DE3722273A1 - Festphasen-bindungsreagentien, ihre herstellung und sie enthaltende assay-kits - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft biochemische Bindungs-Assays vom heterogenen Typ, d.h. solche, bei denen eine biochemische Bindung erzeugt wird zwischen auf einem Festphasen-Träger immobilisierten Spezies und Spezies, die in einer Flüssig­ keit gelöst oder suspendiert sind. Die Erfindung betrifft insbesondere Festphasen-Reagentien mit Trägern, an denen in einem bestimmten Muster eine Vielzahl von Bindungs­ spezies fixiert ist, die aus einer gemeinsamen Quelle stammen, wie z.B. Zellen- oder Viruslysat.

Die Analyse von biologischen Flüssigkeiten zur Bestimmung von darin in Kombination vorhandenen bestimmten Spezies wird häufig durchgeführt für Diagnose- oder Reihenuntersu­ chungszwecke. Viele dieser Assays umfassen die Inkubation einer Probe der Flüssigkeit mit einem Streifen aus einem Festphasen-Material, an den eine Reihe von Spezies gebunden ist, die jeweils eine Bindungsaffinität für eine der nach­ zuweisenden Spezies haben. Der Streifen wird dann abgelesen, um die Anwesenheit der Bindung zwischen den ursprünglich auf dem Streifen vorhandenen Spezies und denjenigen in der Probe festzustellen.

Die auf den Streifen immobilisierten Spezies sind in der Regel biochemische Spezies, wie Proteine oder Peptide, die charakteristische Komponenten einer größeren biochemischen Spezies, wie z.B. eines Virus oder einer Zelle, sind. Bisher handelte es sich bei diesen Spezies-gebundenen Trägern um Tüpfelaufzeichnungen (Blots) von Elektropherogrammen. Da ein einzelnes Elektropherogramm nur eine begrenzte Anzahl von solchen Aufzeichnungen (Blots) liefern kann, unterliegen die Aufzeichnungen (Blots) Beschränkungen in bezug auf ihre Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Gesamtzuverlässigkeit. Abweichungen von einer elektrophoretischen Trennung zur nächsten sowie von einer Ausgangsmischung zur nächsten sind unvermeidlich. Durch die Verwendung von Elektro­ pherogrammen wird das Ausmaß, bis zu dem die verschiedenen Spezies voneinander getrennt und in gut definierten Banden fokussiert werden können, weiter eingeschränkt. Abweichungen in den Mengen der verschiedenen Spezies in der Ausgangsmi­ schung führen zu weiteren Problemen durch Schaffung einer Überbetonung bestimmter Spezies auf Kosten der anderen, wodurch der Nachweis bzw. die Bestimmung der Gesamtmischung erschwert wird.

Es wurde nun gefunden, daß Festphasen-Bindungsreagentien, die einen hohen Grad der Genauigkeit, der Ablesbarkeit und Reproduzierbarkeit in einem Bindungs-Assay ergeben, aus einem biologischen Quellengemisch hergestellt werden können durch Isolieren der verschiedenen Bindungsspezies der Wahl aus dem Gemisch, Verdünnen jeder isolierten Spezies in einer Trägerflüssigkeit unter Bildung einer Reihe von Stammi­ schungen, die jeweils eine der isolierten Spezies in einer vorgegebenen Konzentration enthalten, und Aufbringen der Mischungen auf diskrete, genau definierte Bereiche auf einem Festphasen-Träger, um die verschiedenen Spezies in einem vorgegebenen Muster an dem Träger zu immobilisieren. Die Erfindung ist insbesondere anwendbar bei der Herstellung einer Vielzahl derartiger Muster auf getrennten Trägern auf identische Weise, wobei alle Spezies scharf definierte Banden oder Bindungsbereiche mit einer im wesentlichen einheitlichen Dichte bilden. Diese Träger können Assay- Kits einverleibt werden, die Materialien zur Durchführung identischer Assays auf einer Vielzahl von Proben enthalten, wobei diese Kits außerdem zusätzliche Komponenten enthalten, wie sie für die Durchführung des Assays erforderlich sind.

Biologische Quellengemische, die zur praktischen Durchführung der Erfindung geeignet sind, können in bezug auf ihre Zusam­ mensetzung und die Quelle stark variieren. Diese Gemische umfassen im allgemeinen eine Kombination von biologischen Spezies, insbesondere Makromolekülen, die in Form von Mi­ schungen, Anhäufungen oder Kombinationen vorliegen. Die Erfin­ dung ist insbesondere anwendbar auf Mischungen derartiger Spezies, wie Peptide, Polypeptide und Proteine. Typische Beispiele für solche Mischungen sind Zellen- und Virus- Lysate. Die Erfindung kann beispielsweise angewendet werden zum Isolieren und Trennen von Zell- oder Virus- Antigenen für die Verwendung als Bindungsspezies zum Nach­ weis der Anwesenheit von Antikörpern zu den Antigenen in einer Probe einer Körperflüssigkeit. Alternativ können die Spezies in der Mischung die Antikörper selbst sein, die iso­ liert und zum Nachweis der Anwesenheit von Antigenen in der Flüssigkeitsprobe verwendet werden.

