DE3751890T2

DE3751890T2 - Radionuklid-Antikörper-Verbindung

Info

Publication number: DE3751890T2
Application number: DE3751890T
Authority: DE
Inventors: Becky J Bottino; John M Reno
Original assignee: Poniard Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Poniard Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1986-03-12
Filing date: 1987-01-19
Publication date: 1997-02-20
Anticipated expiration: 2007-01-20
Also published as: CA1280365C; JPS62230800A; EP0237150A2; US4877868A; DE3751890D1; EP0237150B1; EP0237150A3; JPH0762032B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifif radiomarkierte Antikörper und spezifische Bindungsfragmente davon sowie Verfahren zu ihrer Herstellung.
Radiomarkierte Verbindungen sind wertvolle Instrumente zur medizinischen Diagnose und Behandlung. Solche Verbindungen werden in einer Vielzahl an Verfahren verwendet, z.B. bei der Diagnose tiefer Venenthromben, der Untersuchung der Lymphknoten-Pathologie und dem Nachweis, der Einstufung und Behandlung von Neoplasmen. Einige dieser Verbindungen setzen Metalradionuklide wie z.B. Technetium-99m ein. Bei der Verwendung von Radionukliden zur in vivo- Verabreichung ist es wünschenswert, daß sich das Radionuklid in einem Zielorgan oder einer Läsion, z.B. einer Krebsstelle, positioniert. Daher werden Radionuklide üblicherweise formuliert, um eine bevorzugte Bindung an (oder eine Absorption durch) das betreffende Organ oder Gewebe zu erzielen. Es besteht ein großes Interesse daran, ein Radionuklid präzise zu einer vorausgewählten Stelle lenken zu können, um die Hintergrundstrahlung, die sich auf umgebende oder entfernte Gewebe richtet, zu verringern, die Dosierung zu reduzieren, die Hintergrundstrahlung für in vivo- Aufnahmen zu minimieren und unerwünschte Nebenwirkungen zu minimieren. Zu diesem Zweck sind Verfahren mit spezifischen Liganden oder Rezeptoren, mit denen das Radionuklid konjugiert werden kann, von Interesse.
Bekannte radiomarkierte Verbindungen und andere Präparate weisen oif einen oder mehrere deutliche Nachteile auf. In solchen Präparaten kann z.B. die Verbindung zwischen dem Radionuklid und der proteinartigen Substanz von Interesse nichtspezifisch und/oder instabil sein, was zur Dissoziation des Präparats führt, die ihrerseits eine Zunahme der Hintergrundstrahlung bewirkt, die diagnostische Nützlichkeit des Präparats einschränkt und die Bestrahlungsdose an Nicht-Zielstellen erhöht, wodurch die therapeutische Wirksamkeit eingeschränkt wird.
Derivate proteinartiger Substanzen mit Protein-Chelat-Konjugaten sind stabiler. Die Herstellung solcher Protein-Chelat-Derivate kann es jedoch erfordern, daß die proteinartige Substanz relativ rauhen Bedingungen ausgesetzt wird, z.B. organischen Lösungsmitteln und extremen pH- und Temperaturwerten, was zu einer teilweisen Denaturierung führen kann. Außerdem kann die Gegenwart von Radionuklidchelaten die biologische Aktivität bestimmter proteinartiger Substanzen stark verändern. Beispielsweise können Antikörper, die kovalent mit einem Metallradionuklid über einen chelatbildenden Liganden markiert sind, eine verringerte Immunreaktivität aufweisen, was wiederum die Spezifität ihrer Wechselwirkung mit Geweben verringert. Proteine, die einigen Chelatkonjugationsverfahren unterzogen werden, neigen auch zu Denaturierung/Aggregation; solche Wirkungen können die Raten erhöhen, mit denen solche Proteine aus dem Kreislauf ausgeschieden werden, und können daher die Menge der für Aufnahmen oder Therapie zur Verfügung stehenden Radionuklide verringern. Weiters können einige proteinartige Substanzen, die unter Verwendung von Chelatkonjugaten radiomarkiert werden, in einem Patienten eine Immunreaktion auslösen, wodurch die weitere Verwendung des markierten Proteins gefährlich wird.
Quellenangaben von Interesse umfassen Steigman et al., 16 J. Nucl. Med. 573 (1975) (Abstract); Pettit et al., 21 J. Nucl. Med. 59 (1980); und die US-Patentschriften 4.424.200, 4.421.735, 4.323.546, 4.293.537 und 4.057.617. Siehe auch FR-A- 2.515.046, welche die direkte Bindung von bestimmten, von den erfindungsgemäßen Radionukliden unterschiedlichen Radionukliden an Antikörper offenbart und vorschlägt, daß Disulfidgruppen innerhalb des Antikörpers vor der Kombination mit dem Radionuklid reduziert werden.
