FR2601454A1 - Reactifs de liaison en phase solide, leur preparation et necessaires pour analyses les contenant - Google Patents

Abstract

REACTIFS DE LIAISON EN PHASE SOLIDE POUR DES ANALYSES BIOCHIMIQUES PAR LIAISON PREPARES EN ISOLANT PLUSIEURS ESPECES FORMANT DES LIAISONS CHOISIES, PROVENANT D'UN MELANGE DE SOURCE BIOLOGIQUE TEL QU'UN LYSAT CELLULAIRE OU VIRAL; EN DILUANT CHAQUE ESPECE ISOLEE DANS UN LIQUIDE DE SUPPORT, TEL QU'UNE SOLUTION TAMPON CONTENANT UN DETERGENT, POUR FORMER UNE SERIE DE MELANGES DE RESERVE, CHACUN A UNE CONCENTRATION CHOISIE A L'AVANCE; ET EN APPLIQUANT LES MELANGES SUR DES REGIONS SEPAREES, DEFINIES DE MANIERE PRECISE, SUR UN SUPPORT EN PHASE SOLIDE, EN IMMOBILISANT LES ESPECES DANS UNE DISPOSITION CHOISIE A L'AVANCE. APRES DES STADES DE LAVAGE, DE BLOCAGE ET DE STABILISATION APPROPRIES, LE REACTIF EN PHASE SOLIDE OBTENU PEUT ETRE UTILISE COMME UN "WESTERN BLOT" D'UN ELECTROPHORETOGRAMME, MAIS AVEC DE NETS AVANTAGES EN CE QUI CONCERNE LA PRECISION, LA REPRODUCTIBILITE ET LA LISIBILITE.

Description

REACTIFS DE LIAISON EN PHASE SOLIDE, LEUR PREPARATION

ET NECESSAIRES POUR ANALYSES LES CONTENANT

L'invention concerne des dosages par liaison biochimique du type hétérogène, c'est-à-dire ceux mettant en jeu une liaison biochimique entre des espèces immobilisées sur un support en phase solide et des espèces dissoutes ou en suspension dans un liquide. En particulier, l'invention concerne des réactifs en phase so10 lide comprenant des supports sur lesquels sont fixées, dans une répartition distincte, plusieurs espèces formant des liaisons, dérivant d'une source commune telle

qu'un lysat cellulaire ou viral.

L'analyse de certaines espèces présentes en com15 binaison dans les fluides biologiques est souvent effectué à des fins de diagnostic ou de dépistage. Un grand nombre de ces dosages comporte une incubation d'un échantillon du fluide avec une bande de matière en phase solide à laquelle sont liées une série d'espèces ayant 20 chacune une affinité de liaison pour l'une des espèces

que l'on cherche à détecter. La bande est ensuite lue pour détecter la présence d'une liaison entre les espèces initialement présentes sur la bande et celles présentes dans l'échantillon.

Les espèces immobilisées sur les bandes sont généralement des espèces biochimiques telles que des protéines ou des peptides, qui sont des constituants caractéristiques d'espèces biochimiques de plus grandes dimensions comme un virus ou une cellule. Dans le passé, 30 ces supports, auxquels étaient liées des espèces, étaient des taches d'électrophorétogrammes. Comme un électrophorétogramme unique ne peut produire qu'un nombre limité de ces taches, les taches ont des limitations intrinsèques en ce qui concerne la précision, la repro35 ductibilité et la fiabilité globale. Des variations d'une séparation électrophorétique à la suivante, ainsi

que d'un mélange de départ au suivant sont inévitables.

L'utilisation d'électrophorétogrammes limite en outre le degré auquel les diverses espèces peuvent être séparées les unes des autres et concentrées en bandes bien défi5 nies. Des variations dans les quantités des diverses espèces dans le mélange de départ poseront des problèmes supplémentaires en mettant l'accent d'une manière excessive sur certaines espèces aux dépens des autres, rendant ainsi difficile la détection du mélange entier.

On a trouvé à présent que des réactifs de liaison en phase solide qui fournissent un haut degré de précision, de lisibilité et de reproductibilité dans une analyse par liaison peuvent être préparés à partir d'un mélange de source biologique en isolant du mélange les 15 diverses espèces formant des liaisons choisies, en diluant chacune des espèces isolées dans un liquide de support pour former une série de mélanges de réserve contenant chacun une des espèces isolées à une concentration choisie à l'avance, et en appliquant les mélan20 ges sur des régions séparées, définies de manière précise d'un support en phase solide pour immobiliser les diverses espèces sur le support dans une répartition

choisie à l'avance.