Im Prinzip handelt es sich bei den Spezies der erfindungsge­ mäß aufzutrennenden Mischung um irgendeine Kombination von Spezies, von denen jede eine spezifische Bindungsaffinität gegenüber einer von mehreren Komponenten hat, von denen an­ genommen wird, daß sie in der Testprobe vorhanden sind. Ein spezifisches Anwendungsgebiet der vorliegenden Erfin­ dung ist die Herstellung eines Festphasen-Bindungsreagens für einen Assay zur Bestimmung bzw. zum Nachweis des Vorhanden­ seins von Antikörpern zu einem oder mehreren der mit dem erworbenen Immunschwächesyndrom (AIDS) in Verbindung ge­ brachten Viren. Beispiele für anerkannte AIDS-Viren sind das Human T Zellen Leukemia Virus III (HTLV III), das Lymphadenopathy Associated-Virus (LAV) und das Acquired Immune Deficiency Syndrome Related Virus (ARV).

Vor der Abtrennung der Spezies wird das Gemisch im allge­ meinen hergestellt und bearbeitet nach konventionellen Methoden. Bezüglich der Zellen und Viren, insbesondere der in Zellkulturen vorhandenen Viren, werden die Zellen und Viren in einigen Fällen abgetötet und lysiert als Teil der Herstellung, vorzugsweise durch eine Kombination aus einem Detergens und Wärme in der Weise, daß die Bindungseigenschaf­ ten der Antigene oder anderen Spezies, die in dem Assay ver­ wendet werden sollen, im wesentlichen nicht geändert werden.

Die Abtrennung und Isolierung der Bindungsspezies von dem Quellengemisch erfolgt unter Anwendung eines Trennverfah­ rens oder -verfahrensfolge, die an das Ausgangsgemisch und an die nachzuweisenden Spezies angepaßt ist. In vielen Fällen ist es erwünscht, bestimmte Spezies unter Ausschluß von anderen zu isolieren, wobei die ausgewählten Spezies solche sind, die sich an die Spezies in der Probe binden, deren Anwesenheit am charakteristischsten ist für den Zustand, der nachgewiesen werden soll. Die Identität der charakteristischsten Spezies in einer Probe als Hinweis auf einen gegebenen Zustand ist dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt.

Die Abtrennung und Isolierung kann erzielt werden unter Anwendung konventioneller präparativer Trennmethoden, bei­ spielsweise verschiedener Formen der Chromatographie, wie sie bei biochemischen Präparaten angewendet werden. Je nach Umfang und Vielzahl der gesuchten Spezies kann eine Folge von Trennstufen verschiedener Art zur Isolie­ rung jeweils einer Spezies erforderlich sein. Die Reaktions­ folge kann eines oder mehrere dieser Verfahren, wie z.B. die Hochleistungs-Flüssigchromatographie, die Umkehrpha­ sen-Chromatographie, die Gelpermeationschromatographie, die Ionenaustauschchromatographie, die hydrophobe Wech­ selwirkungschromatographie, die Affinitätschromatographie, die Hydroxyapatit-Chromatographie und die Größenaus­ schlußchromatographie, umfassen.

Jede interessierende Bindungs-Spezies in dem Quellengemisch muß von jeder der anderen Spezies vollständig abgetrennt werden, eine vollständige Isolierung der Spezies von allen anderen Komponenten ist jedoch nicht immer erforder­ lich. Im Falle von Virus-Proteinen, die aus einem Virus stammen, das in einer speziellen Zellinie wächst, können beispielsweise auch kontaminierende Proteine und Nuklein­ säuren aus den Wirtszellen vorhanden sein. Wenn diese nicht immunoreaktiv sind mit den gleichen Antikörpern, die an die Virus-Proteine gebunden werden, brauchen sie nicht vollstän­ dig entfernt zu werden. Vorzugsweise wird jedoch eine aus­ reichende Menge dieser und anderer Fremdmaterialien entfernt, so daß die interessierende Spezies mindestens etwa 80 bis 90% des Isolats ausmacht.

Bei der Auswahl der Bedingungen für die Isolierverfahren muß berücksichtigt werden, daß die Bindungskapazitäten (beispielsweise die Immunoreaktivität) der einzelnen Spezies erhalten bleiben. Membranproteine sind beispielsweise häufig sehr hydrophob, die strenge Bedingungen, wie z.B. hohe Konzentrationen an Detergentien oder organischen Lösungs­ mitteln zum Eluieren aus einer speziellen Kolonne erfordern. Diese potentiell strengen Bedingungen können Proteine bis zu einem Punkt denaturieren, an dem sie mit den Antikörpern zu dem nativen Protein nicht mehr reagieren. Die besten Verfahrensbedingungen sind daher ein Gleichgewicht zwischen denaturierenden Bedingungen mit einer hohen Ausbeute und milderen Bedingungen mit einer höheren Immunoreaktivität.

