DE602004012314T2

DE602004012314T2 - Niedermolekulare polysaccharide mit antithrombotischer wirkung

Info

Publication number: DE602004012314T2
Application number: DE602004012314T
Authority: DE
Inventors: Pasqua Anna Oreste; Giorgio Zoppetti
Original assignee: Glycores 2000 Srl
Current assignee: Glycores 2000 Srl
Priority date: 2003-12-17
Filing date: 2004-12-15
Publication date: 2009-03-19
Anticipated expiration: 2024-12-16
Also published as: EP1694714B1; DE602004012314D1; ES2302065T3; EP1694714A2; EP1694714B8; US20070155694A1; JP4975443B2; JP2007514817A; ITMI20032498A1; ATE388169T1; WO2005058976A2; US7812151B2; WO2005058976A3; PT1694714E

Description

GEGENSTAND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft neue niedermolekulare Polysaccharide, abgeleitet von K5 Polysaccharid, mit guter Wirksamkeit auf die Koagulationsparameter mit einem niedrigen hämorrhagischen Risiko, die als Medikamente zur Koagulationsregulierung und die Prävention und die Behandlung Thrombose einsetzbar sind. Die Erfindung betrifft insbesondere neue niedermolekulare epi-K5-N,O-sulfate mit einem Sulfatierungsgrad von 2,7–2,9, die erhaltbar sind durch Behandlung neuer niedermolekularer epi-K5-N-sulfate (ihrerseits hergestellt durch Depolymerisation mit salpetriger Säure von epi-K5-N-sulfaten) mit einem O-Sulfatierungsmittel unter O-Übersulfatierung, durch Unterwerfen des so erhaltenen niedermolekularen epi-K5-amin-O-Übersulfats einer selektiven O-Sulfatierung, durch Behandlung des so erhaltenen teilweise O-desulfatierten Produkts einer 6-O-Sulfatierung und durch abschließende Behandlung des so erhaltenen 6-O-sulfatierten Produkts mit einem Sulfatierungsmittel unter N-Sulfatierungsbedingungen. Die Erfindung betrifft überdies ein Verfahren zur Herstellung dieser niedermolekularen epi-K5-N,O-sulfate mit einem Sulfatierungsgrad von 2,3–2,9 und neue Zwischenprodukte.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Glyksaminglykane wie Heparin, Heparinsulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat und Hyaluronsäure sind Biopolymere, die industriell aus verschiedenen Tierorganen extrahiert werden.
Insbesondere Heparin, vornehmlich erhalten durch Extraktion aus der Darmschleimhaut von Schweinen oder aus der Lunge von Rindern, ist ein polydisperses Copolymer mit einer Molekulargewichtsverteilung von ungefähr 3 000 bis ungefähr 30 000 D bestehend aus einem Gemisch von Ketten im Wesentlichen bestehend aus einer Uronsäure (Glukuronsäure oder Iduronsäure) und eines Aminozuckers (Glukosamin) verbunden durch α-1 → 4 oder β-1 → 4 Bindungen. In Heparin kann die Iduronsäure-Einheit in der 2-Stellung O-sulfatiert sein und die Glukosamin-Einheit ist N-acetyliert oder N-sulfatiert und 6-O-sulfatiert in ungefähr 0,5% der vorliegenden Glukosamin-Einheiten.