Es werden Metallradionuklid-markierte Antikörper und spezifische Bindungsfragmente davon (nachstehend "proteinartige Substanzen" bereitgestellt, die in ihren nativen Zuständen Disulfid(Cystin)-Bindungen enthalten und bei der Diagnose und Behandlung einer Vielzahl pathologischer Zustände Verwendung finden. Genauer gesagt werden Chelat-Metallradionuklid-Konjugate proteinartiger Substanzen zur Diagnose von Zuständen einschließlich der Lymphknoten-Pathologie und tiefen Venenthromben sowie zum Nachweis und zur Einstufung von Neoplasmen eingesetzt. Radionuklidmarkierte Proteine, insbesondere Immunglobuline, werden zur Strahlentherapie von Tumoren verwendet.
Die radionuklidmarkierten proteinartigen Substanzen der vorliegenden Erfindung werden durch die Behandlung der proteinartigen Substanz von Interesse mit einem Disulfid-reduzierenden Mittel und anschließende Reaktion der reduzierten proteinartigen Substanz ("H-behandeltes Produkt") mit einer geeigneten Radionuklidspezies, die 99mTc, ¹&sup8;&sup6;Re und ¹&sup8;&sup8;Re oder &sup6;&sup7;Cu enthält, gebildet. Man stellte fest, daß die H-behandelten Produkte spezifisch mit Radionuklidspezies reagieren, um stabile radionuklidmarkierte Antikörper oder andere radiomarkierte Produkte zu bilden. Die H- behandelten Produkte werden durch Lyophilisierung, Einfrieren und/oder Reaktion mit einem zwei- oder dreiwertigen Kation bzw. mit einer Sulfhydrygruppe vor und nach der Komplexbildung mit dem Metallradionuklid stabilisiert oder modifiziert.
Es werden verbesserte Verfahren und Zusammensetzungen bereitgestellt, die Metallradionuklid-markierte proteinartige Substanzen betreffen. Stabile Zwischenprodukte, die in den Verfahren zur Herstellung der radiomarkierten Produkte gebildet werden, werden ebenfalls bereitgestellt; diese eignen sich, falls dies gewünscht wird, um die Herstellung der radiomarkierten Produkte mit Ausnahme des Radiomarkierungsschritts ausreichend lange vor der Verabreichung abzuschließen, sodaß nur die Radiomarkierung unmittelbar vor der Verabreichung durchgeführt werden muß.
Die Metallradionuklid-markierten proteinartigen Substanzen werden aus einer ausgewählten proteinartigen Substanz, der Behandlung der ausgewählten proteinartigen Substanz mit einem Disulfid-reduzierenden Mittel und anschließender Radiomarkierung mit einem Radionuklid gebildet.
Die proteinartige Substanz besteht entweder aus polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, einschließlich Immunglobulinen oder spezifischen Bindungsfragmenten davon. Proteinartige Substanzen weisen üblicherweise zumindest 1.000 MW, häufiger zumindest etwa 2.000 MW und im allgemeinen weniger als 1,6 MDal, häufiger weniger als etwa 800 KDal auf. Die proteinartigen Substanzen sind dadurch gekennzeichnet, daß zie zumindest eine zugängliche Disulfidbindung besitzen. Unter "zugänglich" ist zu verstehen, daß nach der Reduktion die Thiolgruppen zur Bindung mit dem Metallradionuklid zur Verfügung stehen. Dies kann empirisch bestimmt werden.
Eine Vielzahl an Metallen können als Radionuklid verwendet werden. Dazu zählen &sup6;&sup7;Cu, 99mTc; ¹&sup8;&sup6;Re und ¹&sup8;&sup8;re; diese reagieren im allgemeinen mit den H-behandelten Produkten als Ionen, z.B. &sup6;&sup7;Cu²&spplus;, 99mTc=0³&spplus;, 186,188Re=0&sub2;³&spplus;, bei Umsetzung mit den H-behandelten proteinartigen Substanzen.
Von besonderem Interesse als Antikörper sind Immunglobuline oder deren Äquivalent; dabei können Fab-Fragmente, F(ab')&sub2;, Fv, T-Zellrezeptoren usw. beteiligt sein.
Im allgemeinen wird die ausgewählte proteinartige Substanz mit einem stöchiometrischen Überschuß eines Disulfid-reduzierenden Mittels wie z.B. Dithiothreitol (DTT) in einem wäßrigen Medium mit einem pH-Wert von im allgemeinen etwa 5-8, typischerweise 6-7 behandelt und die Reaktion ausreichend lange fortgesetzt, bis alle ausgewählten proteinartigen Substanzen mit dem reduzierenden Mittel reagieren. Üblicherweise beträgt die Dauer weniger als etwa sechs Stunden und mehr als etwa 15 Minuten, wobei die Temperaturen von etwa 0 bis 50ºC reichen, üblicherweise nicht mehr als etwa 40ºC und vorzugsweise etwa 25ºC betragen. Die jeweiligen Bedingungen werden je nach proteinartiger Substanz, pH-Wert u.dgl. ausgewählt.
Obwohl DTT das bevorzugte Reagens zur Behandlung der proteinartigen Substanzen ist, sind auch andere Reduktionsmittel, die eine Mercaptangruppe oder ein Paar Mercaptangruppen enthalten können, geeignet, wie z.B. Natriumborhydrid, Natriumphosphorthioat, Dithioerythritol (DTE), 2-Mercaptoethanol, Cystein, N- Acetylcystein und Glutathion.
