DE3785023T3

DE3785023T3 - Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure.

Info

Publication number: DE3785023T3
Application number: DE3785023T
Authority: DE
Inventors: Sakayu Kyoto-Shi Kyoto Shimizu; Yoshifumi Otokuni-Gun Kyoto Shinmen; Hideaki Kyoto-Shi Kyoto Yamada
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1987-01-28
Filing date: 1987-09-30
Publication date: 1998-12-17
Anticipated expiration: 2007-10-01
Also published as: EP0276541A2; ES2039451T5; DE3785023T2; EP0276541B1; EP0276541A3; DE3785023D1; EP0276541B2; ES2039451T3; ATE87332T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verf ahren zur Herstellung von Arachidonsäure und ein Arachidonsäure enthaltendes Lipid.
Bekannte Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure sind solche unter Verwendung von Mikroorganismen, d.h. Penicillium, Aspergillus, Rhodotorula oder Fusarium, wie sie in den geprüften japanischen Patentanmeldungen Nos. 56-19231, 56-19232 und 56-19233 offenbart sind. Die Nachteile dieser bekannten Verfahren sind jedoch eine geringe Ausbeute, lange Fermentationszeit und ein kompliziertes Herstellungsverfahren.
Ein Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure unter Ver wendung eines zur Gattung Mortierella gehörenden Mikroorganismus ist jedoch nicht bekannt.
Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure durch Kultivierung eines zur Gattung Mortierella gehörenden und zur Herstellung von Arachidonsäure fähigen Mikroorganismus in einem Kulturmedium bereitgestellt, um Arachidonsäure oder ein Arachidonsäure enthaltendes Lipid herzustellen, und
Rückgewinnung der Arachidonsäure aus der Kultur oder Rückgewinnung des Lipids aus der Kultur und Rückgewinnung der Arachidonsäure aus dem Lipid,
worin ein Additiv, welches ein Fett ist, dem Medium zugesetzt wird, um die Ausbeute an Arachidonsäure zu erhöhen.
In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure durch Kultivierung eines zur Gattung Mortierella gehörenden und zur Herstellung von Arachidonsäure fähigen Mikroorganismus in einem Flüssigmedium, enthaltend eine aus Glucose, Fructose, Xylose, Saccharose, Maltose, lösliche Stärke, Molasse, Glycerol und Mannitol ausgewählte Kohlenstoffquelle, oder einem mit Wasser ergänzten aus Weizenkleie, Häcksel oder Reiskleie ausgewähltem Festmedium bereitgestellt, um Arachidonsäure oder ein Arachidonsäure enthal tendes Lipid herzustellen, und
Rückgewinnung der Arachidonsäure aus der Kultur oder Rückgewinnung des Lipids aus der Kultur und Rückgewinnung der Arachidonsäure aus dem Lipid,
worin ein Additiv, welches Octadecan, Fettsäure, ein Salz der Fettsäure oder eine Kombination davon ist, dem Medium zugesetzt wird, um die Ausbeute an Arachidonsäure zu erhöhen.
In einer dritten Ausführungsform der Erfindung wird die Verwendung eines Fettes als ein Additiv zu dem Kulturmedium zum Erhöhen der Ausbeute an Arachidonsäure in einem Verfahren durch
Kultivierung eines zur Gattung Mortierella gehörenden und zur Herstellung von Arachidonsäure fähigen Mikroorga nismus bereitgestellt, wobei ein eine Arachidonsäure oder ein Lipid einer Arachidonsäure enthaltendes Kulturprodukt erhalten wird, und
Rückgewinnung der Arachidonsäure oder deren Lipids aus dem Produkt.
Gemäß einer vierten Ausführungsform der Erfindung wird die Verwendung von Octadecan, einer Fettsäure oder deren Salz oder eine Kombination davon als ein Additiv zu dem Kulturmedium bereitgestellt, um die Ausbeute an Arachidonsäure in einem Verfahren durch
Kultivierung eines zur Gattung Mortierella gehörenden und zur Herstellung von Arachidonsäure fähigen Mikroorganismus in einem Kulturmedium, welches ein Flüssigmedium, enthaltend eine aus Glucose, Fructose, Xylose, Saccharose, Maltose, lösliche Stärke, Molasse, Glycerol und Mannitol ausgewählte Kohlenstoffquelle, oder ein mit Wasser ergänztes aus Weizenkleie, Häcksel oder Reiskleie ausgewähltes Festmedium ist, zu erhöhen, wobei ein eine Arachidonsäure oder ein Lipid einer Arachidonsäure enthaltendes Kulturprodukt erhalten wird, und
Rückgewinnung der Arachidonsäure oder deren Lipids aus dem Produkt.
Gemäß vorliegender Erfindung kann als Erzeuger-Mikro- Organismus jeder zur Gattung Mortierella gehörender und zur Herstellung von Arachidonsäure fähiger Mikroorganismus verwendet werden. Zum Beispiel können Mortierella elonaata IFO 8570, Mortierella exipua IFO 8571 und Mortierella hygrophila IFO 5941 verwendet werden. Diese Gattungen sind alle am Osaka Institute for Fermentation, 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan, hinterlegt und der Öffentlichkeit ohne jede Beschränkung zugänglich.
Überdies kann der neue Stamm Mortierella elonaata SAM 0219 eingesetzt werden. Dieser Stamm ist erst kürzlich aus dem Boden isoliert und von den vorliegenden Erfindern identifiziert worden und am Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (FRL), Higashi 1-1-3, Yatabe-cho, Tuskuba-gun, Ibaraki-ken, Japan, als FERM P-8703 am 19. März 1986 hinterlegt und zur Internationalen Hinterlegung gemäß dem Budapester Vertrag als FERM BP-1239 am 22. Dezember 1986 überführt worden.
Die vorstehend erwähnte neue Gattung SAM 0219 (FERM BP-1239) hat die nachfolgenden taxonomischen Eigenschaften:

