最終行 「転写終了コドン」ヲ、「翻訳終了コドン」と補正。 （３）第４２頁下から第６行 「懸濁液、」ヲ「懸濁後、」と補正。 （４）第５１頁第４行と第５行との間に、下記を加入す
る。 「さらに具体的に示せば、第４図で得られた（２１−Ｌ
）ｈＵＧを再度逆相ＨＰＬＣにかけて分取しく単一ピー
ク）、６Ｎ塩酸で加水分解し、アミノ酸分析を行なって
アミノ酸組成を確認した（次表）。なお被分析試料は醒
気泳動でも単一バンドを与えた。 簀過ギ酸酸化全行なってシスチンを７ステイン酸として
定ｆ！（６Ｎ塩酸で加水分解）静　（２１−Ｌ）ｈＵＧ
を３チチオグリコール酸、５．８Ｎ塩酸で加水分解 また、Ｃ末端部のアミノ酸配列をカルボキシペゾチダー
ゼＷ（生化学工業製）により分析したところ（次表） さらに、気相プロテインシークエンサー（アプライドバ
イオシステムズ４７０Ａプロテインシークエンサー）に
よりＮ端部の配列は下記の通りであることが確認された
。 なお２．４および９位はセリンに相当、また６、１４お
よび加位はシスティンに相当するので検出不能であった
と考えられる。 したがって、以上の結果より（２１−Ｌ）ｈＵＧ１句 は画定され、確かに本物質が産生されたことを確認した
。１ （５）第５３貞下から第２行 ［ＦＥＲＭ　Ｐ−１７１３３Ｊを、［ＦＥＲＭ　ＢＰ−
５１４Ｊと補正。 ２）第１図金、添付のものの通りに補正する。 受託番号変更届 昭和５９年８月ｌＯ日 特許庁長官　志賀　学　殿 １　事件の表示 昭和５８年　特許前　第１２３５２０号２　発明の名称 ［２１−ロイシン］ヒトウロガストロン、対応遺伝子、
対応プラスミド組換体、 形質転換した細胞およびその製造法 ３　手続をした者 事ｆ１どの関係　特許出願人 湧　水　製　薬　株　式　会　社 ４　代　理　人 工業技術院微生物工業技術研究所 ６１１」受託番号 微■研菌寄第７１３３号 ７　新寄託（店開の名称 旧寄託機関の名称と同じ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記のアミノ酸配列式で表わされるポリペプチドか
   らなることを特徴とする、〔２１−ロイシン〕ヒトウロ
   ガストロン Ａｓｎ”−８ｅｒ−Ａｓｐ−８ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ　
   −Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−８ａｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ　
   −Ｔｙｒ　７　Ｃｙｓ　−Ｌｅｕ　−Ｈｌ　ｓ　−Ａｓ
   ｐ　−Ｇｌｙ　−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−１
   １ｅ−Ｇｌｕ−Ａｌｔ−Ｌｅｕ−Ａｇｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙ
   ｒ−Ａｌａ　−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ　−Ｖ
   ａｌ−Ｇｌｙ　−Ｔｙｒ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａ
   ｒｇ−Ｃｙｓ　−Ｇｌｎ　−Ｔｙｒ　−Ａｒｇ　−Ａｓ
   ｐ　−Ｌｅｕ　−Ｌ：ｙｓ　−Ｔｒｐ　−Ｔｒｐ　−Ｇ
   ｌｕ　−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ２、下記の工程からなること
   を特徴とする、〔２１−ロイシン〕ヒトウロガストロン
   の製造法。 （１）　ヒトウ四ガストロンの２１番目のアミノ酸がロ
   イシンであるポリペプチドに相当する［２１−ロイシン
   〕ヒトウロガストロンの構造遺伝子を化学的に合成する
   こと。 （２）予定した宿主細胞内で増殖可能なプラスミドにこ
   の遺伝子を組み込んで、この細胞内で増殖可能なプラス
   ミド組換体をつくること。 （３）このプラスミドによって、宿主細胞を形質転換さ
   せること。 （４）得られる形質転換体を培養し、産生された〔２１
   −ロイシン〕ヒトウロガストロンヲ回収すること。 ３、予定した宿主細胞内で増殖可能なシラスミドがラク