Nach der Reduktion des bzw. der Disulfid(e) der proteinartigen Substanz wird das Reduktionsmittel normalerweise entfernt, um Komplexbildung mit dem Radionuklid sowie nachteilige physiologische Auswirkungen zu verhindern. Die Entfernung des nichtumgesetzten oder verbrauchten Reduktionsmittels kann herkömmlicherweise und wirksam durch verschiedene chromatographische Verfahren erzielt werden, z.B. Sephadex-Gelbehandlung, Mikroporenfiltration, Zentrifugation usw. Die jeweilige Art der Abtrennung ist für die Erfindung nicht entscheidend.
Abhängig von dem jeweiligen Metall können verschiedene Bedingungen und Verfahren zur Herstellung der Metallradionuklid-Spezies zum Markieren des H-behandelten Produkts eingesetzt werden. Zur Herstellung der Technetium-Spezies wird Natriumpertechnetat in Lösung in Gegenwart eines Reduktionsmittels (z.B. Zinnion oder Dithionit) unter herkömmlichen Bedingungen umgesetzt. Günstigerweise ist ein schwaches chelatbildendes Mittel im Medium enthalten, z.B. Tartrat, Glucoheptonat usw., wodurch ein labiler, löslicher Komplex aus reduziertem Tc-99m gebildet wird. Rhenium-Spezies zur Markierung kann gebildet werden, indem Perrhenat unter Verwendung von Hypophosphorsäure in konzentrierter HCl bei 95ºC zu Rhenium(IV)hexachlorid unter Verwendung von unterphosporiger Säure in konzentrierter HCl bei 95ºC reduziert wird. Das Hexachlorrhenat wird dann in 90% Ethylendiamin mit Sauerstoff bei Raumtemperatur zum Bis(ethylendiamin)dioxorhenium(V) umgewandelt. Der Bis(ethylendiamin)dioxorhenium(V)-Komplex wird dann durch Eindampfen oder Umkristallisieren gewonnen und das Ethylendiamin im Vakuum unter Erhitzen entfernt. Die radioaktive Kupferspezies, die sich zum Radiomarkieren des ausgewählten H-behandelten Produkts eignet, kann durch Auflösen von Kupferoxid (CuO) in Eisessig und Verdampfen der Essigsäure gebildet werden, um Kupferacetat zu ergeben, das dann zur Radiomarkierung in Wasser aufgelöst werden kann.
Labile Komplexe der Metallradionuklid-Spezies können auch als Quelle des Radionuklids zur Komplexbildung mit dem H-behandelten Produkt verwendet werden. Beispielsweise können Tc-99m-Gluconat, Clucoheptonat, Tartrat, Malonat o.dgl. verwendet werden. Ebenso können schwache Chelatkomplexe der Radionuklide verwendet werden, darunter z.B. Bis(ethylendiamin)kupfer(II)chlorid, Bis(aquo)ethylendiaminokupfersulfat oder -nitrat u.dgl.
Typischerweise wird die ausgewählte H-behandelte proteinartige Substanz bzw. das Produkt mit der ausgewählten Metallradionuklid-Spezies radiomarkiert, indem zuerst das Radionuklid in einer Menge aufgelöst wird, die ausreicht, um einem geeigneten Bestrahlungsdosiswert in einem physiologisch annehmbaren Medium wie z.B. Wasser oder einer zweckmäßigen Pufferlösung zu ergeben; anschließend wird das ausgewählte H-behandelte Produkt in einem geeigneten Puffer zugegeben. Vorzugsweise weist die Reaktionslösung oder der Puffer einen pH-Wert im Bereich von etwa 5-10 auf und die Reaktion wird über einen ausreichenden Zeitraum fortgesetzt wird, bis das gesamte H- behandelte Produkt mit der Metallradionuklid-Spezies komplexiert ist. Üblicherweise beträgt die Reaktionszeit weniger als etwa sechs Stunden und mehr als etwa 30 Minuten, wobei die Temperaturen von etwa 0ºC bis etwa 60ºC, häufiger von etwa 25ºC und etwa 50ºC reichen.
Die H-behandelten Produkte können in unterschiedlicher Weise für die Lagerung stabilisiert werden, bis die Radiomarkierung notwendig ist. Zum Beispiel kann das H- behandelte Produkt nach der Behandlung mit dem Reduktionsmittel in entsalzten Lösungen bei unter etwa -10ºC, üblicherweise etwa -20ºC gefroren werden. Es wird sich als günstiger herausstellen, die H-behandelten Produkte gemäß bekannter Verfahren zur Lagerung bei Umgebungs- oder reduzierten Temperaturen geeigneterweise in einzelnen sterilen Fläschchen gefrierzutrockenen oder zu lyophilisieren. Am geeignetsten werden die H-behandelten Produkte entweder mit einem labilen Komplexiermetallion oder mit einem Sulfhydrylgruppen- Derivatisierungsreagens stabilisiert. Die stabilisierten H-behandelten Produkte werden dann für die zukünftige Verwendung eingefroren oder - noch bevorzugter - für die Lagerung als steriles Pulver gefriergetrocknet oder lyophilisiert.
