DE3785617T2

DE3785617T2 - Immunassay-prozess.

Info

Publication number: DE3785617T2
Application number: DE8787109719T
Authority: DE
Inventors: Nobuo Hiratsuka
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1986-07-11
Filing date: 1987-07-06
Publication date: 1993-09-23
Anticipated expiration: 2007-07-07
Also published as: DE3785617D1; EP0254117B1; JPS6319559A; EP0254117A3; US4868131A; EP0254117A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Immunassayverfahren zur Analyse von Blut und anderen Zusammensetzungen, die lebenden Körpern zur klinischen Untersuchung entnommen werden und insbesondere ein vereinfachtes Verfahren zu einem Immunassay, bei dem ein trockenes analytisches Element (integrales mehrschichtiges analytisches Element) verwendet wird, um immunologisch die Veränderung bei einer Krankheit oder dem Grad einer Krankheit zu diagnostizieren oder die Art der Krankheit zu identifizieren. Die Substanz, die in den Blutproben oder anderen Zusammensetzungen, die lebenden Körpern entnommen werden, enthalten sind, und die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens analysiert werden, werden als "Analyt" in der Beschreibung und den beigefügten Patentansprüchen bezeichnet.
Auf dem Fachgebiet ist eine Vielzahl von Immunassayelementen und Immunassayverfahren bekannt, bei welchen die sogenannten Antigen-Antikörper-Reaktionen verwendet werden. Die bekannten Untersuchungselemente umfassen trockene analytische Elemente, wie ein mit einem Reagens imprägniertes Filterpapier, ein integrales mehrschichtiges analytisches Element (nachstehend als mehrschichtiges analytisches Element in einigen Teilen dieser Beschreibung beschrieben) mit einer Reagensschicht und einer porösen Ausbreitungsschicht. Doch sind die Genauigkeiten und Empfindlichkeiten dieser bekannten Immunassayelemente vom Trockentyp unzureichend für praktische Anwendungen, obwohl sie durch einfache Arbeitsschritte verwendet werden können.
Ein Beispiel für das bekannte Immunassayverfahren, bei dem ein trockenes analytisches Element verwendet wird, ist ein Verfahren, bei dem ein in der offengelegten japanischen Patentpublikation Nr. 501144/1983 (WO 83/00391) beschriebener Objektträger verwendet wird. Der Objektträger enthält eine Glasfaserfilterschicht, die als eine poröse Schicht dient. Ein Antikörper gegen das Analyten-Antigen ist auf der Glasfaserfilterschicht immobilisiert. Wenn ein Blutserum, das das Analyten-Antigen enthält, auf den Objektträger getropft wird, wird das Analyten-Antigen an den immobilisierten Antikörper gebunden. Eine wäßrige Flüssigkeit, die ein mit einem Fluoreszenzmarker markiertes Antigen enthält, wird dann auf die Schicht getropft, so daß das markierte Antigen an den verbleibenden immobilisierten Antikörper, der nicht an das Analyten-Antigen gebunden wurde, gebunden ist. Die Reaktionszone der Schicht wird mit einer Spülflüssigkeit gespült, um überschüssiges markiertes Antigen radial auswärts abzuspülen, um das freie markierte Antigen von der Reaktionszone zu entfernen (die B/F-Abtrennung wird durch diesen Spülschritt durchgeführt). Das von dem Marker in den gebundenen markierten Antigen-Antikörper, der durch die Glasfasern in der Reaktionszone immobilisiert wird, emittierte Fluoreszenzlicht wird gemessen, um die optische Dichte davon herauszufinden. Die so gefundenen Daten werden mit einer Calibrationskurve verglichen, um die Menge des in dem Blutserum enthaltenen Analyten-Antigen zu bestimmen. Dieses Verfahren ist in "NIPPON RINSHO KENSA JIDOKA GAKKAISHT" ("Journal of the Japanese Society of Automation of Clinical Examination") 10(1), Seiten 57 bis 60 (1985) und in "Clinical Chemistry", 28(9), Seiten 1894 bis 1898 (1985) beschrieben und wird für praktische Zwecke angewendet. Dieses bekannte Verfahren besitzt einen Nachteil, nämlich, daß eine Spülflüssigkeit sehr genau in die Mitte der Reaktionszone auf dem Objektträger aufgebracht werden inuß, um die B/F-Abtrennung zu bewirken.
Eine Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung des Immunassayverfahrens zur quantitativen Analyse eines Analyten mit hoher Empfindlichkeit und hoher Genauigkeit durch Kombination einer einfachen Handhabung einer Lösung mit der Verwendung eines integralen mehrschichtigen analytischen Elements.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Immunassayverfahrens zur quantitativen Analyse eines Analyten, ohne die Notwendigkeit einer Spezialoperation zur B/F-Abtrennung, bei dem eine kompetitive Immunreaktion zwischen einem markierten Immunreaktanten und einem nichtmarkierten Immunreaktanten in einer wäßrigen Lösung stattfindet und anschließend eine quantitative Bestimmung unter Verwendung eines trockenen integralen mehrschichtigen analytischen Elements folgt.
Erfindungsgemäß wird ein Immunassayverfahren zur quantitativen Analyse eines Analyten-Antigens in einer wäßrigen flüssigen Probe, in der eine unbekannte Menge eines Analyten-Antigens mit einem Antikörper in Konkurrenz mit einer bekannten Menge eines markierten Antigens, das mit einem Marker markiert ist, reagieren gelassen wird und die Menge des Markers in dem markierten Antigen, die nicht an den Antikörper gebunden wurde, quantitativ bestimmt wird, bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
(a) in einer Stufe das Analyten-Antigen und das markierte Antigen zu einer wäßrigen Lösung, die wasserunlösliche Mikroteilchen enthält, auf der der Antikörper in immobilisiertem Zustand zurückgehalten wird, so daß eine kompetitive Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen dem immobilisierten Antikörper und dem Analyten-Antigen und dem markierten Antigen stattfindet, zusetzt,
(b) in einer Stufe die Reaktionslösung nach Beendigung der
kompetitiven Antigen-Antikörper-Reaktion auf ein integrales mehrschichtiges analytisches Element auftropft, welches
(i) eine obere poröse Schicht,
(ii) eine mittlere Detektionsschicht, die ein hydrophiles polymeres Bindemittel, das Wasser absorbiert und dadurch aufgequollen wird, enthält, und
(iii) einen unteren wasserundurchlässigen und transparenten Träger, bei dem die poröse Schicht den markierten Antikörper, der an den durch die Mikroteilchen immobilisierten Antikörper gebunden ist, einfängt und das freie markierte Antigen, das an den Antikörper nicht gebunden ist, da durchpassieren läßt, so daß es in die Detektionsschicht wandern kann, umfaßt, und
(c) in einer Stufe die optische Dichte der Detektionsschicht bestimmt, wobei die optische Dichte im Verhältnis zur Menge des Markers, der das markierte Antigen, das in die Detektionsschicht wandert, markiert, steht.
Die colorimetrische Bestimmung in der Stufe (c) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann beispielsweise nach dem folgenden Verfahren durchgeführt werden. Ein vorbestimmtes Volumen der Lösung, die das freie markierte Antigen enthält, wird auf das mehrschichtige analytische Element getropft, anschließend bei im wesentlichen konstanter Temperatur für eine bestimmte vorgegebene Zeitspanne inkubiert und dann wird die optische Dichte der Farbe, Fluoreszenz, Turbidität oder Absorption innerhalb des ultravioletten Bereichs in dem analytischen Element mittels Messung des reflektierten Lichts oder mittels Messung des transmittierten Lichts von der Seite des transparenten Trägers oder von der Seite der porösen Schicht bestimmt. Durch Vergleichen des so erhaltenen Werts mit den Daten auf einer zuvor aufgestellten Calibrationskurve wird die Menge des freien markierten Antigens in der aufgetropften Lösung bestimmt. Die Menge des Analyten-Antigens in der wäßrigen flüssigen Probe kann indirekt von der so bestimmten Menge des freien bestimmten Antigens in der aufgetropften Lösung bestimmt werden. Alternativ kann die Menge des Analyten-Antigens direkt unter Verwendung einer Calibrationskurve bestimmt werden.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt dieser Erfindung wird ein Immunassayverfahren zur quantitativen Analyse eines Analyten-Antigens in einer wäßrigen flüssigen Probe bereitgestellt, bei dem eine unbekannte Menge eines Analyten-Antigens mit einem Antikörper in Konkurrenz mit einer bekannten Menge eines markierten Antigens, das mit einem Marker markiert ist, reagieren gelassen wird, und die Menge des Markers in dem markierten Antigen, das nicht an den Antikörper gebunden wurde, quantitativ bestimmt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
(a) in einer Stufe das Analyten-Antigen und das markierte Antigen zu einer wäßrigen Lösung, die wasserunlösliche Mikroteilchen enthält, an denen der Antikörper in immobilisiertem Zustand zurückgehalten wird, so daß die kompetitive Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen dem immobilisierten Antikörper und dem Analyten-Antigen und dem markierten Antigen stattfindet, zusetzt;
