JPS6314696A - ビスホモ―γ―リノレン酸及びこれを含有する脂質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は醗酵法によるビスホモ−γ−リノレン酸の製造
方法に関する。

〔従来技術〕

ビスホモ−γ−リノレン酸（エイコサトリエン酸）は魚
油、海藻１勺の構成脂肪酸のひとつとして存在すること
が知られている。しかしながら、その含量はわずかであ
るため単離精製品はたいへん高価なものとなっており、
生産効率の高い製法の開発が強く望まれている。なお、
発酵法によるビスホモ−γ−リノレン酸の製造方法は知
られていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、従来ビスホモ−γ−リノレン酸を生産する能
力を有することが知られていなかったモルティエレラ属
微生物を使用して、安価な常用の培地を用いて、高収率
で、しかも単純な工程でビスホモ−γ−リノレン酸を製
造することができる方法を提供しようとするものである
。

〔問題点を解決するための手段〕

上記の目的はモルティエレラ属に属しビスホモ−γ−リ
ノレン酸生産能を有する微生物を培養してビスホモ−γ
−リノレン酸又はビスホモ−γ−リノレン酸を含有する
脂質を生成せしめ、そしてビスホモ−γ−リノレン酸を
採取することを特徴とするビスホモ−γ　−リ′ルン酸
の製造方法により達成さ焚る。

〔具体的な説明〕

本発明においては、こしルティエレラ属に属し、ビスホ
モ−γ−リノレン酸生産能を有する微生物であれば、す
べて使用することができる。このような微生物として、
例えば；［ルティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒ
ｐｊｌ−ａ　を山＋ｎ−Ｂａ４＋１３　ＩＰＯ８５７０
、モルティエレラ・エキシグアＱｊ４２ｒ−１ｊａｒＬ
！１ｌａＪ料且針ＩＦＯ８５７１、モルティコーレラ・
ヒゲ１１フイラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ｈ３３ｒｏ
ｐｊ＋ｉ−ｊ−ｇ）ＩＰｏ　５９４１等を挙げることが
できる。これらの菌株はいずれも、財団法人醗酵研究所
からなんら制限なく人手することができる。

また、本発明者らが１壌から分離した菌株モルティエレ
ラ・エロンガタＳＡＭ　０２１９　（ｍ工研菌寄第８７
０３号）を使用することもできる。

次に、上記の菌株ＳＡＭ　０２１９　（微工研菌寄第８
７０３号）の菌学的性質を記載する。

各培地における生育状態 培養条件＝２５℃、暗黒下 １、麦芽エキス寒天培地 コロニーの生育は良好、培養２日目のコロニーは直径２
８−３１ｍｍ　、培養５日目のコロニーは直径６５−７
２ｎ＋ｎ＋　、コロニーは決裂状を呈する、気菌糸の発
達は乏しい、胞子のう胞子の形成は良好、胞子のう柄は
気菌糸より生じる、ニンニクに類似した臭いあり。

２、バレイショ・ブドウ糖寒天培地 コロニーの生育は良好、培養２日目のコロニーは直径２
７−３１ｍｍ　、培養５日目のコロニーは直径７５−８
０ｍｍ　、コロニーはハラの礼状を呈する、コロニー中
心部で気菌糸が著しく発達する、コロニーの裏側は黄白
色あるいは黄色、胞子のう胞子の形成は不良、ニンニク
に類似した臭いあり、臭いはやや強い。

３、　ツァヘソク寒天培地 コロニーの生育は比較的良好、培養２日目のコロニーの
直径は２２−２４ｍｍ　、培養５日目のコロニーの直径
は５０−５３ｍｍ、気菌糸の発達は乏Ｕい、気菌糸が密
にからまりあうことがある。

胞子のう胞子の形成は非常に良好、胞子のう柄は気菌糸
より生じる。ニンニクに類似した臭いあり。

４、ＬＣＡ寒天培地（培地の調製方法は、三浦宏一部、
工藤光代著“水生不完全菌のための一寒天培地”日本画
学会会報１１巻、１１’６−１１８頁、１９７０年に従
った） シロニーの生育は良好、培養２日目のコロニーの直径は
２７２７−２４）　、培ａ：５１−１目のコロニーは直
径６４６４−６（ｉ、二重に−は決裂状を呈する、気菌
糸の兇達はコロニーの中心部を除いて乏しい、胞子のう
胞子の形成番、１良好。胞子のう柄は気菌糸より牛しる
。ニンニクに類似した臭いあり。