Typischerweise wird mit Metallionenstabilisierung des H-behandelten Produkts unmittelbar nach dem Abschluß der Reaktion zwischen dem reduzierenden Mittel und der ausgewählten proteinartigen Substanz eine wäßrige oder gepufferte Lösung eines stöchiometrischen Überschusses eines relativ schwach bindenden Metalons zugegeben. Vorzugsweise ist das verwendete Metallion ein Zinkion (Zn²&spplus;), doch andere zwei- oder dreiwertige Metallionen wie z.B. Kalziumion, Magnesiumion u.dgl sind ebenfalls geeignet. Verschiedene schwach gebundene anionische Salze des Metallions können verwendet werden. Zu geeigneten Anionen zählen Chlorid, Iod, Phosphat, Glycinat, Acetat, Gluconat, Malonat u.dgl. Das Metallion und das Gegenion sollten biologisch verträglich sein; toxische Metalonen können nur dann verwendet werden, wenn das stabilisierte H-behandelte Produkt behandelt wird z.B. mit Ionenaustauschharzen, bevor die Radiomarkierung und die Verabreichung erfolgen. Daher eignen sich diese Ionen weniger, da sie einen zusätzlichen Reinigungsschritt erfordern. Die durch Metallionen stabilisierten H-behandelten Produkte werden mit der Metallradionuklid- Spezies typischerweise in der selben Weise radiomarkiert wie beim Radiomarkieren der H-behandelten Produkte. Das stabilisierende Metallion wird für den raschen Austausch mit der jeweiligen Radionuklidspezies ausgewählt; Das stabilisierende Metallion wird solcherart ausgewählt, daß sich die Metallradionuklid-Spezies stärker an das H- behandelte Produkt bindet als das stabilisierende Ion.
Alternativ dazu kann das H-behandelte Produkt gegen Inaktivierung aufgrund der Rekombination der Bis(sulfhydryl)gruppen mit Disulfidbindungen mit Sulfhydrylgruppen-Derivatisierungsreagentien stabilisiert werden. Vorzugsweise werden die Sulfhydryl-Derivatisierungsreagentien so ausgewählt, daß sie mit den Sulfhydrygruppen, die sich bei der Behandlung mit dem reduzierenden Mittel bilden, reagieren und daß sie zur Radiomarkierung entfembar sind. Für bestimmte Metallradionuklid-Spezies, z.B. &sup6;&sup7;cu²&spplus;-Ion kann es jedoch möglich sein, das Derivatisierungsreagens solcherart auszuwählen, daß die Entfernung der derivatisierten Gruppe vor der Radiomarkierung nicht erforderlich ist. Vorzugsweise werden die Sulfhydrylgruppen unter Verwendung von Cyanation (OCN&supmin;) derivatisiert; andere mögliche Derivatisierungsreagentien sind Essigsäureanyhdrid, N-Acetylimidazol, Maleinsäureanhydrid, Bernsteinsäureanhydrid, Sulfition, Trinitrobenzolsulfonsäure u.dgl.
Cyanat eignet sich als reversibles und spezifisches Modifizierungsreagens für Sulfhydrylgruppen von Proteinen (G.R. Stark, J. Biol. Chem. (1964) 239:1411). Unter leicht sauren Bedingungen (etwa pH 6) reagiert KNCO in spezifischer Weise mit den Proteinsulfhydrylgruppen, um S-Carbamylcystein zu bilden. Unter diesen Bedingungen ist die Reaktion mit Amino- und Guanidinylgruppen minimal. Die Zersetzung des S- Carbamylproteins zum anfänglichen Sulfhydryl und Cyanat ist alkalikatalysiert und tritt leicht bei einem pH-Wert von 8 oder mehr auf. Somit kann der cyanatgeschützte, mit DTT behandelte Antikörper durch kurzes Aussetzen einem alkalischen pH-Wert vor dem Markieren mit Radionuklid "aktiviert" werden, oder die "Aktivierung" und Radiomarkierung können bei einem alkalischem pH-Wert gleichzeitig durchgeführt werden. Z.B. erfolgt die Tc-99m-Tartrat-Markierung bei einem pH-Wert von 8-10 und das cyanatgeschützte Protein wird der Radiomarkierungsreaktion ohne vorherige Aktivierung zugegeben.
Die vorliegenden radiomarkierten Produkte können einem Säugetierwirt durch intravenöse, intraarterielle, peritoneale, intratumorale oder subkutane Injektion verabreicht werden, um dem Lymphsystem u.dgl. zugeführt zu werden, wobei dies von der jeweiligen Stelle, an der das Radionuklid erwünscht ist, abhängig ist. Die in einen Wirt zu injizierende Menge hängt im allgemeinen von der Cröße des Wirts ab (etwa 1 bis 3000 µCi/kg des Wirts). Bei menschlichen Wirten beträgt die Dosierung üblicherweise etwa 10-50 mCi/70 kg des Wirts, noch typischer etwa 23-35 mCi/70 kg des Wirts. Bei niedrigeren Säugetieren wie z.B. Mäusen beträgt die Dosis für Bioverteilungsuntersuchungen etwa 25-100 µCi, hingegen bei Bilddarstellungsuntersuchungen bis hinauf zu 1000 µCi oder mehr. Nach der Verabreichung des Radionuklids kann der Wirt je nach dem Zweck auf unterschiedliche Weise zum Nachweis oder zur Therapie behandelt werden.

