KR100434109B1 - 테이코플라닌의 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 테이코플라닌(teicoplanin)을 함유하는 미생물 발효액을 다공성 흡착수지 및 흡착수지에 순차적으로 통과시켜 테이코플라닌 A₃의 함량이 2% 이하로 현저히 감소된 고순도·고역가의 테이코플라닌 A₂복합체를 분리정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

테이코플라닌의 정제방법{Process for the purification of teicoplanin}

본 발명은 테이코플라닌(teicoplanin)을 함유하는 미생물 발효액으로부터 고순도·고역가의 테이코플라닌 A₂복합체(teicoplanin A₂complex)를 분리정제하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스(Actinoplanes teichomyceticus)의 발효액을 저렴한 가격의 다공성 흡착수지 및 흡착수지에 순차적으로 통과시켜 테이코플라닌 A₃의 함량이 현저히 감소된 고순도·고역가의 테이코플라닌 A₂복합체를 분리정제하는 방법에 관한 것이다.

테이코플라닌은 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 종에 속하는 균주(ATCC 31121)에 의해 생산되는 글리코펩타이드계 항생제이다. 테이코플라닌은 거의 모든 그람-양성 세균성 질환의 치료에 사용되며, 페니실린이나 세팔로스포린계의 항생제에 저항성이 있는 세균성 질환의 치료에 광범위하게 사용된다. 또한, 수술환자나 고령환자, 또는 면역력이 약한 사람에게 치명적인 메티실린 내성 포도상구균(MRSA)의 치료에 사용되는 유일한 항생제인 반코마이신(vancomycin)과 유사한 효능을 갖는다. 이것은 반감기가 길어서 1 일 1 회 투여 및 근육주사가 가능한 고부가가치 항생제이다.

악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ATCC 31121로부터의 주요 생성물은 3 가지 주요 인자(A₁, A₂및 A₃)의 혼합물이다. 상기 균주의 발효액으로부터 회수된 생성물을 정제하여 얻은 테이코플라닌 제제가 그람-양성 세균에 의해 유발되는 감염의 치료에 더욱 적합한 것으로 밝혀져 있다(A. H. Williams 등, Journal of Hospital Infection (1986); 7, Suppl. A, 101-103 및 D. Greenwood, Journal of Antimicrobial Chemotherapy (1988); 21, Suppl. A, 1-13). 이 제제는 테이코플라닌 A₂라 불리는 5 가지의 구조적으로 유사한 물질의 복합체(테이코플라닌 A₂복합체)를 함유한다. 현재 일본 항생물질 의약품 기준에 따르면, A₃의 함량이 15% 이하이고 A₂복합체의 함량이 80% 이상인 품질을 갖는 테이코플라닌을 요구하고 있다.

종래의 테이코플라닌 A₂복합체를 정제하는 방법으로는 미국특허 제5,486,465호에 개시된 방법을 들 수 있다. 이 특허방법에 따르면, 발효액의 pH를 11로 조정한 후 여과하고, 여액의 pH를 8로 조정한 후 폴리아미드 수지에 통과시켜 용출하고, 아세톤내에서 결정화하여 테이코플라닌 A₂복합체를 제조한다. 그러나, 이 방법을 이용할 경우, 색소를 완전히 제거할 수 없고, 특히 테이코플라닌 A₃의 제거가 힘들어, 일본 항생물질 의약품 기준에 규정된 품질을 충족시키는 테이코플라닌을 생산하기 어렵다.

본 발명자들은 기존에 개발된 테이코플라닌 정제방법의 문제점을 보완하여 보다 저렴한 비용으로 고순도·고품질의 테이코플라닌을 얻을 수 있는 새로운 정제방법을 개발하고자 집중적인 연구를 수행하였다. 그 결과, 테이코플라닌을 함유하는 미생물 발효액을 저렴한 가격의 다공성 흡착수지 및 흡착수지에 순차적으로 통과시킴으로써, A₃의 함량이 2% 이하로 감소하고 A₂복합체의 순도가 증가하며 대부분의 색소가 제거되어, 소기의 목적을 달성할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 테이코플라닌을 함유하는 미생물 발효액을 다공성 흡착수지 및 흡착수지에 순차적으로 통과시킴으로써, 테이코플라닌 A₂복합체를 고순도로 정제하는 방법을 제공하기 위한 것이다.