Die Eigenschaften und natürliche Biosynthese von Heparin in Säugern wurde von Lindahl et al., 1986 in Lane, D. und Lindahl U. (Herausgeber) „Heparin. Chemical and Biological Properties; Clinical Applications", Edward Arnold, London, Seiten 159–190, von Lindahl, U. Feingold D. S. und Rodén L., 1986 TIBS, 11, 221–225 und von Conrad H. E. „Heparin Binding Proteins", Kapitel 2: Structure of Heparinoids, Academic Press, 1998, beschrieben. Die Biosynthese von Heparin erfolgt ausgehend von seinem Vorläufer N-Acetyl-heperosan bestehend aus einem Gemisch von Ketten bestehend aus der repetitiven Disaccherid-Einheit Glukuronyl-β-1 → 4-N-Acetylglucosamin. Dieser Vorläufer erfährt enzymatische Modifikationen, die teilweise die N-Acetylgruppe hydrolysieren, sie durch eine SO₃ ^– Gruppe ersetzen, das Carboxyl in 5-Stellung eines Teils der Glukuronsäure-Einheiten epimerisieren, diese in Iduronsäure-Einheiten überführen und O-Sulfat-Gruppen einführen, um ein Produkt zu erhalten, das, einmal industriell extrahiert, ungefähr die doppelte Anzahl von Sulfat-Gruppen in Bezug auf die Carboxy-Gruppenpro Disaccharid-Einheit aufweist. Diese enzymatischen Modifikationen führen unter anderem zur Bildung des Pentasaccherid-Antithrombin III (ATIII) Bindungsbereichs, aktives Pentasaccherid genannt, der die Struktur bildet, die für die hohe Affinitätsbindung von Heparin an ATIII notwendig und grundwesentlich für die antikoagulierende und antithrombotische Wirksamkeit von Heparin ist. Das Pentasaccherid, das innen nur einige der Ketten aufweist, die Heparin bilden, enthält eine sulfatierte Glukosamin-Einheit in 3-Stellung und eine Glukuronsäure, die zwischen Iduronsäure enthaltenden Disaccheriden angeordnet ist.
In der Natur ist die Bildung des aktiven Pentasaccherids ermöglicht durch die Epimerisierungreaktion des Carboxyls eines Teils der Glukuronsäure-Einheiten in Iduronsäure-Einheiten mittels der D-Glukuronyl C5-Epimerase (C5-Epimerisierung) und einer geeigneten Sulfatierung, die auch zur Einführung einer Sulfat-Gruppe in das Hydroxyl in 3-Stellung des Glukosamins führt. Insbesondere ist in der Natur die Bildung des aktiven Pentasaccherids dadurch ermöglicht, dass die C5-Epimerisierung in Cluster erfolgt, d. h. auf Abschnitten von Ketten, und extensiv, was zu einem Produkt führt, das mehr Iduronsäure-Einheiten als Glukuronsäure-Einheiten enthält. Handelsübliches Heparin enthält tatsächlich ungefähr 70% Iduronsäure-Einheiten und 30% Glukuronsäure-Einheiten.
BESCHREIBUNG DES STANDES DER TECHNIK
Es ist bekannt, dass das Kapsel K5 Polysaccharid, isoliert von Escherichia coli, beschrieben von Vann W. F. et al. in European Journal of Biochemistry, 1981, 116, 359–364 („Vann 1981") aus einem Gemisch von Ketten besteht, die aus der wiederkehrenden Disaccherid-Einheit Glukuronyl-β-1 → 4-N-Acetylglukosamin gebildet ist und daher die gleiche wiederkehrende Disaccherid-Einheit (A) zeigt
des N-Acetyl-heparosan Vorläufers von Heparin. Das Kapsel K5 Polysaccharid, nachfolgend als „K5 Polysaccharid" oder noch einfacher als „K5" bezeichnet, wurde chemisch modifiziert von Lormeau et al., wie in US 5,550,116 beschrieben, und von Casu et al., wie in Carbohydrate Research, 1994, 263, 271–284 beschrieben. K5-O-Sulfate mit antitumoraler, antimetastatischer, antiviraler, insbesondere anti-HIV-Wirksamkeiten werden in EP 333 243 und WO 96/34958 beschrieben. Das K5 wurde auch durch chemische und enzymatische Mittel modifiziert, um Produkte mit der gleichen Art von in vitro biologischer Koagulationswirksamkeit wie diejenige von Heparin, das aus tierischen Organen extrahiert wurde (extraktives Heparin), zu erhalten.
Der Erhalt der Produkte mit einer Koagulationswirksamkeit der gleichen Art wie diejenige von Heparin erfolgt mittels Verfahren, die die in der Natur auftretenden imitieren und die Schlüsselstufe von C5-Epimerisierung mit D-Glukuronyl C5 Epimerase umfassen.