Selon l'un de ses aspects, l'invention a pour 25 objet un procédé de préparation d'un réactif en phase solide pour une analyse par liaison biochimique mettant en jeu l'analyse d'un échantillon pour y rechercher la présence de plusieurs agents formant des liaisons, choisis à l'avance, caractérisé en ce qu'il comprend les 30 étapes consistant à: (a) isoler d'un mélange de source biologique plusieurs espèces biochimiques ayant chacune une affinité pour un des agents formant des liaisons; (b) diluer chacune des espèces isolées dans un liquide de support séparé pour former un mélange liquide séparé 35 de chacune de ces espèces à une concentration choisie à

l'avance; et (c) appliquer une quantité choisie à l'avance de chacun de ces mélanges liquides sur une région choisie à l'avance d'un support enphase solide pour immobiliser ces espèces sur celui-ci suivant une dispo5 sition choisie à l'avance.

L'invention est particulièrement utile pour préparer une multitude de ces répartitions d'une manière identique sur des supports séparés, o toutes les espèces forment des bandes nettement définies ou des régions 10 de liaison de densité pratiquement uniforme. Ces supports peuvent être incorporés à des nécessaires pour analyses contenant des matières pour effectuer des analyses identiques sur une multitude d'échantillons, ces nécessaires contenant en outre les constituants supplé15 mentaires nécessaires pour effectuer le dosage.

Les mélanges de sources biologiques utilisables dans la pratique de la présente invention peuvent avoir des compositions et des sources très variables. Ces mélanges comprendront généralement n'importe quelle combi20 naison d'espèces biologiques, en particulier des macromolécules, qui se présentent sous forme de mélanges, d'amas ou de combinaisons. L'invention est particulièrement utile pour des mélanges d'espèces telles que des peptides, des polypeptides et des protéines. Des exem25 ples typiques de ces mélanges sont des lysats cellulaires et viraux. L'invention peut être utilisée par exemple pour isoler et séparer des antigènes cellulaires ou viraux pour l'utilisation comme espèces formant des liaisons pour détecter la présence d'anticorps dirigés 30 contre les antigènes dans un échantillon de fluide corporel. L'espèce présente dans le mélange peut aussi être constituée par les anticorps eux-mêmes, devant être isolés et utilisés pour détecter la présence d'antigènes

dans l'échantillon de fluide.

Les espèces du mélange à séparer conformément à la présente invention seront essentiellement n'importe quelle combinaison d'espèces dont chacune a une affinité de liaison spécifique pour l'un des constituants multiples soupçonnés d'être présents dans l'échantillon d'essai. Une utilisation particulière envisagée par la demanderesse est la préparation d'un réactif de liaison en phase solide pour une analyse pour détecter la présence d'anticorps dirigés contre un ou plusieurs des virus associés au Syndrome d'Immuno-Déficience Acquise 10 (SIDA). Des exemples de virus du SIDA caractérisés sont le virus-III de la leucémie des lymphocites T humains (HTLV-III), le virus associé à la lymphadénopathie (LAV) et le virus apparenté au syndrome d'immunodéficience

acquise (ARV).

Avant la séparation des espèces, le mélange est généralement préparé et traité par des techniques classiques. Pour les cellules et les virus, en particulier les virus résidant dans des cultures cellulaires, les cellules et les virus sont dans certains cas tués et 20 lysés en tant que partie de la préparation, de préférence par une combinaison de détergent et de la chaleur, de telle sorte que les propriétés de liaison des antigènes ou d'autres espèces à utiliser dans l'analyse ne

soient pas notablement altérées.

La séparation et l'isolement des espèces formant des liaisons à partir du mélange source sont effectués par un processus ou une séquence de séparation adaptés au mélange de départ et à l'espèce que l'on cherche à recueillir. Dans de nombreux cas, il sera souhaitable 30 d'isoler certaines espèces à l'exclusion des autres, les

espèces choisies étant celles qui se lient aux espèces présentes dans l'échantillon dont la présence est la plus révélatrice de l'état qu'on cherche à détecter.

L'identité des espèces les plus révélatrices dans un 35 échantillon en ce qui concerne un état donné sera connue

de l'homme du métier.