도 1은 본 발명에 따라 정제된 테이코플라닌의 HPLC 분석결과(일본 항생물질 의약품 기준 분석법)를 나타내는 도면; 및,

도 2는 대조품으로 시판중인 타고시드(Gruppo Lepetit S.P.A. 이탈리아)의 HPLC 분석결과(일본 항생물질 의약품 기준 분석법)를 나타내는 도면.

본 발명은 테이코플라닌을 함유하는 미생물 발효액을 다공성 흡착수지 및 흡착수지에 순차적으로 통과시킨후 용출시키고, pH를 조정하여 테이코플라닌을 침전시켜 테이코플라닌 A₂복합체를 순수하게 분리정제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 테이코플라닌을 함유하는 미생물 발효액으로는 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 균주, 예를 들어, 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스 ATCC 31121의 진탕배양액을 사용한다. 즉, 통상의 추출방법에 따라, 이 발효액에 용매, 예를 들어, 프로판올 또는 이소프로판올을 가하여 혼합하고 30 분간 방치한 후, 여과 깔때기를 사용하여 균체와 고형 불순물을 제거하고 여액을 얻는다. 이 여액을 감압농축기를 사용하여 농축한다.

이 농축액을 다공성 흡착수지, 바람직하게는 HP20(삼양사 제품)에 예를 들어, 0.5 내지 2.0 배 칼럼 부피의 유속으로 흡착시킨다. 그 후, 물로 세척하고, 용매, 예를 들어, 이소프로판올, 메탄올 또는 NH₄OH를 사용하여 용출한다. 이로써 대부분의 색소가 제거되고, 테이코플라닌 A₃의 함량이 현저하게 감소한다. 테이코플라닌 용출액을 감압농축기에서 농축하여, 대부분의 용매를 증발시켜 제거한다.

이어서, 테이코플라닌 농축액을 흡착수지, 바람직하게는 알루미나(WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD. 제품) 또는 SP850(삼양사 제품), 보다 바람직하게는 SP850에 통과시켜 흡착시키고, 물로 세척한 후 용매, 예를 들어, 이소프로판올, 메탄올 또는 NH₄OH를 사용하여 용출한다. 이로써, HP20 수지에의 통과 및 용출 후 잔존한 색소 및 불순물을 완전히 제거할 수 있다. 용출액을 감압농축기에서 농축하여, 대부분의 용매를 증발시켜 제거한다. 농축액의 pH를 4∼6 범위로 조정하고 2∼8 ℃의 저온에서 방치하여 테이코플라닌을 침전시킨다. 침전물을 여과하고, 진공건조기에서 건조시켜 테이코플라닌 A₂복합체를 회수한다.

상기한 바와 같은 과정을 거쳐 정제된 산물은 HPLC에 의해 분석하였을 때 테이코플라닌 A₃의 함량이 2% 이하로 현저히 감소하고, 테이코플라닌 A₂복합체를 80% 이상 함유하며, 1000 mcg/㎎ 이상의 항균역가를 갖는 고순도·고역가의 테이코플라닌 A₂복합체이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하는 것은 아니다.

실시예 1: 다공성 흡착수지(HP20) 정제

테이코플라닌을 960 ㎎/ℓ 농도로 함유하는 악티노플라네스 테이코마이세티쿠스(Actinoplanes teicomyceticus) ATCC 31121의 발효액 1000 ㎖에 670 ㎖의 n-프로판올을 첨가하여 혼합하였다. 30 분간 방치한 후 규조토 여과기를 사용하여 여과하여, 1450 ㎖의 여액을 얻었다. 이 여액을 감압농축기를 사용하여 40 ℃ 이하에서 150 ㎖까지 농축하였다.