Die in IT 1230785 , WO 92/17507 , WO 96/14425 und WO 97/43317 beschriebenen Verfahren verwenden K5 als Ausgangsmaterial. Von Fermentation stammendes K5 wird einer N-Deacylierung gefolgt von N-Sulfatierung unterworfen und dann wird das K5-N-Sulfat so erhalten mittels einer C5-Epimerisierung mit C5-Epimerase erhalten entweder durch Chromatographie einer Lösung von mikrosomalen Enzymen von Maus-Mastozytom ( IT 1 230 785 ) oder von Rinderleber ( WO 92/17507 , WO 96/14425 und WO 97/43317 ) in Lösung übergeführt.
Die D-Glukuronyl C5 Epimerase aus Rinderleber wurde gereinigt nach Campbell, P. et al. in J. Biol. Chem., 1994, 269/43, 26953–26958 („Campbell 1994"), der auch ihre Zusammensetzung in Aminosäuren lieferte und ihre Verwendung in Lösung beschrieb zur Transformierung eines K5-N-Sulfats in das entsprechende 30% epimerisierte Produkt, wobei die Bildung von Iduronsäure mittels Hochdruck-Flüsigkeits-Chromatographie als Folge einer vollständigen Depolymerisation mit salpetriger Säure bis zum Disaccharid gezeigt wird.
Das Dokument WO 96/48006 beschreibt die DNA-Sequenz, die für die D-Glukuronyl C5 Epimerase und eine rekombinate D-Glukuronyl C5 Epimerase kodiert, erhalten aus einem rekombinanten, diese DNA enthaltenden Expressionsvektor, nachfolgend gereinigt nach Campbell et al. wie gezeigt von Jin-Ping L. et al. in J. Biol. Chem., 2001, 276, 20069–20077 („Jin-Ping 2001").
Die komplette C5-Epimerase-Sequenz wurde von Crawford B. E. et al. in J. Biol. Chem., 2001, 276, (24), 21538–21543 (Crawford 2001) beschrieben.
Das Dokument WO 01/72848 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von N-deacylierten, N-sulfatierten Derivaten von K5 Polysaccharid, epimerisiert zu mindestens 40% Iduronsäure bezogen auf die Gesamtheit der Uronsäuren, mit einem Molekulargewicht von 2 000 bis 30 000, enthaltend 25 bis 50% Ketten mit hoher Affinität für ATIII und mit einer antikoagulierenden und antithrombotischen Wirksamkeit, ausgedrückt als HCII/AntiXa-Verhältnis von 1,5 bis 4.
Dieses Verfahren, das aufeinanderfolgend die Herstellung von K5 von Escherichia coli, N-Deacetylierung und N-Sulfatierung, C5-Epimerisierung, Übersulfatierung, selektive O-Desulfatierung, 6-O-Sulfatierung und N-Sulfatierung umfasst, sieht eine C5-Epimerisierung vor, ausgeführt mit C5-Epimerase in Lösung oder immobilisiert in Gegenwart von spezifischen zweiwertigen Kationen. Nach dem Dokument WO 01/72848 kann die C5-Epimerisierung nicht differenziert ausgeführt werden mit einem natürlichen oder rekombinanten Enzym, immobilisiert oder in Lösung bei einer Temperatur von 30 bis 40°C für eine Zeitdauer von 1 bis 24 Stunden.
Überdies offenbart dieses Dokument eine Depolymerisierungsreaktion mit salpetriger Säure, ausgeführt am Endprodukt am Ende der oben genannten Reaktionssequenz.
Das Dokument US 2002/0062019 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von zur Regulierung von Koagulation wirksamen epi-K5-N,O-sulfaten mit einem Sulfatierungsgrad von 2,3 bis 2,9 und einem Molekulargewicht von 2 000 bis 30 000, oder von 4 000 bis 8 000, oder von 18 000 bis 30 000. Dieses vorgenannte Verfahren umfasst die Stufen: (s-a) eine N-Deacetylierung von K5 Polysaccharid und eine N-Sulfatierung des erhaltenen K5-Amins, (s-b) eine Epimerisierung von K5-Sulfat, (s-c) eine O-Übersulfatierung von epi-K5-N-sulfat, (s-d) eine teilweise O-Desulfatierung, (s-e) eine selektive 6-O-Sulfatierung, (s-f) eine N-Sulfatierung des so erhaltenen Produkts, wobei jedes am Ende irgendeiner Verfahrensstufe (s-b)–(s-f) erhaltene Produkt es zulässt, einer Depolymerisierung unterworfen zu werden. Dieses Dokument beschreibt ein epi-K5-N,O-sulfat mit einem Molekulargewicht von 7 400, erhalten gemäß der oben genannten Verfahrensstufen (s-a)–(s-f), gefolgt von einer Depolymerisation mit salpetriger Satire am Ende der Stufe (s-f) mit einem Sulfatierungsgrad von 2,3 bis 2,9.
