DE3850497T2 - Methode zur markierung von antikörpern mit einem metallion. - Google Patents
Methode zur markierung von antikörpern mit einem metallion.Info
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Description
- Proteine werden mit verschiedenen Radiometallen und anderen Radioisotopenelementen zur Verwendung bei immundiagnostischen und immuntherapeutischen Verfahren markiert. Einige Radiometalle haben überlegene Eigenschaften für die Anwendung bei diesen Verfahren. Technetium-99m ist ein ideales Radionuklid zur szintigraphischen Abbildung aufgrund seiner nuklearen Eigenschaften. Es hat eine Einzelphotonenergie von 140 keV, eine Halbwertszeit von ca. 6 h und ist aus einem &sup9;&sup9;Mo-99mTc-Generator leicht zu erhalten. Rhenium-Radioisotope sind Beta-Emitter, die Zielzellen vernichten können und daher für die Therapie nützlich sind. Rhenium-186 und -188 hat auch Gamma-Emission, die ihm als ein zusätzliches Merkmal erlaubt, mittels szintigraphischer Techniken abgebildet zu werden.
- Zwei allgemeine Verfahren werden angewandt, um Proteine wie etwa Antikörper mit Radiometallen zu markieren. Die erste ist die direkte Markierungsmethode, bei der das Radiometall an das Proteinmolekül selbst gebunden wird. Die zweite ist die indirekte Markierungsmethode, wobei ein Chelatbildner mit dem Protein gekoppelt und das Radiometall an das Protein über den Chelatbildner gekoppelt wird.
- Rhodes zeigt ein Verfahren der direkten Markierung von Protein mit Technetium-99m, wobei Liganden-Festphasen-Austausch erfolgt; siehe US-PS 4 305 922. Nach dem Verfahren von Rhodes wird Pertechnetat zu Technetium IV reduziert und dann auf eine Sephadex®-Säule aufgebracht. Das reduzierte Technetium-99m wird an das Sephadex®-Material gebunden. Eine Lösung des zu markierenden Proteins wird auf das obere Ende der Sephadex-Säule gegossen, wo ihr Verweilen zugelassen wird, so daß der Ligandenaustausch stattfindet. Infolgedessen wird das Technetium-99m bevorzugt von dem Sephadex- Material auf das Protein übertragen. Das Protein kann mit einem Zinn(II)-chlorid vorbehandelt sein (dieses Verfahren wird als "Vorverzinnen" bezeichnet), um die Übertragung des Radiometalls auf das Protein zu verstärken; siehe US-PS 4 424 200.
- Es wurde verschiedentlich versucht, Proteine mit Radiometallen nach dem indirekten Verfahren zu markieren. Bei einem solchen Versuch-wird ein Chelatbildner wie etwa eine Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) an das Protein konjugiert, und dann wird das Metallion an dem Chelatbildner, der an das Proteinmolekül gebunden ist, markiert. Beispielsweise zeigt Khaw et al., Science 209 : 295-297 (1980), Antikörper für Herzmyosin, die mit Indium-111 über DTPA markiert sind, und den Einsatz der markierten Antikörper für die Abbildung von Myocardinfarkt. Siehe außerdem Krejcarek et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 77 : 581-585 (1977); R.L. Childs und D.J. Hnatowich, J. Nucl. Med., 26 : 293 (1985); US-PS 4 652 440 Paik et al., (1987). Bei einem neueren Verfahren beschreibt Fritzberg et al. den Einsatz von bestimmten Diaminodithiol- und Diamidodithiolgruppen als Chelatbildner. Fritzberg et al., J. Nucl. Med., 27:957 (1986); EP-Patentanmeldung 86100360.6. In der US-PS 4 027 005 zeigen Adler et al. mit Technetium markierte Polyhydroxycarbonsäuren zum Einsatz als Radionuklid-Diagnosemittel.
- Unterschiedliche Erfolge sind sowohl mit den direkten als auch den indirekten Verfahren der Markierung von Proteinen mit Radiometallen erzielt worden. Das markierte Produkt ist aber häufig in vivo instabil. Außerdem sind häufig Verfahren zum Reinigen des markierten Produkts vor dem Einsatz erforderlich. Es besteht ein Bedarf für verbesserte Verfahren zum stabilen Markieren von Proteinen für radioimmundiagnostische und radioimmuntherapeutische Verfahren.
- Die Erfindung gibt ein einfaches, rasches und effizientes Verfahren zum Markieren von Sulfhydryl enthaltenden Antikörpern oder Antikörperfragmenten mit den Radiometallen Technetium-99m, Rhenium-186, Rhenium-188, Rhenium-189 und Rhenium-191 an. Allgemein umfaßt das Verfahren die folgenden Schritte:
- a. Bilden eines wäßrigen Gemischs aus:
- (i) dem radioaktiven Metall in einer oxidierten Form; und
- (ii) einem Reduktionsmittel und einem wasserlöslichen Polyhydroxycarboxyl-Liganden, der ausgewählt ist aus Saccharinsäure, Galactarsäure, Arabonsäure und Salzen davon und der fähig ist, mit dem radioaktiven Metall in seinem reduzierten Zustand einen stabilen Komplex zu bilden und das radioaktive Metall quantitativ mit einem Sulfhydryl enthaltenden Antikörper auszutauschen; und
- b. In-Kontakt-Bringen des Gemischs mit einem Sulfhydryl enthaltenden Antikörper oder Antikörperfragment, um einen Radiometall-markierten Antikörper oder ein solches Antikörperfragment zu bilden.
- EP-A-0 237 150 wurde am 16. 09. 87 veröffentlicht und beansprucht eine Priorität vom 12. 03. 86 und wird daher gemäß Art.54(3) EPÜ genannt. Sie zeigt ein Verfahren und ein Set zum Herstellen eines mit einem Radionuklid markierten Proteins aus einem Protein-Vorläufer mit wenigstens einer Disulfidbindung. Das Verfahren umfaßt den Einsatz eines Disulfid-Reduktionsmittels, und die Markierungs-Spezies ist beispielsweise ein labiler, löslicher Komplex von reduziertem Tc-99m, das durch Einsatz eines schwachen Chelatbildners komplexiert ist. Spezielle Beispiele der in EP-A-0 237 150 angegebenen Chelatbildner sind Gluconat-, Glucoheptonat-, Tartrat- und Malonat-Spezies. Es wird nichts über die Liganden Saccharinsäure, Galactarsäure, Arabonsäure und ihre Salze gesagt, deren Einsatz durch die vorliegende Erfindung beansprucht wird.
- Die Technetium-99m-markierten Antikörper oder Antikörperfragmente der Erfindung eignen sich für radioimmundiagnostische Zwecke wie etwa die Immunszintigraphie. Die mit Rhenium markierten Antikörper oder Antikörperfragmente können für die Therapie eingesetzt werden.
- Der besonders bevorzugte Ligand ist Saccharinsäure (D- Glucarsäure). Saccharinsäure bildet schnell und stabil einen Komplex mit Technetium-99m in seinem reduzierten Zustand und ohne die Bildung von signifikanten Technetium-Kolloiden. Wenn Technetium-99m mit einem Sulfhydryl enthaltenden Antikörper in Kontakt gebracht wird, wird es bevorzugt auf den Antikörper übertragen, um einen stabilen markierten Antikörper zu bilden.
- Die bevorzugten Reduktionsmittel zum Einsatz bei dem Verfahren sind Zinn(II)-Reduktionsmittel wie etwa Zinn(II)chlorid. Diese Reagenzien reduzieren Technetium wirkungsvoll und sind pharmakologisch akzeptabel.
- Das Verfahren der Erfindung kann angewandt werden zum Markieren von ganzen Antikörpern (z. B. IgG) oder von Antikörperfragmenten (z. B. Fab'). Ganze Antikörper können beispielsweise mit dem Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT) reduziert werden, um Sulfhydryl enthaltende Antikörper zu ergeben. Fab'-Fragmente eignen sich besonders zum Markieren mit dem Verfahren. Unter nichtoxidierenden Bedingungen enthalten diese Fragmente freie Sulfhydrylgruppen (wie sie durch Reduktion von Disulfidbrücken erzeugt werden, die in F(ab)'-Fragmenten vorhanden sind). Für die meisten radioimmundiagnostischen Verfahren werden Antikörperfragmente wie etwa Fab'-Fragmente bevorzugt, und daher eignet sich das Markierungsverfahren der Erfindung besonders gut zur Herstellung von Radiopharmazeutika für diese Verfahren.