Wenn die Spezies aus dem Quellengemisch einmal isoliert sind, wer­ den sie einzeln in Trägerflüssigkeiten verdünnt zur Bildung von individuellen Stammlösungen, von denen jede eine oder etwa eine der Spezies enthält. In einigen Fällen kann eine spezielle Spezies definiert sein als ein enger Molekular­ gewichtsbereich und sie kann einer verhältnismäßig breiten Elektropherogrammbande mit unscharfen Grenzbereichen ent­ sprechen, während andere Spezies als solche mit einzelnen Molekulargewichten definiert sein können. Das Verdünnen kann umfassen entweder ein Auflösen oder ein Suspendieren der Spezies in der Trägerflüssigkeit, je nach ihrer Löslich­ keit. Die Trägerflüssigkeit selbst kann wäßrig oder orga­ nisch oder eine Mischung davon sein und vorzugsweise handelt es sich dabei um eine Pufferlösung. Zu Beispielen gehören eine mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), TRIS/- Methanol, PBS/Propanol, PBS/Acetonitril und Carbonat. Die Konzentration der Spezies in der Trägerflüssigkeit ist nicht kritisch und sie kann stark variieren. Die Konzentration kann im allgemeinen beliebig gewählt werden, jedoch unter Be­ rücksichtigung der Speziesdichte, die angestrebt wird im Endzustand in gebundener Form an den Festphasen-Träger. Bei den meisten Anwendungszwecken ergibt eine Konzentration in dem Bereich von etwa 0,01 bis etwa 10 µg/ml die besten Ergeb­ nisse.

Häufig ist es erwünscht, daß die Stammlösungen aus den ver­ schiedensten Gründen weitere Komponenten enthalten. Zu Bei­ spielen gehören Detergentien, wie Natriumdodecylsulfat (SDS), Triton X-100 (Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pennsylvanien/ USA), 3-(Chloramidopropyl)dimethylammonio)-1-propansulfonat (CHAPS) und Tween 20, 40, 60 und 80 (Handelsprodukte der Firma Atlas Chemical Industries, Inc., Wilmington, Delaware/ USA). Es können auch bakterizide und bakteristatische Agen­ tien darin enthalten sein, wie z.B. Natriumazid und Thimero­ sal. Wenn die Spezies kovalent an den Träger gebunden werden sollen, können verschiedene Kupplungsmittel, wie sie dem Fachmann an sich bekannt sind, verwendet werden. Zu geeig­ neten Beispielen gehören EDAC (Ethyldimethylaminopropyl­ carbodiimid) und bifunktionelle Reagentien, wie z.B. MBS (m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester). Diese Kupp­ lungsmittel sind im allgemeinen in der Stammlösung nicht ent­ halten und ihre Verwendung kann entsprechend den konventio­ nellen Methoden sein. So kann beispielsweise die gesamte Trägeroberfläche zuerst mit dem Kupplungsmittel derivatisiert werden, worauf dann die Bindungs-Spezies auf die spezifi­ schen Bereiche aufgebracht werden. Die übrigen Bereiche kön­ nen dann blockiert werden oder ausgelöscht werden, um ein weiteres Binden zu verhindern.

Der Festphasen-Träger kann irgendein Material sein, das die Bindungs-Spezies immobilisieren kann, das jedoch im übrigen inert ist oder inert gemacht werden kann in bezug auf die anderen Reagentien und Komponenten in dem Assay, in dem der Träger verwendet werden soll. Die Auswahl des Trägermaterials hängt vom Typ der darauf zu immobilisierenden Spezies sowie von der Immobilisierungsmethode, die von der Adsorption bis zur chemischen Bindung reicht, ab.

Im allgemeinen kann irgendeine beliebige geometrische Gestalt verwendet werden, auf der genau definierte Bereiche, vorzugs­ weise diskrete Bereiche, einen für jede Spezies entsprechend einem vorgegebenen Muster bezeichnet werden können. Bei den meisten Anwendungen handelt es sich bei dem Träger um eine Membran, eine Folie bzw. Platte oder einen Streifen aus dem Material. Zu Beispielen für diese Trägermaterialien gehören Cellulosenitrat, Cellulose und derivatisierte Cellulose, Glasfasern, verschiedene Nylonarten und Derivate davon, Teflon und verwandte Materialien und Verbundstoffe aus die­ sen Materialien sowie Kombinationen dieser Materialien mit anderen Materialien, die Proteine oder Peptide binden können. Beispiele für die letztgenannten sind Ionenaustauschharze. Trägermaterialien in Form von Membranen oder Streifen sind zur Erleichterung des Eintauchens in die Probeflüssigkeiten bevorzugt.