Kultureigenschaften auf verschiedenen Kulturmedien

Kulturbedingung: 25ºC im Dunkeln

1. Malzextrakt-Agar

Die Kolonien wachsen schnell, erreichen einen Durchmesser von 28 bis 31 mm in 2 Tagen und einen Durchmesser von 65 bis 72 mm in 5 Tagen; die Kolonien sind gelappt; die Bildung eines Luftmycels ist gering; die Sporulation ist gut; die Sporangiophoren bilden sich aus den Lufthyphen; das Mycel hat einen knoblauchartigen Geruch.

2. Kartoffeldextrose-Agar

Die Kolonien wachsen schnell, erreichen einen Durchmesser von 27 bis 31 mm in 2 Tagen und einen Durchmesser von 75 bis 80 mm in 5 Tagen; die Kolonien bilden ein rosettenförmiges Muster dichter Lappen; viele Luftmycele werden in der Mitte der Kolonie gebildet; die Rückseite der Kolonie ist von gelblich-weißer oder gelber Farbe; die Sporulation ist gering; das Mycel hat einen ziemlich starken knoblauchartigen Geruch.

3. Czapek's-Agar

Die Kolonien wachsen mäßig schnell, erreichen einen Durchmesser von 22 bis 24 mm in 2 Tagen und einen Durchmesser von 50 bis 53 mm in 5 Tagen; die Bildung von Luftmycelen ist gering; gelegentlich haften die Lufthyphen fest aneinander; die Sporulation ist reichlich; das Mycel hat einen knoblauchartigen Geruch.
4. LCA-Agar (hergestellt gemäß Koichiro Miura und Mitsuyo Y. Kudo, "An agar-medium for aquatic Hyphomycetes", Transactions of the Mycological Society of Japan, Vol. 11, Seiten 116-118, 1970)
Die Kolonien wachsen schnell, erreichen einen Durchmesser von 27 bis 29 mm in 2 Tagen und einen Durchmesser von 64 bis 66 mm in 5 Tagen; die Kolonien sind gelappt; die Bildung von Luftmycelen ist gering, ausgenommen in der Mitte der Kolonie; die Sporulation ist gut; Sporangiophoren bilden sich aus den Lufthyphen; das Mycel hat einen knoblauchartigen Geruch.