La séparation et l'isolement peuvent être réalisés par des techniques de séparation préparatives classiques, telles que les diverses formes de chromatographie utilisées dans les préparations biochimiques. Sui5 vant le degré et la variété des espèces recherchées, une séquence de séparations de divers types peut être nécessaire pour isoler chacune d'elles. On peut faire entrer dans la séquence une ou plusieurs techniques telles que la chromatographie liquide haute performance, la chroma10 tographié en phase inversée, la chromatographie par perméation de gel, la chromatographie d'échange d'ions, la chromatograhie par interaction hydrophobe, la chromatographie d'affinité, la chromatographie sur hydroxyapatite et la chromatographie d'exclusion de tailles.

Chacune des espèces formant des liaisons intéressantes présentes dans le mélange source doit être complètement séparée des autres espèces de ce type, mais l'isolement complet de l'espèce de tous les autres constituants n'est pas toujours nécessaire. Dans le cas de 20 protéines virales provenant d'un virus cultivé dans une ligné cellulaire particulière, par exemple des protéines contaminantes et des acides nucléiques provenant des cellules hôtes seront également présents. Si ceux-ci ne sont pas immunoréactifs avec les mêmes anticorps que 25 ceux qui se lient aux protéines virales, ils n'ont pas

besoin d'être éliminés complètement. On préfère cependant qu'une quantité suffisante de ces matières étrangères ainsi que d'autres soit éliminée de telle sorte que les espèces intéressantes constituent au moins 30 environ 80 & 90 % de l'isolat.

Lorsque l'on choisit des conditions pour les techniques d'isolement, on doit prendre en considération la nécessité de maintenir les capacités de liaison (par exemple l'immunoréactivité) des diverses espèces. Les 35 protéines des membranes, par exemple, sont souvent très hydrophobes, ce qui exige des conditions sévères telles que des concentrations élevées en détergents ou en solvants organiques pour l'élution à partir d'une colonne particulière. Ces conditions potentiellement rigoureuses peuvent dénaturer les protéines au point qu'elles ne 5 réagissent plus avec les anticorps dirigés contre la protéine native. Les meilleures techniques seront donc un équilibre entre les conditions de dénaturation avec un taux de récupération élevé et les conditions plus

douces avec une immunoréactivité supérieure.

Dès qu'elles sont isolées du mélange source, les

espèces sont diluées individuellement dans des liquides de support pour former des solutions de réserve individuelles contenant chacune une ou approximativement une des espèces. Dans certains cas, une espèce particulière 15 peut être définie comme une gamme étroite de poids moléculaires et peut correspondre à une bande électrophorétogramme relativement large aux frontières floues, tandis que d'autres espèces peuvent être définies comme des poids moléculaires uniques. La dilution peut impliquer 20 soit la dissolution, soit la mise en suspension de l'espèce dans le liquide de support, suivant sa solubilité.

Le liquide de support peut lui-même être aqueux ou organique ou un mélange, et ce sera de préférence une solution tampon. Comme exemples de celle-ci, on citera une 25 solution saline tamponnée au phosphate (PBS), du TRIS/ méthanol, du PBS/propanol, du PBS/acétonitrile et du carbonate. La concentration des espèces dans le liquide de support n'est pas déterminante et peut varier dans de larges limites. Cependant, la concentration sera généra30 lement choisie en se basant sur la densité de l'espèce

que l'on cherche à réaliser dans son état final tel que lié au support en phase solide. Dans la plupart des applications, une concentration allant d'environ 0,01 à environ 10 microgrammes par millilitre donnera les meil35 leurs résultats.

Il sera fréquemment souhaitable d'inclure des constituants supplémentaires dans les solutions de réserve pour diverses raisons. Comme exemples de ceux-ci, on citera des détergents tels que le dodécylsulfate de sodium (SDS), le Triton X-100 (Rohm and Haas Co., Phila5 delphie, Pennsylvanie), le 3-[(chloramidopropylidiméthylammonio] 1- propanesulfonate (CHAPS), et les Tween 20, 40, 60 et 80 (Atlas Chemical Industries, Inc., Wilmington, Delaware). Des agents bactéricides et bactériostatiques peuvent également être incorporés, par exemple de 10 l'azide de sodium et du thimérosal. Si les espèces doivent être liées par covalence au support, on peut utiliser divers agents de couplage connus de l'homme du métier. Comme exemples de ceux-ci, on citera l'EDAC (éthyl diméthylaminopropyl carbodiimide) et des réactifs bi15 fonctionnels tels que par exemple le MBS (ester-mmaléimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide). Ces agents de couplage ne sont généralement pas incorporés & la solution de réserve, et leur procédé d'utilisation peut se conformer aux techniques classiques. Par exemple, la 20 totalité de la surface du support peut d'abord être

transformée en dérivé avec l'agent de couplage, puis l'espèce formant des liaisons peut être appliquée à des régions déterminées. Les régions restantes peuvent alors être bloquées ou "trempées* (quenched) pour empêcher une 25 liaison supplémentaire.