(b) in einer Stufe die Reaktionslösung nach Beendigung der kompetitiven Antigen-Antikörper-Reaktion auf einem integralen mehrschichtigen analytischen Element zutropft, welches
(i) eine obere poröse Schicht,
(ii) eine mittlere Farbreagensschicht, enthaltend ein hydrophiles polymeres Bindemittel und ein Färbereagens, das mit dem markierenden Marker unter Induktion einer optisch detektierbaren Veränderung reagiert, und
(iii) einen unteren wasserundurchlässigen und transparenten Träger, bei dem die poröse Schicht das markierte Antigen, das an den Antikörper, der durch die Mikroteilchen immobilisiert ist, gebunden ist, einfängt und das freie markierte Antigen, das an den Antikörper nicht gebunden - ist, da durchpassieren läßt, um in die Farbreagensschicht unter Entwicklung einer Farbe zu wandern, umfaßt; und
(c) in einer Stufe die optische Dichte der Farbreagensschicht bestimmt, wobei die optische Dichte im Verhältnis zur Menge des Markers, der das markierte Antigen, das in die Farbreagensschicht wandert, markiert, steht, wobei die Menge des Analyten-Antigens, das in der wäßrigen flüssigen Probe enthalten ist, bestimmt wird.
Obwohl das erfindungsgemäße Immunassayverfahren unter Bezug auf einen Fall, bei dem ein Analyt ein Antigen ist, beschrieben wurde, kann das erfindungsgemäße Immunassayverfahren auf die Analyse eines Antikörpers angewandt werden. In einem solchen Falle, d.h., wenn es gewünscht ist, die Menge eines Analyten-Antikörpers zu bestimmen, werden ähnliche Verfahren, wie im vorigen Absatz beschrieben, durchgeführt, während ein markierter Antikörper anstelle des markierten Antigens verwendet wird, und wobei ähnliche Mikroteilchen, die auf sich ein immobilisiertes Antigen tragen, verwendet werden.
Beispiele für das markierte Antigen oder den markierten Antikörper, die erfindungsgemäß verwendet werden können, umfassen die markierten Antigene und die markierten Antikörper, die in der nachstehenden Publikationsliste beschrieben sind.
D. Monroe, "Analytical Chemistry", 56(8), 920A, (1984); Eiji Ishikawa et al., "KOSO-MENEKI SOKUTEIHO" ("Enzyme Immunoassay"), 2. Auflage (veröffentlicht von IGAKU SHOIN 1982);
Fukuko Watanabe, "KENSA-TO-GIJUTSU" ("Examination & Technology"), 9(7), Seite 583 (1981);
I. Hemmilae, "Clinical Chemistry", 31(3), Seite 359 (1985); und
Ikuo Johno, "PHARMACIA", 21(2), Seite 126 (1985).
Markierende Materialien, die auf dem Fachgebiet bekannt sind und die zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignet sind, sind beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe, wie FITC (Fluoresceinisothiocyanat), Oxidasen, wie Glucoseoxidase (GOD; EC 1.1.3.4) und Galactoseoxidase (EC 1.1.3.9), Hydrolasen, wie Peroxidase (POD; EC 1.11.1.7), alkalische Phosphatase (ALP; EC 3.1.3.1) und α-Amylase (EC 3.2.1.1), chemilumineszente Farbstoffe, wie Luminol und oxidierende chemilumineszente Enzyme, wie Luciferase.
Das Antigen oder der Antikörper können an ein ausgewähltes markierendes Material nach irgendeinem der herkömmlichen Verfahren, die beispielsweise in den folgenden Literaturstellen beschrieben sind, gebunden werden.
Tadashi Kawai, "RINSHO KENSA GIJUTSU ZENSHO, Bd. 4 - MENEKI KESSEI KENSA" ("Clinical Examination Technology Reihe, Bd. 4 - Immunoserum Examination"), Seiten 97 bis 102, veröffentlicht von IGAKU SHOIN (1977);
"Biochem. Biophys. Res. Commun.", 74, 538 (1977);
"Clinica Chimica Acta" 83, 161 (1978); und offengelegte japanische Patentpublikationen Nrn. 79024/1978 (US-A 4,272,505), 142522/1978 (US-A 3,998,943), 146295/1976 (US-A 4,230,797) und 67388/1977 (US-A 4,230,797).
Spezifische Beispiele für die markierten Antigene und die markierten Antikörper sind GOD-gebundenes Anti-Human- Immunglobulin (IgG), ALP-gebundenes Anti-IgG, α-Fetoprotein markiert mit POD.
Das Antigen oder der Antikörper können von den Mikroteilchen immobilisiert werden und können an einem Marker nach irgendeinem der beispielsweise in den Veröffentlichungen und Beschreibungen, die oben aufgeführt wurden, beschriebenen Verfahren, gebunden werden.
Das markierte Antigen oder der markierte Antikörper werden in Form einer wäßrigen Lösung in einer pH-Pufferlösung verwendet, die eine ähnliche Pufferzusammensetzung besitzt, wie in Zusammenhang mit der Pufferlösung, die Mikroteilchen zum Tragen des Antigens oder Antikörpers in immobilisiertem Zustand enthält, beschrieben wird. Es ist bevorzugt, daß die Lösung, die das markierte Antigen oder den markierten Antikörper enthält, eine wäßrige Lösung eines geeigneten pH-Puffers, ausgewählt aus den bekannten pH-Pufferzusammensetzungen, ist. Besonders wenn ein Enzym als das markierende Material verwendet wird, ist es bevorzugt oder sogar in einigen Fällen erforderlich, den pH-Wert der Lösung innerhalb eines optimalen pH-Bereichs für das verwendete Enzym einzustellen und beizubehalten. Die Menge des markierten Antigens oder des markierten Antikörpers sollte im wesentlichen die gleiche oder größer als die Menge des Analyten-Antigens oder des Analyten-Antikörpers, der in der wäßrigen flüssigen Probe enthalten ist, sein.
Die Mikroteilchen zum Tragen des Antigens oder Antikörpers in dem immobilisierten Zustand können feste kugelförmige Teilchen oder Kügelchen anderer Form sein und können aus natürlichen oder synthetischen organischen Polymeren bestehen, die nicht wesentlich die Antigen-Antikörper-Bindungsreaktionen (Immunreaktionen) hemmen. Spezifische Beispiele für solche polymere Materialien sind Agarose, Gelatine, Pururan, Cellulose, Celluloseacetat, gehärteter Polyvinylalkohol und Polystyrol. Die feinen Teilchen können in Form von kurzen Fasern oder Mikrokapseln aus den vorstehend erwähnten polymeren Materialien vorliegen. Die Teilchengröße der Mikroteilchen liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 0,1 um bis etwa 1 mm, bevorzugt von etwa 0,5 um bis etwa 100 um.
Es ist bevorzugt, daß die Lösung, die die Mikroteilchen, die das Antigen oder den Antikörper tragen, enthält, eine wäßrige Lösung eines geeigneten pH-Puffers, ausgewählt aus den bekannten pH-Pufferzusammensetzungen, ist. Besonders wenn ein Enzym als das markierende Material verwendet wird, ist es bevorzugt oder in einigen Fällen sogar erforderlich, den pH-Wert der Lösung, der die Mikroteilchen, die das Antigen oder den Antikörper tragen, innerhalb eines optimalen pH-Bereichs für das verwendete Enzym einzustellen und beizubehalten. Beispiele für pH-Pufferzusammensetzungen, die zu diesem Zweck verwendet werden, sind in den folgenden Publikationen beschrieben, auf die hiermit Bezug genommen wird.
"Kagaku Binran, Kiso-hen" (Chemical Handbook, Fundamental Volume), herausgegeben von Chemical Society of Japan und veröffentlicht von Maruzen, Tokio (1966), Seiten 1312 bis 1320;
"Data for Biochemical Research", 2. Ausgabe, herausgegeben von R. M. C. Dawson et al. und veröffentlicht von Oxford bei Clarendon Press (1969), Seiten 476 bis 508; "Biochemistry", 5, Seiten 467 bis 477 (1966), und "Analytical Biochemistry", 104, Seiten 300 bis 310 (1980).
Eine Ausführungsform des integralen mehrschichtigen analytischen Elements, das zur Durchführung des erf indungsgemässen Verfahrens verwendet werden kann, umfaßt eine obere poröse Schicht zum Einfangen der Mikroteilchen, eine mittlere Detektionsschicht und einen unteren wasserundurchlässigen und transparenten Träger. Die Detektionsschicht besteht aus einem hydrophilen polymeren Bindemittel und dient als eine wasserabsorbierende Schicht. Der nichtgebundene (freie) markierte Immunreaktant, der in der wäßrigen Lösung enthalten ist, und der auf die Detektionsschicht weitergeleitet wird, wird von der Detektionsschicht absorbiert, und der daran bindende Marker wird durch colorimetrische Bestimmung bestimmt. Eine alternative Ausführungsform des integralen mehrschichtigen analytischen Elements enthält eine obere poröse Schicht zum Einfangen der Mikroteilchen und eine mittlere Farbreagensschicht und einen unteren wasserundurchlässigen und transparenten Träger. Die Farbreagensschicht kann aus einer einzelnen Schicht eines hydrophilen polymeren Bindemittels, welches darin ein Farbreagens, das mit dem Marker, der den Immunreaktanten markiert, reagiert, enthält, zusammengesetzt sein oder kann eine zusammengesetzte Schicht sein, die eine Detektionsschicht aus einer Schicht mit einem hydrophilen polymeren Bindemittel und einer porösen Schicht, die auf der hydrophilen polymeren Bindemittelschicht angebracht ist, sein.