Mikroskopieuntersuchung

Sporangiophoren, Art der Verzweigung der Sporangiophoren, Sporangium, Sporangiosporen oder dergleichen wurden mikroskopisch von mikroskopischen Präparaten und die Kolonie per se von verschiedenen Medien untersucht.
Eine Sporangiophore läuft spitz aus und hat eine Länge von 87,5 bis 320 um, eine Breite von 3 bis 7,5 pm an der Wurzel und eine Breite von 1,0 bis 2,5 pm an der Spitze. Eine Sporangiophore verzweigt sich oft an der Wurzel. Ein Sporangium ist von kugelförmiger Form, hat einen Durchmesser von 15 bis 30 um, enthält viele Ascosporen in sich und hat eine unklare Farbe nach dem Ablösen der Sporangiosporen. Eine Sporangiospore ist von elliptischer oder, seltener, von nierenförmiger Form, hat eine glatte Oberfläche und eine Größe von 7,5 bis 12,5 x 5 bis 7,5 um. Eine ziemlich große Anzahl an Chlamydosporen werden gebildet. chlamydosphoren treten einzeln oder, seltener, zusammen in einer kettenförmigen Form auf. Gelegentlich erscheinen einige Mycele an der Ecke der Chlamydosphoren.
Die Chlamydosphore ist von elliptischer oder subspherischer Form und hat eine Größe von 12,5 bis 30 x 7,5 bis 15 um oder einen Durchmesser von 12,5 bis 15 pm. Zygosporen werden nicht beobachtet.