検鏡観察 各培地の検鏡標本およびコロニーの直接検鏡で、胞子の
う柄、胞子のう柄の分岐の仕方、胞子のう、胞子のう胞
子などを観察した。

胞子のう柄は長さ８７．’５−３２０μｍ、幅は基部で
３−７．５μｍ、先端に向けて先細り、１．０−２．５
μｍとなる。胞子のう柄はしばしば基部で分岐する。胞
子のうば球形、直径１５−３０μｍ、内部に多数の胞子
のう胞子を含む、離脱後やや不明瞭なカラーを残す。胞
子のう胞子は楕円形、希に腎臓形、表面は平滑、７．５
−１２．５ｘ　５−７．５μｍ、厚膜胞子は比較的多数
形成される。単独、希に連鎖することがある。時に数本
の菌糸を周囲に出すことがある。楕円形また亜球形、１
２．５−３０ｘ　７．５−１５μｍ０または直径１２．
５−１５８ｍ０接合胞子は観察されない。

３、生理的性質 最適生育条件 ｐ　Ｈ：　６−９ 温度＝２０−３０℃ 生育の範囲 ｐＨ：４−１０ 温度：５−４０℃ 以上の菌学的諸性質に従い本発明の菌株（ＳＡＭ−０２
１９）の分類学的イ！’７．　ｉＦ／の検索を、Ｊ、Ａ
、ｖｏｎ　Ａｒｘ。

”Ｔｈｅ　Ｇｅｎｅｒａ　ｏｆ　Ｆｕｎ１４ｉ　　ｓｐ
ｏｒｕｌａｔｉｎｇｉｎ　ＰｕｒｅＣｕｌｔｕｒｅ、”
　３ｒｄ　ｅｄ、、　、１．Ｃｒａｍｅｒ＋ｌ９１（Ｌ
およびに、Ｈ。

Ｄｏｍｓｃｈ、　　Ｗ、Ｇａｍ５．＆　　’Ｉ’、１１
．八ｎｄｅｒｓｏｎ、”Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　　ｏｆ
Ｓｏｉｌ　Ｆｕｎｇｉ、”＾ｃａｄ０ｍｉｃ　ｌ’ｒｅ
ｓｓ、　１９８０に準拠して求めると、胞子のう柄の先
端に１状の胞子のうを形成する、柱軸を１．１だない、
胞−ｒ−のう胞子に付属糸がない、培養菌糸がこ゛−ン
ニクに類似した臭いを発する、ということから本菌株は
ｊ９の■旦鎮−属に属する真菌であるとｈえられる。

そこで、Ｗ、Ｇａｍ５．　”＾ｆｌａｙ　ｔｏ　ｔｌｕ
＋　５ｐｅｃｉｅｓ　ｏｆＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ、”
　ｒ’ｃｒｓｏｏｎｉａ　５−　、　３８］−３９１、
１９７７準拠して既知のＭｏｒｔ、ｉ３；−稠１１ａ−
属の種類と菌学的諸性質を比較すると、本菌株はコ［に
一がビロード状でない、培養菌糸がニンニクに類似した
臭いを発つする、胞子のう柄が長さ８７．５−３２０μ
ｍで分岐は下部でのみ生じ、葡萄の房状に分岐しない、
胞子のうば内部に多数の胞子のう胞子を含む、というこ
とからＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ属Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌ
ａ亜属（Ｓｕｇｅｎ、　Ｍｏｒｔｉｅｒｅ旦鱒−↓Ｉｙ
−ｇｒｏｐ、ｈ　ｉ　Ｉａ節（Ｓｅｃｔ。

Ｈｙｚｏｐ　ｈ　ｉ　Ｉ　ａ　）に含まれると考えられ
る。

打肛叩１ハ節には２２種が含まれている。本菌株とこれ
ら２２種と菌学的諸性質を比較すると、本菌株は耳躾旦
町ｅｌｌａ　ｚｙ３知見」膣中匪鈍国比、およびルＡ頃
■傾の３種に類似すると考えられる。そこで、Ｋ、１１
．Ｄｏｍｓｃｈ、　Ｗ、Ｇａｍ５．＆　Ｔ、−Ｈ，八ｎ
ｄｅｒｓｏｎ。

Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　５ｏｉｌ　Ｆｕｎｇｉ、
”　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