Beispiel 1

Herstellung von DTT-behandeltem monoklonalem Antikörper

Einer Lösung aus 25 mg monoklonalem Mäuseantikörper in 2,5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS; 0,05 M Phosphat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 7,5) wurde eine relativ konzentrierte Lösung von DTT in PBS auf eine Endkonzentraton von 1 mM zugegeben. Die resultierende Lösung wurde 30 min lang bei Raumtemperatur gerührt.
Das gesamte Reaktionsgemisch wurde auf Sephadex G-25, die vorher mit PBS äquilibriert wurde (1,5 x 5,0cm Kunststoffsäule, eluiert mit PBS), gereinigt; 1,2 ml große Fraktionen wurden gesammelt. Die nun entsalzten Fraktionen mit einer Absorption (280 nm) von mehr als 0,1 wurden vereint; sie wurden in Aliquoten in kleine Fläschchen gefüllt und sofort bei -20ºC eingefroren. Die Analyse des Reaktionsgemisches durch HPLC (Beispiel 8) zeigte die Gegenwart von nur monomerem Antikörper in den gesammelten Fraktionen und somit auf das Fehlen von Aggregation.
Andere Verfahren zur Lagerung von DTT-behandelten proteinhältigen Substanzen sind nachstehend beschrieben.

Beispiel 2

a. Markierung von DTT-behandeltem monoklonalem Antikörper mit Tc-99m-Tartrat

Eine Lösung aus Tc-99m-Tartrat wurde durch Zugabe von 1,1 ml entgastem destilliertem Wasser mit 9% Ethanol zu 100 µg (etwa 0,43 µmol) SnCl&sub2;, 75 mg (etwa 0,32 mMol) Dinatriumtartrat und 3,2 mCi Natrium (Tc-99m) Pertechnetat gebildet. Dieses Gemisch wurde mit einem Wasserbad 15 min lang auf 50ºC erwärmt. Nach dem Abkühlen wurden in einem getrennten Behälter 100 µl der Tc-99m-Tartatlösung, 200 µl 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH 8,0) und 100 µg DTT-behandelter Antikörper, der wie in Beispiel 1 hergestellt und unmittelbar vor der Verwendung aufgetaut wurde, vermischt.
Das Gesamtvolumen der Lösung wurde mit einer wäßrigen Lösung von 0,15 M Natriumchlorid auf 0,5 ml eingestellt und 60 min lang bei 50ºC inkubiert. HPLC- Analyse (Beispiel 8) der resultierenden Lösung zeigte die Gegenwart von monomerem Antikörper, wobei nur ersichtlich war, daß durch das Markierungsverfahren keine Aggregation bewirkt wurde.
Die Analyse der Reaktionsprodukte gemäß dem Verfahren von Beispiel 7 ergab, daß 84% des Tc-99m an den Antikörper gebunden waren. Ein ähnlicher Versuch erfolgte ohne DTT-Behandlung des Antikörpers; die Analyse der Reaktionsprodukte zeigte, daß nur 18% des Tc-99m an den Antikörper gebunden waren.

b. Markierung von DTT-behandeltem Antikörper mit Tc-99m-Glucoheptonat

Dieser Versuch erfolgte unter Verwendung des Glucoscan -Sets (New England Nuclear, Cambridge, MA). Ein Glucoscan -Fläschchen wurde mit 3 mCi Natrium-(Tc-99m)- Pertechnetat und ausreichend wäßriger 0,15 M Natriumchloridlösung rekonstituiert, um ein Endvolumen von 1,0 ml zu ergeben. Das Fläschchen wurde 15 min lang auf Raumtemperatur gehalten. Getrennt davon wurden 200 µl 0,2 M Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 6,0), 100 µl der oben hergestellten Tc-99m-Glucoheptonatlösung und 100 µg des wie in Beispiel 1 hergestellten DTT-behandelten Antikörpers vermischt. Das Gesamtvolumen wurde mit 0,15 M Natriumchloridlösung auf 0,5 ml eingestellt und 60 min lang bei 50ºC inkubiert. Die HPLC-Analyse zeigte die Gegenwart von nur monomerem Antikörper. Die Analyse der Reaktionsprodukte gemäß dem Verfahren von Beispiel 7 ergab, daß 95% des Tc-99m an den Antikörper gebunden waren. Nicht mit DTT behandelter, sondern dem gleichen Tc-99m-Glucoheptonat-Markierungsverfahren unterzogener Antikörper führte zur Bindung von nur 6% des Tc-99m an den Antikörper.