Physiologische Eigenschaften

Optimale Wachstumsbedingung:
pH: 6 bis 9
Temperatur: 20ºC bis 30&sup0;c
Wachstumsbereich:
pH: 4 bis 10
Temperatur: 5cc bis 40ºC
Auf der Basis der vorstehend erwähnten taxonomischen Eigenschaften und gemäß J.A. von Arx ("The Genera of Fungi Sporulating in Pure Culture", 3. Ausgabe, J. Cramer, 1981) und K.H. Domsch, W. Gams und T.H. Anderson ("Compendium of Soil Fungi", Academic Press, 1980) wird von dem Stamm SAM- 0219 der vorliegenden Erfindung angenommen, daß er ein zur Gattung Mortierella gehörender Pilz ist, da ein Sporangium an einer Spitze einer Sporangiophore gebildet wird, das Sporangium keine Collumnella, die Sporangiospore keinen Anhang und das Mycel einen knoblauchartigen Geruch hat.
Aus diesem Grund wurden die taxonomischen Eigenschaften des Stammes der vorliegenden Erfindung mit denen einer bekannten Spezies der Gattung Mortierella gemäß W. Gams ("A key to the species of Mortierella", Persoonia 9, Seiten 381-391, 1977) verglichen. Als Ergebnis und unter Berücksichtigung, daß die Kolonie nicht samtig ist, das Mycel einen knoblauchartigen Geruch, eine Sporangiophore eine Länge von 87,5 bis 320 um hat und sie sich nur in ihrem unteren Bereich und nicht razemös verzweigt, und ein Sporangium in sich viele Sporangiosporen enthält, wurde festgestellt, daß der fragliche Stamm zur Gattung Mortierella, Unterart Mortierella, Sektion Hygrophila, gehört. Die Sektion Hygrophila beinhaltet 22 Arten. Gemäß einem Vergleich des Stammes der vorliegenden Erfindung mit diesen 22 Arten ist der Stamm der vorliegenden Erfindung ähnlich Mortierella zychae, Mortierella elongatula und Mortierella elongata.
Auf dieser Grundlage wurde der Stamm der vorliegenden Erfindung mit den vorstehend erwähnten drei Stämmen unter Bezugnahme auf K.H. Domsch, W. Gams und T.H. Anderson ("Compendium of Soild Fungi", Academic Press, 1980), W. Gams ("Some New or Noteworthy Species of Mortierella", Persoonia 9, Seiten 111-140, 1976) G. Linnemann ("Mortierella Coemans 1863"), H. Zyche und R. Siepmann ("Mucorales Eine Beschreibung Aller Gattungen und Arten dieser Pilzgruppe", S. 155-241, J. Cramer-Verlag, 1965) verglichen. Der Stamm der vorliegenden Erfindung ist völlig verschieden von Mortierella zvchae sowohl in Länge und Breite der Sporangiophore an der Basis und der Größe des Sporangiums. Überdies ist der Stamm der vorliegenden Erfindung verschieden von Mortierella elonaatula in Form und Größe der Sporangiospore. Der Stamm der vorliegenden Erfindung ist verschieden von Mortierella elongata, indem die Sporangiophore kürzer ist, die Chlamydosphore elliptisch oder von subglobulärer Form ist, Chlamydosporen selten kettenförmig miteinander verbunden sind und nur eine geringe Anzahl von strahlenförmig ausgehenden Hyphen hervorbringen. Die vorliegenden Erfinder schlossen jedoch, daß diese Unterschiede zwischen dem vorliegenden Stamm und Mortierella elongata nicht ausreichend sind, um den vorliegenden Stamm von Mortierella elongata zu unterscheiden, und identifizierten so den Stamm der vorliegenden Erfindung als Mortierella elongata und bezeichneten ihn als Stamm SAM 0219.
Sporen, Mycele oder eine Vorkultur werden als ein Inokulum zum Kultivieren des vorliegenden Stammes verwendet. Das verwendete Medium kann ein Flüssig- oder Festmedium sein. Ein Flüssigmedium enthält als eine Kohlenstoffquelle zum Beispiel Glucose, Fructose, Xylose, Saccharose, Maltose, lösliche Stärke, Molasse, Glycerol oder Mannitol. Stickstoffquellen beinhalten organische Substanzen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Casaminosäure, Corn-Steep- Liquor, und anorganische Substanzen wie Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und dergleichen. Wenn nötig, können anorganische Salze wie Phosphatsalze, Magnesium sulfat, Eisensulfat und Kupfersulf at, und Vitamine einem Medium zugesetzt werden. Die Konzentration dieser Komponenten wird so ausgewählt, daß jede Komponente das Wachstum des verwetideten Mikroorganismus nicht nachteilig beeinflußt. Praktischerweise beträgt die Konzentration der Kohlenstoffquelle 0,1 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise 1 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Mediums. Die Konzentration der Stickstoffquelle beträgt 0,01 bis 5 Gew.-%, vorzugsweise 0,1 bis 2 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Mediums.
Zur Steigerung der Herstellung von Arachidonsäure werden zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Mediumbestandteilen Octadecan, Fettsäuren oder deren Salze oder Fette dem Medium in einer Menge von 0,01% bis 20% zugesetzt. Mehr als zwei Arten dieser Additive können zugesetzt werden.
Octadecan wird dem Medium vorzugsweise zu Beginn der Kultivierung und Fettsäuren oder deren Salze vorzugsweise zu Beginn und/oder während der Kultivierung zugesetzt. Wenn ein solches Additiv während des Kultivierens verwendet wird, wird es auf einmal, schrittweise oder kontinuierlich zugesetzt.