- Das Verfahren zum Radiomarkieren von Antikörper oder Antikörperfragmenten mit den bezeichneten Radiometallen kann als ein einfaches Zwei-Phiolen-Verfahren durchgeführt werden. Zu diesem Zweck können Sets mit den Reagenzien in einer gebrauchsfertigen Form vorgesehen werden, um an Ort und Stelle vom Kliniker verwendet zu werden. Beispielsweise kann ein solches Set eine erste Phiole, die ein Reduktionsmittel (z. B. Zinn(II)-ionen) und den wasserlöslichen Liganden (z. B. Saccharinsäure oder ein Salz davon) enthält, und eine zweite Phiole aufweisen, die ein Fab'-Fragment enthält, das für das spezielle diagnostische oder therapeutische Vorgehen geeignet ist. Die Reaktionen werden bevorzugt in einem wäßrigen Medium durchgeführt, obwohl die Reagenzien in lyophilisierter, gefrorener oder wäßriger Form vorliegen können. Zur Herstellung von Technetium-99m-markierten Fragmenten wird Technetium-99m (allgemein in Form von Pertechnetat) der ersten Phiole zugesetzt, und dann werden die Inhalte der ersten und der zweiten Phiole vermischt und für eine Dauer inkubiert, die ausreicht, um eine quantitative Übertragung von Technetium-99m auf das Fab'-Fragment zu bewirken. Die Zusammensetzung kann dann ohne Reinigung in den Patienten injiziert werden. Zur Radiomarkierung mit Rhenium werden anstelle des Technetiums Rheniumisotope (in Form eines Perrhenats) eingesetzt. Das Rhenium-markierte Fab'-Fragment eignet sich ebenfalls zur Injektion ohne Reinigung.
- Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann die Radiomarkierung in einer einzigen Phiole durchgeführt werden. Ein Set kann eine einzige Phiole aufweisen, die ein Antikörpergemisch, das aus einem Sulfhydryl enthaltenden Antikörper oder Antikörperfragment besteht, ein Reduktionsmittel (z. B. Zinn(II)-ionen) und bevorzugt einen wasserlöslichen Liganden (z. B. D-Glucarsäure oder ein Salz davon) enthält. Das Antikörpergemisch wird bevorzugt in lyophilisierter Form bereitgestellt, obwohl die gefrorene oder die wäßrige Form ebenfalls geeignet sind. Technetium-99m (allgemein in Form von 99mTc-Pertechnetat) wird der Phiole zugesetzt, und das
- resultierende Gemisch wird ausreichend lang inkubiert, um eine quantitative Übertragung von Technetium-99m auf den Antikörper oder das Antikörperfragment zu bewirken. Diese Zusammensetzung kann dann ohne Reinigung in den Patienten injiziert werden. Die Technetium-99m-markierten Antikörper und Antikörperfragmente, die mit dem Verfahren der Erfindung hergestellt sind, können für diagnostische Zwecke eingesetzt werden, etwa für die Immunszintigraphie von Tumor, Myokardinfarkt, Thrombosen oder bakteriellem Abszeß. Rheniummarkierte Antikörper können eingesetzt werden, um selektiv ein Rhenium-Radioisotop in vivo für die Therapie abzugeben.
- Das Verfahren nach der Erfindung bietet mehrere wichtige Vorteile. Wie gesagt, sind die eingesetzten Liganden fähig, Technetium-99m quantitativ in stabiler Form zu komplexieren als einen Komplex ohne die Bildung einer signifikanten Menge von Technetiumkolloid. Bei Kontakt mit einem Sulfhydryl enthaltenden Antikörper unter geeigneten Bedingungen wird das komplexierte Technetium-99m im wesentlichen quantitativ auf Sulfhydryl enthaltende Antikörper übertragen, so daß eine radiodiagnostische Zusammensetzung mit sehr hoher spezifischer Aktivität hergestellt werden kann. Der Antikörper oder die Antikörperfragmente, die mit dem Verfahren markiert werden, behalten ihre ursprüngliche Immunreaktivität und infolgedessen ihre Ziel-Spezifität. Der radiomarkierte Antikörper ist in Lösung und in Serum stabil. Wenn Fab'-Fragmente, die mit dem Verfahren markiert wurden, in vivo verabreicht werden, sammelt sich nur sehr wenig Markierung in der Leber an, was darauf hinweist, daß der markierte Antikörper in vivo stabil ist. Außerdem kann das Markierungsverfahren sehr schnell ausgeführt werden (es kann in weniger als einer Stunde durchgeführt werden), und das Verfahren kann bei Raumtemperatur und pH 5-9 durchgeführt werden. Das markierte Produkt muß vor dem Gebrauch nicht gereinigt werden.
- Fig. 1 zeigt Gamma-Szintigramme eines Hunds zu verschiedenen Zeitpunkten nach Injektion von mit Technetium-99m markiertem Myosin-spezifischem Fab'- Fragment;
- Fig. 2 zeigt Gamma-Szintigramme desselben Hunds von verschiedenen Ansichten;
- Fig. 3 zeigt die Resultate von Maus-Bioverteilungsuntersuchungen im Blut, durchgeführt mit Antifibrin T2G1S, das in Einzelphiolen- und Doppelphiolen-Markierungssets hergestellt wurde;
- Fig. 4 zeigt die Resultate von Maus-Bioverteilungsuntersuchungen in der Leber, durchgeführt mit Antifibrin T2G1S, das in Einzelphiolen- und Doppelphiolen-Markierungssets hergestellt wurde;
- Fig. 5 zeigt die Resultate von Maus-Bioverteilungsuntersuchungen in der Milz, durchgeführt mit Antifibrin T2G1S, das in Einzelphiolen- und Doppelphiolen-Markierungssets hergestellt wurde;
- Fig. 6 zeigt die Resultate von Maus-Bioverteilungsuntersuchungen in der Niere, durchgeführt mit Antifibrin T2G1S, das in Einzelphiolen- und Doppelphiolen-Markierungssets hergestellt wurde;
- Fig. 7 zeigt die Resultate von Maus-Bioverteilungsuntersuchungen im Dickdarm, durchgeführt mit Antifibrin T2G1S, das in Einzelphiolen- und Doppelphiolen-Markierungssets hergestellt wurde.
- Bei einer Ausführungsform wird das Verfahren der Erfindung durchgeführt durch Umsetzen von Technetium-99m (in einem oxidierten Zustand) mit einem wasserlöslichen Liganden in Gegenwart eines Reduktionsmittels, um einen stabilen Komplex zwischen Technetium-99m in einem reduzierten Zustand (z. B. im Valenzzustand IV oder V) und dem Liganden zu bilden, und anschließendes Umsetzen des Komplexes mit einem Antikörper oder Antikörperfragment, das ein oder mehr Sulfhydrylgruppen enthält. Bei der bevorzugten Ausführungsform zur Markierung eines Sulfhydryl enthaltenden Antikörpers mit Technetium-99m wird wäßriges Natrium-99m-Pertechnetat mit einer wäßrigen Lösung eines Zinn(II)-Reduktionsmittels und Saccharinsäure (oder einem Salz davon) vermischt, um einen 99mTc-Saccharatkomplex zu bilden. Der Komplex wird dann mit einem Fab'- Fragment in Kontakt gebracht und für einen Zeitraum und unter Bedingungen inkubiert, die einen Austausch von Technetium-99m aus dem Komplex zu dem Fab'-Fragment zulassen, um ein Technetium-markiertes Fab'-Fragment zu erhalten. Der gesamte Vorgang kann in weniger als einer Stunde bei Raumtemperatur und einem pH von ca. 5-9 ablaufen. Unter diesen Bedingungen kann eine im wesentlichen komplette Übertragung von Technetium-99m (aus dem 99m-Tc-Saccharatkomplex zu dem Antikörper-Protein) ohne einen signifikanten Verlust von Antikörper-Immunreaktivität erreicht werden.
- Die Erfindung gibt ein Verfahren an, um Protein in einer einzigen Phiole radioaktiv zu markieren. Die Reduktion der oxidierten Form von Technetium-99m und die Radiomarkierungs- Reaktion (d. h. die Kopplung des Radioisotops an Protein) werden in derselben Phiole erreicht. Im vorliegenden Zusammenhang betrifft der Ausdruck "Phiole" jede Art von Reaktionsgefäß und soll keinerlei Einschränkung enthalten. Das Verfahren ist einfach, effizient und reproduzierbar, und es minimiert die Sicherheitsrisiken für Personen, die die Radiomarkierung durchführen. Das Verfahren der Erfindung eignet sich besonders zum Markieren von Antikörpern (poly- und monoklonalen) für die Diagnose. Antikörper können nach diesem Verfahren auf eine hohe spezifische Reaktivität unter minimalem Verlust der Immunreaktivität markiert werden.