Beispiel 3

Stabilität von radiomarkiertem, DTT-behandeltem Antikörper

DTT-behandelter Antikörper wurde gemäß dem Verfahren aus Beispiel 1 hergestellt und gemäß dem Verfahren aus Beispiel 2a mit Tc-99m-Tartrat markiert. Die Analyse der Reaktionsprodukte gemäß dem Verfahren aus Beispiel 7 zeigte, daß durch dieses Verfahren 95% des Tc-99m an den Antikörper gebunden waren. Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) wurde der Lösung des markierten Antikörpers auf eine Endkonzentration von 2 mg/ml zugegeben. DTPA, ein wirkungsvoller Chelatbildner von Technetium, war somit in großem Überschuß vorhanden. Nach dem Erwärmen der resultierenden Lösung über einen Zeitraum von 60 min bei 50ºC in einem Wasserbad zeigte die Analyse gemäß Beispiel 7, daß 97% des ursprünglich gebundenen Tc-99m nach der Behandlung mit DTPA gebunden blieben.

Beispiel 4

Herstellung von DTT-behandeltem, mit Zinkion stabilisiertem Antikörper (Zn-DTT- behandelter Antikörper)

a. Ohne Entfernung des Zinkion-Überschusses

DTT-behandelter Antikörper wurde nach dem Verfahren von Beispiel 1 hergestellt, außer daß das Endpräparat nicht gefroren wurde. Eine wäßrige Zinkchloridlösung (ZnCl&sub2;) wurde der Lösung von DTT-behandeltem Antikörper sofort zugegeben, um eine Lösung mit einer Endzinkionenkonzentration von 0,1 mM zu ergeben. Diese Lösung wurde bis zur weiteren Verwendung bei Raumtemperatur gelagert.

b. Entfernung von überschüssigem Zinkion

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde angewendet, außer daß eine wäßrige Zinkchloridlösung auf eine Endzinkionenkonzentration von 0,1 mM dem ursprünglichen Reaktionsgemisch zugegeben wurde. Die resultierende Lösung wurde auf einer mit PBA voräquilibrierten Sephadex G-25-Säule entsalzt. Die den Antikörper enthaltenden Fraktionen wurden bei Raumtemperatur gelagert.

c. Vergleichsantikörper

Die Vorgangsweise von Beispiel 4b wurde übernommen, wobei auf DTT verzichtet wurde, um den nur mit Zinkion behandelten Antikörper zu charakterisieren.

Beispiel 5

Radiomarkierung von mit Zinkion stabilisierten Antikörpern

Getrennte Lösungen von unbehandeltem Antikörper, DTT-behandeltem Antikörper (Beispiel 1), Zn-DTT-behandeltem Antikörper (Beispiel 4a), entsalztem Zn-DTT- behandeltem Antikörper (Beispiel 4b) und Vergleichsantikörper (Beispiel 4c) wurden jeweils mit Tc-99m-Tartrat gemäß dem Verfahren aus Beispiel 2a radiomarkiert. Dieses Markierungsverfahren erfolgte unmittelbar nach der Herstellung der einzelnen Lösungen. Eine zweite Reihe an Radiomarkierungsversuchen wurde nach Lagerung jeder der fünf Lösungen bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 24 Stunden durchgeführt. Jede der zehn Lösungen wurde gemäß dem Verfahren aus Beispiel 6 hinsichtlich des Prozentsatzes an gebundenem Tc-99m analysiert; die Ergebnisse sind in Tabelle I dargestellt.

BeispieL 6

Analyse des Ausmaßes der Radiomarkierung

Die Dünnschicht-Chromatographie (TLC) wurde verwendet, um das Ausmaß der Proteinradiomarkierung zu bestimmen. Silikagel-imprägnierte Glasfaserplatten wurden von Gelman Sciences Inc., Ann Arbor, Michigan erhalten und gemäß den Anweisungen des Herstellers aktiviert. Ein 2-5 µl Aliquot des Radiomarkierungs-Reaktionsgemisches wurde aufgetropft und der TLC-Streifen in 0,65 M Ammoniumacetat, 25% Methanol entwickelt Der TLC-Streifen wurde halbiert und jede Hälfte in einem Napf- Radioaktivitätszähler gezählt, der auf das geeignete Radionuklid geeicht war. Das Protein und somit die proteingebundene Radioaktivität verbleibt am Start, und die Nichtprotein-Radioaktivität wandert mit der Lösungsmittelfront. Das Ausmaß an Proteinradiomarkierung wurde mittels der folgenden Formel errechnet:
% gebundenes Protein = Zählungen am Start/Zählungen am Start + Zählungen an der Lösungsmittelfront x 100% Tabelle I Radiomarkierungsversuche die Zinkionenstabilisierung zeigen
Aus diesen Ergebnissen lassen sich mehrere Schlüsse ziehen. Die DTT-Behandlung des Antikörpers erhöht das Ausmaß der Radiomarkierung mit Tc-99m stark. Wenn jedoch die DTT-behandelte Antikörperlösung 24 Stunden lang bei Raumtemperatur stehengelassen wird, ist das Ausmaß an gebundenem Tc-99m nicht größer als jenes, das an unbehandelten Antikörper gebunden ist. Dies zeigt auf bzw. stützt die Vermutung, daß die DTT-Behandlung die Disulfidbindungen im Antikörper reduziert, um Bis(sulfhydryl)gruppen zu ergeben, die sich ihrerseits innerhalb von 24 Stunden bei Raumtemperatur rekombinieren, um die ursprüngliche Disulfidverbindung zu bilden.
Die Wirksamkeit der nach der Herstellung erfolgenden Radiomarkierung des mit Zink- DTT behandelten Antikörpers ist im wesentlichen die gleiche wie die Wirksamkeit der Markierung ohne Zn²&spplus;-Zugabe. Die zusätzliche Behandlung mit Zinkion verhindert jedoch die Oxidation der Sulfhydrygruppen auf wirkungsvolle Weise, wodurch der DTT-behandelte Antikörper stabilisiert und die Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen zur Radiomarkierung, wenn klinisch erwünscht, erleichtert wird. Die Radiomarkierungseffizienz ist bei den verwendeten Zinkionenkonzentrationen im wesentlichen die gleiche, ob der mit Zn-DTT behandelte Antikörper zur Entfernung von überschüssigem Zinkion entsalzt wird oder nicht. Die Behandlung von Antikörpern mit Zinkionen ohne DTT-Behandlung senkt die Radiomarkierungseffizienz.