Die Kultivierungstemperatur reicht von 5ºC bis 40ºC, vorzugsweise 20ºC bis 30ºC. Der pH-Wert des Mediums beträgt 4 bis 10, vorzugsweise 6 bis 90
Die Kultivierung wird vorzugsweise unter Belüftung und/oder Bewegung, durch Schütteln bei einem Flüssigmedium oder durch Stehenlassen durchgeführt und gewöhnlicherweise während 2 bis 10 Tagen.
Wenn die Kultivierung mit einem Festmedium durchgeführt wird, ist das Festmedium aus mit Wasser in einer Menge von 50 bis 100 Gew.-%, bezogen auf Weizenkleie, Häcksel oder Reiskleie, versetzter Weizenkleie, Häcksel oder Reiskleie zusammengesetzt.
Wenn nötig, wird das Medium mit einer geringen Menge einer Stickstoffquelle, anorganischen Salzen und/oder weniger wichtigen Nährstoffen versetzt.
Die Kultivierung wird bei einer Tempratur von 5ºC bis 40ºC, vorzugsweise 20ºC bis 30ºC, während 3 bis 14 Tagen durchgeführt.
Während des Kultivierens werden Arachidonsäure enthaltende Lipide intrazellulär akkumuliert. Bei Einsatz eines Flüssigmediums wird die Arachidonsäure aus den kultivierten Zellen gemäß dem nachfolgenden Verfahren wiedergewonnen.
Nach dem Kultivieren werden kultivierte Zellen aus der Kul turbrühe mittels herkömmlicher Verfahren wie Filtration oder Zentrifugation gesammelt, die Zellen mit Wasser gewaschen und vorzugsweise die gewaschenen Zellen getrocknet. Das Trocknen wird durch zum Beispiel Lyophilisation oder Lufttrocknen durchgeführt. Die getrockneten Zellen werden mit einem organischen Lösungsmittel oder einer Mischung davon, vorzugsweise unter Stickstoffatmosphäre, behandelt, um ein Arachidonsäure enthaltendes Lipid zu extrahieren. Das organische Lösungsmittel oder dessen Mischung sind zum Beispiel Ether wie Ethylether, Kohlenwasserstoffe wie Hexan, Alkohole wie Methanol oder Ethanol, halogenierte Kohlenwasserstoffe wie Chloroform oder Dichlormethan, Petrolether sowie eine Mischung aus Chloroform, Methanol und Wasser oder eine Kombination aus Methanol und Petrolether. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels wird ein kon zentrierte Arachidonsäure enthaltendes Lipid erhalten.
Alternativ können naße Zellen der Extraktion unterworfen werden. In diesem Fall wird ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel wie Methanol oder Ethanol oder ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, das das wassermischbare Lösungsmittel und Wasser oder andere organische Lösungsmittel enthält, verwendet. Das Extraktionsverfahren ist das gleiche wie vorstehend für getrocknete Zellen beschrieben.
Das so erhaltene Lipid enthält Arachidonsäure in Form einer Lipidverbindung wie Fett. Obwohl die Arachidonsäure in Form der freien Säure isoliert werden kann, ist es bevorzugt, sie in Form eines Esters mit einem niederen Alkohol, zum Beispiel als Methylarachidonat, zu isolieren. Durch die Umwandlung der Arachidonsäure in solch einen Ester kann sie leicht von den anderen Lipidkomponenten und von anderen, während des Kultivierens gebildeten Fettsäuren, wie Palmitinsäure, Oleinsäure, Linolensäure und dergleichen, abgetrennt werden, die auch zur gleichen Zeit, zu der die Arachidonsäure verestert wird, verestert werden. Um Methyl arachidonat zu erhalten, wird zum Beispiel das wie vorstehend beschrieben hergestellte Lipid mit 5 bis 10% Salzsäurelösung in absolutem Methanol oder einer 10 bis 50% BF&sub3;-Lösung in Methanol während 1 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur behandelt.
Die so erhaltene Mischung wird mit einem organischen Lösungsmittel wie Hexan, Ethylether oder Ethylacetat extrahiert, um Methylarachidonat rückzugewinnen. Anschließend wird der Extrakt über wasserfreiem Natriumacetat getrocknet und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck abdestilliert, wobei ein Rückstand erhalten wird, der hauptsächlich eine Fettsäuremischung enthält. Die Mischung enthält, zusätzlich zu der Verbindung Methylarachidonat, Methylpalmitat, Methylstearat, Methyloleat und dergleichen.
Aus dieser Mischung wird Methylarachidonat durch Säulenchromatographie, Niedertemperaturkristallisation, einem Hamstoffadduktverfahren oder einer Kombination dieser Verfahren isoliert
Das isolierte Methylarachidonat wird anschließend mit Alkali hydrolysiert und mit einem organischen Lösungsmittel wie Ethylether, Ethylacetat oder dergleichen extrahiert, wobei die freie Arachidonsäure erhalten wird.
Alternativ kann Arachidonsäure ohne Umwandlung in ihren Methylester durch Alkalolyse mit zum Beispiel 5% Natriumhydroxid bei Raumtemperatur während 2 bis 3 Stunden mit nachfolgender Extraktion der Fettsäuren aus dem Alkalolyseprodukt und Isolierung der gewünschten Arachidonsäure erhalten werden.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Beipiele näher erläutert.