Dasselbe Dokument beschreibt auch eine K5 Fraktion mit einem Molekulargewicht von etwa 5 000, das auch den Stufen (s-a)–(s-f) unterworfen werden kann.
Zur Vereinheitlichung der Terminologie und um den Text verständlicher zu machen werden in der vorliegenden Beschreibung konventionelle Termini verwendet, im Singular oder Plural. Im Einzelnen:

– mit „K5" oder „K5 Polysaccharid" wird bezeichnet das Kapsel-Polysaccharid von Escherichia coli erhalten mittels Fermentation, d. i. ein Gemisch von Ketten bestehend aus Disaccharid-Einheiten (A) gegebenenfalls enthaltend eine Doppelbindung am nicht-reduzierenden Ende wie oben dargestellt, wie auch immer hergestellt und gereinigt nach den in der Literatur beschriebenen Verfahren, insbesondere entsprechend Vann 1981, entsprechend Manzoni M. et al., Journal of Bioactive Compatible Polymers, 1996, 11, 301–311 („Manzoni 1996") oder gemäß des in WO 01/72848 oder US 2002/0062019 beschriebenen Verfahrens; für den Fachmann ist es offensichtlich, dass dies, wie nachfolgend gezeigt, auf jedes N-Acetylheparosan angewendet werden kann.;
– unter C5-Epimerase versteht man die D-Glukuronyl C-5 Epimerase, extraktive oder rekombinant wie auch immer hergestellt, isoliert und gereinigt insbesondere wie in Campbell 1994, in der WO 98/48006 , in Jin-Ping L. et al. in J. Biol. Chem. 2001, 276, 20069–20077 („Jin-Ping 2001") oder in Crawford 2001 beschrieben;
– mit K5-Amin ist gemeint mindestens 95% N-deacelyliertes K5, vorzugsweise vollständig N-deacetyliertes, worin nämlich N-Acetyl-Gruppen mit einem normalen NMR-Gerät nicht detektierbar sind;
– mit „K5-N-sulfat" wird bezeichnet mindestens 95%, vorzugsweise 100% N-deacetyliertes und N-sulfatiertes K5, weil N-Acetyl-Gruppen mit einem normalen NMR-Gerät nicht detektierbar sind;
– mit „epi-K5" wird das K5 und seine Derivate bezeichnet, worin 40%–60% der Glukuronsäure-Einheiten zu Iduronsäure-Einheiten C5-epimerisiert sind;
– mit „epi-K5-N-sulfat" wird K5-N-sulfat bezeichnet, worin 40%–60% der Glukuronsäure-Einheiten zu Iduronsäure-Einheiten C5-epimerisiert sind;
– mit „epi-K5-amin-O-Übersulfat" wird epi-K5-amin-O-sulfat mit einem Sulfatierungsgrad von mindestens 2 bezeichnet;
– mit „epi-K5-N,O-sulfat" wird ein K5-N,O-sulfat bezeichnet, worin 40%–60% der Glukuronsäure-Einheiten zu Iduronsäure-Einheiten C5-epimerisiert sind, mit einem Sulfatierungsgrad von 2,3 bis 2,9;
– die konventionellen Termini und oben angegebenen Ausdrücke beziehen sich auf K5 wie nach Fermentation isoliert, im Allgemeinen mit einer Molekulargewichtsverteilung von etwa 1 500 bis etwa 50 000 mit einem mittleren Molekulargewicht von 12 000–25 000, vorteilhafter Weise von 15 000–25 000;
