DE3709959C2 - - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Enzymen mit einem rekombinante Plasmide enthaltenden Bakterium und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

In den letzten Jahren ist die Herstellung von brauchbaren Substanzen mit Hilfe eines rekombinante Plasmide enthaltenden Bakteriums in den Vordergrund getreten. Die Herstellung solcher wertvoller Substanzen verbleibt jedoch weitgehend im experimentellen Stadium und hat nicht das Stadium der Massenproduktion erreicht.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von Enzymen in großen Mengen mit Hilfe eines rekombinante Plasmide enthaltenden Bakteriums und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zu schaffen.

Gemäß der Erfindung umfaßt das Verfahren zur Herstellung eines Enzyms mit Hilfe eines rekombinante Plasmide enthaltenden Bakteriums das Kultivieren eines Wirtschaftsbakteriums, in welches Enzym-Gene und ein Steuer-Gen, welches einen Apo-Repressor bildet, eingeführt sind, und zwar in einem Zustand, in dem die Bildung des Enzyms reprimiert ist, indem ein Kulturmedium verwendet wird, das einen Co-Repressor enthält, sowie das Entfernen des Co-Repressors aus dem erhaltenen Kulturmedium und das anschließende Kultivieren des Wirtsbakteriums zur Herstellung des Enzyms unter Verwendung eines keinen Co-Repressor enthaltenden Kulturmediums (vgl. Anspruch 1).

Die Vorrichtung zur Herstellung des Enzyms weist einen Fermenter zur Kultivierung eines Wirtsbakteriums auf, in das Enzym-Gene und ein einen Apo-Repressor bildendes Steuer-Gen eingeführt sind, unter Anwendung eines einen Co-Repressor enthaltenden Kulturmediums, ferner einen zylindrischen Filter zur Entfernung des Co-Repressors durch Hindurchleiten einer im Fermenter enthaltenden Kulturlösung, eine Zirkuliereinrichtung zum Umwälzen der Kulturlösung aus dem Fermenter durch den Filter und ein Kulturmedium-Reservoir zum Zuführen eines keinen Co-Repressor enthaltenden Kulturmediums in den Fermenter (vgl. Anspruch 6).

In einem Wirtsbakterium, in welches Enzym-Gene und ein einen Apo-Repressor bildendes Steuer- bzw. Kontroll-Gen eingeführt sind, wird der Apo-Repressor vom Kontroll-Gen gebildet. Da das Wirtsbakterium erfindungsgemäß im Anfangsstadium unter Verwendung eines einen Co-Repressor enthaltenden Kulturmediums kultiviert wird, vereinigt sich der vom Kontroll-Gen gebildete Apo-Repressor mit dem Co-Repressor unter Bildung eines Repressors. Dieser Repressor vereinigt sich mit den Operatorteilen der Enzym-Gene, so daß die Transkription reprimiert wird. Dementsprechend wächst das Bakterium und die Bakterienzahl steigt in einem Stadium an, in dem die Herstellung des Enzyms unterdrückt ist. Wenn dann der Co-Repressor aus der Kulturlösung entfernt und der Wirtsbazillus unter Verwendung eines keinen Co-Repressor enthaltenden Kulturmediums kultiviert wird, wird das Enzym vom Wirtsbakterium produziert. Auf diese Weise kann, nachdem die Bakterienzahl angewachsen ist, Enzym in großen Mengen hergestellt werden.

Im zylindrischen Filter wird der Co-Repressor schnell durch Querstrom-Filtration aus der Kulturlösung entfernt. Das Verfahren zur Herstellung des Enzyms ist leicht durchführbar, wodurch es möglich ist, die Herstellung des Enzyms und seine Massenproduktion zu steuern.

Weitere Ausgestaltungen und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen und der Zeichnung. In der Zeichnung zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung des Aufbaus einer Ausführungsform der Vorrichtung zur Herstellung von Enzym;

Fig. 2 eine teilweise aufgebrochene perspektivische Darstellung eines bei der Vorrichtung nach Fig. 1 verwendeten Filters;

Fig. 3 bzw. 4 Darstellungen eines Plasmids, das in ein E. coli, entsprechend einem Beispiel der Erfindung, eingeführt ist;

Fig. 5 eine charakteristische Darstellung des Verhältnisses zwischen der Kultivationsdauer und der Tryptophan-Konzentration, der Trübung der Kulturbrühe und der totalen und spezifischen Aktivität des Enzyms bei einer Ausführungsform der Erfindung;

Fig. 6 eine charakteristische Darstellung des Verhältnisses zwischen der Filtratmenge und der Konzentration an Tryptophan bei einer Ausführungsform der Erfindung;

Fig. 7 eine charakteristische Darstellung des Verhältnisses zwischen der Kultivationsdauer und dem Filtratfluß bei einer Ausführungsform nach der Erfindung; und

Fig. 8 eine vergrößerte Schnittdarstellung eines Teils des Filters nach Fig. 2.