Le support en phase solide peut être n'importe quelle matière capable d'immobiliser les espèces formant des liaisons, ou encore être inerte ou susceptible d'être rendue inerte vis-à-vis des autres réactifs et cons30 tituants de l'analyse dans lesquels le support doit être utilisé. Le choix de la matière de support dépendra du type d'espèces à immobiliser sur celui-ci ainsi que du procédé d'immobilisation, lequel ira de l'adsorption à

la liaison chimique.

En général, on peut utiliser n'importe quelle

forme géométrique sur laquelle on peut dessiner des régions définies de manière précise, de préférence séparées, une pour chaque espèce, suivant une répartition choisie à l'avance. Dans la plupart des applications, le 5 support sera une membrane, une feuille ou une bande de matière. Des exemples de ces matières de support sont le nitrate de cellulose, la cellulose et des dérivés de la cellulose, la fibre de verre, divers nylons et des dérivés de ceux-ci, le Téflon et des matières apparentées, 10 et des composites de ces matières ainsi que des combinaisons de ces matières avec d'autres matières capables de lier des protéines ou des peptides. Les résines échangeuses d'ions sont des exemples de ces dernières.

On préfère des matières de support sous forme de mem15 branes ou de bandes en raison de la facilité d'immersion

dans les liquides échantillons.

Les espèces sont appliquées sur le support, par l'intermédiaire de leurs solutions de réserve, suivant une répartition choisie à l'avance qui est communiquée à 20 l'utilisateur comme aide à la détection. La répartition se compose de régions définies de manière précise sur le support, de préférence éloignées les unes des autres et contenant chacune une espèce unique (ou une gamme étroite de poids moléculaires) à une densité pratiquement 25 uniforme sur toute la surface de la région. La taille de chacune des régions et la disposition globale ne sont pas déterminantes et peuvent varier dans de larges limites, comprenant par exemple des points séparés de diverses tailles, des lignes séparées de longueur et de 30 largeur définies et des lignes continues de largeur définie. Des lignes parallèles semblables aux bandes d'un électrophorétogramme sont particulièrement utiles, bien que la présente invention permette une amélioration considérable par rapport aux électrophorétogrammes en 35 réglant les lignes de façon à réaliser une intensité,

une netteté et un espacement pratiquement uniformes.

Le procédé d'application peut aussi varier dans de larges limites, le procédé optimum dans chaque cas dépendant des géométries et de la disposition des régions de liaison. L'application peut par exemple être 5 réalisée par des jets ou microjets de pulvérisation émis par des buses sous pression, ainsi que par transfert par action capillaire. L'application peut comprendre la pulvérisation contrôlée de dessins séparés sur une surface de membrane stationnaire, la pulvérisation contrôlée de 10 lignes continues ou de dessins en points sur une surface de membrane mobile, l'application de gouttes mesurées directement sur une surface de membrane soit stationnaire, soit mobile en utilisant un dispositif de micropipettage de précision, l'application d'un écoulement 15 continu contrôlé en utilisant un applicateur du type àmèche ou à pinceau et n'importe quelle autre technique capable d'appliquer une solution liquide ou une suspension sur une région définie de manière précise d'une

surface solide.

Le procédé d'application ainsi que la concentration de la solution de réserve seront choisies en vue de réaliser une densité d'espèce désirée sur le support en phase solide. Les densités peuvent varier dans de larges limites, et les quantités optimales dépendront du procé25 dé de détection envisagé dans l'analyse elle-même. Dans

la plupart des applications, une densité d'espèce d'au moins environ 10 picogrammes par millimètre carré de surface du support, de préférence d'environ 0,1 & environ 10 microgrammes par millimètre carré, donnera les 30 meilleurs résultats.

Dès que la solution ou le mélange de réserve a été appliqué et que l'espèce a été liée, le support peut être traité d'une manière similaire à ceux utilisés dans une analyse de type "Western blot". Ceci peut comprendre 35 une séquence de stades comprenant un lavage, un blocage et/ou une stabilisation avant de sécher la membrane en vue de l'emballage. Les solutions de lavage sont généralement de l'eau désionisée et/ou distillée contenant un tampon, des détergents, des agents bactéricides/ bactériostatiques et des protéines telles que la sérum5 albumine de bovidés (BSA) ou la gammaglobuline bovine (BGG). Les solutions de blocage seront généralement des solutions aqueuses et/ou organiques contenant des protéines et/ou des détergents divers. Des techniques de stabilisation peuvent comprendre par exemple une immer10 sion du support lié dans des solutions de protéines ou d'agents fixateurs divers telles que le glutaraldéhyde, ou sa saturation par celles-ci, ou une lyophilisation de

l'espèce formant des liaisons sur le support.