– außer das Molekulargewicht ist anders spezifiziert, bezeichnen die konventionellen Termini und oben definierten Ausdrücke, wenn sie mit dem vorangesetzten Akronym „LMW" (low molecular weight/niedriges Molekulargewicht) versehen sind, insbesondere LMW-epi-K5-N-sulfat, LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfat, LMW-epi-K5-N,O-sulfat, Produkte mit niedrigem Molekulargewicht, deren mittleres Molekulargewicht von etwa 1 500 bis etwa 12 000 ist;
– wenn nachfolgend steht „-derivat" bezeichnen die konventionellen Termini und oben definierten Ausdrücke insgesamt sowohl die Derivate von nativem K5 als auch K5 mir niedrigem Molekulargewicht;
– der Terminus „depolymerisiertes LMW-epi-K5-N-sulfat" bezeichnet ein LMW-epi-K5-N-sulfat erhalten entsprechend der Sequenz (i) → (ii) oder der Sequenz (ii) → (i) wie unten dargelegt; analoger Weise bezeichnen die Termini „depolymerisiertes LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfat" und „depolymerisiertes LMW-epi-K5-amin-N,O-sulfat" ein LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfat bzw. ein LMW-epi-K5-N,O-sulfat erhalten ausgehend von depolymerisiertem LMW-epi-K5-N-sulfat;
– das prefix „(epi), das „K5" in konventionellen Termini und oben angegebenen Ausdrücken vorangesetzt ist, bezeichnet insgesamt Produkte sowohl von nativem K5 als auch von epi-K5 (40–60% epimerisiert).

– außer spezifisch anders angegeben bezeichnet der Terminus „Molekulargewicht" oder „mittleres Molekulargewicht" das Molekulargewicht bestimmt mittels HPLC (Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatogrphie) gegen Standards von Heparin und Heparin mit niedrigem Molekulargewicht;
– mit dem Terminus „ungefähr" oder „etwa" betreffend das Molekulargewicht wird das Molekulargewicht bezeichnet gemessen mittels Viskosimetrie ± das theoretische Gewicht einer Disaccherid-Einheit einschließlich des Gewichts von Natrium berechnet als 461 für den Fall eines epi-K5-N-sulfat-derivats und 644 für den Fall eines epi-K5-N,O-sulfat-derivats mit einem Sulfatierungsgrad von 2,8;
– mit dem Ausdruck „vorwiegende Species" ist die Verbindung bezeichnet, die in dem Gemisch bestehend aus dem LMW-epi-K5-N-sulfat, dem LMW-epi-K5-amin-O- Übersulfat oder dem LMW-epi-K5-N,O-sulfat die meist vorhandene Spezies ist, bestimmt durch den Peak der Kurve des mittels HPLC gemessenen Molekulargewichts;
– außer anders speziell angegeben wird mit „Sulfatierungsgrad" das SO₃ ^–/COO^–-Verhältnis bezeichnet, ausdrückbar auch als die Zahl der Sulfat-Gruppen pro Disaccharid-Einheit, gemessen mittels konduktimetrischer Methode beschrieben von Casu B. et al. in Carbohydrate Research, 1975, 39, 168–176 (Casu 1975);
– mit „O-Übersulfatierungsbedingungen" ist eine extreme O-Sulfatierung bezeichnet beispielsweise durchgeführt nach der Methode C beschrieben von B. Casu et al. in Carbohydrate Research, 1994, 263, 271–284 (Casu 1994);
– mit dem Terminus „Alkyl" wird ein lineares oder verzweigtes Alkyl bezeichnet, während „Tetrabutylammonium" für die Tetra(n-butyl)ammonium-Gruppe steht.