Die poröse Schicht oder die poröse Ausbreitungsschicht kann beispielsweise eine Ausbreitungsschicht aus einem Gewebe bzw. Flächengebilde, wie einem Breitgewebe oder Popelingewebe, wie in den offengelegten japanischen Patentpublikationen Nrn. 164356/1980 (US-A 4,292,272) und 66359/1982 (GB 2,087,074A) beschrieben ist; eine Ausbreitungsschicht aus einem gestrickten bzw. gewirkten Gewebe, wie einem Trikotgestrickten Gewebe, einem Doppeltrikot-gestrickten Gewebe oder einem Milanese-gestrickten bzw. gewirkten Gewebe, wie in der offengelegten japanischen Patentpublikation Nr. 222769/1985 (EP 0 162 302A) beschrieben; eine Ausbreitungsschicht aus einem Papier, das eine organische Polymerfaserpulpe enthält, wie in der offengelegten japanischen Patentpublikation Nr. 148250/1982 beschrieben ist (entsprechend Chemical Abstract 98:49994q); eine nicht-faserige isotrop poröse Ausbreitungsschicht einschließlich eines Membranfilters (Blush-Polymerschicht) oder eine poröse Schicht, die offenzellige Mikroporen aus Polymer- Mikrokügelchen, Glas-Mikrokügelchen oder Diatomenerde-Kügelchen enthält, und die von einem hydrophilen polymeren Bindemittel zurückgehalten werden, wie in der japanischen Patentpublikation Nr. 21677/1978 und der US-A 3,992,158 beschrieben ist; eine nicht-faserige isotrop poröse Ausbreitungsschicht aus einer porösen Schicht, enthaltend offenzellige Mikroporen (dreidimensionale Gitterstruktur aus Teilchen), worin die polymeren Mikrokügelchen aneinander durch einen punktförmigen Kontakt, der die Punkte durch einen Polymer-Klebstoff, der nicht wasserquellbar ist, verbindet, verbunden sind, wie in der offengelegten japanischen Patentpublikation Nr. 90859/1980 (US-A 4,258,001) beschrieben ist; ein zusammengesetztes Membranfilter (zusammengesetzte Blush-Polymerschicht) mit einer kontinuierlichen mikroporösen Struktur und mit zwei hochpolymeren mikroporösen Schichten, gebildet durch das Mehrschichten- Beschichtungsverfahren oder das Mehrschichten-Gußbeschichtungsverfahren, wie in der japanischen Patentanmeldung 232726/1985 (offengelegte japanische Patentpublikation Nr. 91543/1987) beschrieben ist, wobei die beiden polymeren mikroporösen Schichten eng miteinander über ihre Grenzflächen unter Bildung eines integralen zusammengesetzten Laminats verbunden sind. Ein zusammengesetztes Laminat einschließlich einer faserigen voluminösen Filtrationsschicht, hergestellt durch ein Verfahren zur Filterherstellung, wie in der offengelegten japanischen Patentpublikation Nr. 230063/1985 (EP 159 727 A) beschrieben und eine Gewebsschicht (hergestellt aus gewebtem bzw. gewirktem Tuch), wobei die Fasern der Filterschicht und die Fasern der Gewebsschicht an den Grenzflächen zwischen diesen Schichten unter Bildung eines integralen Verbundlaminats miteinander verschlungen sind, ein Verbundlaminat einschließlich einer faserigen voluminösen Filtrationsschicht, hergestellt durch das Verfahren zur Herstellung von Filtern, wie in der offengelegten japanischen Patentpublikation Nr. 230064/1985 (EP 159 727 A) beschrieben und eine nicht-faserige mikroporöse Schicht, wie eine Membranfilterschicht, wobei die Fasern der voluminösen Filtrationsschicht die Mikroporen der nicht-faserigen mikroporösen Schicht an der Grenzfläche zwischen diesen Schichten unter Bildung eines integralen Verbundlaminats ankern, und andere bekannte Glasfaser-Filtermaterialien. Es ist im allgemeinen bevorzugt, daß die poröse Schicht oder die poröse Ausbreitungsschicht die obere Schicht bildet.
Die hydrophile polymere Bindemittelschicht (oder die wasserabsorbierende oder Detektionsschicht, wie in einigen Teilen dieser Beschreibung bezeichnet) ist eine Schicht, die als Hauptkomponente ein hydrophiles Polymeres, das Wasser absorbiert und dadurch quillt, umfaßt. Das Wasser in der wäßrigen flüssigen Probe, das durch die poröse Schicht oder die poröse Ausbreitungsschicht auf die Grenzfläche zwischen der porösen Schicht und der hydrophilen polymeren Bindemittelschicht dringt, wird von der zuletzt genannten Schicht absorbiert. Wenn die verwendete Probe Vollblut ist, wird die Durchdringung der wäßrigen Komponente davon (d.h. das Blutplasma) auf die Reagensschicht oder die Detektionsschicht durch die Funktion der hydrophilen polymeren Bindemittelschicht beschleunigt. Das hydrophile Polymere, das in der hydrophilen polymeren Bindemittelschicht verwendet werden kann, besitzt eine prozentuale Quellung, im allgemeinen im Bereich von etwa 150% bis etwa 2000%, bevorzugt von etwa 250% bis etwa 1500%, bei 30ºC. Spezifische Beispiele für das erfindungsgemäß verwendete hydrophile Polymere umfassen Gelatinearten, wie säurebehandelte Gelatine und entionisierte Gelatine, Gelatinederivate, wie phthalierte Gelatine und Hydroxyacrylat-gepfropfte Gelatine, wie in den offengelegten japanischen Patentpublikationen Nrn. 171864/1984 (EP 119 861 A) und 115859/1985 (entsprechend Chemical Abstracts 103:138078h), und Agarose, Pururan, Pururanderivate, Polyacrylamide, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon, wie in den japanischen offengelegten Patentpublikationen Nrn. 171864/1984 (EP 119 861 A) und 115859/1985 beschrieben ist. Diese hydrophilen Polymeren können einzeln oder in Kombination mit einem oder mehreren anderen hydrophilen Polymeren verwendet werden. Im allgemeinen bevorzugte hydrophile Polymere, die in der erfindungsgemäßen hydrophilen polymeren Bindemittelschicht enthalten sind, sind Gelatine und Gelatinederivate, die anderen bevorzugten Beispiele sind Polyacrylamide und Polyvinylalkohol.
Die hydrophile polymere Bindemittelschicht besitzt in trokkenem Zustand eine Dicke im allgemeinen im Bereich von etwa 1 um bis etwa 100 um, bevorzugt von etwa 3 um bis etwa 30 um, und ist in einer Beschichtungsmenge von etwa 1 g/m² bis etwa 100 g/m², bevorzugt von etwa 3 g/m² bis etwa 30 g/m², aufgebracht. Die hydrophile polymere Bindemittelschicht kann einen bekannten pH-Puffer, eine organische Carbonsäure, ein saures Polymeres oder ein basisches Polymeres, um einen gemäß Verwendung (während des analytischen Vorgangs) eingestellten pH-Wert zu haben, enthalten. Die hydrophile polymere Bindemittelschicht kann weiterhin mit einem bekannten Beizmittel oder polymeren Beizmitteln versetzt sein. Obwohl es bevorzugt ist, daß die hydrophile polymere Bindemittelschicht im wesentlichen transparent ist, können eine kleine Menge Mikroteilchen aus Titandioxid, Mikroteilchen aus Bariumsulfat oder Ruß darin dispergiert sein, um die optische Eigenschaft der Schicht zu kontrollieren, sofern notwendig.
Die Farbreagensschicht ist eine wasserabsorbierende und wasserpermeable Schicht aus einem hydrophilen polymeren Bindemittel, das darin eine Reagenzzusammensetzung (Farbreagenzzusammensetzung) enthält, die mit der Markerverbindung oder der Markerkomponente des markierten Antikörpers (oder des markierten Antigens) unter Induktion einer optisch detektierbaren Veränderung reagiert, wobei die Reagenszusammensetzung im wesentlichen gleichförmig in der Farbreagensschicht dispergiert ist. Die optisch detektierbare Veränderung bedeutet die Veränderungen, die durch optische Messung detektiert werden können und umfaßt eine Veränderung in der Farbe, Färbung (Entwicklung einer bestimmten Farbe), Emission eines Fluoreszenzlichts, Veränderung in der Absorptionswellenlänge im UV-Bereich oder Auftreten von Trübung.
Das hydrophile polymere Bindemittel, das zur Bildung der Farbreagensschicht verwendet werden kann, umfaßt hydrophile Polymere, die in der vorstehend erwähnten polymeren Bindemittelschicht verwendet werden. Die Farbreagensschicht besitzt in trockenem Zustand eine Dicke im allgemeinen im Bereich von 3 um bis etwa 50 4m, bevorzugt von etwa 5 um bis etwa 30 um, und ist in einer Beschichtungsmenge von etwa 3 g/m² bis etwa 50 g/m², bevorzugt von etwa 5 g/m² bis etwa 30 g/m², aufgebracht. Die Farbreagensschicht kann einen bekannten pH-Puffer, eine organische Carbonsäure, ein saures Polymeres oder ein basisches Polymeres enthalten, um einen eingestellten pH-Wert bei Verwendung (während des analytischen Arbeitsganges) zu haben. Die Farbreagensschicht kann weiterhin mit einem bekannten Beizmittel oder polymeren Beizmittel versetzt sein. Obwohl es bevorzugt ist, daß die Farbreagensschicht im wesentlichen transparent ist, können eine kleine Menge an Titandioxidmikroteilchen, Bariumsulfatmikroteilchen oder Ruß darin dispergiert sein, um die optische Eigenschaft der Schicht zu kontrollieren, sofern notwendig.
Die Farbreagensschicht kann durch Zugabe einer Farbreagenszusammensetzung zu einer porösen Schicht, ähnlich wie der, die als die zuvor erwähnte poröse Schicht verwendet wurde, nach dem Verfahren, das in der offengelegten japanischen Patentpublikation Nr. 4959/1986 (EP 166 365 A) beschrieben ist, hergestellt werden.
Eine geeignete Farbreagenszusammensetzung kann aus einer Vielzahl von bekannten Farbreagenszusammensetzungen, die in der Farbreagensschicht enthalten sein sollen, ausgewählt werden. Wenn eine Oxidase, wie Glucoseoxidase oder Galactoseoxidase oder eine Peroxidase als das markierende Material verwendet wird, sind die folgenden Beispiele Beispiele von bevorzugten Reagenszusammensetzungen.