- Die Vorteile, die das vorliegende Ein-Phiolen-Verfahren gegenüber Verfahren, die zwei Phiolen verwenden, und anderen bekannten Verfahren zum Markieren mit Technetium-99m bietet, sind folgende: (1) Rasches Markieren bei Umgebungsbedingungen. Es können Markierungsausbeuten von mehr als 90% in 5-15 min bei Umgebungstemperatur ohne Erwärmen erreicht werden. Die klinischen Vorteile der nahezu sofortigen Herstellung eines diagnostischen Mittels können erheblich sein.
- (2) Die Stabilität der lyophilisierten Formulierung des Ein- Phiolen-Verfahrens ist der vergleichbaren Formulierung, die bei einem Zwei-Phiolen-Verfahren angewandt wird, überlegen.
- (3) Bioverteilungsuntersuchungen des aus dem Ein-Phiolen- Verfahren resultierenden Produkts zeigen statistisch signifikante Unterschiede in wesentlichen Schlüsselorganen. Die Aufnahme in Niere und Leber ist bei dem nach diesem Verfahren hergestellten Produkt geringer. Die Ausscheidung aus dem Blut ist signifikant rascher. Diese Arten von Unterschieden weisen darauf hin, daß ein Produkt aus diesem Verfahren eine schwächere Hintergrunddosis, geringere absorbierte Dosis für kritische Organe erzeugt und in einer rascheren Ausscheidung aus dem Blut und damit einer schnelleren Möglichkeit zur Abbildung von interessierenden Bereichen resultiert. Dies wären insgesamt erhebliche klinische Vorteile. (4) Die Plasmastabilität des Produkts ist höher. Das ergibt mehr lebensfähiges, intaktes Produkt, das als diagnostisches Mittel in vivo dienen kann.
- Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden ein Antikörpergemisch, bestehend aus Sulfhydryl enthaltendem Antikörper oder Antikörperfragment, ein Reduktionsmittel und ein wasserlöslicher Ligand einer Phiole zugefügt. Bevorzugt wird eine hermetisch verschließbare Reaktionsphiole verwendet, die Mittel zum Einleiten und Entnehmen von Reagens bevorzugt unter sterilen oder halbsterilen Bedingungen aufweist. Eine Phiole, die eine Öffnung für eine Injektion mittels Spritze aufweist, wird bevorzugt. Alle Reagenzien können mittels Spritze in die Reaktionsphiole injiziert und daraus entnommen werden, wodurch die Gefahr verringert wird, daß jemand Reagenzien ausgesetzt wird, die ein Strahlen- oder biologisches Risiko bedeuten. Bei einer am meisten bevorzugten Ausführungsform wird das Gemisch lyophilisiert, und die Phiole wird vorverschlossen und zum Gebrauch in dieser Form geliefert. Zum Markieren des Antikörpers oder Antikörperfragments wird Technetium-99m in einem oxidierten Zustand mit dem Antikörpergemisch in Kontakt gebracht. Dann läßt man die Radiomarkierungsreaktion ablaufen. Die Dauer und Bedingung der Inkubation sind nicht kritisch. Bevorzugt wird die Inkubation für einen Zeitraum von ca. 1 min bis ca. 60 min und am meisten bevorzugt von ca. 5 min bis ca. 30 min durchgeführt.
- Nach Beendigung der Markierungsreaktion wird der markierte Antikörper oder das Antikörperfragment aus der Phiole entnommen. Weder eine Trennung noch eine Reinigung sind erforderlich. Der gesamte Vorgang kann in weniger als 15 min bei Umgebungstemperatur und einem pH von ca. 5-9 ablaufen. Unter diesen Bedingungen kann eine im wesentlichen komplette Markierung des Antikörpers oder Antikörperfragments mit Technetium-99m ohne erheblichen Verlust von Antikörper- Immunreaktivität erreicht werden.
- Die verschiedenen Reagenzien, die bei dem Verfahren eingesetzt werden, und die Parameter des Verfahrens werden nachstehend im einzelnen erörtert.
- Im allgemeinen sind bei dem Verfahren nach der Erfindung nützliche Liganden wasserlösliche Chelatbildner (oder sie können wasserlöslich gemacht werden), die fähig sind, mit Technetium-99m oder einem der Rhenium-Radioisotope in ihrem reduzierten Zustand einen Komplex zu bilden, um einen stabilen Metallion/Liganden-Komplex zu bilden. Der Komplex kann das Technetium-99 mit einem Sulfhydryl enthaltenden Antikörper oder Antikörperfragment austauschen.
- Die bei der Erfindung eingesetzten Liganden sind Polyhydroxydicarbonsäuren mit einem Molekulargewicht von weniger als ca. 10.000 Dalton und ausgewählt aus Saccharinsäure, Galactarsäure, Arabonsäure und Salzen davon.
- Der besonders bevorzugte Ligand zur Verwendung bei diesem Verfahren ist Saccharinsäure. Wie gesagt, komplexiert Saccharinsäure rasch mit Technetium-99m, um einen stabilen Technetium-99m-Saccharat-Komplex zu bilden. Bei Kontakt mit einem Sulfhydryl enthaltenden Antikörper oder Antikörperfragment wird eine im wesentlichen quantitative Übertragung von Technitium-99m aus dem Komplex an das Protein rasch und unter schonenden Bedingungen erreicht. Wie nachstehend beschrieben wird, wird angenommen, daß das Technetium-99m vorzugsweise auf bevorzugte Bindungsstellen an den Proteinmolekülen übertragen wird. Diese bevorzugte Übertragung resultiert in einem markierten Antikörper oder -fragment, das in vivo immunreaktiv und ausgesprochen stabil ist.
- Reduktionsmittel zum Einsatz bei dem Verfahren sind physiologisch akzeptabel, um Technetium-99m aus seinem oxidierten Zustand in den Oxidationszustand IV oder V zu reduzieren oder um Rhenium aus seinem oxidierten Zustand zu reduzieren. Beispiele von Reduktionsmitteln, die bei dem Verfahren eingesetzt werden können, sind Zinn(II)-chlorid, Zinn(II)-fluorid, Zinn(II)-tartrat und Natriumdithionit; die bevorzugten Mittel sind Zinn(II)-Reduktionsmittel, insbesondere Zinn(II)-chlorid.
- Die Quelle von Technetium-99m sollte bevorzugt wasserlöslich sein. Bevorzugte Quellen sind Alkali- und Erdalkalimetall- Pertechnetat (TcO4-). Das Technetium-99m wird besonders bevorzugt in Form von frischem Natriumpertechnetat aus einem sterilen Technetium-99m-Generator (z. B. aus einem herkömmlichen &sup9;&sup9;Mo/99mTc-Generator) erhalten. Es kann aber jede andere Quelle von physiologisch akzeptablem Technetium-99m verwendet werden.
- Rhenium-Radioisotope (die Isotope 186, 188, 189 und 191) in Form von Perrhenatsalzen können mittels geeigneter Reaktortechnologie produziert oder von einem geeigneten Generator erzeugt werden. Die Perrhenatsalze sind stabile, lösliche Salze und verhalten sich gleichartig wie Pertechnetat. Perrhenat verlangt ein etwas größeres Reduktionspotential zur Reduktion und hat die Tendenz, in Gegenwart von Sauerstoff rascher als Pertechnetat zu Perrhenat zurückzukehren. Daher können andere Bedingungen notwendig sein, um Rhenium zu reduzieren und in seinem reduzierten Zustand zu stabilisieren. Diese Bedingungen können von einem Fachmann empirisch ermittelt werden.
- Die Sulfhydryl enthaltenden ganzen Antikörper oder Antikörperfragmente mit niedrigerem Molekulargewicht können mit dem Verfahren der Erfindung markiert werden. Es wird angenommen, daß Sulfhydrylgruppen wenigstens einen Teil von bevorzugten Bindungsstellen bilden, die an Molekülen anwesend sind, und daß mit dem Verfahren der Erfindung die Radiometalle bevorzugt aus dem Radiometall/Liganden-Komplex zu diesen bevorzugten Stellen an den Molekülen ausgetauscht werden. Die bevorzugte Markierung dieser Stellen an den Antikörper- Molekülen resultiert in markierten Antikörpern ausnehmend guter Stabilität.