Beispiel

Bei der in diesem Beispiel beschriebenen Ausführungsform wird die Herstellung von β-Galactosidase unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben.

Zunächst wurde ein Plasmid pMCT98 hergestellt, indem ein EcoRI-Fragment, das einen trp-Promoter trägt, aus pOCT3 gereinigt wurde und in die EcoRI-Stelle von pMC1403 eingesetzt wurde, welche ein β-Galactosidase-Gen Lac Z, ein β-Galactosidopermease- Gen Lac Y und ein Galactosidotransacetylase- Gen Lac A, wie in Fig. 3 gezeigt, enthielt, wobei eine Gen- Rekombinationstechnik angewendet wurde. Eine Promoterregion, eine Operatorregion und eine Attenuatorregion sind in einem Teil von trp (dargestellt durch einen schwarzen Pfeil) vorhanden.

Danach wurden das pMCT98 und ein pRLK13 mit einem Apo-Repressor trp R, wie in Fig. 4 dargestellt, in Gegenwart von Metall-Ionen in Escherichia coli C600 eingeführt, um E. coli C600 zu transformieren.

Wenn ein Co-Repressor Tryptophan vorhanden ist, dann kombiniert das Tryptophan in diesem transformierten E. coli C600 mit dem im trp R-Teil des Plasmids pRLK13 gebildeten Apo-Repressor unter Bildung eines Repressors. Dieser Repressor kombiniert mit dem Operator im trp-Teil des Plasmids pMCT98 und unterdrückt die Transkription. In Abwesenheit von Tryptophan wird demgegenüber die Transkription iniziiert.

Die nachfolgende Tabelle zeigt das Verhältnis zwischen der Konzentration von Tryptophan und der spezifischen Aktivität von β-Galactosidase, wenn ein in der obigen Weise erhaltener E. coli-Bazillus C600 kultiviert wird. Es ist aus der Tabelle ersichtlich, daß die spezifische Aktivität abnimmt mit ansteigender Tryptophan-Konzentration.

Unter Verwendung von E. coli C600 wird β-Galactosidase mit Hilfe einer Vorrichtung zur Herstellung von Enzymen, wie sie in Fig. 1 schematisch dargestellt ist, produziert.

In Fig. 1 enthält ein Fermenter 1 eine Kulturlösung 2 eines gen-rekombinierendens E. coli C600, welches in der obigen Weise erhalten werden kann. Die Kulturlösung 2 wird durch Wasser mit konstanter Temperatur, das aus einem Bad 3 konstanter Temperatur zirkuliert, auf einer konstanten Temperatur gehalten. Zur Durchführung einer Querstrom-Filtration wird die Kulturlösung 2 dann durch eine Leitung 4, eine Pumpe 5, eine mit einem Kugelventil 6 ausgerüstete Leitung 7, einen Durchflußmesser 8 und ein Einlaßrohr 9 zu einem keramischen Filter 11 geführt, der vorzugsweise wie in Fig. 2 dargestellt, ausgebildet ist. Der Filter 11 ist in einem Filtergehäuse 10 installiert. Das Filtrat 12 gelangt durch den keramischen Filter 11 und wird dann über eine mit einem Solenoid-Ventil 13 ausgerüstete Filtratleistung 14 einem Filtratbad 15 zugeführt.

Auf der anderen Seite wird eine konzentrierte bakterienhaltige Lösung dem Fermenter 1 durch eine mit einem Kugelventil 16 ausgerüstete Auslaßleitung 17 zurückgeführt. Daneben ist parallel zur Pumpe 5 zwischen den Leitungen 4 und 7 eine mit einem Kugelventil 18 versehene Bypass-Leitung 19 vorgesehen. Weiterhin sind das Einlaßrohr 9 und die Auslaßleitung 17 mit Druckmeßeinrichtungen 20 bzw. 21 versehen. Ein Gaszuführungsrohr 23 zum Rückspulen ist mit einem Solenoid-Ventil 22 versehen und mit der Filtratleitung 14 verbunden. Zusätzlich ist der Fermenter 1 mit einem Niveau-Meßgerät 24 ausgerüstet. Mit Hilfe einer mit dem Niveau- Meßgerät 24 zusammenarbeitenden Pumpe 25 wird eine neue Kulturlösung in den Fermenter 1 aus einem Kulturmedium-Reservoir 26 zum Ausgleich der abgeführten Filtratmenge zugeführt.