Wenn das markierende Material eine Oxidase ist:

(1) Reagenszusammensetzung, enthaltend eine Peroxidase, ein Chromogen und einen Kuppler. Bei Verwendung einer solchen Reagenszusammensetzung wird Wasserstoffperoxid durch die Wirkung der markierenden Oxidase erzeugt, welches auf das Chromogen und den Kuppler einwirkt, so daß die oxidative Kupplung des Chromogens und des Kupplers in Gegenwart der Peroxidase unter Bildung eines Chinoniminfarbstoffs stattfindet.
(2) Reagenszusammensetzung, enthaltend einen Leukofarbstoff oder ein autooxidatives Chromogen und eine Peroxidase. Bei Verwendung einer solchen Reagenszusammensetzung wird Wasserstoffperoxid durch Wirkung der markierenden Oxidase erzeugt, so daß der Leukofarbstoff oder das Chromogen in Gegenwart der Peroxidase oxidiert wird, was zur Bildung eines färbenden Farbstoffs führt.

Wenn das markierende Material eine Peroxidase ist:

(3) Reagenszusammensetzung, enthaltend eine Oxidase, ein Chromogen und einen Kuppler. Bei Verwendung einer solchen Reagenszusammensetzung wird Wasserstoffperoxid durch Wirkung der markierenden Peroxidase erzeugt, welcher auf das Chromogen und den Kuppler einwirkt, so daß die oxidative Kupplung des Chromogens und des Kupplers in Gegenwart der Peroxidase unter Bildung eines Chinoniminfarbstoffs stattfindet.
(4) Reagenszusammensetzung, enthaltend einen Leukofarbstoff oder ein autooxidatives Chromogen und eine Oxidase. Bei Verwendung einer solchen Reagenszusammensetzung wird Wasserstoffperoxid durch Wirkung der markierenden Oxidase erzeugt, welcher das Leukopigment oder das Chromogen in Gegenwart der markierenden Peroxidase oxidiert, was zur Bildung eines färbenden Farbstoffs führt.
Beispiele für das Chromogen umfassen 4-Aminoantipyrin (auch als 4-Aminophenazon, d.h. 1-Phenyl-2,3-dimethyl-4-amino-3- pyrazolin-5-on bezeichnet), beschrieben in "Ann. Clin. Biochem.", 6 24 bis 27 (1969); und 4-Aminoantipyrin-Analoga einschließlich 1-trisubstituiertes-Phenyl-2, 3-dimethyl-4- amino-3-pyrazolin-5-one, wie 1-(2,4,6-Trichlorphenyl)-2,3- dimethyl-4-amino-3-pyrazolin-5-on, beschrieben in der offengelegten japanischen Patentpublikation Nr. 54962/1984 (EP 103 901 A) und 1-(3,5-Dichlorphenyl)-2,3-dimethyl-4- amino-3-pyrazolin-5-on, und 1-Phenyl-2, 3-dimethyl-4-dimethylamino-3-pyrazolin-5-on, beschrieben in der japanischen Patentpublikation Nr. 25840/1980 (US-A 3,886,045). Unter diesen Verbindungen sind bevorzugte Chromogene 4-Aminoantipyrin, 1-(2,4,6-Trichlorphenyl)-2,3-dimethyl-4-amino-3-pyrazolin-5-on und 1-(3,5-Dichlorphenyl)-2,3-dimethyl-4- amino-3-pyrazolin-5-on.
Beispiele von verwendbaren Kupplern sind in "Ann. Clin. Biochem." 6, 24 bis 27 (1969), den japanischen Patentpublikationen Nrn. 25840/1980 (US-A 3,886,045), 45599/1983 (US-A 3,983,005) und 18628/1983 (US-A 4,402,335) und den offengelegten japanischen Patentpublikationen Nrn. 164356/1980 (US-A 4,292,272), 124398/1981 (US-A 4,350,762) und 155852/1981 (US-A 4,291,121) beschrieben; spezifische Beispiele sind Phenol, Phenolsulfonsäuren (und die Alkalimetallsalze davon und die Erdalkalimetallsalze davon), wie 2- Hydroxy-1-benzolsulfonsäure, 4-Hydroxy-1-benzolsulfonsäure, 3,5-Dichlor-2-hydroxy-1-benzolsulfonsäure und 2-Hydroxy-3- methoxy-1-benzolsulfonsäure; 1-Naphthol; 2-Naphthol; Dihydroxynaphthaline, wie 1,7-Dihydroxynaphthalin; Naphtholsulfonsäuren (und Alkalimetallsalze davon und Erdalkalimetallsalze davon), wie 1-Hydroxy-4-naphthalinsulfonsäure; und andere Phenol- und Naphtholderivate. Unter diesen Verbindungen sind bevorzugte Kuppler 1,7- Dihydroxynaphthalin, 1-Hydroxy-2-naphthalinsulfonsäure (einschließlich Na-Salz, K-Salz und Li-Salz davon), 3,5- Dichlor-2-hydroxy-1-benzolsulfonsäure und 2-Hydroxy-3-methoxy-1-benzolsulfonsäure (einschließlich Na-Salz, K-Salz und Li-Salz davon).
Beispiele für verwendbare Leukofarbstoffe sind Triarylimidazol-Leukofarbstoffe, wie 2- (4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-4,5-bis(4-(dimethylamino)phenyl) imidazol, beschrieben in der japanischen Patentpublikation Nr. 5519/1982 (US-A 4,089,747) und Diarylimidazol-Leukofarbstoffe, wie 2-(3,5- Dimethoxy-4-hydroxyphenyl)-4-(4-(dimethylamino)phenyl)-5- phenetylimidazol, beschrieben in der offengelegten japanischen Patentpublikation Nr. 193352/1984.
Beispiele für die Peroxidase, die erfindungsgemäß verwendet werden kann, sind eine Peroxidase (EC 1.11.1.7) pflanzlichen oder tierischen Ursprungs, wie in "Rinsho Koso Handbook" (Clinical Enzyme Handbook), herausgegeben Von Baba, Wada, Kitamura und Okuda, Kodansha (1982), "Koso Handbook" (Enyzme Handbook) herausgegeben von Maruo und Tamiya, Asakura-shoten (1982), T. E. Barman, "Enzyme Handbook", Springer Verlag (1969) und den japanischen Patentpublikationen Nrn. 45599/1981 (US-A 3,983,005) und 5520/1982 (US-A 4,211,845) beschrieben; und eine Peroxidase (EC 1.11.1.7) mikrobiellen Ursprungs, wie in der japanischen Patentpublikation Nr. 5035/1983 (Chemical Abstracts 97: 180163q) beschrieben. Es ist bevorzugt, daß eine nicht-spezifische Peroxidase pflanzlichen oder mikrobiellen Ursprungs verwendet wird. Beispiele für eine bevorzugte Peroxidase sind Meerrettich-Peroxidase, Rettich-Peroxidase und aus den Mikroorganismen Cochliobolus und Curvularia genera extrahierte Peroxidasen.
Ein bekannter pH-Puffer kann in der Schicht, die die Peroxidase enthält, oder der benachbarten Schicht enthalten sein, so daß der pH-Wert der Schicht innerhalb des Bereichs von pH 5,0 bis pH 8,0, bevorzugt von pH 6,0 bis pH 7,0, während der analytischen Operation gehalten wird. Der Gehalt der in 1 m² des mehrschichtigen Elements enthaltenen Peroxidase ist im allgemeinen auf einen Bereich von etwa 1000 U bis etwa 100.000 U, bevorzugt von etwa 2000 U bis etwa 60.000 U, eingestellt. Wenn eine Hydrolase, wie alkalische Phosphatase oder α-Amylase als das markierende Material verwendet wird, sind im folgenden Beispiele für bevorzugte Reagenszusammensetzungen angegeben.