- Ganze Antikörper (z. B. IgG) können mit Sulfhydrylgruppen versehen werden durch Reduktion der Antikörper mit einem Reduktionsmittel wie etwa Dithiothreitol DTT. Die Behandlung mit DTT legt die Sulfhydrylgruppen durch Reduktion von Disulfidbrücken frei.
- Für die meisten immundiagnostischen Verfahren sind Antikörperfragmente bevorzugte Reagenzien. Antikörperfragmente bieten gegenüber ganzen Antikörpern eine Reihe von Vorteilen für Abbildungsverfahren, was im allgemeinen die raschere Verteilung und Ansammlung an der Zielstelle und eine geringere Immunogenität einschließt. Fab'-Fragmente sind einwertig und Antigen-bindend und enthalten freie Sulfhydrylgruppen (wenn sie unter nichtoxidierenden Bedingungen gehalten werden). Diese Fragmente können mit dem Verfahren nach der Erfindung wirkungsvoll markiert werden.
- Fab'-Fragmente können wie folgt aus ganzen Antikörpern hergestellt werden: Ein Antikörper-Molekül wird zuerst mit einer Endopeptidase wie etwa Pepsin behandelt, um den Fc- Teil des Antikörper-Moleküls zu entfernen. Das resultierende F(ab)'&sub2;-Fragment wird mit einem Reduktionsmittel wie DTT oder Cystein behandelt, um Disulfidbindungen aufzubrechen, die an dem F(ab)'&sub2;-Fragment anwesend sind, was in der Freilegung der an den Molekülen anwesenden Sulfhydrylgruppen resultiert, wodurch zwei Fab'-Moleküle aus jedem Antikörper- Molekül erhalten werden.
- Die Menge des Reduktionsmittels ist die Menge, die notwendig ist, um das Technetium zu reduzieren, um die Bindung an den Liganden in einem reduzierten Zustand zu ermöglichen. Bei einer bevorzugten Ausführung ist Zinn(II)-chlorid (Sncl&sub2;) das Reduktionsmittel und kann im Bereich von 1-1000 ug/ml, bevorzugt ca. 30-500 ug/ml liegen. Die Menge Saccharinsäure (als Kaliumsaccharat) kann zwischen ca. 0,5 mg/ml und der in dem Medium maximal löslichen Menge liegen. Bevorzugte Mengen von Saccharinsäure liegen im Bereich von 30-15 ug/ml. Die Menge von Antikörper (oder -fragment) kann zwischen 0,01 und ca. 30 mg/ml, bevorzugt von ca. 0,17 bis ca. 1,5 mg/ml betragen. Schließlich kann Technetium-99m in Form von Pertechnetat in Mengen eingesetzt werden, die bis zu ca. 500 uCi/ml, bevorzugt ca. 1-50 mCi/ml betragen. Die Menge von mCi je mg Antikörper ist bevorzugt ca. 3-150.
- Die Reaktion zwischen dem Protein und dem Metallion-Übertragungsliganden-Komplex wird bevorzugt in einer wäßrigen Lösung bei einem pH ausgeführt, bei dem das Protein stabil ist. "Stabil" bedeutet, daß das Protein löslich bleibt und seine biologische Aktivität beibehält. Normalerweise ist der pH für die Reaktion ein pH von ca. 5-9, wobei der bevorzugte pH ca. 6-8 ist. Der Metallion-Übertragungschelat-Komplex und der Antikörper werden inkubiert, und zwar bevorzugt bei einer Temperatur von ca. 20ºC bis ca. 60ºC, am meisten bevorzugt von ca. 20ºC bis ca. 37ºC, und zwar für eine ausreichende Dauer, um die Übertragung des Metallions aus dem Liganden-Komplex zu dem Antikörper zuzulassen. Im allgemeinen genügt weniger als eine Stunde, um die Übertragungsreaktion unter diesen Bedingungen zu beenden.
- Das Reagens zur Durchführung des Markierungsverfahrens kann in Sets zusammengestellt sein, um das Verfahren bequem in der Klinik durchzuführen. Ein Set zur Markierung von Antikörper oder Antikörperfragmenten mit den Radiometallen kann im Minimalfall aus einer Komponente, nämlich einer Phiole (hermetisch verschlossen und steril) bestehen, die ein Reduktionsmittel (bevorzugt Zinn(II)-ionen) und Saccharinsäure oder ein Salz davon enthält. Diese Sets können verwendet werden, wenn der Antikörper oder das Antikörperfragment vom Benutzer zur Verfügung gestellt wird.
- Sets können auch eine zweite Phiole aufweisen, die den Sulfhydryl enthaltenden Antikörper oder das Antikörperfragment enthält, das zu markieren ist. Zwei-Komponenten-Sets weisen folgendes auf:
- a. eine Phiole, die ein Reduktionsmittel und einen wasserlöslichen Übertragungsliganden enthält; und
- b. einen Sulfhydryl enthaltenden Antikörper oder ein solches Antikörperfragment unter nichtoxidierenden Bedingungen.
- Sets können ausgelegt sein, um den entsprechenden Antikörper oder das (die) Antikörperfragment(e) für jedes spezielle immundiagnostische oder immuntherapeutische Vorgehen (von denen einige nachstehend erörtert werden) zu enthalten.
- Die Reagenzien in dem Set können in wäßriger, lyophilisierter oder gefrorener Form vorgesehen sein. Lyophilisierte Zubereitungen können beim Gebrauch mit wäßrigem Medium verdünnt werden. Die Menge an Reagenzien in jeder Phiole kann je nach den gewählten Parametern des Verfahrens verschieden sein (siehe oben unter Reaktionsbedingungen).
- Wenn Reagenzien als ein Zwei-Komponenten-Set wie beschrieben vorgesehen sind, kann der Markierungsvorgang einfach als eine Zwei-Phiolen-Technik durchgeführt werden. Technetium- 99m (beispielsweise in Form von wäßrigem Natriumpertechnetat) wird der Phiole zugesetzt, die das Reduktionsmittel und den wasserlöslichen Liganden in wäßriger Lösung enthält.
- Die Inhalte der beiden Phiolen werden dann vermischt und für einen Zeitraum inkubiert, der ausreicht, um die Markierung des Antikörpers oder Antikörperfragments zu bewirken. Der radiomarkierte Antikörper oder das Antikörperfragment können dann ohne Reinigung unmittelbar eingesetzt werden.
- Die Reagenzien zur Durchführung des Markierungsverfahrens werden in einem Ein-Phiolen-Set zusammengestellt, um das Verfahren vorteilhaft in der Klinik auszuführen. Bei einer Ausführungsform umfaßt das Set eine Phiole (hermetisch verschlossen und steril), die einen Sulfhydryl enthaltenden Antikörper oder ein Antikörperfragment, ein Reduktionsmittel (bevorzugt Zinn(II)-ionen) und einen wasserlöslichen Liganden (bevorzugt D-Glucarsäure oder ein Salz davon) enthält. Diese Sets können verwendet werden, wenn Technetium-99m vom Benutzer bereitgestellt wird. Die Sets sind ausgelegt, um den entsprechenden Antikörper oder Antikörperfragment(e) für jedes spezielle immundiagnostische oder immuntherapeutische Verfahren (von denen einige nachstehend erörtert werden) zu enthalten.
- Die Reagenzien in dem Set können in wäßriger, gefrorener oder lyophilisierter Form vorgesehen sein. Lyophilisierte Zubereitungen können zum Gebrauch mit wäßrigem Medium verdünnt werden. Die Menge an Reagenzien in jeder Phiole kann je nach den gewählten Parametern des Verfahrens verschieden sein (siehe oben unter Reaktionsbedingungen). Das Markierungsverfahren kann ausgeführt werden, indem einfach Technetium-99m (beispielsweise in Form von wäßrigem Natriumpertechnetat) der Phiole zugesetzt wird, die den Antikörper oder das Antikörperfragment, das Reduktionsmittel und, bei einer bevorzugten Ausführungsform, den wasserlöslichen Liganden enthält. Der Inhalt der Phiole wird dann vermischt und für einen ausreichenden Zeitraum inkubiert, um die Markierung des Antikörpers oder Antikörperfragments zu bewirken. Der radiomarkierte Antikörper oder das Antikörperfragment kann dann sofort ohne Reinigung verwendet werden.