Schließlich ist festzuhalten, dass in der Literatur das Polysaccharid K5 (K5) auch „Acetylaminoheparosan" genannt wird. So entspricht K5-Amin „Aminoheparosan", K5-N-sulfat „Sulfaminoheparosan" usw., während, wenn diese Produkte epimerisiert sind, in der Literatur den oben genannten Termini der Terminus „epimerisiert" vorangesetzt ist. In diesem Zusammenhang bezieht sich die vorliegende Beschreibung auf „K5", um den Ursprung der darin geoffenbarten Produkte zu betonen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In der Patentanmeldung PCT/IB03/002338 sind epi-K5-amino-O-Übersulfat-derivate geoffenbart, die verwendbar sind als Zwischenprodukte bei der Herstellung von epi-K5-N,O-Übersulfat-derivaten mit antiangiogenetischer und antiviraler Wirksamkeit. Diese epi-K5-amino-N,O-Übersulfat-derivate sind mittels eines Verfahrens herstellbar, das umfasst die Behandlung eines epi-K5-N-sulfat-derivate mit vorzugsweise Tetrabutylammoniumhydroxid, wobei die Reaktionsmischung für eine Zeitdauer von 30–60 Minuten bei einem pH-Wert von etwa 7 stehen gelassen wird, Isolierung des so erhaltenen Salzes, vorzugsweise des Tetrabutylammoniumsalzes, und Behandlung dieses Salzes mit einem Sulfatierungsmittel unter O-Übersulfatierungsbedingungen. Das oben genannte Dokument offenbart die Herstellung von LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfaten von einem LMW-epi-K5-N-sulfat als Ausgangsmaterial.
Dasselbe Dokument PCT/IB03/002338 , sowie die Dokumente IT MI2002A001346 und IT MI2002A001854 offenbaren zum ersten Mal LMW-epi-K5-N-sulfate, vorzugsweise frei von N-acetyl-Gruppen, worin der Gehalt an Iduronsäure bezogen auf die Gesamtheit von Uronsäuren 40%–60% ist, vorzugsweise etwa 50%. Diese LMW-epi-K5-N-sulfate sind als Zwischenprodukte bei der Herstellung von LMW-epi-K5-N,O-sulfaten mit hohem Wirksamkeitsgrad an verschiedenen biologischen Parametern (IT MI2002A001346) verwendbar. Die Herstellung dieser LMW-epi-K5-N-sulfate ist im Detail in den drei oben genannten Dokumenten beschrieben.
Überdies offenbart PCT/IB03/02339 pharmazeutische Massen enthaltend als Wirkstoff ein (epi)K5-amino-O-Übersulfat-derivat oder ein pharmazeutisch zulässiges Salz hiervon, erhältlich nach einem Verfahren, das umfasst

– Erwärmen eines (epi)K5-N-sulfat-derivat in Säure-Form mit einer tertiären oder quaternären organischen Base, Stehenlassen der Reaktionsmischeng für eine Zeitdauer von 30–70 Minuten bei Aufrechterhaltung des pH-Wertes der Lösung eines Wertes von ungefähr 7 durch Zusetzen der tertiären oder quaternären organischen Base und Isolieren des Salzes mit dieser organischen Base; und
– Behandlung dieses organischen basischen Salzes dieses (epi)K5-N-sulfat-derivats mit einem O-Sulfatierungsmittel unter O-Übersulfatierungsbedingungen und Isolieren des (epi)K5-amino-O-Übersulfat-derivats.

Bei der Herstellung von N,O-sulfatierten, N-acetylierten Derivaten von K5 Polysaccharid, zumindest 40% epimerisiert zu Iduronsäure bezogen auf die gesamten Uronsäuren und mit einem niedrigen Molekulargewicht wie in WO 01/72848 und in US 2002/0062019 beschrieben, wird beobachtet, dass die Depolymerisation des Produkts hohen Molekulargewichts erhalten am Ende der Stufe (g) des in WO 01/72848 beschriebenen Verfahrens und am Ende der Stufe (vi) des in US 2002/0062019 beschriebenen Verfahrens nicht-einheitliche Ergebnisse ergeben kann, da sie im Allgemeinen depolymerisierte Produkte mit einer wesentlich niedrigeren Wirksamkeit an allen Koagulationsparametern liefert als derjenigen von Produkten mit hohem Molekulargewicht, von denen sie abgeleitet sind. Vermutlich findet dies deswegen statt, weil Degradierung mit salpetriger Säure beeinflusst wird durch die Gegenwart der Sulfat-Gruppen. Insbesondere die Gegenwart von Sulfaten in 3-Stellung des Glukosamins ruft heterogene Produkte hervor, wie beschrieben von Nagasawa et al. in Thrombosis Research, 1992, 65, 463–467 (Nagasawa 1992). In US 2002/0062019 wurde dieser Nachteil dadurch behoben, dass die selektive O-Sulfatierungsstufe ausgeführt wurde unter Aufrechterhaltung der Dauer der Reaktion des übersulfatierten Produkts mit Dimethylsulfoxid/Methanol im Bereich von 135–165 Minuten, vorzugsweise bei etwa 60°C für 150 Minuten. Dieses besonders vorteilhafte Verfahren ist im Detail in WO 02/50125 beschrieben.