Wenn das markierende Material eine alkalische Phosphatase ist:

(5) Farbreagenszusammensetzung, enthaltend ein Arylphosphat oder ein Salz davon, das ein selbstfärbendes Substrat, wie p-Nitrophenylphosphat (oder ein Salz davon, wie ein Na-Salz oder Tris-Salz) oder p-Nitrophenylazonaphthylphosphat (oder ein Salz davon, wie Bis(2-ethylaminoethanol)salz), beschrieben in der offengelegten japanischen Patentpublikation Nr. 110058/1986 (EP 182 179 A) und der japanischen Patentanmeldung Nr. 111187/1985 (offengelegte japanische Patentpublikation Nr. 269067/1986) ist.

Wenn das markierende Material α-Amylase ist:

(6) Farbreagenszusammensetzung, enthaltend ein Substrat, an das ein färbendes Material gebunden ist, wie p-Nitrophenyl-α -D-maltoheptaosid, beschrieben in der offengelegten japanischen Patentpublikation Nr. 51892/1979 (US-A 4,554,631), p- Nitrophenyl-α-D-maltopentaosid, beschrieben in der offengelegten japanischen Patentpublikation Nr. 129997/1983 (US-A 4,472,499) und ein Pigment oder ein fluoreszierendes Pigment, gebunden an Stärke, beschrieben in der offengelegten japanischen Patentpublikation Nr. 131089/1978 (US-A 4,144,306).
Das integrale mehrschichtige analytische Element kann nach bekannten Verfahren, die in den vorstehend angegebenen Patentbeschreibungen beschrieben sind, hergestellt werden. Es ist bevorzugt, daß das mehrschichtige analytische Element ein quadratförmiges Scheibchen mit einer Größe von etwa 15 mm x 15 mm bis etwa 30 mm x 30 mm oder ein kreisförmiges Scheibchen mit im wesentlichen der gleichen Größe geschnitten wird, und das Scheibchen wird in einen Objektträger, wie er in der japanischen Patentpublikation Nr. 28331/1982 (US-A 4,169,751), den japanischen Gebrauchsmusterpublikationen Nrn. 142454/1981 (US-A 4,387,990) und 32350/1983 und den offengelegten japanischen Patentpublikationen Nrn. 63452/1982 und 501144/1983 (WO 83/00391) beschrieben ist, eingebracht, wodurch Objektträger zur Analyse gebildet werden. Für einige Anwendungen kann ein kontinuierliches streifenförmiges mehrschichtiges analytisches Element in einer Kassette oder einem Magazin enthalten sein oder ein geschnittenes Stück des mehrschichtigen analytischen Elements kann in einer Karte mit einer Öffnung auf einer Seite enthalten sein.
Das erfindungsgemäße Immunassayverfahren wird nun genauer unter Bezug auf eine Ausführungsform davon beschrieben, bei der die Menge eines Antikörpers, der in einer wäßrigen flüssigen Probe enthalten ist, unter Verwendung eines markierten Antikörpers analysiert wird.
Mikroteilchen, auf denen ein Antigen gegen den Analyten-Antikörper in immobilisiertem Zustand angebracht ist, werden in einer Pufferlösung mit einem pH-Wert, der für die erwartete Immunreaktion geeignet ist, dispergiert, wodurch eine Dispersion gebildet wird. Ein vorbestimmtes Volumen der Dispersion wird in ein Reaktionsgefäß gegeben und mit einem vorbestimmten Volumen einer wäßrigen flüssigen Probe (z.B. Blutplasma oder Blutserum), enthaltend den Analyten-Antikörper, versetzt und weiter mit einem vorbestimmten Volumen einer Pufferlösung, enthaltend einen markierten Antikörper in einer Menge, etwa gleich oder größer als die geschätzte Maximalmenge des Analyten-Antikörpers, versetzt, wodurch eine gemischte Lösung erhalten wird. Die gemischte Lösung wird bei einer Temperatur von etwa 10ºC bis etwa 45ºC, bevorzugt von etwa 20ºC bis etwa 30ºC, über eine Zeitspanne von etwa 3 Minuten bis etwa 30 Minuten, bevorzugt von etwa 5 Minuten bis etwa 20 Minuten, unter Schütteln oder Rühren der gemischten Lösung für eine geeignete Zeitspanne inkubiert, wodurch kompetitive Immunreaktionen zwischen dem immobilisierten Antigen und dem Analyten-Antikörper und dem markierten Antikörper stattfinden. Die Inkubation wird fortgesetzt, bis die kompetitiven Immunreaktionen beendet sind. Während dieser Inkubationsoperation werden ein Teil des Analyten-Antikörpeis und ein Teil des markierten Antikörpers an das von den Mikroteilchen immobilisierte Antigen gebunden (dies ist ein Fall, in dem im wesentlichen der gesamte Analyten-Antikörper an das durch die Mikroteilchen immobilisierte Antigen gebunden wird) und der nichtgebundene (freie) markierte Antikörper wird in der Pufferlösung in dem Reaktionsgefäß gelassen (das ist ein Fall, in dem der freie markierte Antikörper im wesentlichen Null ist). Danach wird ein im wesentlichen konstantes Volumen im Bereich von etwa 5 ul bis etwa 100 ul, bevorzugt von etwa 6 ul bis etwa 70 ul, und am bevorzugtesten ein konstantes Volumen der Lösung in dem Reaktionsgefäß aufgenommen und auf die poröse Ausbreitungsschicht oder die poröse Schicht des integralen mehrschichtigen analytischen Elements getropft, wodurch der Antikörper und der markierte Antikörper, die an das von den feinen Teilchen immobilisierte Antigen gebunden sind, von der porösen Ausbreitungsschicht oder der porösen Schicht eingefangen werden und der freie markierte Antikörper und das als Lösungsmittel wirkende Wasser in die Farbreagensschicht oder die Detektionsschicht weitergeleitet werden (dieser Arbeitsschritt entspricht der B/F-Abtrennung, die absichtlich als Trennoperation bei dem herkömmlichen Verfahren durchgeführt wird). Die optische Dichte der in dem Analysenelement entwickelten Farbe wird dann nach irgendeinem der bekannten Verfahren gemessen, um colorimetrisch die Menge des Analyten-Antikörpers, die in der wäßrigen flüssigen Probe enthalten ist, zu bestimmen.