- Technetium-99m-markierte Antikörper oder Antikörperfragmente können in der Immunszintigraphie eingesetzt werden. Wie gesagt, werden für die meisten immunszintigraphischen Techniken Antikörperfragmente bevorzugt. Markierte Fab'-Fragmente von tumorspezifischen Antikörpern können präpariert und eingesetzt werden, um Primär- oder Sekundärtumoren abzubilden. Im allgemeinen wird das Technetium-99m-markierte Antikörperfragment präpariert durch Bilden eines wäßrigen Gemischs aus (i) 99mTc; und (ii) einem Reduktionsmittel und einem wasserlöslichen Liganden; und In-Kontakt-Bringen des Gemischs mit einem für den Tumor spezifischen Fab'-Fragment.
- Das markierte Fab'-Fragment kann dann parenteral (bevorzugt intravenös) in einen Patienten injiziert werden. Nach der Injektion läßt man ausreichend Zeit verstreichen, bis das markierte Fab'-Fragment sich an der Tumorstelle sammelt. Der Patient wird dann mit einer Gamma-Kamera abgetastet, um die Gamma-Emission des Technetiums-99m nachzuweisen und dadurch eine Abbildung des Tumors zu erhalten. Auf diese Weise kann der Tumor lokalisiert und seine Größe bestimmt werden.
- Tumor-spezifische Antikörperfragmente zur Verwendung bei diesen Verfahren können von Anti-Kolorektalkarzinom-Antikörper, Anti-Lunkenkarzinom-Antikörper, Anti-Ovarialkarzinom-Antikörper, Anti-Mammakarzinom-Antikörper und Anti- Prostatakarzinom-Antikörper erhalten werden. Einige spezielle Beispiele von tumorspezifischen Antikörpern, die mit dem Verfahren nach der Erfindung markiert und zur Abbildung von Tumoren eingesetzt werden können, sind die monoklonalen Antikörper 17-1A und 19-9 (gastrointestinal), CA 125 (ovarial) und 103D2 (Brust).
- Mit dem Verfahren der Erfindung markierte Antikörper können eingesetzt werden, um Myocardinfarkte abzubilden. Die Abbildung von Myocardinfarkten zur Bestimmung ihrer Größe und Lage wird von Haber in der US-PS 4 421 735 beschrieben. Kurz gesagt, wird bei Anwendung des Markierungsverfahrens der Erfindung eine Abbildung eines Myocardinfarkts eines Patienten erhalten, indem zuerst ein Tc-99m-markiertes, Myosinspezifisches Fab'-Fragment präpariert wird, wobei zuerst ein wäßriges Gemisch aus (i) 99mTc und (ii) einem Reduktionsmittel und einem wasserlöslichen Liganden für 99mTc hergestellt wird; und dann das Gemisch mit einem Myosin-spezifischen Fab'-Fragment in Kontakt gebracht wird. Das markierte Myosin-spezifische Fragment wird dann intravenös in einen Patienten injiziert (beispielsweise nach einem Koronarverschluß). Man läßt das markierte Fragment am Ort des Infarkts akkumulieren, und eine Abbildung des Infarkts wird durch Abtasten des Herzbereichs mit einer Gamma-Kamera erhalten.
- Ein bevorzugter Antikörper für die Erzeugung von markierten Myosin-spezifischen Fab'-Fragmenten ist der monoklonale Antikörper R11D10.
- Außerdem können Fibrin-spezifische Fab'-Fragmente mit dem Verfahren der Erfindung markiert werden, um Reagenzien zur Abbildung von Blutgerinnseln herzustellen. Ein Tc-99mmarkiertes Fibrin-spezifisches Fragment wird präpariert durch Bilden eines wäßrigen Gemischs aus (i) 99mTc und (ii) einem Reduktionsmittel und einem wasserlöslichen Liganden für 99mTc und In-Kontakt-Bringen des Gemischs mit einem Fibrin-spezifischen Fab'-Fragment. Das 99mTc-markierte Fibrin-spezifische Fragment wird in den Patienten injiziert. Nachdem sich das Fragment am Ort des Blutgerinnsels gesammelt hat, wird der Patient abgetastet, um eine Abbildung des Gerinnsels zu erhalten. Fibrin-spezifische Antikörper, die nicht kreuzreaktionsfähig mit Fibrinogen sind, sind die bevorzugten Antikörper für dieses Abbildungsverfahren.
- Antikörperfragmente, die für Bakterien spezifisch sind, können bei immunszintigraphischen Verfahren eingesetzt werden, um eine Abbildung eines bakteriellen Abszesses in einem Patienten zu erhalten. Zu diesem Zweck werden bakterienhemmende oder Anti-Makrophagen-Antikörperfragmente eingesetzt. Antikörper gegen eine gemeinsame Determinante von gramnegativen Bakterien (z. B. Anti-Lipid-A-Antikörper) können eingesetzt werden, um einen Abszeß abzubilden, der durch einen gramnegativen Mikroorganismus hervorgerufen ist. Der Antikörper wird-mit Technetium-99m wie oben beschrieben markiert, in den Patienten injiziert, und kann sich dann an dem Abszeß ansammeln. Der Patient wird dann mit dem Photoabtastgerät abgetastet, um eine Abbildung des Abszesses zu erhalten.
- Rhenium-markierte Antikörper oder Antikörperfragmente können eingesetzt werden, um selektiv Rhenium-Radioisotope an Zielzellen in vivo abzugeben. Beispielsweise können Rheniummarkierte Antikörper selektiv Krebszellen suchen und zerstören. Zu diesem Zweck können Tumor-spezifische Antikörper, wie sie oben beschrieben wurden, mit dem Verfahren der Erfindung markiert werden, und der resultierende markierte Antikörper kann parenteral in einen Patienten injiziert werden, der von dem Tumor befallen ist.
- Die Erfindung wird durch die nachstehende Beispielsbeschreibung weiter veranschaulicht.
- Monokaliumsaccharat (25 mg) wurde in 0,2M Hydrogencarbonat (1,0 ml) mit pH 8,0 gelöst. 500 -1 Saccharatlösung wurden 40 ul Zinn(II)-chlorid (2,5 mg/ml) in 0,1M Essigsäure zugefügt, gefolgt von 500 ul Tc-99m-Generatoreluat (_60 mCi/mg Protein). Die resultierende Lösung ließ man für 5 min bei Raumtemperatur stehen, wonach sie auf radiochemische Reinheit mittels Papierchromatographie (Whatman 3MM, 60% CH&sub3;CN:40%H&sub2;O) analysiert wurde.
- Monoklonaler Antimyosin-Antikörper R11D10 (F(ab)'2, 5 mg/ml in 40mM Trispuffer mit pH 7,0, wurde mit 10mM DTT für 60 min bei Raumtemperatur reduziert und dann durch eine Sephadex G-25-Säule geschickt, um das Reduktionsmittel zu entfernen. Die resultierende Lösung enthielt 80% Fab'-Fragment nach Gel-Filtrations-HPLC.
- Antimyosin-Antikörper R11D10 Fab' (500 ul einer 1 mg/ml- Lösung) in 50mM Phosphat, 0,35mM ZnCl&sub2;, pH 6,5, wurde mit 500 ul 99mTc-Saccharatlösung vermischt und bei Raumtemperatur für 5-60 min stehengelassen. Das resultierende 99mTcmarkierte Protein wurde auf radiochemische Reinheit mittels Papierchromatographie (Whatman 3MM; 60% CH&sub3;CN:40% H&sub2;O) und Gelfiltrations-HPLC und auf Immunreaktivität unter Verwendung einer Myosin-Affinitätssäule analysiert.
- 99mTc-Saccharat wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt unter Verwendung verschiedener Konzentrationen von Kaliumsaccharat (0,09-12,25 mg/ml). Die Produkte wurden mittels Papierchromatographie (Whatman 3MM, 60% CH&sub3;CN/40% H&sub2;O; 99mTc-Rf = 1,0, 99mTc-Saccharat, Rf = 0,4; 99mTcO&sub2;·xH&sub2;O, Rf = 0). Die Daten in der Tabelle I zeigen, daß eine Konzentration von 6 mg/ml Kaliumsaccharat in 0,2M Hydrogencarbonat genügt, um das reduzierte Technetium vollständig zu stabilisieren.
- Proben von 99mTc-Saccharat, das aus 6 und 12 mg/ml Kaliumsaccharat präpariert worden war, wurden über einen Zeitraum von 7 h analysiert. Die Resultate (Tabelle II) zeigten, daß das Präparat aus 12 mg/ml Saccharat stabiler war und über einen Zeitraum von ca. 2 h stabil war.