Beispiel 1

20 ml eines 2% Glucose, 1% Hefeextrakt und 0,2% Tween 20 sowie ein Additiv, d.h. 0,5% Octadecan oder verschiedene Arten eines Natriumsalzes einer in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgelisteten Fettsäure oder Lipids, enthaltenden Mediums (pH 6,0) wurden in Erlenmeyer-Kolben mit einem Volumen von jeweils 100 ml eingebracht und die Kolben bei 120ºC während 20 Minuten autoklaviert. Mortierella elongata SAM 0219 (FERM BP-1239) wurde in das Medium geimpft und anschließend während 5 Tagen bei 28ºC mit Schüttelrotation bei 200 Upm kultiviert. Die Kulturbrühen wurden getrennt filtriert, um Zellen zu erhalten. Die Zellen wurden dann vollständig mit Wasser gewaschen und lyophilisiert, um getrocknete Zellen zu erhalten. Die Zellen wurden mit einem Gemisch aus Chloroform, Methanol und Wasser gemäß dem Bligh and Dyer's Einphasenextraktionsverfahren extrahiert, um ein Gesamtlipid zu erhalten. Das Lipid wurde mit einem Gemisch aus Methanol und Salzsäure (95:5) bei 20ºC während 3 Stunden behandelt, um die Arachidonsäure zu verestern. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethylether extrahiert, um ein Gemisch aus Fettsäuremethylestern zu erhalten.
Die Mischung wurde durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Octadecylsilan und Elution mit 95%-iger Acetonitrillösung getrennt, um Methylarachidonat enthaltende Fraktionen zu erhalten. Nach Vereinigung der Fraktionen wurde das Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer abdestilliert, um gereinigtes Methylarachidonat zu erhalten. Die so erhaltene Methylarachidonatzubereitung wurde mit einer handelsüblich erhältlichen Methylarachidonatzubereitung mittels Gaschromatographie, High-Performance-Liquid Chromatographie und Massenspektrometrie verglichen. Beide Zubereitungen zeigten dieselben Ergebnisse, was zeigte, daß die gemäß Beispiel 1 hergestellte Zubereitung Methylarachidonat ist.
Das Gewicht der getrockneten Zellen, die Menge an Gesamtlipid, die Menge an Gesamtfettsäuremethylester, der Gehalt an Methylarachidonat und die Menge an Methylarachidonat pro Kulturbrühe für jedes zugesetzte Additiv sind der nachfolgenden Tabelle 1 zu entnehmen. Tabelle 1
Wie Tabelle 1 zu entnehmen ist, erhöht die Zugabe von Octadecan, Salzen von Fettsäuren und Lipid die Produktion von Arachidonsäure um 10 bis 80% bezüglich der kein Additiv enthaltenden Kontrolle.

Beispiel 2

20 ml eines 2% Glucose und 1% Hefeextrakt enthaltenden Mediums wurden in 100-ml-Erlenmeyer-Kolben eingebracht und die Kolben bei 120ºC während 20 Minuten autoklaviert. Mortierella elongata SAM 0219 (FERM BP-1239) wurde in das Medium geimpft und anschließend bei 28ºC während 4 Tagen inkubiert. Nach Zugabe von 100 mg verschiedener Arten von Natriumsalzen einer Fettsäure oder eines Lipids in jeden der Kolben wurde die Inkubation bei 28ºC für weitere 2 Tage fortgesetzt. Die Kulturen wurden getrennt filtriert, um Zellen zu erhalten. Die Zellen wurden dann der Extraktion, Hydrolyse und Methylveresterung gemäß der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise unterworfen. Die Menge an Methylarachidonat pro getrockneten Zellen und pro Kulturbrühe für jedes Additiv sind der nachfolgenden Tabelle 2 zu entnehmen. Tabelle 2
Wie Tabelle 2 zu entnehmen ist, erhöht die Zugabe von Salzen von Fettsäuren und Lipiden die Produktion von Arachidonsäure um 10 bis 60% bezüglich der kein Additiv enthaltenden Kontrolle.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure durch