Die Spezies werden in Form ihrer Stammlösungen auf den Trä­ ger aufgebracht unter Anwendung eines vorgegebenen Musters, das dem Anwender bekanntgegeben wird als Hilfsmittel für den Nachweis. Das Muster besteht aus genau definierten Be­ reichen auf dem Träger, die vorzugsweise einen Abstand vonein­ ander haben und jeweils eine einzelne Spezies (oder einen engen Molekulargewichtsbereich) in einer im wesentlichen ein­ heitlichen Dichte über die gesamte Fläche des Bereiches ent­ halten. Die Größe jedes Bereiches und die Gesamtanordnung sind nicht kritisch und können stark variiert werden und sie umfassen beispielsweise diskrete Punkte verschiedener Größen, diskrete Linien definierter Länge und Breite und kontinuier­ liche Linien definierter Breite. Parallele Linien ähnlich den Banden eines Elektropherogramms sind besonders vorteilhaft, wobei mit der vorliegenden Erfindung eine beträchtliche Ver­ besserung gegenüber den Elektropherogrammen erzielt werden kann durch Kontrolle bzw. Steuerung der Linien, um eine im wesentlichen einheitliche Intensität, Schärfe und Abstand zu erzielen.

Das Auftragsverfahren kann auch stark variieren, wobei die optimale Methode in jedem Falle von der geometrischen Form und der Anordnung der Bindungsbereiche abhängt. Das Auf­ bringen kann erzielt werden beispielsweise durch Sprühstrah­ len oder Mikrostrahlen, die aus unter Druck stehenden Düsen austreten, sowie durch Übertragung als Folge einer Kapillar­ wirkung. Das Auftragen kann umfassen das kontrollierte Auf­ sprühen von diskreten Mustern auf eine stationäre Membran­ oberfläche, das kontrollierte Aufsprühen von kontinuierli­ chen Linien- oder Punktmustern auf eine sich bewegende Membranoberfläche, das Aufbringen von abgemessenen Tropfen direkt auf eine stationäre oder sich bewegende Membranober­ fläche unter Verwendung einer Präzisionsmikropipettier­ einrichtung, das Aufbringen eines kontrollierten kontinuier­ lichen Stromes unter Verwendung einer Auftragseinrichtung vom Docht- oder Bürsten-Typ sowie beliebige andere Verfahren, mit denen es möglich ist, eine flüssige Lösung oder Suspen­ sion auf einen genau definierten Bereich auf einer Feststoff­ oberfläche aufzubringen.

Das Auftragsverfahren sowie die Konzentration der Stamm­ lösung werden ausgewählt im Hinblick auf die Erzielung der gewünschten Speziesdichte auf dem Festphasen-Träger. Die Dichten können stark variieren und optimale Mengen hängen von dem Nachweisverfahren ab, das in dem Assay selbst in Be­ tracht gezogen wird. Bei den meisten Anwendungen ergibt eine Speziesdichte von mindestens etwa 10 µg/m² Trägeroberfläche, vorzugsweise von etwa 0,1 bis etwa 10 µg/m² Trägeroberfläche, die besten Ergebnisse.

Wenn einmal die Stammlösung oder Mischung aufgebracht worden ist und die Spezies daran gebunden ist, kann der Träger auf ähnliche Weise wie in einem "Western-Blot" behandelt werden. Diese Behandlung kann umfassen eine Folge von Behandlungs­ stufen, wozu gehören das Waschen, das Blockieren und/oder das Stabilisieren vor dem Trocknen der Membran und vor dem Ver­ packen. Bei den Waschlösungen handelt es sich im allgemeinen um entionisiertes und/oder destilliertes Wasser, das Puffer, Detergentien, bakterizide/bakteristatische Agentien und Pro­ teine, wie BSA oder BGG, enthält. Bei den Blockierungslösun­ gen handelt es sich im allgemeinen um wäßrige und/oder orga­ nische Lösungen, die verschiedene Proteine und/oder Deter­ gentien enthalten. Die Stabilisierungsverfahren können bei­ spielsweise umfassen das Eintauchen des gebundenen Trägers in Lösungen von verschiedenen Proteinen oder Fixiermitteln, wie z.B. Glutaraldehyd, oder das Sättigen des gebundenen Trägers mit diesen Lösungen oder das Lyophilisieren der Bindungs-Spezies auf dem Träger.

Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, eine Vielzahl von identischen Festphasen-Reagentien herzustellen, von de­ nen jedes das gleiche Muster der Bindungs-Spezies in den gleichen Dichten trägt zur Durchführung wiederholter Assays auf einer Vielzahl von Proben. Ein besonders nützlicher Weg, dieses Ergebnis zu erzielen, besteht darin, die Stamm­ mischungen in Form von Strahlen auf eine sich bewegende Folie bzw. Platte des Trägermaterials auszupressen unter Bildung von diskreten parallelen Linien der Bindungsbereiche. Die Folie bzw. Platte wird dann in Streifen von im wesentlichen gleicher Breite in Richtung quer zu den parallelen Linien zerschnitten.