Beispiel 7

Hochleistungs-FIüssigkeitschromatographie-(HPLC)Aggregationsanalyse

Größenausschluß-HPLC wurde unter Verwendung einer Toyo Soda TSK 3000-Säule, 7,5 mm x 30 cm, (erhältlich bei Kratos, Inc., Ramsey, NJ) durchgeführt. Die Säule wurde mit 0,2 M Natriumphosphat, pH 7,0, mit 0,15 M Natriumchlorid (bei 1,0 ml/min) eluiert. Das Säureeluat wurde sowohl unter Verwendung eines "in-line"-UV-Detektors als auch eines "in-line"-Radioaktivitätsdetektors überwacht. Die Säule wurde mittels zweckmäßiger Protein-Molekulargewichtstandards geeicht, wobei der Vergleich das untersuchte Protein vor der Radiomarkierung war.

Beispiel 8

Derivatisierung von DTT-behandeltem Antikörper mit Cyanation

DTT-behandelter Antikörper (25 mg) wurde wie nach dem Verfahren in Beispiel 1 hergestellt, außer daß das Reaktionsgemisch auf einer (mit 0,05 M Natriumphosphat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 6,0 voräquilibrierten) Sephadex G-25 gereinigt wurde. Unmittelbar nach der Chromatographie wurden 60 µl einer wäßrigen Lösung mit 5 mg/ml Kaliumcyanat zugegeben und der pH-Wert durch die Zugabe von 1 M Essigsäure auf 6,0 gehalten. Nach 30 Minuten wurde die Lösung auf mit PBS voräquilibrierter Sephadex G-25 entsalzt. Die das Protein enthaltenden Fraktionen wurden vereint, auf etwa 10 mg/ml konzentriert und bei 4ºC gelagert. Der cyanatgeschützte Antikörper wird mittels des Verfahrens nach Beispiel 2a mit Tc-99m- Tartrat markiert.

Beispiel 9

Bindung des mit Tc-99m markierten "H-behandelten Produkts" an menschliche FMX- Met II-Tumorzellen

Die Wirkungen, die die DTT-Behandlung und die anschließende Tc-99m-Markierung auf die Antikörperkomponente, welce das Antigen, gegen das dieser Antikörper gerichtet ist, bindet, ausüben, wurden durch einen Zellbindeassay ermittelt. Der Assay war eine Variante des durch T. Lindmo et al., J. of Immunol. Meth. (1984) 72: 77-89 beschriebenen Assays. Radiomarkierter 9.2.27-anti-Melanomantikörper wurde zwei Stunden lang bei einer gleichbleibenden Konzentration der menschlichen FMX-Met II- Melanomtumorzellen, die festgelegt wurden, um Bedingungen des Antigenüberschusses darzustellen, inkubiert. Als Vergleich für die nichtspezifische Bindung des radiomarkierten Antikörpers an die Tumorzellen wurden Tumorzellen zumindest eine Stunde lang in der Gegenwart eines 200-fachen Überschusses von nicht-radiomarkiertem Antikörper der gleichen Spezifität präinkubiert. Nach der Inkubation der Zielzellen und des radiomarkierten Antikörpers wurde der Radioaktivitätswert in einem Gamma- Napfzähler quantifiziert. Die Analyse des monoklonalen 9.2.27-Antikörpers in dieser Weise zeigte, daß die antigenspezifische Bindung an Zielzelen etwa 76%, mit einer nichtspezifischen Bindungkomponente von weniger als 4%, ausmacht. Mittels der Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung kann man proteinartige Substanzen, die in ihren nativen Zuständen Disulfidbindungen enthalten, rasch radiomarkieren, um radionuklidsubstituierte Reagentien zur in-vivo-Verwendung bereitzustellen. Die Reagentien können in reiner Form und guter Ausbeute bereitgestellt werden. Die Radiomarkierung kann unter milden Bedingungen, unter denen die proteinartigen Substanzen weder denaturiert noch aggregiert werden, wirksam durchgeführt werden. Außerdem können die reaktiven proteinartigen Substanzen, die durch die Behandlung mit DTT hergestellt werden, zur Langzeitlagerung bei Raumtemperaturen stabilisert und dann - im Bedarfsfall kurz vor der Verabreichung - radiomarkiert werden. Somit kann man ein Radionuklid zuverlässig zu einer erwünschten Stelle lenken, wo nur geringe Radioaktivitätswerte nichtspezifisch gerichtet und gebunden sind. Die Zusammensetzungen und Verfahren gemäß der Erfindung bieten stabil radiomarkierte proteinartige Zusammensetzungen mit interessanten physiologischen Eigenschaften, wobei die Auswirkungen der so markierten proteinartigen Substanzen auf die biologische Aktivität minimiert werden.