１９８０、Ｗ、Ｇａｍ５．　”Ｓｏｍｅ　ｎｅｗ　ｏｒ
　ｎｏｔｅｉｖｏｒｔｈｙ　５ｐｅｃｉｅｓｏｆ　Ｍｏ
ｒｔｉｅｒｅｌｌａ、”　Ｐｅｒｓｏｏｎｉａ９　、１
１１−１４０．１９７７）、およびＧ、Ｌｉｎｎｅｍａ
ｎｎ、”Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　Ｃｏｅｍａｎｓ　１
８６３．”Ｈ，Ｚｙｃｈａ　＆　Ｒ，Ｓｉｅｐｍａｎｎ
、　”Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ　Ｅｉｎｅ　Ｂｅｓｃｈ−ｒ
ｅｉｂｕｎｇ　　Ａｌｔｅｒ　　Ｇａｔｔｕｎｇｅｎ　
　ａｎｄ　　Ａｒｔｅｎ　　ｄｉｅｓｅｒ　　Ｐｉｌｚ
−ｇｒｕｐｐｅ、”ｐｐ、１５５−１４０．　Ｊ、Ｃｒ
ａｍｅｒ、１９６９を参考にして、本菌株とこれら３種
と菌学的諸性質を比較した。本菌株は、ＬＨ薊並とは胞
子のう柄の長さと基部の幅、胞子のうの大きさで、明瞭
に異なる。

Ｌ１姐註ｔｕｌａとは胞子のう胞子の形態と大きさで、
明瞭に異なる。Ｌ吋卯計圏とは胞子のう柄がやや短い、
厚膜胞子の形態が楕円形または細球形でときに連鎖する
ことがあり、さらに厚膜胞子がときに数本の菌糸を周囲
に出す、という点で異なるが、本発明者らはこのような
差異は本菌株をＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　　、ｅｌｏ「
！８ａ、ｊａと別種であるとするには十分でないと判断
した。そこで、本発明者らは本菌株をＭｏｒｔｉｅｒｅ
ｌｌａ　ｃｌ−ｐｇＨａｔａ　ＳＡＭ　０２１９と同定
した。ＳＡＭ　０２１９株は昭和６１年３　Ｊｌ　１．
９日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（Ｆ
ＲＩ）に受託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−８７０３として寄託さ
れている。

本発明に使用される菌株を培養する為には、その菌株の
胞子、菌糸又は予め培養して得られた前培養液を、液体
培地又は固体培地に接種し培養する。液体培地の場合に
、炭素源としてはグルコース、フラクトース、−１−シ
ｌ」−ス、サッカロース、マルトース、可溶性デンプン
、糖蜜、グリセロール、マンニトール等の一般的に使用
されているものがいずれも使用できるが、これらに限ら
れるものではない。窒素源としてはペプトン、酵母エキ
ス、麦芽エキス、肉ニートス、カリ′ミノ酸、コーンス
テイブリカｒ等の天然窒素源の他に、尿素等の有機窒素
源、ならびに硝酸すＩ・１Ｊウム、硝酸アンモニウム、
硫酸アンモニウム等の無機窒素源を用いることができる
。この他必要に応じリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸
鉄、硫酸銅等の無機塩及びビタミン等も微量栄養源とし
て使用できる。これらの培地成分は微生物の生育を害し
ない濃度であれば特に制限はない。実用上一般に、炭素
源は０．１〜３０重量％、好ましくは１〜１０重量％、
窒素源は０．０１〜５重量％、好ましくは０，１〜２重
量％の濃度とするのが良い。又、培養温度は５〜４０℃
、好ましくは２０〜３０℃とし、培地のｐＨは４〜１０
、好ましくは６〜９として、通気撹拌培養、振盪培養、
又は静置培養を行なう。培養は通常２〜１０日間行う。

固体培地で培養する場合は、固形物重量に対して５０〜
１００重量％の水を加えたふすま、もみがら、米ぬか等
を用い、５〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃の温度に
おいて、３〜１４日間培養を行う。この場合に必要に応
じて培地中に窒素源、無機塩類、微量栄養源を加えるこ
とができる。

このように培養して、菌体内に、ビスホモ−γ−リノレ
ン酸を含有する脂質が生成蓄積される。

液体培地を使用した場合には、培養菌体から、次のよう
にしてビスポ□モーγ−リノレン酸の採取を行なう。

培養終了後、培養液より遠心分離及び＃過等の常用の固
液分離手段により培養菌体を得る。菌体は十分水洗し、
好ましくは乾燥する。乾燥は凍結乾燥、風乾等によって
行うことができる。乾燥菌体は、好ましくは窒素気流下
でイ１−ａ溶媒によって抽出処理する。有ａ？’ｆｆ媒
として番：１エーテル、ヘキサン、メタノール、エタノ
ール、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル等
を用いることができ、またメタノールと石油エーテルの
交互抽出や、クロロホルム−メタノール−水の一層系の
溶媒を用いた抽出によっ−Ｃも良好な結果を得ることが
できる。抽出物から減圧下で有ａ？８媒を留去すること
により、高温度のビスホモ−γ−リノレン酸を含有した
脂質が得られる。