Es wurde nun gefunden, dass depolymerisierte LMW-epi-K5-N,O-sulfate mit einem Sulfatierungsgrad von etwa 2,3 bis 2,9 und guter Wirksamkeit an Koagulationsparametern hergestellt werden können durch Unterwerfen eines depolymerisierten LMW-epi-K5-N-sulfats einer O-Übersulfatierungsreaktion, beispielsweise gemäß der Methode C beschrieben von B. Casu et al. in Carbohydrate Research, 1975, 39, 168–176 (Casu 1975), um ein depolymerisiertes LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfat zu erhalten, durch Unterwerfen des depolymerisierten Übersulfatproduktes einer selektiven O-Desulfatierung, dann einer 6-O-Sulfatierung und schließlich durch Behandlung des so erhaltenen teilweise desulfatierten, depolymerisierten Produkts mit einem Sulfatierungsmittel unter den Bedingungen einer N-Sulfatierung, um das gewünschte depolymerisierte LMW-epi-K5-N,O-Sulfat mit einem Sulfatierungsgrad von etwa 2,3 bis etwa 2,9 zu erhalten.
Es wurde auch gefunden, dass bei Arbeiten ausgehend von einem depolymerisierten LMW-epi-K5-N-sulfat die selektive Teil-O-Desulfatierung mit Dimethylsulfoxamid/Methanol in einem ausgedehnteren Erwärmungszeitenbereich ausgeführt werden kann, um so in reproduzierbarer Weise schließlich depolymerisierte LMW-epi-K5-N,O-sulfate zu erhalten mit immer hoher Wirksamkeit an Koagulationsparametern, wenn auch variabel in Funktion der angewendeten Zeitdauer der selektiven O-Desulfatierung.
Es wurde insbesondere überraschend gefunden, wenn ein depolymerisiertes LMW-epi-K5-N-sulfat mit einem mittleren Molekulargewicht von ungefähr 6 000 einer O-Sulfatierung, das so erhaltene depolymerisierte LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfat einer selektiven O-desulfatierung, das teilweise O-desulfatierte, depolymerisierte Produkt einer 6-O-sulfatierung und dann einer N-Sulfatierung unter ähnlichen Bedingungen wie die in WO 02/50125 beschriebenen unterworfen wird, dass ein depolymerisiertes LMW-epi-K5-N,O-sulfat erhalten wird mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 6 000, einem Sulfatierungsgrad von 2,7–2,9, einer Anti-XA Aktivität und einer Anti-IIa Aktivität, jeweils so hoch wie eine Hälfte der Wirksamkeit des niedrigmolekulargewichtigen Heparin Standards (sLMWH), nämlich einem Anti-Xa/Anti-IIa Verhältnis identisch mit demjenigen von sLMWH, jedoch einem Steigerungspotential der Koagulationsdauer von 5 bis 8 Mal niedriger als derjenigen von sLMWH. So wurde zum ersten Mal ein Glykoseaminoglykan erhalten abgeleitet von dem Polysaccharid K5, das als gleich dem sLMWH hingestellt werden kann, soweit es das Anti-Xa/Anti-IIa Verhältnis betrifft, und das bei gleichen Dosierungen ein 2,5- bis 4-fach niedrigeres Blutungsrisiko als sLMWH aufweist.