농축액을 다공성 흡착수지 HP20 수지(삼양사 제품) 100 ㎖에 시간당 120 ㎖의 유속으로 통과시켜 흡착시켰다. 그 후, 시간당 200 ㎖ 유속의 증류수 400 ㎖을 이용하여 세척하고, 20% 이소프로판올 500 ㎖로 세척하였다. 세척이 완료된 후,40% 이소프로판올을 사용하여 HP20 수지로부터 테이코플라닌을 용출시켰다. 그 결과, 450 ㎖(수율: 88%)의 용출액을 얻었다. 용출액을 감압농축기를 사용하여 40 ℃ 이하에서 65 ㎖까지 농축하였다.

실시예 2: 흡착수지(알루미나) 정제

실시예 1에서 얻은 농축액 120 ㎖을 흡착수지 알루미나(WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD. 제품) 80 ㎖에 시간당 100 ㎖의 유속으로 통과시켜 흡착시켰다. 시간당 150 ㎖ 유속의 물 200 ㎖로 세척한 후, 동일 유속의 메탄올 400 ㎖을 사용하여 세척하였다. 세척이 완료된 후, 0.1 N NH₄OH를 사용하여 알루미나 수지로부터 테이코플라닌을 용출시켰다. 용출 즉시 용출액의 pH를 7.5로 조정하였다. 수득된 용출액의 부피는 400 ㎖(수율: 79%)이었다.

실시예 3: 흡착수지(SP850) 정제

실시예 1에서 얻은 농축액 120 ㎖을 흡착수지 SP850(삼양사 제품) 80 ㎖에 시간당 100 ㎖ 의 속도로 통과시켜 흡착시켰다. 시단당 150 ㎖ 유속의 물 200 ㎖로 세척하고, 동일 유속의 20% 이소프로판올 400 ㎖을 사용하여 세척하였다. 세척이 완료된 후 40% 이소프로판올을 사용하여 테이코플라닌을 용출시켰다. 수득된 용출액의 부피는 400 ㎖이었으며, 대부분의 색소가 제거되었다.

실시예 4: 결정 회수 및 분석

실시예 3 및 실시예 4의 방법으로 얻은 용출액을 각각 감압농축기를 사용하여 40 ℃ 이하에서 20 ㎖로 농축하였다. pH를 4.5로 조정한 후 4 ℃에서 하룻밤 동안 방치하고 여과하였다. 여과된 침전물을 45 ℃ 이하의 진공건조기에서 하루밤 동안 건조하였다. 건조된 테이코플라닌의 무게는 610 ㎎이었다. 이것을 1998년 일본 항생물질 의약품 기준에 의한 HPLC로 분석하였다. 이 때, 대조품으로 현재 시판중인 타고시드(Gruppo Lepetit S.P.A. 이탈리아, 제조번호: A0106)를 사용하였다.

그 결과를 도 1 및 2에 각각 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 정제함으로써, 테이코플라닌 A₂복합체의 함량이 83.5%이고, 1024 mcg/㎎ 이상의 항균 효능을 갖는 고순도·고역가의 테이코플라닌 A₂를 수득할 수 있었다. 특히 이것은 테이코플라닌 A₃의 함량이 0.78%로 현저히 감소된 것으로 나타났다. 한편, 도 2에 나타낸 바와 같이, 시판품인 타고시드의 경우, 본 발명에 따른 정제품에 비해 테이코플라닌 A₂복합체의 함량과 순도가 떨어지고, 테이코플라닌 A₃의 함량이 훨씬 높은 것으로 확인되었다.

본 발명에 따른 정제방법을 이용하면, 테이코플라닌 A₃의 함량이 현저히 감소된 고순도·고역가의 테이코플라닌 A₂복합체를 경제적으로 분리정제할 수 있다.

Claims (3)

1. (i) 테이코플라닌을 함유하는 미생물 발효액을 다공성 흡착수지에 통과시켜 용출하고;

   (ii) 단계 (i)에서 얻은 용출액을 알루미나에 통과시켜 용출하며;

   (iii) 단계 (ii)에서 얻은 용출액의 pH를 4∼6 범위로 조정하여 테이코플라닌 A₂복합체를 침전시키는 단계를 포함하는,

   테이코플라닌 A₂복합체의 정제방법.
2. 제1항에 있어서, 다공성 흡착수지가 HP20인 방법.
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