Die Menge des freien markierten Antikörpers, der von der Farbreagensschicht oder der Detektionsschicht des mehrschichtigen analytischen Elements zurückgehalten wird, kann nach irgendeinem der bekannten colorimetrischen Bestimmungsverfahren, die in den zuvor zitierten früheren Patentbeschreibungen beschrieben sind, bestimmt werden. Ausführlich: ein konstantes Volumen der wäßrigen Probe, die den freien markierten Antikörper enthält, wird auf-die Ausbreitungsschicht getropft und bei im wesentlichen konstanter Temperatur von etwa 20ºC bis etwa 40ºC, bevorzugt innerhalb eines Temperaturbereichs bis etwa 37ºC (mit einem Temperaturbereich von etwa 35ºC bis etwa 40ºC) über eine Zeitspanne von 1 Minute bis 10 Minuten inkubiert. Die optische Dichte der Farbe, Fluoreszenz, Trübung oder die Absorption im ultravioletten Bereich in der Farbreagensschicht oder der Detektionsschicht des mehrschichtigen analytischen Elements wird von der Seite des transparenten Trägers mittels einer Reflexions-Lichtmessung gemessen (die optische Dichte kann durch Messen des reflektierten Lichts von der Seite der Ausbreitungsschicht bestimmt werden oder kann durch Messen des transmittierten Lichts von der Seite des Trägers oder von der Seite der Ausbreitungsschicht gemessen werden). Gemäß dem Prinzip des colorimetrischen Bestimmungsverfahrens wird die Menge des freien markierten Antikörpers in der wäßrigen flüssigen Probe durch Vergleich des gefundenen Werts mit den Daten auf einer zuvor aufgestellten Calibrationskurve bestimmt, und dann wird die Menge des Analyten-Antikörpers indirekt aus der so ermittelten Menge des freien markierten Antikörpers berechnet. Alternativ kann die Menge des Analyten-Antikörpers direkt unter Verwendung der Calibrationskurve bestimmt werden. Ein präziser Wert kann durch einen einfachen Arbeitsschritt unter Verwendung irgendeines der Apparate für chemische Analysen, beispielsweise in den offengelegten japanischen Patentpublikationen Nrn. 77746/1981 (US-A 4,488,810), 21566/1983 (US-A 4,584,275) und 161867/1983 (US-A 4,424,191) beschrieben sind, erhalten werden.
Wenn der Analyt ein Antigen ist, wird ein Antikörper gegen das Analyten-Antigen auf den Mikroteilchen in immobilisiertem Zustand gehalten, und ein markiertes Antigen wird für die kompetitive Reaktion verwendet. Die anderen Arbeitsschritte sind ähnlich denen, die für die Bestimmung des Analyten-Antikörpers, wie vorstehend beschrieben, verwendet wurden. Ein Hapten kann quantitativ durch ähnliche Verfahrensschritte analysiert werden.
Da ein immobilisiertes Antigen (ein immobilisierter Antikörper) einer kompetitiven Reaktion zwischen einem Antikörper und einem markierten Antikörper (einem Antigen und einem markierten Antigen) in einem wäßrigen Medium erfindungsgemäß unterworfen wird, findet die kompetitive Reaktion schneller und positiver statt, als sie in einer kleinen Menge eines wäßrigen Mediums, das in einem trockenen integralen mehrschichtigen analytischen Element zurückgehalten wird, ablaufen würde. Da die colorimetrische Bestimmung des markierten Antikörpers (markierten Antigens) unter Verwendung eines trockenen analytischen Elements durchgeführt wird, kann die Bestimmung leicht in kurzer Zeit unter Erhalt eines genauen Ergebnisses durchgeführt werden. Nur durch Auftropfen der wäßrigen flüssigen Probe nach Beendigung der kompetitiven Reaktion auf die poröse Schicht oder die poröse Ausbreitungsschicht kann die B/F-Trennung, die der arbeitsaufwendigste und mühsamste Arbeitsschritt ist, automatisch ohne die Notwendigkeit komplizierter Arbeitsschritte einschließlich Zentrifugenabtrennung oder Filtration zur B/F-Trennung durchgeführt werden.
Obwohl das erfindungsgemäße Immunassayverfahren die Handhabung der Lösung beinhaltet, ist das Verfahren beträchtlich vereinfacht im Vergleich mit dem Verfahren, das in "NIPPON RINSHO KENSA JIDOKA GAKKAT-SHI" ("Journal of the Japanese Society of Automation of Clinical Examination"), 10, Seiten 57 bis 60 (1985) beschrieben ist, worin eine Spüllösung mitten auf die Reaktionszone auf einem kleinen Objektträger aufgebracht werden muß, um die B/F-Trennung vorzunehmen. Da ein solcher delikater Arbeitsschritt des Aufbringegns einer Spülflüssigkeit bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wegfällt, kann eine genaue quantitative Analyse innerhalb kurzer Zeit mittels des Immunassayverfahrens gemäß dieser Erfindung durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele, die nur als Beispiele angegeben sind, näher erläutert.

Beispiel 1

(1) Herstellung des integralen mehrschichticien analytischen Elements:

Eine wäßrige Lösung einer Farbreagenszusammensetzung wurde auf einen farblosen und transparenten Polyethylenterephthalat(PET)-Film mit einer Dicke von 180 um und der Funktion als Träger aufgebracht und anschließend getrocknet, wodurch eine Farbreagensschicht mit einer Dicke von etwa 10 um nach Trocknen gebildet wurde, so daß die Bedeckung (aufgebrachte Menge) jedes der Inhaltsstoffe in der so gebildeten Farbreagensschicht auf die nachstehend beschriebene Menge eingestellt wurde.
Entionisierte Gelatine 13 g/m²
Peroxidase 1700 IU/m²
1,7-Dihydroxynaphthalin 330 mg/m²
4-Aminoantipyrin 800 mg/m²
Nonylphenoxypolyethoxyethanol 130 mg/m²
(enthaltend durchschnittlich 10 Oxyethyleneinheiten)
Andererseits wurde ein glatt gewebtes Flächengebilde aus 100 count dicken PET-gesponnenen Garnen mit einer wäßrigen Lösung aus Glucose imprägniert, anschließend getrocknet, so daß das Gewebe Glucose in einer Menge von 30 g/m² enthielt. Gemäß dem in der offengelegten japanischen Patentpublikation Nr. 4959/1986 (EP 166 365 A) beschriebenen Verfahren wurde das glatt gewebte Tuch, das mit Glucose imprägniert war, mit einem Celluloseacetat-Membranfilter mit einer minimalen Porengröße von 1,2 um und einer Dicke von 140 um unter Verwendung einer Stärkepaste verbunden, wodurch ein integrales Laminat mit zwei eng verbundenen Lagen hergestellt wurde.
Die Farbreagensschicht wurde gleichförmig mit entionisiertem Wasser benetzt und das integrale Laminat wurde auf die nasse Farbreagensschicht gegeben, so daß die glatt gewebte Schicht eng mit der Farbreagensschicht verbunden wurde. Eine leichte Kompressionskraft wurde an die obere Seite des integralen Laminats unter Herstellung eines integralen mehrschichtigen analytischen Elements angelegt.