La présente invention permet de préparer une 15 multitude de réactifs en phase solide identiques, portant chacun le même dessin d'espèces formant des liaisons aux mêmes densités pour effectuer des analyses répétitives sur une multitude d'échantillons. Une manière particulièrement utile pour y parvenir est de projeter 20 les mélanges de réserve sous forme de jets en direction

d'une feuille mobile de la matière de support pour former des lignes parallèles séparées de régions de liaison. La feuille est ensuite découpée en bandes de largeurs pratiquement égales dans la direction transversale 25 aux lignes parallèles.

Les réactifs terminés qui se composent des supports ayant chacun une répartition identique d'espèces formant des liaisons immobilisées, peuvent être emballés en tant que partie d'un nécessaire pour analyses conte30 nant des constituants supplémentaires utilisés avec les

réactifs en phase solide pour analyser des échantillons.

La nature des constituants dépendra du type d'analyse projeté, du mode opératoire de l'analyse et du procédé par lequel la présence d'une liaison entre les espèces 35 présentes sur -le support et les espèces présentes dans

l'échantillon sera détectée.

Un procédé de détection préféré comprend l'utilisation d'un conjugué de deux constituants: (a) un récepteur ayant de l'affinité pour les agents formant des liaisons présents dans l'échantillon tels que liés 5 aux espèces présentes dans le support en phase solide, et (b) un marquage capable de donner un signal détectable. Ces récepteurs sont généralement des anticorps spécifiques de sites antigéniques communs à tous les agents formant des liaisons. Par exemple, lorsque les agents 10 formant des liaisons sont eux-mêmes des anticorps d'un certain type, tels que l'IgG humaine, le récepteur peut être de l'anti-IgG humaine. On peut aussi utiliser d'autres types d'immunoglobines, tels que l'IgM, l'IgA, l'IgE, etc. L'agent marqueur peut être n'importe lequel 15 des divers types d'espèces produisant des signaux bien connus dans la technique biochimique, tels que par exemple des espèces produisant une coloration, des espèces fluorométriques et des espèces radiométriques. Une forme particulièrement commode est une forme dans la20 quelle le constituant de marquage du conjugué est un constituant d'un système à deux constituants produisant un signal, l'autre constituant étant fourni dans une solution séparée en tant que partie du nécessaire. Par exemple, le constituant formant une partie du conjugué 25 peut être une enzyme, tandis que le constituant présent

dans la solution séparée peut être un substrat sur lequel agit l'enzyme. Les constituants supplémentaires du nécessaire comprendront généralement des agents de blocage et des solutions d'agents de lavage/dilution, 30 contenant si on le désire une protéine non humaine.

On trouvera dans ce qui suit une description

d'un mode opératoire de préparation pour l'isolement et la purification de protéines virales du SIDA conformément à la présente invention. Celle- ci est donnée à ti35 tre de simple illustration et n'est pas destinée à limiter ni à définir l'invention en aucune manière.

EXEMPLE

Protéines virales du SIDA Les protéines virales du SIDA actuellement intéressantes dans les analyses des anticorps anti-SIDA sont 5 celles ayant des poids moléculaires de 160, 120, 65, 55, 41-43, 32, 24, 18 et 15 kilodaltons. Les principales classes de techniques de séparation utilisables pour purifier ces protéines sont la chromatographie d'affinité, d'exclusion de tailles, en phase inversée, par interac10 tion hydrophobe, d'échange d'ions et sur l'hydroxyapatite. La chromatographie liquide haute performance (HPLC) augmente fortement le pouvoir de résolution de chaque technique. La chromatographie d'affinité peut comprendre l'une quelconque d'un certain nombre de tech15 niques utilisant des anticorps immobilisés, des lectines, des colorants ou d'autres adsorbants spécifiques d'un groupe. Ces milieux peuvent être spécifiques d'un

ou plusieurs constituants viraux.