- 99mTc-markiertes R11D10 Fab' wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt unter Einsatz verschiedener Proteinkonzentrationen bis zu 1250 ug/ml. Nach 1 h wurden die Reaktionsgemische mittels Papierchromatographie und HPLC analysiert. Die Resultate (Tabelle III) zeigten, daß die radiochemische Ergiebigkeit von der Proteinkonzentration abhängig war und daß eine quantitative Markierung innerhalb von 1 h unter Einsatz von wenigstens 340 ug/ml erhalten werden konnte.
- 100 ul ganzer Antikörper (2 mg/ml), F(ab')&sub2; (2 mg/ml), Fab' (1mg/ml) von Antimyosin-Antikörper R11D10, Anti-Pankreas- Antikörper 19-9 und Anti-Kolorektal-Antikörper 17-1A wurden mit 100 ul 99mTc-Saccharatlösung bei Raumtemperatur für 1 und 3 h inkubiert. Die resultierenden Produkte wurden mittels Papierchromatographie analysiert. Die Resultate (Tabelle IV) zeigten, daß die Markierung von nichtreduzierten Antikörpern/Fragmenten weniger als 5% gegenüber einer quantitativen Markierung der Fab'-Fragmente betrug.
- Beide Antikörperfragmente wurden wie in Beispiel 1 beschrieben präpariert und markiert. Gelfiltrations-HPLC-Analyse der Produkte nach 3 h bei Raumtemperatur zeigt, daß bei dem 17-1A 35% des Proteins in Form von F(ab')&sub2; und 65% Fab' vorlag, wogegen bei R11D10 23% in Form von F(ab')&sub2; und 77% als Fab' vorlag. Der radioaktive Nachweis zeigte jedoch, daß 80% der Radioaktivität für beide Antikörper dem Fab'-Peak zugeordnet war. Diese Ergebnisse zeigen, daß das 99mTc- Saccharat bevorzugt die Fab'-Fragmente markiert.
- 99mTc-markiertes 17-1A Fab' und R11D10 Fab' wurden bei 37ºC für 1 h in Gegenwart und in Abwesenheit von Humanplasma inkubiert. Die Resultate (Tabelle V) zeigten, daß 80% des Technetiums an den Antikörper für mehr als 20 h gebunden blieb, und zwar auch in Gegenwart von Plasma.
- Die Immunreaktivität von 99mTc-R11D10 Fab'-Präparat wurde unter Verwendung einer Myosin-Affinitätssäule bestimmt. 99mTc-17-1A wurde als Kontrolle verwendet, um eine nichtspezifische Bindung zu schätzen. Jedes markierte Protein wurde bei 37ºC in Gegenwart von Humanplasma inkubiert.
- Wie die Tabelle VI zeigt, war das 99mTc-markierte R11D10 Fab' nach 3 h zu nahezu 80% immunreaktiv und nach 20 h 70% immunreaktiv. Der letztere Fall entsprach 80% Beibehaltung der Immunreaktivität, die unmittelbar nach der Markierung gefunden wurde.
- Mischlingshunde (n=6) wurden mit intravenös verabreichtem Pentobarbitol (30 mg/kg) anästhesiert, und die Atmung wurde an einem Harvard-Beatmungsgerät aufrechterhalten. Die linke Brustwand wurde eröffnet, das Herz in einer Perikardwiege aufgehängt, und ein Segment der linken vorderen absteigenden Koronararterie wurde ungefähr zwei drittel der Strecke von der Spitze bis zur Basis herausgetrennt. Die LAD wurde dann mit einem Seidenfaden verschlossen. Nach drei Stunden LAD- Verschluß wurde der verschließende Faden entfernt, und die Reperfusion wurde hergestellt. Nach 15 min Reperfusion wurden 200 uCi Indium-111-markiertes R11D10 Fab-DTPA injiziert, und 30 s später wurden 10 mCi Technetium-markiertes R11D10 Fab' injiziert. Die Reihenabbildung mit einer Gamma-Kamera wurde unmittelbar nach Verabreichung der Markierung eingeleitet. Fig. 1 zeigt die Gamma-Szintigramme eines Hunds nach 35 min (oben links), 1,5 h (oben rechts), 2,5 h (unten links) und 5 h (unten rechts) der Antikörperinjektion. Fig. 2 zeigt die Gamma-Abbildungen desselben Hunds wie in Fig. 1, und zwar eine rechte Seitenansicht (oben links), eine Hinter- und eine Vorderansicht (unten rechts). In sämtlichen Ansichten mit Ausnahme der Hinteransicht wurden deutliche Abbildungen des Myocardinfarkts beobachtet. Was noch wichtiger ist: Diese Figur zeigt keine signifikante Aufnahme in der Leber 3 h nach Injektion von Tc-R11D10-Fab'.
- Untersuchungen der biologischen Verteilung wurden mit Balb/c-Mäusen durchgeführt. Die Mäuse (4 Mäuse je Gruppe) wurden intravenös entweder mit 150 uCi von Technetium-99mmarkiertem R11D10 Fab' (4 uCi/ug) oder 10 uCi Indium-111- markierter R11D10 Fab-DTPA (4 uCi/ug) injiziert.
- Gruppen von Mäusen wurden 1, 4 und 8 Stunden nach Empfang der Injektionen getötet, und Organe wurden entnommen, gewogen und gezählt. Die Tabelle VII faßt die Prozentsätze der injizierten Dosis pro Gramm, der für jedes Präparat erhalten wurde, zusammen.
- Das 99mTc-R11D10 Fab' verschwand rasch sowohl aus dem Blut als auch der Leber. Der Prozentsatz der injizierten Dosis bei Tc-R11D10 Fab' im Blut nach 1 h war 13,6% und fiel nach 8 h auf 2,0%. Ein gleichartiger Abfall der Radioaktivität wurde in der Leber zum letztgenannten Zeitpunkt beobachtet (6,4% in 1 h und 2,4% in 8 h). Das Indium-111-markierte Präparat zeigte jedoch eine viel höhere Radioaktivität sowohl in der Leber (10,8%) als auch im Blut (5,1%) in der achten Stunde nach der Injektion.
- Monokaliumarabonat (20 mg) wurde in 0,1M Na&sub2;CO&sub3; (1,0 ml) mit pH 10,0 gelöst. Zu 500 ul Arabonatlösung wurden 500 ul Tc- 99m-Generatoreluat (ca. 50 mCi/mg Protein) zugefügt, gefolgt von 40 ul Zinn(II)-chlorid (2,5 mg/ml) in 0,1M Essigsäure.
- Die resultierende Lösung ließ man für 30 min bei Raumtemperatur stehen, und dann wurde sie unter Einsatz von 1,0M Salzsäure auf pH 7 eingestellt.
- Die Probe wurde mittels Papierchromatographie (Whatman 3MM, 60% CH&sub3;CN:40% H&sub2;O) auf radiochemische Reinheit analysiert.
- Das gleiche Vorgehen wie in Beispiel 1 wurde zur Herstellung von R11D10 Fab' angewandt.
- Antimyosin-Antikörper R11D10 Fab' (500 ul einer 1 mg/ml- Lösung) in 50mM Phosphat, 0,35mM ZnCl&sub2;&sub1; pH 6,5, wurde mit 500 ul 99mTc-Arabonatlösung vermischt und bei Raumtemperatur für 60 min stehengelassen. Das resultierende 99mTc-markierte Protein wurde auf radiochemische Reinheit wie in Beispiel 1 angegeben analysiert. Die Resultate zeigten die quantitative Übertragung von 99mTc auf das Protein unter diesen Bedingungen. TABELLEN Tabelle I Prozent 99mTcO2 und 99mTc-Saccharat nach Inkubation bei Raumtemperatur für 1 h in verschiedenen Konzentrationen von Saccharinsäure, analysiert mittels Papierchromatographie Saccharinsäure Tc-Saccharat Tabelle II Stabilität von 99mTc-Saccharat bei Raumtemperatur Zeit Tc-SACC Tabelle III Prozentsatz 99mTc-markiertes R11D10 Fab' nach Markierung mit 99mTc-Saccharat in verschiedenen Proteinkonzentrationen, analysiert mittels Papier- und HPLC-Gelfiltrationschromatographie Proteinkonzentration Tc-mark. Ab Tc-Saccharat Tabelle IV Auswertung der Übertragung von 99mTechnetium als 99mTc- Saccharat auf reduzierte gegenüber nichtreduzierten Antikörpern/Fragmenten Ab Markierung nach Tabelle V Stabilität von 99mTc-markiertem 17-1A Fab' und 99mTcmarkiertem R11D10 Fab' in Ab- und in Anwesenheit von Humanplasma Tc-markiertes Ab ohne H-Plasma mit Tabelle VI Immunreaktivität von Tc-markiertem R11D10 Fab' Bindung Tabelle VII Bioverteilung in % injizierte Dosis je Gramm Indiummarkierter R11D10 Fab-DTPA und Technetium-99m-markiertem R11D10 Fab' nach 1, 4 und 8 h nach Injektion in Mäuse Gewebe Blut Milz Magen Darm Niere Leber Lunge Herz Muskeln Knochen keine Angaben
- T2G1s F(ab')&sub2;-Antikörperfragment (162 mg) in Trispuffer (15,5 ml, 0,05M, pH 8,0) mit Natriumchlorid (0,1M) wurde mit DTT (1mM) für 1-2 h bei Umgebungstemperatur behandelt. Das resultierende Gemisch wurde mittels Diafiltration unter Argongas durch Austausch mit 20 Volumina Natriumphosphatpuffer (0,05M, pH 6,4), enthaltend Natriumchlorid (0,1M) und EDTA (0,001M), gereinigt und ergab eine Lösung, die T2G1s Fab' (135 mg, Konzentration 1 mg/ml) enthielt.