(2) Immunassay-Arbeitsschritte:

1 ml einer wäßrigen Lösung eines Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,0 und enthaltend dispergierte Polyharnstoff- Mikrokapseln, mit jeweils einer durchschnittlichen Teilchengröße von 5 um und mit menschlichem Immunglobulin IgG in immobilisiertem Zustand wurde in ein Reagensglas gegeben, wobei die Konzentration der in der Lösung aufgelösten oder dispergierten festen Komponenten 10% betrug. In das Reagensglas wurden 100 ul einer Probenflüssigkeit (Blutserum) enthaltend Anti-IgG und 100 u1 einer wäßrigen Lösung des Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,0 und enthaltend dispergiertes Anti-IgG, markiert mit Glucoseoxidase (nachstehend als "GOD" bezeichnet) gegeben. Das Reagensglas wurde 3 Minuten lang geschüttelt und dann ließ man es zwei Minuten lang ruhig stehen, um die kompetitive Reaktion zwischen dem Anti-IgG und dem markierten Anti-IgG mit dem immobilisierten menschlichen Immunglobulin zu erlauben. 30 ul der Dispersion der Mikrokapseln, enthaltend nicht-gebundene (freie) GOD, markiert mit Anti-IgG, wurden aufgenommen.
30 ul der Dispersion wurden auf die Membranfilterschicht des vorstehend erwähnten integralen mehrschichtigen analytischen Elements aufgetropft und bei 37ºC 10 Minuten lang inkubiert. Während der Inkubationsperiode wanderte der ungebundene (freie) mit GOD markierte Anti-IgG durch die Membranfilterschicht und drang in die glucosehaltige glatt gewebte Tuchschicht ein, worin GOD, die den markierten Anti- IgG markierte, Glucose oxidierte und zersetzte, wodurch H&sub2;O&sub2; erzeugt wurde, welches in die Farbreagensschicht unter Bildung eines Chinoniminfarbstoffs durch eine oxidative Kupplungsreaktion wanderte, wodurch eine Farbe in der Farbreagensschicht entwickelt wurde.
Unmittelbar nach Beendigung der Inkubation wurde die optische Dichte der entwickelten Farbe in der Farbreagensschicht bestimmt, wobei ein sichtbares Licht mit einer mittleren Wellenlänge von 540 nm auf dem PET-Träger heraustrat und das reflektierte Licht gemessen wurde. Es wurde gefunden, daß die optische Dichte des reflektierten Lichts in naher Beziehung zur Menge des Anti-IgGs stand, so daß die Menge des Anti-IgGs durch colorimetrische Bestimmung bestimmt werden konnte.

Beispiel 2

(1) Herstellung des integralen mehrschichtigen analytischen Elements:

Eine wäßrige Lösung einer Reagenszusammensetzung wurde auf einen farblosen und transparenten Polyvinylchlorid(PVC)- Film mit einer Dicke von 150 um, der als Träger diente, beschichtet und anschließend getrocknet, so daß eine Detektionsschicht gebildet wurde, die auch als wasserabsorbierende Schicht diente und eine Dicke von etwa 15 um nach Trocknen besaß. Die Bedeckung (aufgebrachte Menge) jedes der Inhaltsstoffe in der so gebildeten Detektionsschicht wurde auf die nachstehend beschriebene Menge eingestellt.
Alkali-behandelte entionisierte Gelatine 20 g/m²
Nonylphenoxypolyethoxyethanol (enthaltend durchschnittlich 10 Oxyethyleneinheiten) 1000 mg/m²
2-Amino-2-methyl-1-propanol 15 g/m²
Andererseits wurde ein glatt gewebtes Tuch aus 120 count dickem baumwollgesponnenem Garn mit einer wäßrigen Lösung eines Di-tris-p-nitrophenylphosphatsalzes (Tris(hydroxymethyl)aminomethan-p-nitrophenylphosphat) in einer Glycinpufferlösung (pH 10,5) imprägniert. Anschließend wurde getrocknet, so daß das Gewebe das Di-tris-p-nitrophenylphosphatsalz in einer Menge von 20 g/m² enthielt. Gemäß dem in der offengelegten japanischen Patentpublikation Nr. 4959/1986 (EP 166 365 A) beschriebenen Verfahren wurde das glatt gewebte mit der vorstehend erwähnten Reagenszusammensetzung imprägnierte Gewebe mit einem Nylonmembranfilter mit einer minimalen Porengröße von 0,6 um und einer Dicke von 140 um unter Verwendung einer Stärkepaste verbunden, wodurch ein integrales Laminat einschließlich zwei eng verbundener Lagen hergestellt wurde.
Die Detektionsschicht wurde mit der glatt gewebten Gewebeschicht des integralen Laminats einschließlich der zwei Lagen unter Herstellung eines integralen mehrschichtigen analytischen Elements verbunden.

(2) Immunassay-Arbeitsschritte:

1 ml eines wäßrigen Latex, enthaltend dispergierte Polystyrol-Mikroteilchen mit jeweils einer durchschnittlichen Teilchengröße von 0,8 um und mit menschlichem Immunglobulin IgG in immobilisiertem Zustand wurde in ein Reagensglas gegeben. Die Konzentration der festen Komponenten, die in der Lösung aufgelöst oder dispergiert waren, betrug 10%. In das Reagensglas wurden 100 ul einer Probenflüssigkeit (Blutserum), enthaltend Anti-IgG und 100 ul einer wäßrigen Lösung des Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,0 und enthaltend dispergiertes Anti-IgG, markiert mit alkalischer Phosphatase (nachstehend als "ALP" bezeichnet) gegeben. Das Reagensglas wurde 3 Minuten geschüttelt und dann 2 Minuten still stehengelassen, um die kompetitive Reaktion des Anti- IgGs und des markierten Anti-IgGs mit dem immobilisierten Human-Immunglobulin zu erlauben. 50 ul der Dispersion der Mikroteilchen, enthaltend nicht-gebundenes (freies) ALP- markiertes Anti-IgG wurden aufgenommen. 50 ul der Dispersion wurden auf die Membranfilterschicht des vorstehend erwähnten integralen mehrschichtigen analytischen Elements getropft und bei 37ºC 7 Minuten lang inkubiert. Während der Inkubationsperiode wanderte der nicht-gebundene (freie) ALP-markierte Anti-IgG durch die Membranfilterschicht (poröse Schicht) und drang in die glatt gewebte Gewebeschicht, die die Reagenszusammensetzung enthielt, wodurch das ALP, das den markierten Anti-IgG markierte, das p-Nitrophenylphosphatsalz unter Freigabe von p-Nitrophenol hydrolysierte, welches in die Detektionsschicht wanderte, wodurch eine Farbe in der Detektionsschicht entwickelt wurde.
Unmittelbar nach Beendigung der Inkubation wurde die optische Dichte der entwickelten Farbe in der Detektionsschicht bestimmt, wobei ein sichtbares Licht mit einer mittleren Wellenlänge von 460 nm aus dem PVC-Träger hervortrat und das reflektierte Licht gemessen wurde. Es wurde gefunden, daß die optische Dichte des reflektierten Lichts in enger Beziehung zu der Menge des Anti-IgGs stand, so daß die Menge an Anti-IgG durch colorimetrische Bestimmung bestimmt werden konnte.

Claims

1. Immunassayverfahren zur quantitativen Analyse eines Analyten-Antigens in einer wäßrigen flüssigen Probe, worin eine unbekannte Menge eines Analyten-Antigens mit einem Antikörper kompetitiv mit einer bekannten Menge eines markierten Antigens, das mit einem Marker markiert ist, reagieren gelassen wird, und die Menge des Markers in dem markierten Antigen, das von dem Antikörper nicht gebunden wurde, quantitativ bestimmt wird, umfassend die Stufen:

(a) Zugabe des Analyten-Antigens und des markierten Antigens zu einer wäßrigen Lösung, enthaltend wasserunlösliche Mikroteilchen, auf welchen der Antikörper in immobilisiertem Zustand zurückgehalten wird, so daß die kompetitive Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen dem iminobilisierten Antikörper und dem Analyten-Antigen und dem markierten Antigen stattfindet;

(b) Auftropfen der Reaktionslösung nach Beendigung der kompetitiven Antigen-Antikörper-Reaktion auf einem integralen mehrschichtigen analytischen Element, umfassend

(i) eine obere Poröse Schicht,

(ii) eine mittlere Detektionsschicht, enthaltend ein hydrophiles polymeres Bindemittel, das unter Quellung Wasser absorbiert, und

(iii) einen unteren wasserundurchlässigen und transparenten Träger, wobei die poröse Schicht das markierte Antigen, das an den von den Mikroteilchen immobilisierten Antikörper gebunden ist, einfängt, und das freie markierte Antigen, das an den Antikörper nicht gebunden ist, hindurchdringen läßt, wodurch es zur Detektionsschicht wandert; und

(c) Bestimmen der optischen Dichte der Detektionsschicht, wobei die optische Dichte im Verhältnis zur Menge des Markers, der das markierte Antigen, das zur Detektionsschicht wandert, markiert, steht.