Die fertigen Reagentien, die jeweils aus den Trägern bestehen, von denen jeder mit einem identischen Muster aus immobili­ sierten Bindungs-Spezies versehen ist, können als Teil eines Assay-Kits, das weitere Komponenten enthält, wie sie in Ver­ bindung mit Festphasen-Reagentien beim Analysieren von Proben verwendet werden, verpackt werden. Die Art der Komponente hängt vom Typ des gewünschten Assays, dem Assay-Verfahren und der Methode ab, mit der die Anwesenheit einer Bindung zwi­ schen Spezies auf dem Träger und der Spezies in der Probe nachgewiesen wird.

Ein bevorzugtes Nachweisverfahren umfaßt die Verwendung eines Konjugats aus zwei Komponenten, nämlich (a) einem Rezeptor mit einer Affinität für die Bindungsagentien in der Probe in der an die Spezies in dem Festphasen-Träger gebundenen Form und (b) einem Markierungsmittel, das ein nachweisbares Signal ergeben kann. Bei diesen Rezeptoren handelt es sich im allge­ meinen um Antikörper, die für Antigenzentren spezifisch sind, die allen Bindungsagentien gemeinsam sind. Wenn bei­ spielsweise die Bindungsagentien selbst Antikörper eines be­ stimmten Typs sind, wie z.B. Human-IgG, kann der Rezeptor Anti-Human-IgG sein. Alternativ können auch andere Typen von Immunoglobulinen verwendet werden, wie z.B. IgM, IgA, IgE und dgl. Das Markierungsmittel kann irgendeiner der ver­ schiedenen Typen von ein Signal liefernden Spezies sein, wie sie auf dem biochemischen Gebiet allgemein bekannt sind, wie z.B. farbbildende Spezies, fluorometrische Spezies und radio­ metrische Spezies. Eine besonders vorteilhafte Form ist eine solche, in der die Markierungskomponente des Konjugats eine Komponente eines Zwei-Komponenten-Signalerzeugungssystems ist, wobei die andere Komponente in einer getrennten Lösung als Teil des Kits zugeführt wird. So kann beispielsweise die Komponente, die einen Teil des Konjugats bildet, ein Enzym sein, während die Komponente in der getrennten Lösung ein Substrat sein kann, auf welches das Enzym einwirkt. Weitere Kit-Komponenten sind im allgemeinen Blockierungsmittel und Wasch/- Verdünnungsmittel-Lösungen, die ggf. Nicht-Human-Protein ent­ halten.

Nachstehend wird ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Isolie­ rung und Reinigung von AIDS-Virus-Proteinen näher beschrie­ ben, es sei jedoch darauf hingewiesen, daß die Erfindung keineswegs darauf beschränkt ist.

Beispiel AIDS-Virus-Proteine

AIDS-Virus-Proteine, die in den AIDS-Antikörper-Assays der­ zeit von Interesse sind, sind diejenigen mit Molekulargewichten von 160, 120, 65, 55, 41-43, 32, 24, 18 und 15 Kilodalton. Die hauptsächlichen Klassen der Trennmethoden, die für die Reinigung dieser Proteine geeignet sind, sind die Affinitäts-, Größenausschluß-, Umkehrphasen-, hydrophobe Wechsel­ wirkungs-, Ionenaustausch- und Hydroxyapatit-Chromatographie. Die Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC)-Methode führt zu einer starken Verbesserung des Auflösungsvermögens jedes Verfahrens. Die Affinitätschromatographie kann umfassen eine Reihe von Methoden, in denen immobilisierte Antikörper, Lectine, Farbstoffe oder andere Gruppen-spezifische Adsor­ bentien verwendet werden. Diese Medien können für eine oder eine Reihe von Virus-Komponenten spezifisch sein.

Zur Vorbereitung für die Trennungen wird das Virus unter Ver­ wendung von SDS oder CHAPS durch ein Detergenz solubilisiert und mit Mercaptoethanol oder Dithiothreit reduziert. Bei der vorläufigen Chromatographie in einer Lectin-Affinitäts-Kolon­ ne werden die Glycoprotein-Komponenten der Mischung zurück­ gehalten. Während der Durchführung einer Trennung können mehr als ein Typ dieser Adsorbentien verwendet werden und der Typ des verwendeten Lectins hängt von der Spezifität und Affinität für die gewünschten Virus-Komponenten ab.

Die nicht-zurückgehaltenen Proteine werden dann in einer Umkehrphasen-HPLC-Kolonne konzentriert, danach mit einem zu­ nehmenden Gradienten der organischen Komponente eluiert, um die restlichen Proteine abzutrennen. Bei der Kolonne kann es sich in dieser Stufe um eine Kolonne mit gebundener Phase, wie z.B. C-4-, C-1-, Phenyl- oder Cyanopropyl-Kolonne han­ deln. Die in der Lectin-Kolonne zurückgehaltenen Glycopro­ teine werden eluiert und in einer Umkehrphasen-HPLC-Kolonne konzentriert, aus der sie durch Gradientenelution abgetrennt werden. Die Umkehrphasen-Kolonne führt in jedem Falle zu einer Konzentration und weiteren Abtrennung und Entsalzung der Proteine. Nach der Umkehrphasen-Chromatographie können die Fraktionen in einem Verdampfer, beispielsweise einem Savant Speed-Vac (Handelsprodukt der Firma Savant Instruments Inc., Farmingdale, New York/USA) zur Trockne eingeengt wer­ den. Die Abtrennung kann überwacht werden durch Entnahme klei­ ner Proben aus jeder Fraktion und Untersuchen derselben un­ ter Anwendung der Western-Blot-Analyse.