Eine bevorzugte Ausführungsform des oben erwähnten keramischen Filters 11 ist in Fig. 2 dargestellt und mit der Bezugsziffer 31 versehen. Dieser Filter 31 hat eine Gesamtlänge von 750 mm und besitzt einen Filterkörper 32 aus Aluminiumoxid in der Gestalt einer hexagonalen Säule. Beide Enden des Filterkörpers 32 sind mit keramischen Dichtungen 33 versehen. Der Filterkörper 32 und die keramischen Dichtungen 33 besitzen im Innern neunzehn Durchgangsporen bzw. -kanäle 34 mit einem Durchmesser von 4 mm, die sich in Längsrichtung erstrecken. Die verfügbare Filterfläche ist 0,16-2,0 m² groß. Der erwähnte Filterkörper 32 besitzt vorzugsweise eine Verbundstruktur in der Weise, daß der Porendurchmesser der für die Querstrom-Filtration dienenden Poren um die Durchgangsporen bzw. -kanäle 34 herum allmählich größer wird. Eine bevorzugte Ausführungsform für den Filterkörper ist unter der Bezeichnung "Cerabel Ceramic Filter" erhältlich. Wie in Fig. 8 dargestellt, besitzt der Filterkörper vorzugsweise eine an jeder Innenseite der Durchgangsporen bzw. -kanäle 34 vorgesehene Filterschicht 32a, eine Zwischenschicht 32b und eine Stützschicht 32c. Die Stärke t1 der Filterschicht 32a beträgt ungefähr 20 µm. Die Stärke t2 der Zwischenschicht 32b beträgt ca. 20 µm. Die Stärke t3 der Stützschicht 32c beträgt ca. 1,4-2 mm. Der Porendurchmesser des Aluminiumoxids der Filterschicht 32a beträgt vorzugsweise 0,2-10 µm, wobei mit 0,2-3 µm beste Ergebnisse erhalten werden.

β-Galactosidase wird mit Hilfe der beschriebenen Herstellungsvorrichtung für Enzyme in der folgenden Weise produziert.

Unter Verwendung einer Charge eines Kulturmediums, welches mit den benötigten Aminosäuren ergänzt ist, wobei Glucose als Kohlenstoffquelle dient und Tryptophan als Co-Repressor in einer Konzentration von 100-200 µg/ml vorliegt, wird eine chargenweise Kultivierung von E. coli C600 während 5 Stunden bei 37°C und einem pH-Wert von 7 durchgeführt.

Danach wird - unter gleichzeitigem Zuführen eines Kulturmediums derselben Zusammensetzung, das jedoch kein Tryptophan enthält, aus einem Kulturmedium-Reservoir 26, die Kulturlösung 2 des Fermenters 1 mit Hilfe der Pumpe 6 durch den Filter 11 geführt, um Tryptophan aus der Kulturlösung zu entfernen und die konzentrierte, die Bakterien enthaltende Lösung dem Fermenter 1 wieder zurückzuführen.

Fig. 5 zeigt das Verhältnis zwischen der Kultivierungsdauer und der Konzentration des Tryptophans, der Trübung der Kulturbrühe und der Gesamtaktivität und der spezifischen Aktivität von β-Galactosidase. In Fig. 5 zeigt die gestrichelte Linie den Zeitpunkt, an dem die Filtration eingeleitet wird. Fig. 6 zeigt das Verhältnis zwischen der Filtratmenge und der Tryptophan-Konzentration. Fig. 7 zeigt das Verhältnis zwischen der Kultivierungsdauer und dem Filtrationsfluß.

Aus Fig. 5 ist ersichtlich, daß die Konzentration des Tryptophans in der Kulturlösung nach Filtrationsbeginn schnell abnimmt. Wie in Fig. 6 gezeigt, nimmt die Konzentration von Tryptophan nach Beginn der Filtration mit zunehmender Filtratmenge ab. Es wurde somit gefunden, daß das Tryptophan sehr schnell aus der Kulturlösung entfernt werden kann.

Die Trübungskurve in Fig. 5 für die Kulturbrühe zeigt, daß das Bakterium ständig wächst, abgesehen vom Zeitpunkt direkt nach Filtrationsbeginn. Die Wachstumsrate der Bakterien ist jedoch vor Filtrationsbeginn größer als nach Filtrationsbeginn. Dies wird so erklärt, daß vor dem Filtrationsbeginn Enzym nicht gebildet wird und nur das Wachstum der Bakterien stattfindet, wogegen nach Filtrationsbeginn die Tryptophanabnahme das Bakterium veranlaßt, das Enzym zu bilden und zu wachsen. Dies ist aus der Tatsache ersichtlich, daß die Kurven für die Gesamtaktivität und die β-Galactosidase-Aktivität in Fig. 5 vor Filtrationsbeginn sehr niedrige Werte zeigen, jedoch rasch ansteigende Werte nach Filtrationsbeginn. Auf diese Weise kann die Bildung des Enzyms gesteuert werden, was die Massenproduktion von Enzym möglich macht.