また、上記の方法に代えて湿菌体を用いて抽出を行うこ
とができる。この場合にはメタノール、エタノール等の
水に対して相溶性の溶媒、又はこれらと水及び／又は他
の溶媒とから成る水に対して相溶性の混合溶媒を使用す
る。その他の手順は上記と同様である。

上記のようにして得られた脂質中には、ビスホモ−γ−
リノレン酸が脂質化合物、例えば脂肪の構成成分として
含まれている。これらを、直接分離することもできるが
、低級アルコールとのエステル、例えばビスホモ−γ−
リノレン酸メチルとして分離するのが好ましい。このよ
うなエステルにすることにより、他の脂質成分から容易
に分離することができ、また、培養中に生成する他の脂
肪酸、例えばパルミチン酸、オレイン酸、リノール酸等
（これらも、ビスホモ−γ−リノレン酸のエステル化に
際してエステル化される）から容易に分離することがで
きる。例えば、ビスホモ−γ−リノレン酸のメチルエス
テルを得るには、前記の抽出脂質を無水メタノール−塩
酸５％〜１０％、ＢＦ、−メタノール１０％〜５０％等
により、室温にて１〜２４時間処理するのが好ましい。

前記の処理液からヒスボモーγ−リノレン酸メチルエス
テルを回収するにはへ十′リン、エーテル、酢酸エチル
等の有機溶剤で抽出するのが好ましい。

次に、この抽出液を無水酢酸り一トリウム等により乾燥
し、有機溶媒を好ましくは減圧下で留去することにより
主として脂肪酸エステルから成る混合物が得られる。こ
の混合物中には、目的とするビスホモ−γ−リノレン酸
メチルエステルの他に、パルミチン酸メチルエステル、
ステアリン酸メチルエステル、オレイン酸メチルエステ
ル等が含まれている。これらの脂肪酸メチルエステル混
合物からビスホモ−γ−リノレン酸メチルエステルを単
離するには、カラムクロマトグーｙ−ｙイー、低温結晶
化法、尿素包接体法等を、争独で、又は組み合わせて使
用することができる。

こうして単離されたビスボモーγ−リノレン酸メチルか
らビスホモ−γ−リノレン酸を得るには、アルカリで加
水分解した後、エーテル、酢酸エチル等の有機溶媒で抽
出すればよい。

また、ビスホモ−γ−リノレン酸をそのメチルエステル
を経ないで採取するには、前記の抽出脂質をアルカリ分
解（例えば５％水酸化ナトリウムにより室温にて２〜３
時間）した後、この分解液から、脂肪酸の抽出・精製に
常用されている方法により抽出・精製することができる
。

次に、実施例により、この発明をさらに具体的に説明す
る。

〔ビスホモγ−リノレン酸の製造方法 〕災旌拠土 グルコース５％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３
％及び麦芽エキス０．３％を含む培地（ｐｌ（６，０）
５０ｍｊ！を５００ｍｎ溶坂ロフラスコに入れ、１２０
℃で２０分間殺菌した。モルティエレラ・エロンガタＳ
ＡＭ　０２１９（ＦＥｌ？Ｍ　Ｐ−８７０３）　　１白
金耳を接種し、レシプロシェーカーＣ１Ｃ１１Ｏｒｐに
より２８℃で５日間振盪培養した。培養後、濾過にて菌
体を回収し、十分水洗した後、凍結乾燥した。これによ
り、１．２ｇの乾燥菌体を得た。この菌体より、クロロ
ホルム−メタノール−水の一層系の溶媒を用いるＢｌｉ
ｇｈ　＆　Ｄｙｅｒの抽出法によって総脂質を抽出した
ところ、２９０■の脂質が得られた。この脂質を無水メ
タノール−塩酸（９５：、、５　）を用いて２０°Ｃに
て３時間処理することによってメチルエステル化し、エ
ーテルで抽出して１８０１Ｅの脂肪酸メチルを得た。こ
れをさらにカラノ、クロマトグラフィーによって分翔１
し、ビスホ干−γ−リノレン酸メチル画分を分取し、ロ
ータリーエバポレーターによって溶媒を留去した結５１
．５．２■の精製されたビスホモ−γ−リノレン酸メチ
ルを得た。本標品と市販のビスホモ−γ−リノレン酸を
メチルエステル化し、カフムク［１７Ｉグラフ、イーに
よって単離精製して調製したビスホモ−γ　リルン酸メ
チル標準サンプルについＣ、ガスク「１マトク４ラフイ
一分析、高速液体りＩ＋　−、ｖ　ｌ・グラフィー分析
及、質量分析、及びＮＭＲ分ＪＩ’＋’に、Ｌ、　＝、
て比較を行なったところ、両者はいずれの分析において
も一致した。