Pour préparer les séparations, on solubilise le 20 virus par un détergent en utilisant du SDS ou du CHAPS et on le réduit avec du merceptoéthanol ou du dithiothréitol. Une chromatographie préliminaire sur une colonne d'affinité de lectine retient les constituants glycoprotéiques du mélange. Plusieurs types de ces adsorbants 25 peuvent être utilisés au cours d'une séparation, et le type de lectine utilisé dépendra de la spécificité et de

l'affinité pour les constituants viraux désirés.

Les protéines non retenues sont ensuite concentrées sur une colonne d'HPLC à phase inversée, puis 30 éluées avec un gradient croissant de constituant organique pour séparer les protéines restantes. A ce stade, la colonne peut être une colonne à phase liée telle que par exemple C-4, C-1, phényle ou cyanopropyle. Les glycoprotéines retenues sur la colonne de lectine sont éluées et 35 concentrées sur une colonne d'HPLC à phase inversée également, dont elles sont séparées par élution à gradient.

Dans chaque cas, la colonne à phase inversée concentre, sépare encore et dessalinise les protéines. Apres la chromatographie en phase inversée, les fractions peuvent être concentrées & sec dans un évaporateur tel qu'un 5 Speed-Vac Savant (Savant Instruments, Inc., Farmingdale, New-York) . La séparation peut être suivie en prélevant de petits échantillons de chaque fraction et en les dosant par analyse par Western blot.

Dans un autre schéma opératoire, la première sé10 paration peut être effectuée par chromatographie à perméation de gel, qui sépare les protéines de poids moléculaires élevés (160, 120 et 65 kd) les unes des autres et des constituants de poids moléculaires plus faibles.

Les constituants de poids moléculaires plus faibles peu15 vent alors être appliqués directement sur une colonne à phase inversée pour la dessalinisation et la séparation simultanées. Les séparations incomplètes peuvent alors

être répétées sur d'autres colonnes à phase inversée.

Une troisième solution est d'utiliser une chro20 matographie d'échange d'ions ou sur hydroxyapatite en présence de détergents comme première dimension, suivie d'une séparation finale en phase inversée. La chromatographie d'interaction hydrophobe en présence de modificateurs organiques est une quatrième solution, tandis 25 que la chromatographie d'affinité utilisant une colonne de colorants telle que le Bleu Affi-Gel est une cinquième solution, toutes deux étant suivies d'une HPLC en

phase inversée.

Une autre solution est l'utilisation d'une ou 30 plusieurs colonnes d'affinité d'anticorps immobilisés dirigés contre un ou plusieurs des constituants viraux,

suivie d'une HPLC en phase inversée.

Un exemple particulier d'une séparation de protéines virales de SIDA en utilisant une technique de 35 perméation de gel sera à présent décrite.

1. Préparation de l'échantillon de virus Le virus purifié est mis en suspension dans une

solution de dodécylsulfate de sodium à 2 % et de 2-mercaptoéthanol 700 mM dans du chlorure de TRIS 600 mM à pH 5 8,0 et chauffé pendant 2 minutes à 100'C. Le virus lysé et solubilisé obtenu est ajouté directement à une colonne d'HPLC.

2. Chromatoqraphie d'exclusion de tailles La colonne est une colonne de chromatographie 10 d'exclusion de tailles TSK 250 Bio-Rad, de 600 x 7,5 mm

(Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, Californie), et la chromatographie est réalisée en utilisant une élution isocratique avec un mélange de 20 % d'isopropanol dans du PBS contenant 0,05 % de Triton X-100. Le débit est de 15 0,75 ml/min et l'effluent est suivi à 214 nm. Des fractions d'un volume de 0,5 ml sont recueillies au moyen d'un collecteur de fractions automatique, et le constituant organique est éliminé dans un évaporateur SpeedVac. L'éluat est suivi au moyen d'un Western blot pour 20 assurer la séparation des protéines virales.

Les protéines virales ayant les poids moléculaires les plus élevés (160, 120 et 65 kd) sont isolées individuellement par cette séparation, tandis que les autres protéines s'éluent sous forme de mélanges: 65 et 25 55 kd; 55 et 41-53 kd; 41-43, 30 et 24 kd; et 24 et 18 kd. Les fractions à constituant unique (160, 120 et 65 kd) sont dessalinisées sur une colonne de garde à phase inversée (C-8, 4,6 x 40 mm) et le solvant est évaporé pour laisser la protéine pure. Les protéines prove30 nant des fractions à constituants multiples sont isolées

comme il est décrit dans les paragraphes suivants.