- Einer entgasten Lösung (5 ml) von Monokalium-D-glucarsäure (12,5 mg/ml, 0,05M) in Kaliumphosphatpuffer (0,05M, pH 6,4) mit EDTA (0,0005M) und Natriumchlorid (0,16M) wurde Zinn(II)-chloridlösung (7,5 ul, 0,1 mg/ml in 1N HCl) zugefügt. Dieser Lösung (4,7 ml) wurde eine Lösung von murinem monoklonalem Antikörper-Fab'-Fragment, gewonnen aus Zellinie T2Gls (0,312 ml, 8 mg/ml in 0,05M Kaliumphosphatpuffer, pH 6,4, enthaltend 0,1M Natirumchlorid und 0,001M EDTA) und präpariert wie in Unterabschnitt A.1 oben beschrieben, zugefügt. Nach gründlichem Vermischen wurden Portionen (1,0 ml) in Serumphiolen gefüllt, lyophilisiert und dann mit einem Gummiverschluß dicht verschlossen.
- Bei einem Ein-Phiolen-Verfahren wurde Natrium(99mTc)pertechnetat (1,0 ml, 20 mCi) der Phiole von T2G1s Fab', die in Unterabschnitt A.2 beschrieben ist, zugefügt. Man ließ die Lösung bei Umgebungstemperatur stehen, und das Gemisch wurde in Abständen analysiert unter Anwendung der Chromatographie auf WhatmanTM 3MM-Papier und Elution mit Acetonitril:Wasser (7 : 3). Bei diesem System verblieb das Produkt an dem Ursprung, während (99mTc)pertechnetat und reduziertes komplexiertes Technetium-99m von dem Ursprung abwanderten. Das Ende der Reaktion wurde durch den Prozentsatz von radiomarkiertem Produkt an dem Ursprung festgestellt. Weitere Verdünnungen wurden erforderlichenfalls mit Kochsalzlösung (0,9%) vorgenommen. Das Produkt dieses Ein-Phiolen- Verfahrens wurde weiter analysiert, wie in dem folgenden Abschnitt C beschrieben wird.
- Eine Phiole wurde präpariert, so daß sie T2G1s Fab' (0,5 mg), im wesentlichen wie oben in Unterabschnitt A.1 beschrieben präpariert, in einer Pufferlösung (1,0 ml) aus Kaliumphosphat (0,05M, pH 6,4), Natriumchlorid (0,1M) und EDTA (0,001M) enthielt. Die Phiole wurde mit einem Gummiverschluß verschlossen.
- Es wurde eine Phiole präpariert, so daß sie T2G1s Fab' (0,5 mg), im wesentlichen gemäß der Beschreibung in Unterabschnitt A.1 präpariert, in einer Pufferlösung (1,0 ml) aus Kaliumphosphat (0,05M, pH 6,4), Natriumchlorid (0,05M), Lactose (0,05M) und EDTA (0,0005M) enthielt. Der Inhalt der Phiole wurde lyophilisiert und die Phiole dann mit einem Gummiverschluß verschlossen.
- Unter Anwendung von anaeroben Bedingungen wurden Phiolen präpariert, so daß sie eine Lösung (1,0 ml) aus Monokalium- D-glucarsäure (12,5 mg, 0,05 mmol), Zinn(II)-chlorid (150 ug, 0,79 umol) und Natriumhydrogencarbonat (16,8 mg, 0,2 mmol, pH 7,6) enthielten. Der Phioleninhalt wurde lyophilisiert und die Phiolen dann mit einem Gummiverschluß verschlossen.
- Bei den Zwei-Phiolen-Verfahren wurde der oben beschriebenen Zinn(II)-zusammensetzung Natrium(99mTc)pertechnetat (1,0 ml, 20 mCi) zugefügt. Nach 10 min wurde 0,5 ml dieser Lösung der Lösung und lyophilisierten Formulierungen des T2G1s Fab' gemäß der Beschreibungen in den obigen Unterabschnitten a) und b) zugesetzt. Das Produkt wurde wie in Abschnitt C beschrieben analysiert.
- Die Immunreaktivität des markierten Antikörpers wurde getestet durch Aufbringen einer Teilmenge der Antikörper- Reaktionsgemische auf eine Affinitätssäule (die ersten sieben Aminosäuren des Aminoterminus der Beta-Kette von Humanfibrin, gekoppelt an CNBr-Sepharose® 6B). Das Volumen des gepackten Betts war 1 ml. Die Säule wurde mit 10 ml 1% BSA in 0,01M Natriumphosphat, 0,145M NaCl, pH 7,0, eluiert, gefolgt von Elution mit 10 ml 0,1M Glycin, pH 2,5. Während dieser Elutionsschritte wurden Fraktionen von jeweils 1 ml gesammelt und in einer NaI(T1)-Vertiefungszähleinrichtung gezählt. Der Prozentsatz der Immunreaktivität wurde wie folgt berechnet:
- % Immunreaktiv. = Glvcin-eluierte Gesamtnettozählwerte/mit beiden Lösungen eluierte Gesamtnettozählwerte·100
- Die Resultate sind in den Tabellen VIII und IX gezeigt.