Bei einem alternativen Verfahren kann die erste Abtrennung durch Gelpermeationschromatographie erfolgen, wodurch die Proteine mit hohem Molekulargewicht (160, 120 und 65 kDa) voneinander und von den Komponenten mit niedrigerem Molekular­ gewicht getrennt werden. Die Komponenten mit niedrigerem Molekulargewicht können dann direkt auf eine Umkehrphasen- Kolonne aufgegeben werden zur Durchführung einer gleichzei­ tigen Entsalzung und Trennung. Unvollständige Trennungen kön­ nen dann auf anderen Umkehrphasen-Kolonnen wiederholt werden.

Eine dritte Alternative besteht darin, die Ionenaustausch- oder Hydroxyapatit-Chromatographie in Gegenwart von Detergen­ tien als erste Maßnahme anzuwenden, woran sich eine Umkehr­ phasen-Schlußtrennung anschließt. Die hydrophobe Wechsel­ wirkungs-Chromatographie in Gegenwart von organischen Modifi­ zierungsmitteln ist eine vierte Alternative, während die Affinitätschromatographie, in der eine Farbstoffkolonne, wie z.B. Affi-Gel Blue, verwendet wird, eine fünfte Alternative ist, an beide schließt sich die Umkehrphasen-HPLC an.

Eine vierte Alternative ist die Verwendung einer oder mehre­ rer Affinitätskolonnen mit immobilisierten Antikörpern gegen­ über einer oder mehreren der Virus-Komponenten, woran sich eine Umkehrphasen-HPLC anschließt.

Ein spezifisches Beispiel für eine AIDS-Virus-Protein-Tren­ nung, in der eine Gelpermeationsmethode angewendet wird, wird nachstehend näher beschrieben.

1) Herstellung der Virus-Probe

Ein gereinigtes Virus wurde in einer Lösung von 2% Natrium­ dodecylsulfat und 700 mM 2-Mercaptoethanol in 60 mM TRIS-Chlo­ rid bei pH 8,0 suspendiert und zwei Minuten lang auf 100°C erhitzt. Das resultierende lysierte und solubilisierte Virus wurde dann direkt einer HPLC-Kolonne zugesetzt.

2) Größenausschluß-Chromatographie

Bei der Kolonne handelt es sich um eine Bio-Rad TSK 250- Größenausschluß-Chromatographiekolonne einer Größe von 600 mm×7,5 mm (ein Handelsprodukt der Firma Bio-Rad Labora­ tories, Inc., Richmond, Kalifornien/USA) und die Chromato­ graphie wurde durchgeführt unter Anwendung einer isokrati­ schen Elution mit einem Gemisch aus 20% Isopropanol in PBS, das 0,05% Triton X-100 enthielt. Die Strömungsrate betrug 0,75 ml/min und der Abstrom wurde bei 214 nm überwacht. Die Fraktionen mit einem Volumen von 0,5 ml wurden unter Verwen­ dung eines automatischen Fraktionssammlers gesammelt und die organische Komponente wurde in einem Speed-Vac-Verdampfer entfernt. Das Eluat wurde mittels des Western-Blot überwacht, um die Abtrennung der Virus-Proteine sicherzustellen.

Die Virus-Proteine mit dem höchsten Molekulargewicht (160, 120 und 65 kd) wurden einzeln mittels dieser Trennung iso­ liert, während die übrigen Proteine in Form von Mischungen eluiert wurden (65 und 55 kDa; 55 und 41-43, 30 und 24 kDa; und 24 und 18 kDa). Die Einzelkomponenten-Fraktionen (160, 120 und 65 kd) wurden in einer Umkehrphasen-Kolonne (C-8, 4,6 mm×40 mm) entsalzen und das Lösungsmittel wurde ver­ dampft, wobei das reine Protein zurückblieb. Die Proteine aus den Multikomponenten-Fraktionen wurden wie in den nach­ stehenden Abschnitten beschrieben isoliert.