   トースオペロンの発現系を利用できるものである、特許
   請求の範囲第２項記載の製造法。 ４、ラクトースオペロンの発現系が大腸菌由来のもので
   ある、特許請求の範囲第３項記載の製造法。 ５、宿主細胞がＢｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する大腸
   菌である、特許請求の範囲第２〜４項記載の製造法。 ６．１’：２］−ロイシン］ヒトウロガストロンヲ表現
   する構造遺伝子を含む二本鎖ポリデオキシリホヌクレオ
   チド。 ７構造遺伝子が下記の塩基配列である、特許請求の範囲
   第６項記載の二本鎖？リデオキシリゼヌクレオテド。 Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　ＣｙｓＡＡ
   Ｔ　−ＴＣＣ−ＧＡＣ−ＡＧＣ−ＧＡＧ　−ＴＧＴ　−
   Ｔ１’Ａ　−Ａ（’、Ｇ　−ＣＴＧ　−ＴＣＧ　−ＣＴ
   Ｃ−ＡＣＡ　−Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ａｓ
   ｐ　ＧｌｙＣＣＧ　−ＴＴＧ　−ＡＧＴ　−ＣＡＣ−Ｇ
   ＡＣ−ＧＧＣ−ＧＧＣ−ＡＡＣ−ＴＣＡ　−ＧＴＧ　−
   ＣＴＧ　−ＣＣＧ　−Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ
   　Ａｓｐ　ＧｌｙＴＡＣ−ＴＧＴ　−ＣＴＧ　−ＣＡＣ
   −ＣＡＴ　−（Ｅｒに−ＡＴＧ　−ＡＣＡ　−ＧＡＣ−
   Ｇ将−ＣＴＡ　−ＣＣＧ　−Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　
   Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　ＧｌｕＧＴＴ　−ＴＧＣ−ＣＴＧ　−
   ＴＡＴ　−ＡＴＴ　−ＧＡＡ　−ＣＡＡ　−ＡＣＧ　−
   ＧＡＣ−ＡＴＡ　−ＴＡＡ　−ＣＴＴ　−Ａｌａ　Ｌｅ
   ｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　ＡｌａＧＣＴ　−ＣＴＧ
   　−ＧＡＣ−ＡＡＡ　−ＴＡＣ−ＧＣＴ　−ＣＧＡ　−
   ＧＡＣ−ＣＴ”Ｇ　−ＴＴＴ　−Ａ’ｌ’Ｇ　−ＣＧＡ
   　−Ｃｙｓ　Ａａｎ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ
   ＴＧＴ　−ＡＡＣ−ＴＧＴ　−ＧＴＴ　−ＧＴＴ　−Ｇ
   ＧＣ−ＡＣＡ　−ＴＴＧ　−ＡＣＡ　−ＣＡＡ　−ＣＡ
   Ａ　−ＣＣＧ　−Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｇａｙ　Ｇｌｕ　Ａ
   ｒｇ　ＣｙｓＴＡＣ−ＡＴＣ−ＧＧＴ−ＧＡＡ−ＣＧＣ
   −Ｔ（ンＣ−ＡＴＧ　−ＴＡＧ　−ＣＣＡ　−ＣＴＴ　
   −ＧＣＧ　−ＡＣＧ　−ＧｌｎＴｙｒＡｒｇＡｓｐＬｅ
   ｕＬｙｓＣＡＧ　−ＴＡＣ−ＡＧＡ　−ＧＡＴ　−’Ｃ
   ＴＧ　−ＡＡＡ　−ＧＴＣ−ＡＴＧ　−ＴＣＴ　−ＣＴ
   Ａ　−ＧＡＣ−ＴＴＴ　−Ｔｒｐ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｌ
   ｅｕ　ＡｒｇＴＧＧ　−ＴＧＧ　−ＧＡＡ　−ＣＴＧ　
   −ＣＧＴＡＣＣ−ＡＣＣ−ＣＴＴ　−ＧＡＣ−ＧＣＡ８
   構造遺伝子の５′末端にメチオニンを指定するコドンお
   よび３′末端に読取停止を指定するコドンを一つまたは
   二つ以上含む、特許請求の範囲第６項または第７項記載
   の二本鎖ポリデオキシリゼヌクレオチド。 ９、シ２１−ロイシン〕ヒトウロガストロンヲ表現する
   構造遺伝子を含むプラスミド組換体。 １０、ヒトウロガストロンの２１番目のアミノ酸がロイ
   シンであるポリペプチドに相当する化学的に合成された
   〔２１−ロイシン〕ヒトウロガストロンの構造遺伝子を
   組み込んだ、予定した宿主細胞内で増殖可能な、プラス
   ミド組換体によって形質転換されたことを特徴とするエ
   シェリキア・コリー（Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
   ｉ′）　ａ