3. Chromatoqraphie d'interaction hydrophobe en phase inversée Les fractions contenant la protéine 24 kd sont 35 fractionnées sur une colonne TSK Phényl-5PW Bio-Rad

(7,5 x 125 mm) pour éliminer sélectivement cette protéine. On fait passer un gradient linéaire de 100 % de solvant A (acide trifluoroacétique aqueux à 0,1 %) jusqu'à 100 % de solvant B (acide trifluoroacétique à 0,1 % dans 5 de l'acétonitrile contenant 10 % d'isopropanol) sur une durée de trente minutes. La protéine p24 traverse la colonne la première, tandis que les autres protéines s'éluent ultérieurement sous forme de mélange. Le mélange est soumis à un fractionnement supplémentaire par chro10 matographie en phase inversée sur une colonne C-4.

La colonne Phényl-5PW peut aussi fonctionner sur un mode d'interaction hydrophobe en utilisant un gradient de sel inversé en présence d'isopropanol & 20 %,

avec des résultats similaires.

4. Chromatoaraphie en phase inversée supDlémentaire Les mélanges deprotéines provenant de la colonne de filtration sur gel décrite au paragraphe 2 ci-dessus sont soumis à un fractionnement supplémentaire sur 20 une colonne Hi-Pore RP304 Bio-Rad. Avant le fractionnement, on fait évaporer les échantillons dans un évaporateur Speed-Vac pour éliminer le constituant organique, puis on les injecte directement sur la colonne. On fait passer un gradient linéaire du tampon A (acide hepta25 fluorobutyrique aqueux à 0,1 %) au tampon B (acide heptafluorobutyrique à 0,1 % dans de l'acétonitrile) sur une durée de 60 minutes après 15 minutes initiales à 100 % de tampon A, avec un débit de 1 ml/min tout en suivant l'éluant à 214 nm. On recueille les fractions à 30 des intervalles de 0,5 ml et on les suit par analyse de

type Western blot. Tous les mélanges de protéines restants sont résolus en constituants uniques par ce procédé.

La description détaillée qui précède est donnée 35 essentiellement dans un but d'illustration. Il est

évident pour l'homme du métier que de nombreuses modifications, variations et substitutions supplémentaires, non mentionnées ici, pourraient être apportées sans sortir de l'esprit et du cadre de l'invention.

Claims (22)

REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation d'un réactif en phase solide pour une analyse par liaison biochimique mettant en jeu l'analyse d'un échantillon pour y rechercher la 5 présence de plusieurs agents formant des liaisons, choisis à l'avance, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: (a) isoler d'un mélange de source biologique plusieurs espèces biochimiques ayant 10 chacune une affinité pour un des agents formant des liaisons; (b) diluer chacune des espèces isolées dans un liquide de support séparé pour former un mélange liquide séparé de chacune de 15 ces espèces à une concentration choisie à l'avance; et (c) appliquer une quantité choisie à l'avance de chacun de ces mélanges liquides sur une région choisie à l'avance d'un sup20 port en phase solide pour immobiliser ces espèces sur celui-ci suivant une disposition

choisie à l'avance.

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le mélange de source biologique est un 25 élément choisi dans le groupe constitué de lysats viraux

et cellulaires et de combinaisons de ceux-ci.

3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les espèces biochimiques sont un élément choisi dans le groupe constitué de peptides, polypepti30 des, protéines et combinaisons de ceux-ci.

4. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les espèces biochimiques sont des antigènes viraux.

5. Procédé suivant l'une des revendications 1 à 35 4, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape consistant à

préparer plusieurs des réactifs en phase solide en appliquant uniformément dans le stade (c) les mélanges

liquides à plusieurs supports en phase solide.

6. Procédé suivant la revendication 5, caracté5 risé en ce que le stade (c) comprend l'application de courants continus de chacun des mélanges liquides dans des lignes parallèles le long d'une feuille du support en phase solide, puis la séparation de cette feuille en

bandes transversales aux lignes parallèles.

7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que les courants continus sont des jets émis

par des buses sous pression.

8. Procédé suivant l'une des revendications 1 à

7, caractérisé en ce que le stade (c) comprend la liai15 son par covalence des espèces au support en phase solide.

9. Procédé suivant l'une des revendications 1 à

8, caractérisé en ce que le stade (c) comprend l'application des mélanges liquides à une densité d'espèce d'au 20 moins environ 10 picogrammes par millimètre carré de

surface du support en-phase solide.

10. Procédé suivant la revendication 9, caractérisé en ce que le stade (c) comprend l'application des mélanges liquides à une densité d'espèce d'environ 0,1 à 25 environ 10 microgrammes par millimètre carré de surface

du support en phase solide.