Kultivierung eines zur Gattung Mortierella gehörenden und zur Herstellung von Arachidonsäure in einem Kulturmedium fähigen Mikroorganismus, um Arachidonsäure oder ein Arachidonsäure enthaltendes Lipid herzustellen, und Rückgewinnung der Arachidonsäure aus der Kultur oder Rückgewinnung des Lipids aus der Kultur und Rückgewinnung der Arachidonsäure aus dem Lipid,

worin ein Additiv, welches ein Fett ist, dem Medium zugesetzt wird, um die Ausbeute an Arachidonsäure zu erhöhen.

2. Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure durch

Kultivierung eines zur Gattung Mortierella gehörenden und zur Herstellung von Arachidonsäure -fähigen Mikroorganismus in einem Flüssigmedium, enthaltend eine aus Glucose, Fructose, xylose, Saccharose, Maltose, lösliche Stärke, Molasse, Glycerol und Mannitol ausgewählte Kohlenstoffquelle, oder einem mit Wasser ergänzten aus Weizenkleie, Häcksel oder Reiskleie ausgewähltem Festmedium, um Arachidonsäure oder ein Arachidonsäure enthaltendes Lipid herzustellen, und

Rückgewinnung der Arachidonsäure aus der Kultur oder Rückgewinnung des Lipids aus der Kultur und Rückgewinnung der Arachidonsäure aus dem Lipid,

worin ein Additiv, welches Octadecan, eine Fettsäure, ein Salz der Fettsäure oder eine Kombination davon ist, dem Medium zugesetzt wird, um die Ausbeute an Arachidonsäure zu erhöhen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß

das Additiv dem Medium am Beginn der Kultivierung zugesetzt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Fett-, Fettsäure- oder Fettsäuresalz-Additiv dem Medium während der Kultivierung zugesetzt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein aus der Gruppe bestehend aus Mortierella elongata IFO 8570, Mortierella elonaata SAM 0219 (FERM BP-1239), Morteriella exigua IFO 8571 und Mortierella hygrophila IFO 5941 ausgewählter Mikroorganismus eingesetzt wird.

6. Verwendung eines Fettes als ein Additiv zu dem Kulturmedium, um die Ausbeute an Arachidonsäure in einem Verfahren durch

Kultivierung eines zur Gattung Mortierella gehörenden und zur Herstellung von Arachidonsäure fähigen Mikroorganismus zu erhöhen, wobei ein eine Arachidonsäure oder ein Lipid der Arachidonsäure enthaltendes Kulturprodukt erhal ten wird, und

Rückgewinnung der Arachidonsäure oder deren Lipids aus dem Produkt.

7. Verwendung eines Octadecans, einer Fettsäure oder ihres Salzes oder einer Kombination davon als ein Additiv zu dem Kulturmedium, um die Ausbeute an Arachidonsäure in einem Verfahren durch

Kultivierung eines zur Gattung Mortierella gehörenden und zur Herstellung von Arachidonsäure fähigen Mikroorganismus zu erhöhen, in einem Kulturmedium, welches ein Flüssigmedium, enthaltend eine aus Glucose, Fructose, Xylose, Saccharose, Maltose, lösliche Stärke, Molasse, Glycerol und Mannitol ausgewählte Kohlenstoffquelle ist, oder ein mit Wasser ergänztes aus Weizenkleie, Häcksel oder Reiskleie ausgewähltes Festmedium ist, wobei ein eine Arachidonsäure oder ein Lipid der Arachidonsäure enthaltendes Kuiturprodukt erhalten wird, und Rückgewinnung der Arachidonsäure oder deren Lipids aus dem Produkt.

8. Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Arachidonsäure als Ester aus dem Kulturmedium rückgewonnen wird.