精製前及び精製後のビスポモーγ−リノレン酸メチル量
は培地当り、それぞれ０．１１１■／　ｍ　１２及び０
、１０ｍｇ　／　ｍ　１　、乾燥菌体当り、それぞれ７
．５ｍ１ｒ／ｇ及び４．３曙／ｇであった。

プ膜１殊Ｉ 実施例と同じ組成の培地５βを１５Ｊジャーファーメン
タ−に仕込み、１２０℃で４０分間殺菌後、モルティエ
レラ・エロンガタＳＡＭ　０２１９（ＦＥＲＭ　Ｐ−８
７０３）の前培養液２００ｍ７！を接種した。３０℃、
通気量０．５　ｖ、ｖ、ｍで３日間通気攪拌培養を行な
い、得られた湿菌体３７０ｇ　（乾燥重量１２０ｇ）に
ついて、実施例１と同様に抽出、加水分解、メチルエス
テル化を行なったところ、総脂質３１ｇ、混合脂肪酸メ
チル１９ｇを得た。このもののビスホモ−γ−リノレン
酸メチル含量は５％、生成量は培地当り０．１９ｇ／ｎ
、乾燥菌体当り７．９■／ｇであった。

又、培養終了後、濾過によって得られた培養濾液４，０
５０ｍＩｌを乾燥後、実施例１と同様に抽出、加水分解
、及びメチルエステル化を行なったところ、５％のビス
ホモ−γ−リノレン酸メチルを含む混合脂肪酸メチル１
２７■を得た。

■凡町、　ＩＦＯ８５７１）、及びモルディエレラ・ヒ
グロフィラ（Ｍｏｒｔ土ｅ−ｒｅｊｌ＋４−ｈ２Ｂｒｐ
７旧ｊ＋ｉ、ＩＦＯ５９４１）について実施例１と同様
な操作を行なったところ、それぞれ６５■、９３ｗの脂
肪酸メチルを得た。

これらの脂肪酸メチル中に含まれるビスホモ−γ−リノ
レン酸メチルをｆｉｔ　ｍｌ・精製したところ、それぞ
れの菌株について２．７■、及び４．５■が得られた。

・ 実１１」ｔ グルコース２％、酵１υエキス１％、Ｔｗｅｅｎ　２０
０．２％及び種々の炭化水素、脂肪酸ナトリウム又は油
脂０．５％を含む培Ｉｔ！！　（ｐＨｔｉ、　０　）　
２０　ｍｌｌを１００ｍＩ！容マイヤーに入れ、１２０
℃で２０分間殺菌した。モルティエレラ・エロンガタＳ
ＡＭ　０２１９（ＦＥＲＭ　Ｐ−８７０３）　　１白金
耳を接種し、ロータリーシェーカー（２００ｒｐｍ）に
より２８℃で５日間培養した。

得られた菌体について、実施例１と同様に抽出、加水分
解、及びメチルエステル化を行なった。培地に添加した
種々の炭化水素、脂肪酸ナトリウ１１、及び油脂それぞ
れについて、得られた乾燥菌体重量、総脂質量、総脂肪
酸メチル量、ビスホモ−γ−リノレン酸含量、及び培地
当りのビスホモ−γ−リノレン酸メチル生成量は下表の
ようになった。

標準培地に脂肪酸ナトリウム又は油脂類を添加した場合
、ビスホモ−γ−リノレン酸の生成量は無添加区にくら
べ、２〜２０％向上した。

手続補正書（自発） 昭和６２年１り〕２日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属に属
   し、ビスホモ−γ−リノレン酸生産能を有する微生物を
   培養して、ビスホモ−γ−リノレン酸、又はビスホモ−
   γ−リノレン酸を含有する脂質を生成せしめ、そしてビ
   スホモ−γ−リノレン酸を採取することを特徴とするビ
   スホモ−γ−リノレン酸の製造方法。