2. Immunassayverfahren zur quantitativen Analyse eines Analyten-Antigens in einer wäßrigen flüssigen Probe, worin eine unbekannte Menge eines Analyten-Antigens mit einem Antikörper kompetitiv mit einer bekannten Menge eines markierten Antigens, das mit einem Marker markiert ist, reagieren gelassen wird, und die Menge des Markers in dem markierten Antigen, das von dem Antikörper nicht gebunden wurde, quantitativ bestimmt wird, umfassend die Stufen:

(a) Zugabe des Analyten-Antigens und des markierten Antigens zu einer wäßrigen Lösung, enthaltend wasserunlösliche Mikroteilchen, auf welchen der Antikörper in immobilisiertem Zustand zurückgehalten wird, so daß die kompetitive Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen dem immobilisierten Antikörper und dem Analyten-Antigen und dem markierten Antigen stattfindet;

(i) eine obere poröse Schicht,

(ii) eine mittlere Farbreagenzschicht, enthaltend ein hydrophiles polymeres Bindemittel und ein Farbreagenz, das mit dem markierenden Marker unter Bildung einer optisch detektierbaren Veränderung reagiert, und

(iii) einen unteren wasserundurchlässigen und transparenten Träger, wodurch die poröse Schicht das markierte Antigen, das an den durch die Mikroteilchen immobilisierten Antikörper gebunden ist, einfängt, und das freie markierte Antigen, das an den Antikörper nicht gebunden ist, hindurchpassieren läßt, wobei es in die Farbreagenzschicht unter Entwicklung einer Farbe wandert, und

(c) Bestimmen der optischen Dichte der Farbreagenzschicht, wobei die optische Dichte im Verhältnis zur Menge des Markers, der das markierte Antigen, das in die Farbreagenzschicht wandert, markiert, steht, wodurch die Menge des Analyten-Antigens, das in der wäßrigen flüssigen Probe enthalten ist, bestimmt wird.

3. Immunassayverfahren zur quantitativen Analyse eines Analyten-Antigens in einer wäßrigen flüssigen Probe, worin eine unbekannte Menge eines Analyten-Antigens mit einem Antikörper kompetitiv mit einer bekannten Menge eines markierten Antigens, das mit einem Marker markiert ist, reagieren gelassen wird, und die Menge des Markers in dem markierten Antigen, das von dem Antikörper nicht gebunden wurde, quantitativ bestimmt wird, umfassend die Stufen:

(i) eine obere poröse Schicht,

(ii) eine mittlere Farbreagenzschicht, die eine zusammengesetzte Schicht ist, umfassend

a) eine Detektionsschicht, enthaltend ein hydrophiles polymeres Bindemittel und

b) eine poröse Schicht, welche auf der Detektionsschicht angebracht ist und ein Farbreagenz enthält, das mit dem markierten Marker unter Bildung einer optisch detektierbaren Veränderung reagiert, und

(iii) einen unteren wasserundurchlässigen und transparenten Träger, wobei die poröse Schicht das markierte Antigen, das an den von den Mikroteilchen immobilisierten Antikörper gebunden ist, einfängt, und das freie markierte Antigen, das an den Antikörper nicht gebunden ist, hindurchpassieren läßt, wodurch es in die Farbreagenzschicht unter Entwicklung einer Farbe wandert, und

(c) Bestimmen der optischen Dichte der Farbreagenzschicht, wobei die optische Dichte im Verhältnis zur Menge des Markers, der das markierte Antigen markiert, das in die Farbreagenzschicht wandert, steht, wodurch die Menge des Analyten- Antigens, das in der wäßrigen flüssigen Probe enthalten ist, bestimmt wird.

4. Immunassayverfahren zur quantitativen Analyse eines Analyten-Antikörpers in einer wäßrigen flüssigen Probe, worin eine unbekannte Menge eines Analyten-Antikörpers mit einem Antigen kompetitiv mit einer bekannten Menge eines markierten Antikörpers, der mit einem Marker markiert ist, reagieren gelassen wird, und die Menge des Markers in dem markierten Antikörper, der nicht an das Antigen gebunden wurde, quantitativ bestimmt wird, umfassend die Stufen

(a) Zugeben des Analyten-Antikörpers und des markierten Antikörpers zu einer wäßrigen Lösung, enthaltend wasserunlösliche Mikroteilchen, auf denen das Antigen in immobilisiertem Zustand zurückgehalten wird, so daß eine kompetitive Antigen- Antikörper-Reaktion zwischen dem immobilisierten Antigen und dem Analyten-Antikörper und dem markierten Antikörper stattfindet;

(i) eine obere poröse Schicht,

(iii) einen unteren wasserundurchlässigen und transparenten Träger, wodurch die poröse Schicht den markierten Antikörper, der an das von den Mikroteilchen immobilisierte Antigen gebunden ist, einfängt, und den freien markierten Antikörper, während das Antigen nicht gebunden ist, hindurchpassieren läßt, wodurch er in die Detektionsschicht wandert, und

(c) Bestimmen der optischen Dichte der Detektionsschicht, wobei die optische Dichte im Verhältnis zur Menge der Markers, der den markierten Antikörper, der in die Detektionsschicht wandert, markiert, steht.

5. Immunassayverfahren zur quantitativen Analyse eines Analyten-Antikörpers in einer wäßrigen flüssigen Probe, worin eine unbekannte Menge eines Analyten-Antikörpers mit einem Antigen kompetitiv mit einer bekannten Menge eines markierten Antikörpers, der mit einem Marker markiert ist, reagieren gelassen wird, und die Menge des Markers in dem markierten Antikörper, der nicht an das Antigen gebunden wurde, quantitativ bestimmt wird, umfassend die Stufen

(a) Zugeben des Analyten-Antikörpers und des markierten Antikörpers zu einer wäßrigen Lösung, enthaltend wasserunlösliche Mikroteilchen, auf denen das Antigen in immobilisiertem Zustand zurückgehalten wird, so daß eine kompetitive Antigen- Antikörper-Reaktion zwischen immobilisiertem Antigen und dem Analyten-Antikörper und dem markierten Antikörper stattfindet;

(i) eine obere poröse Schicht,

(iii) einen unteren wasserundurchlässigen und transparenten Träger, wodurch die poröse Schicht den markierten Antikörper, der an das von den Mikroteilchen immobilisierte Antigen gebunden ist, einfängt, und den freien markierten Antikörper, der an das Antigen nicht gebunden ist, hindurchpassieren läßt, wodurch er in die Farbreagenzschicht unter Entwicklung einer Farbe wandert, und

(c) Bestimmen der optischen Dichte der Farbreagenzschicht, wodurch die optische Dichte im Verhältnis zur Menge des Markers, der den markierten Antikörper, der in die Farbreagenzschicht wandert, markiert, steht, wodurch die Menge des Analyten-Antikörpers, der in der wäßrigen flüssigen Probe enthalten ist, bestimmt wird.

6. Immunassayverfahren zur quantitativen Analyse eines Analyten-Antikörpers in einer wäßrigen flüssigen Probe, worin eine unbekannte Menge eines Analyten-Antikörpers mit einem Antigen kompetitiv mit einer bekannten Menge eines markierten Antikörpers, der mit einem Marker markiert ist, reagieren gelassen wird, und die Menge des Markers in dem markierten Antikörper, der nicht an das Antigen gebunden wurde, quantitativ bestimmt wird, umfassend die Stufen

(i) eine obere poröse Schicht,

a) eine Detektionsschicht, enthaltend ein hydrophiles polymeres Bindemittel, und

b) eine poröse Schicht, die auf der Detektionsschicht angebracht ist und ein Farbreagenz enthält, das mit dem markierenden Marker unter Bildung einer optisch detektierbaren Veränderung reagiert, und

(iii) einen unteren wasserundurchlässigen und transparenten Träger, wobei die poröse Schicht den markierten Antikörper, der an das von den Miktroteilchen immobilisierte Antigen gebunden ist, einfängt, und den freien markierten Antikörper, der an das Antigen nicht gebunden ist, hindurchpassieren läßt, wodurch er in die Farbreagenzschicht unter Entwicklung einer Farbe wandert, und

(c) Bestimmen der optischen Dichte der Farbreagenzschicht, wobei die optische Dichte im Verhältnis zur Menge des Markers, der den markierten Antikörper, der in die Farbreagenzschicht wandert, markiert, steht, wodurch die Menge des Analyten-Antikörpers, der in der wäßrigen flüssigen Probe enthalten ist, bestimmt wird.