Wie in Fig. 7 dargestellt, nimmt der Filtratfluß bzw. die Filtratmenge im Laufe der Zeit allmählich ab, der Filtrationsfluß kann jedoch durch kontrollierte Rückspül-Intervalle und Rückspüldruck in gewissem Maße regeneriert werden (vgl. Pfeil in Fig. 7).

Im oben beschriebenen Beispiel wird zur Durchführung der Querstrom-Filtration ein Aluminiumoxid-Keramikfilter mit neunzehn Durchgangsporen bzw. -kanälen, wie in Fig. 2 dargestellt, verwendet. Es können jedoch auch andere Filter aus anderen Materialien, wie Metallen, Kunstharzen u. dgl. verwendet werden, wenn sie die richtigen Porengrößen besitzen. Der Filter kann einen oder eine Vielzahl von Durchgangskanälen besitzen.

Wie im einzelnen beschrieben, kann somit gemäß der Erfindung die Herstellung eines Enzyms gesteuert werden, wodurch die Massenproduktion des Enzyms ermöglicht ist.

Claims (11)

1. Verfahren zur Herstellung von Enzymen mit einem rekombinante Plasmide enthaltenden Bakterium, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Wirtsbakterium, in das Enzym-Gene und ein einen Apo-Repressor bildendes Kontroll-Gen eingeführt sind, in einem Zustand kultiviert, in dem die Bildung des Enzyms reprimiert ist, wobei ein einen Co- Repressor enthaltendes Kulturmedium verwendet wird, der Co-Repressor aus der erhaltenen Kulturlösung entfernt wird und danach das Wirtsbakterium zur Herstellung des Enzyms unter Verwendung eines kleinen Co-Repressor enthaltenden Kulturmediums kultiviert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine rekombinante Plasmide beherbergende Kulturlösung von E. coli C600 in einem Fermenter aufgenommen wird, und die Kulturlösung durch Hindurchleiten von Wasser konstanter Temperatur aus einem Temperierbad auf einer konstanten Temperatur gehalten wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kulturlösung zur Durchführung einer Querstrom-Filtration durch eine Leitung, eine Pumpe, ein Kugelventil, einen Durchflußmesser und ein Einlaßrohr in ein Filter geleitet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Filtrat durch den Filter geleitet und dann durch eine mit einem Solenoid-Ventil ausgerüstete Filtratleitung in ein Filtratbad gelassen wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine die Bakterien enthaltende konzentrierte Lösung durch ein mit einem Kugelventil ausgerüstetes Auslaßrohr in den Fermenter zurückgeführt wird.

6. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 5, gekennzeichnet durch einen Fermenter (1) zur Kultivierung des Bakteriums unter Verwendung eines einen Co-Repressor enthaltenden Kulturmediums; einen zylindrischen Filter (11) zur Entfernung des Co- Repressors eine Zirkulationseinrichtung für das Zirkulieren der Kulturlösung aus dem Fermenter (1) durch den Filter (11); und ein Kulturmedium-Reservoir (26) zum Zuführen eines keinen Co-Repressor enthaltenden Kulturmediums zum Fermenter.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Filter (11) aus keramischem Material besteht.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Filter (11) einen Filterkörper (32) aus Aluminiumoxid in der Gestalt einer hexagonalen Säule und an beiden Enden des Filterkörpers angebrachte keramische Dichtungen (33) aufweist, wobei der Filterkörepr (32) und die keramischen Dichtungen eine Vielzahl von in Längsrichtung verlaufenden Durchgangsporen (34) besitzt.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Filterkörper eine Verbundstruktur in der Weise besitzt, daß der Porendurchmesser um die Durchgangsporen (34) herum graduell zunimmt.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Filter (11) in einem Filtergehäuse angeordnet ist.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß ein Einlaßrohr und ein Auslaßrohr jeweils mit einem Durchmesser versehen sind und ein Gaszuführungsrohr für das Rückwaschen mit einem Solenoid- Ventil ausgerüstet und mit einer Filtratleitung verbunden ist, der Fermenter mit einem Niveaumesser (24) und einer mit dem Niveaumesser zusammenwirkenden Pumpe zur Kompensation der Filtratmenge durch Zuführen neuer Kulturlösung aus dem Kulturmedium-Reservoir (26) versehen ist.