- Die Tabelle 1 zeigt auch Markierungsraten für die Ein- und die Zwei-Phiolen-Sets, bestimmt durch den % Proteineinschluß gemäß der in Unterabschnitt A.3 beschriebenen Papierchromatographie-Technik. Die Resultate zeigen, daß das Ein- Phiolen-Set markiertes Produkt rascher als die Zwei-Phiolen- Sets erzeugt. Tabelle VIII Markierungsverhältnis von Ein- und Zwei-Phiolen-Sets Set Lager-Temp Alter bei Test Protein-Einschluß Immunreaktivität Zwei-Phiolen-Lösung Zwei-Phiolen lyophilisiert Eine Phiole
- Die Stabilität der Ein- und der Zwei-Phiolen-Sets wurde durch % Proteineinschluß mittels der in Unterabschnitt A.3 beschriebenen Papierchromatographie bei 40 und bei 370 bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, daß das Ein-Phiolen-Set in dem Zeitraum von 12-17 Tagen bei Lagerung bei 370 einen überlegenen Markierungs-Wirkungsgrad behält. Tabelle IX Stabilität von Ein- und Zwei-Phiolen-Sets Set Lager-Temp Alter bei Test Protein-Einschluß Immunreaktivität Zwei-Phiolen-Lösung Zwei-Phiolen lyophilisiert Eine Phiole
- Die biologische Verteilung in Mäusen von markierten Antikörperfragmenten, präpariert mit dem Ein-Phiolen-Set und dem Zwei-Phiolen-Lösungsset gemaß der obigen Beschreibung in den Abschnitten A und B, wurde untersucht durch intravenöses Injizieren von Mäusen mit den markierten Fragmenten und Bestimmen der relativen Mengen von Radiomarkierung, die sich in verschiedenem Gewebe ansammelten. Die Resultate sind in der Tabelle X und in den Fig. 3-7 gezeigt. Die Resultate zeigen statistisch signifikante Unterschiede, wobei das Ein- Phiolen-Set in jedem ausgewerteten Organsystem günstiger ist. Tabelle X UNTERSUCHUNG DER BIOVERTEILUNG VON ANTIFIBRIN T2G1S IN MÄUSEN VERGLEICH VON EIN- UND DOPPELPHIOLEN-PRÄPARATEN MITTLERE %-DOSIS JE GRAMM IN FÜNF TIEREN Organ-System Zeit nach Injekt. Eine Phiole Mittel Doppelphiole p-Wert Blut Herz Lungen Leber Milz Nieren Magen Dünndarm Dickdarm Muskeln Gonaden
- Markierter Antikörper wurde wie in den obigen Beispielen und dem Vergleichsversuch (Lösungsformulierung) präpariert. Die 99mTc-markierten T2G1s Fab'-Fragmente (100 ul) wurden citriertem Plasma (50 ul) zugefügt. Die Tabelle XI vergleicht die Plasmastabilität, bestimmt durch % Proteineinschluß bei 370 der Produkte aus dem Ein-Phiolen-Set und dem Zwei-Phiolen-Set gegenüber einer Kontrolle (kein Plasma zugefügt). Die Resultate zeigen, daß die Plasmastabilität des Ein-Phiolen-Sets besser als die des Zwei-Phiolen-Sets ist. Tabelle XI Set kein Plasma zugefügt Kontrolle Einschluß Zwei-Phiolen-Lösung Eine Phiole
Claims (26)
1. Verfahren zum direkten Markieren eines Sulfhydryl
enthaltenden Antikörpers oder Antikörperfragments mit
einem radioaktiven Metall, das ausgewählt ist aus der
Gruppe, die aus Technetium-99m, Rhenium-186, Rhenium-
188, Rhenium-189 und Rhenium-191 besteht, wobei das
Verfahren die folgenden Schritte aufweist:
a. Bilden eines Gemischs aus:
i) dem radioaktiven Metall; und
ii) einem Reduktionsmittel und einem
wasserlöslichen Polyhydrocarboxyl-Liganden, der ausgewählt
ist aus Saccharinsäure, Galactarsäure,
Arabonsäure und Salzen davon, wobei der Ligand fähig
ist, das radioaktive Metall zu komplexieren, um
einen löslichen Radiometall-Ligand-Komplex zu
bilden;
b. In-Kontakt-Bringen des Gemischs mit einem
Sulfhydryl enthaltenden Antikörper oder
Antikörperfragment unter Bedingungen, die die Übertragung des
Radiometalls auf den Antikörper oder das Fragment
erlauben, um einen Radiometall-markierten
Antikörper oder ein solches Antikörperfragment zu bilden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Sulfhydryl
enthaltende Antikörper ein reduziertes IgG ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Antikörperfragment
ein Fab'-Fragment ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Fab' durch Reduktion
eines F(ab')&sub2; mit DTT erzeugt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reduktionsmittel
ein Zinn(II)-Reduktionsmittel ist.
6. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Fab'-Fragment von
Antimyosin-, Antifibrin- oder Antithrombozyt-Antikörper
abgeleitet ist.
7. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Fab'-Fragment von
einem Antitumor-Antikörper abgeleitet ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der
Antitumor-Antikörper ein Anti-Kolorektalkarzinom-Antikörper, Anti-
Ovarialkarzinom-Antikörper,
Anti-Lungenkarzinom-Antikörper, Anti-Mammakarzinom-Antikörper oder
Anti-Prostatakarzinom-Antikörper ist.
9. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Fab'-Fragment von
einem bakterienhemmenden Antikörper oder Anti-
Makrophagen-Antikörper abgeleitet ist.
10. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 5, wobei das
Antikörperfragment ein Fab'-Fragment ist, das
radioaktive Metall Technetium-99m in wäßriger Lösung ist und
der wasserlösliche Ligand eine Saccharinsäure oder ein
Salz davon aufweist.
11. Verfahren nach Anspruch 10 in Abhängigkeit von Anspruch
5, wobei das Gemisch aus Technetium-99m, Saccharinsäure
oder Salz davon und Zinn(II)-Reduktionsmittel in einer
ersten Phiole gebildet wird und der Inhalt der ersten
Phiole danach mit dem Inhalt einer zweiten Phiole, die
das Fab'-Fragment in wäßriger Lösung unter
nichtoxidierenden Bedingungen enthält, vermischt wird.
12. Zusammensetzung zum direkten Radiomarkieren von
Sulfhydryl enthaltenden Antikörpern oder
Antikörper-Fragmenten mit einem radioaktiven Metall, das ausgewählt
ist aus der Gruppe, die aus Technetium-99m, Rhenium-
186, Rhenium-188, Rhenium-189 und Rhenium-191 besteht,
wobei die Zusammensetzung ein Gemisch aus dem
radioaktiven Metall, einem Reduktionsmittel und
Saccharinsäure oder einem Salz davon in einer wäßrigen Lösung
mit einem pH von 5-9 aufweist.
13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei das
Reduktionsmittel ein Zinn(II)-Reduktionsmittel ist.
14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei das Zinn(II)-
Reduktionsmittel Zinn(II)-chlorid ist.
15. Set zum Radiomarkieren eines Sulfhydryl enthaltenden
Antikörpers oder Antikörper-Fragments mit einem
radioaktiven Metall, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die
aus Technetium-99m, Rhenium-186, Rhenium-188, Rhenium-
189 und Rhenium-191 besteht, wobei das Set folgendes
aufweist:
a. eine Phiole, die ein Gemisch aus einem
Reduktionsmittel und einem wasserlöslichen Polyhydroxycarboxyl-
Liganden, der aus Saccharinsäure, Galactarsäure und
Arabonsäure und Salzen davon ausgewählt ist, enthält;
und
b. eine Phiole, die Fab'-Fragment unter
nichtoxidierenden Bedingungen enthält.
16. Set nach Anspruch 15, wobei das Antikörper-Fragment ein
Fab'-Fragment, das Radiometall Technetium-99m und der
wasserlösliche Ligand ein Salz von Saccharinsäure ist.
17. Set nach Anspruch 15 oder Anspruch 16, wobei das
Reduktionsmittel ein Zinn(II)-Reduktionsmittel ist.
18. Set nach Anspruch 16, wobei das Fab'-Fragment von einem
Antimyosin-, Antifibrin- oder Antithrombozyt-Antikörper
abgeleitet ist.
19. Set nach Anspruch 16, wobei das Fab'-Fragment von einem
Antitumor-Antikörper abgeleitet ist.
20. Set nach Anspruch 19, wobei der Antitumor-Antikörper
ein Anti-Kolorektalkarzinom-Antikörper,
Anti-Ovarialkarzinom-Antikörper,
Anti-Mammakarzinom-Antikörper oder
Anti-Prostatakarzinom-Antikörper ist.
21. Set nach Anspruch 16, wobei das Fab'-Fragment von einem
bakterienhemmenden Antikörper oder einem
Anti-Makrophagen-Antikörper abgeleitet ist.
22. Verfahren zum Markieren eines Sulfhydryl enthaltenden
Fab'-Antikörper-Fragments mit Technetium-99m, wobei das
Verfahren folgende Schritte aufweist:
a. Bereitstellen einer Phiole, die ein lyophilisiertes
Gemisch aus folgendem enthält:
i. dem Fab'-Antikörper-Fragment;
ii. einem Zinn(II)-Reduktionsmittel; und
iii. D-Glucarsäure; und
b. Zufügen einer wäßrigen Lösung von
Natrium(99mTC)pertechnetat zu der Phiole.
23. Ein-Phiolen-Set zum Markieren eines Sulfhydryl
enthaltenden Antikörpers oder Antikörper-Fragments mit
Technetium-99m, wobei das Set ein Antikörpergemisch aus
einem Sulfhydryl enthaltenden Antikörper oder
Antikörper-Fragment, ein Reduktionsmittel und einen
wasserlöslichen Polyhydroxycarboxyl-Liganden, der ausgewählt
ist aus Saccharinsäure, Galactarsäure, Arabonsäure und
Salzen davon, aufweist, wobei das Antikörper-Gemisch
mit Technetium-99m in einem oxidierten Zustand
enthalten ist, um markierten Antikörper oder markiertes
Antikörper-Fragment bereitzustellen.
24. Ein-Phiolen-Set nach Anspruch 23, wobei das Antikörper-
Gemisch in einer lyophilisierten Form bereitgestellt
wird.
25. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bedingungen, die
die Überführung des radioaktiven Metalls erlauben,
folgende sind: eine Temperatur von ca. 20ºC bis ca.
60ºC, in einer wäßrigen Lösung mit einem pH von ca. 5
bis ca. 9, für ca. 1 h.
26. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Bedingungen,
unter denen Schritt (b) durchgeführt wird, folgende
sind: eine Temperatur von ca. 20ºC bis ca. 60ºC, in
einer wäßrigen Lösung mit einem pH von ca. 5 bis ca. 9,
für ca. 1 h.
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