Claims

1. Proteinderivat mit Dimercaptogruppen, die durch Reduktion endogener Disulfidbindungen gebildet wurden und die Gruppen sind, durch die 99mTc, ¹&sup8;&sup6;Re, ¹&sup8;&sup8;Re oder &sup6;&sup7;Cu direkt an das Protein gebunden ist, wobei das Proteinderivat ein Antikörper oder ein spezifisches Bindungsfragment davon ist.

2. Proteinderivat nach Anspruch 1, worin das Radionuklid 99mTc ist.

3. Verfahren zum direkten Markieren eines Proteins mit 99mTc, ¹&sup8;&sup6;Re, ¹&sup8;&sup8;Re oder &sup6;&sup7;Cu, umfassend das Umsetzen einer Quelle von 99mTc, ¹&sup8;&sup6;Re, ¹&sup8;&sup8;Re oder &sup6;&sup7;Cu mit einem Protein mit durch Reduktion endogener Disulfidbindungen gebildeten Dimercaptogruppen, und das direkte Binden von 99mTc, ¹&sup8;&sup6;Re, ¹&sup8;&sup8;Re oder &sup6;&sup7;Cu an ein Protein durch die Dimercaptogruppen, wobei das Protein ein Antikörper oder ein spezifisches Bindungsfragment davon ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, weiters umfassend nach dem Reduzieren und vor dem direkten Binden das Stabilisieren des Dimercaptoproteins durch Lyophilisieren, Gefrieren und/oder Reaktion mit einem zwei- oder dreiwertigen Kation oder mit einem Sulfhydrylgruppen-Derivatisierungsmittel.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die Dimercaptogruppen durch Lyophilisierung des Proteins stabilisiert werden und das stabilisierte Dimercaptoprotein durch Hydratation vor der direkten Markierung regeneriert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 4, worin die Dimercaptogruppen durch Reaktion mit einem labilen Zn&spplus;&spplus;-, Ca&spplus;&spplus;- oder Mg&spplus;&spplus;-Kation stabilisiert werden.

7. Verfahren nach Anspruch 4, worin die Dimercaptogruppen durch Derivatisierung durch ein Cyanation stabilisiert werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, worin das Radionuklid 99mTc ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, umfassend die Reduktion zumindest einer endogenen Disulfidbindung durch ein disulfidreduzierendes Mittel.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin das Reduktionsmittel Dithiothreitol ist.

11. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, worin nichtumgesetztes oder aufgebrauchtes Reduktionsmittel nach der Reduktion entfernt wird.

12. Set zum direkten Markieren eines Proteins mit dem Radionuklid 99mTc, ¹&sup8;&sup6;Re, ¹&sup8;&sup8;Re oder &sup6;&sup7;Cu, umfassend eine Packung, die ein lyophilisiertes Proteinderivat mit zumindest einer Dimercaptogruppe enthält, die durch Reduktion einer endogenen Disulfidbindung gebildet wurde, worin das Protein ein Antikörper oder ein spezifisches Bindungsfragment davon ist.

13. Set nach Anspruch 12, zusätzlich umfassend eine Quelle des Radionuklids zur direkten Bindung an die Dimercaptogruppen.

14. Set nach Anspruch 12 oder 13, worin das Radionuklid 99mTc ist.

15. Verwendung eines lyophilisierten Proteinderivats mit zumindest einer Dimercaptogruppe, die durch Reduktion endogener Disulfidbindungen gebildet wurde, zur Bildung eines Proteinderivats, worin das Radionuklid 99mTc, ¹&sup8;&sup6;Re, ¹&sup8;&sup8;Re oder &sup6;&sup7;Cu durch eine Dimercaptogruppe direkt an das Protein gebunden ist, worin das Proteinderivat, dessen endogene Disulfidbindung reduziert ist, ein Antikörper oder ein spezifisches Bindungsfragment davon ist.

16. Verwendung nach Anspruch 15, worin das Radionuklid 99mTc ist.