11. Procédé suivant l'une des revendications 1 à

, caractérisé en ce que les liquides de support du

stade (b) sont des solutions tampons.

12. Procédé de préparation de plusieurs réactifs en phase solide utilisables dans l'analyse de plusieurs échantillons biologiques pour y rechercher la présence de plusieurs agents formant des liaisons choisis à l'avance, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes 35 consistant à: (a) isoler individuellement d'un mélange de source biologique plusieurs espèces biochimiques ayant chacune une affinité pour un des agents formant des liaisons; (b) diluer chacune des espèces isolées dans une solution tampon pour former plusieurs mélanges de réserve contenant chacun une des espèces isolées à une concentration allant d'environ 0,01 à environ 10 micro10 grammes par millilitre; (c) projeter les mélanges de réserve en jets sur une feuille de support en phase solide se déplaçant par rapport à ceux-ci pour y lier les espèces isolées en lignes 15 parallèles séparées, à des densités choisies à l'avance allant d'environ 0,1 à environ 10 microgrammes par millimètre carré; (d) bloquer les régions non liées du support en phase solide pour empêcher pra20 tiquement une liaison non spécifique; et

(e) découper la feuille en bandes de largeurs pratiquement égales, transversalement aux lignes parallèles.

13. Procédé de préparation de plusieurs réactifs 25 en phase solide pour l'utilisation pour l'analyse de plusieurs échantillons biologiques pour y rechercher des anticorps ayant une affinité pour des antigènes choisis à l'avance d'un virus résidant dans une cellule hôte, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant 30 à: (a) lyser la cellule hôte et le virus pour former un lysat; (b) isoler individuellement de ce lysat les antigènes choisis à l'avance; (c) diluer les antigènes isolés dans des solutions tampons pour former plusieurs solutions de réserve contenant chacune un des antigènes isolés à une concentration choisie à l'avance; (d) appliquer des quantités choisies à l'avance des solutions de réserve sur des régions choisies à l'avance d'un support en phase solide pour lier les antigènes qu'elles contiennent à ce support à des densités 10 choisies à l'avance, dans une disposition spatiale choisie à l'avance; et

(e) bloquer les régions non liées de ce support pour empêcher pratiquement une liaison non spécifique.

14. Réactif en phase solide pour une analyse par

liaison biochimique, comprenant plusieurs espèces biochimiques formant des liaisons, liées à un support en phase solide dans des régions séparées de celui-ci à des densités choisies à l'avance, préparé conformément au 20 procédé de l'une des revendications 1 à 11.

15. Nécessaire pour analyses contenant plusieurs réactifs en phase solide comprenant chacun plusieurs espèces biochimiques formant des liaisons, liées à un support en phase solide dans des régions séparées à des 25 densités choisies -à l'avance, préparé conformément au

procédé de la revendication 12.

16. Nécessaire pour analyses suivant la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un conjugué de (a) un récepteur ayant de l'affinité pour 30 tous lesdits agents formant des liaisons, et (b) un marquage capable de fournir un signal détectable.

17. Nécessaire pour analyses suivant la revendication 16, caractérisé en ce que le marquage est un constituant d'un système à deux constituants produisant 35 un signal et en ce que ce nécessaire pour analyses comprend en outre le constituant restant de ce système à

deux constituants produisant un signal.

18. Nécessaire pour analyses contenant plusieurs réactifs en phase solide, comprenant chacun plusieurs antigènes viraux liés à un support en phase solide dans 5 des régions séparées, à des densités choisies à l'avance, préparés conformément au procédé de la revendication 13.

19. Nécessaire pour analyses suivant la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un 10 conjugué de (a) un récepteur ayant de l'affinité pour

des anticorps dirigés contre lesdits antigènes viraux et (b) un marquage capable de fournir un signal détectable.

20. Nécessaire pour analyses suivant la revendication 19, dans lequel le récepteur est de l'anti-IgG 15 humaine.

21. Nécessaire pour analyses suivant la revendication 19 ou 20, caractérisé en ce que le marquage est un constituant d'un système à deux constituants produisant un signal et le nécessaire pour analyses com20 prend en outre une solution de l'autre constituant de ce

système à deux constituants produisant un signal.

22. Nécessaire pour analyses suivant la revendication 19, dans lequel le récepteur est une anti-IgG humaine, et le marquage est un constituant d'un système 25 à deux constituants produisant un signal; et ce nécessaire pour analyses comprend en outre une solution de l'autre constituant de ce système à deux constituants produisant un signal, et une solution de lavage contenant une protéine non humaine.