3) Umkehrphasen-hydrophobe Wechselwirkungs-Chromatographie

Die Fraktionen, die ein Protein mit 24 kd enthielten, wurden auf einer Bio-Rad TSK Phenyl-5PW-Kolonne (7,5 mm×125 mm) fraktioniert, um dieses Protein selektiv zu entfernen. Es wurde ein linearer Gradient von 100% Lösungsmittel A (0,1% ige wäßrige Trifluoroessigsäure) bis 100% Lösungsmittel B (0,1%-ige Trifluoroessigsäure in Acetonitril, enthaltend 10% Isopropanol) innerhalb von 30 Minuten durchlaufen gelas­ sen. Das Protein p24 passierte die Kolonne zuerst, während die anderen Proteine anschließend in Form einer Mischung elu­ iert wurden. Die Mischung wurde durch Umkehrphasen-Chromato­ graphie unter Verwendung einer C-4-Kolonne weiter fraktioniert. Die Phenyl-5PW-Kolonne konnte auch als hydrophobe Wechsel­ wirkungs-Kolonne unter Anwendung eines Umkehrsalz­ gradienten in Gegenwart von 20% Isopropanol verwendet werden, wobei ähnliche Ergebnisse erzielt wurden.

4) Weitere Umkehrphasen-Chromatographie

Die Proteinmischungen aus der im obigen Abschnitt 2 be­ schriebenen Gelfiltrations-Kolonne wurden weiter fraktio­ niert auf einer Bio-Rad Hi-Pore RP304-Kolonne. Vor der Fraktionierung wurden die Proben in einem Speed-Vac- Verdampfer eingedampft, um die organische Komponente zu entfernen, dann wurden sie direkt in die Kolonne einge­ spritzt. Es wurde ein linearer Gradient von dem Puffer A (0,1%ige wäßrige Heptafluorbuttersäure) bis zum Puffer B (0,1%ige Heptafluorbuttersäure in Acetonitril) über einen Zeitraum von 60 Minuten, nachdem anfänglich 15 Mi­ nuten lang 100% Puffer A durchlaufen gelassen worden waren, in einer Strömungsrate von 1 ml/min durchlaufen ge­ lassen, während das Eluat bei 214 nm überwacht wurde. Es wurden Fraktionen in 0,5 ml-Intervallen gesammelt und durch Western-Blot-Analyse überwacht. Alle restlichen Protein­ mischungen wurden nach dieser Methode in Einzelkomponenten aufgetrennt.

Die Erfindung wurde zwar vorstehend näher erläutert, es ist jedoch für den Fachmann klar, daß sie darauf keineswegs beschränkt ist, sondern daß zahlreiche zusätzliche Modifi­ kationen, Abänderungen und Substitutionen durchgeführt werden können, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden Erfindung verlassen wird.

Claims (22)

1. Verfahren zur Herstellung eines Festphasen-Reagens für einen biochemischen Bindungs-Assay, bei dem eine Probe auf die Anwesenheit einer Vielzahl von vorher festgelegten Bindungsagentien analysiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen umfaßt:

• a) Isolieren einer Vielzahl von biochemischen Spezies, die jeweils eine Affinität für eines der Bindungsagen­ tien aufweisen, aus einem biologischen Quellen-Gemisch,
• b) Verdünnen jeder der isolierten Spezies in einer ge­ trennten Trägerflüssigkeit unter Bildung einer getrenn­ ten Flüssigkeitsmischung aus jeder der Spezies in einer vorher festgelegten Konzentration und
• c) Aufbringen einer vorher festgelegten Menge jeder der Flüssigkeitsmischungen auf einen vorher festgelegten Bereich auf einem Festphasen-Träger, um die Spezies in einem vorgegebenen Muster darauf zu immobilisieren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem biologischen Quellen-Gemisch um einen Vertreter aus der Gruppe der Virus- und Zellenlysate und Kombinationen davon handelt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die biochemischen Spezies ausgewählt werden aus der Gruppe der Peptide, Polypeptide, Proteine und Kombinationen davon.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den biochemischen Spezies um Virus-Antigene handelt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt die Herstellung einer Viel­ zahl der Festphasen-Reagentien durch gleichmäßiges Auf­ bringen der Flüssigkeitsmischungen in der Stufe (c) auf jeweils eine Vielzahl der Festphasen-Träger.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe (c) umfaßt das Aufbringen kontinuierlicher Ströme jeder der Flüssigkeitsmischungen in paralle­ len Linien entlang einer Platte aus dem Festphasen-Träger und anschließendes Auftrennen der Platte in Streifen quer zu den parallelen Linien.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die kontinuierlichen Ströme Strahlen darstellen, die aus unter Druck stehenden Düsen austreten.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe (c) umfaßt das kovalente Binden der Spezies an den Festphasen-Träger.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe (c) umfaßt das Aufbringen der Flüssigkeitsmischungen bis zu einer Speziesdichte von mindestens etwa 10 µg/m² Oberfläche des Festphasen-Trägers.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe (c) umfaßt das Aufbringen der Flüssigkeitsmischungen bis zu einer Speziesdichte von etwa 0,1 bis etwa 10 µg/m² Oberfläche des Festphasen- Trägers.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägerflüssigkeiten in der Stufe (b) Pufferlösungen verwendet werden.

12. Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von Fest­ phasen-Reagentien zum Analysieren jeder einer Vielzahl von biologischen Proben zur Bestimmung der Anwesenheit einer Vielzahl von vorher ausgewählten Bindungsagentien, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen umfaßt:

• a) individuelles Isolieren einer Vielzahl von biochemischen Spezies, die jeweils eine Affinität für eines der Bin­ dungsagentien haben, aus einem biologischen Quellen­ gemisch,
• b) Verdünnen jeder der isolierten Spezies in einer Puffer­ lösung unter Bildung einer Vielzahl von Stammischungen, die jeweils eine der isolierten Spezies in einer Konzen­ tration in dem Bereich von etwa 0,01 bis etwa 10 µg/ml enthalten,
• c) Auspressen der Stammischungen in Form von Strahlen auf eine Festphasen-Trägerplatte, die sich in Relation dazu bewegt, um die isolierten Spezies in Form von diskreten parallelen Linien in vorgegebenen Dichten in dem Bereich von etwa 0,1 bis etwa 10 µg/ml daran zu binden,
• d) Blockieren der ungebundenen Bereiche des Festphasen- Trägers, um eine nicht-spezifische Bindung im wesentli­ chen zu verhindern, und
• e) Zerschneiden der Platte zu Streifen mit einer im wesent­ lichen gleichen Breite quer zu den parallelen Linien.

13. Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von Fest­ phasen-Reagentien für die Verwendung bei der Analyse jeweils einer Vielzahl von biologischen Proben zur Bestimmung von Antikörpern mit einer Affinität für vorher festgelegte Antigene eines Virus, der in einer Wirtszelle vorliegt, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen um­ faßt:

• a) Lysieren der Wirtszelle und des Virus unter Bildung eines Lysats,
• b) individuelles Isolieren der vorher festgelegten Antigene aus dem Lysat,
• c) Verdünnen der isolierten Antigene in Pufferlösungen unter Bildung einer Vielzahl von Stammlösungen, von denen jede eines der isolierten Antigene in einer vorgegebenen Konzentration enthält,
• d) Aufbringen vorher festgelegter Mengen derStammlösungen auf vorher festgelegte Bereiche auf einem Festphasen- Träger, um die Antigene darin in vorgegebenen Dichten in einem vorgegebenen Raummuster an den Träger zu binden und
• e) Blockieren der ungebundenen Bereiche auf dem Träger, um eine nicht-spezifische Bindung im wesentlichen zu verhindern.

14. Festphasen-Reagens für einen biochemischen Bindungs- Assay, gekennzeichnet durch eine Vielzahl von biochemischen Bindungsspezies, die an einen Festphasen-Träger in diskre­ ten Bereichen desselben in vorher festgelegten Dichten gebunden sind, wie es nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 erhältlich ist.

15. Assay-Kit, gekennzeichnet durch eine Vielzahl von Festphasen-Reagentien, wie sie nach dem Verfahren nach An­ spruch 12 erhältlich sind, die jeweils umfassen eine Viel­ zahl von biochemischen Bindungsspezies, die an einen Fest­ phasen-Träger in diskreten Bereichen in vorher festgelegten Dichten gebunden sind.

16. Assay-Kit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem umfaßt ein Konjugat aus (a) einem Rezeptor mit einer Affinität für alle Bindungsagentien und (b) einem Markierungsmittel, das ein nachweisbares Signal abgeben kann.

17. Assay-Kit nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Markierungsmittel um eine Komponente eines Zwei-Komponenten-Signalerzeugungssystems handelt und daß das Assay-Kit außerdem die restliche Komponente des Zwei-Komponenten-Signalerzeugungssystems umfaßt.

18. Assay-Kit, gekennzeichnet durch eine Vielzahl von nach dem Verfahren gemäß Anspruch 13 erhältlichen Fest­ phasen-Reagentien, die jeweils umfassen eine Vielzahl von Virus-Antigenen, die an einen Festphasen-Träger in dis­ kreten Bereichen in vorher festgelegten Dichten gebunden sind.

19. Assay-Kit nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem umfaßt ein Konjugat aus (a) einem Rezeptor mit einer Affinität für Antikörper gegenüber den Virus- Antigenen und (b) einem Markierungsmittel, das ein nach­ weisbares Signal abgeben kann.

20. Assay-Kit nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Rezeptor um Anti-Human-IgG handelt.

21. Assay-Kit nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekenn­ zeichnet, daß es sich bei dem Markierungsmittel um eine Komponente eines Zwei-Komponenten-Signalerzeugungssystems handelt und daß das Assay-Kit außerdem eine Lösung der restlichen Komponente des Zwei-Komponenten-Signalerzeugungs­ systems umfaßt.

22. Assay-Kit nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Rezeptor um Anti- Human-IgG handelt und daß es sich bei dem Markierungs­ mittel um eine Komponente eines Zwei-Komponenten-Signal­ erzeugungssystems handelt und daß das Assay-Kit außerdem eine Lösung der restlichen Komponente des Zwei-Komponenten- Signalerzeugungssystems sowie eine ein Nicht-Human-Protein enthaltende Waschlösung umfaßt.