Weiters wurde gefunden, dass depolymerisierte LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfate erhältlich nach dem Verfahren, das die Behandlung eines depolymerisierten LMW-epi-K5-N-sulfats mit einem O-Sulfatierungsmittel unter O-Übersulfatierungsbedingungen umfasst, im Wesentlichen ohne antikoagulierende Wirksamkeit sind und eine gute mikrobielle Wirkung aufweisen wie die der in PCT/IB03/02339 beschriebenen LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfate.
Schließlich wurde gefunden, dass alle (epi)K5-amin-O-Übersulfate mit einem Sulfatierungsgrad von 2 bis 4, erhalten durch Behandlung der entsprechenden (epi)K5-N-sulfat-Derivate mit einem O-Sulfatierungsmittel unter O-Übersulfatierungsbedingungen, im Wesentlichen ohne antikoagulierende Wirksamkeit sind, eine gute mikrobielle Wirkung aufweisen und so wirksame Bestandteile für die Herstellung pharmazeutischer Massen sind. Diese pharmazeutischen Massen sind zur Behandlung von Infekten mikrobiellen, insbesondere viralen Ursprungs bestimmt.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt das ¹³C-NMR Spektrum des depolymerisierten LMW-epi-K5-amin-O-sulfats von Beispiel 1(b).
2 zeigt das ¹³C-NMR Spektrum des depolymerisierten LMW-epi-K5-amin-N,O-sulfats enthaltend zu 80% 6-O-sulfat von Beispiel 1(c).
3 zeigt das ¹³C-NMR Spektrum des endgültig depolymerisierten LMW-epi-K5-amin-N,O-sulfats von Beispiel 1(d), anzeigend die Gegenwart von sulfatierten 2,5-Anhydromannitol-Einheiten.
DETAILIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
So ist Gegenstand der Erfindung die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung neuer depolymerisierter LMW-epi-K5-N,O-sulfate mit einem Sulfatierungsgrad von 2,3 bis 2,9 und ihrer pharmazeutisch zulässigen Salze zu erhalten, das umfasst

(a) Behandlung eines tertiären oder quaternären organischen Basensalzes eines depolymerisierten LMW-epi-K5-N-sulfats mit einem Sulfatierungsmittel unter O- Übersulfatierungsbedingungen, um ein depolymerisiertes LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfat zu erhalten;
(b) Unterwerfen des so erhaltenen depolymerisierten LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfats einer selektiven O-Desulfatierung, um ein depolymerisiertes LMW-epi-K5-amin-O-sulfat zu erhalten;
(c) Behandlung eines tertiären oder quaternären organischen Basensalzes des so erhaltenen depolymerisierten LMW-epi-K5-amino-O-sulfats mit einem O-sulfatierungsmittel, um ein LMW-epi-K5-amino-O-sulfat enthaltend mindestens 80% 6-O-sulfat zu erhalten;
(d) Unterwerfen des so erhaltenen, mindestens 80% 6-O-sulfat enthaltendes depolymerisiertes LMW-epi-K5-N,O-sulfat einer N-Sulfatierungreaktion und Isolieren des so erhaltenen depolymerisierten LMW-epi-K5-amino-N,O-sulfats, vorzugsweise als Natriumsalz hiervon, das gegebenenfalls in ein anderes pharmazeutisch zulässiges Salz hiervon übergeführt wird.

Salze mit Alkalimetallen, insbesondre Natrium oder Kalium, mit Erdalkalimetallen, insbesondere Kalzium und Magnesium, mit Aluminium und mit Zink sind bevorzugte pharmazeutisch zulässige Salze.
Die depolymerisierten Ausgangs-LMW-epi-K5-N-sulfate können hergestellt werden durch Unterwerfen eines epi-K5-N-sulfats einer Depolymerisierung mit salpetriger Säure gefolgt von einer Reduktion üblicherweise mit Natriumborhydrid. Die zur Herstellung der depolymerisierten oben genannten Ausgangs-LMW-epi-K5-N-sulfate verwendeten epi-K5-N-sulfate sind solche mit einem Iduronsäuregehalt von 40–60% und die mindestens 95% N-sulfat-Gruppen enthalten, wie beispielsweise solche, die in WO 01/72848 , US 2002/0062019 oder WO 02/068477 beschrieben sind.
Besonders bevorzugt werden die oben dargelegten depolymerisierten Ausgangs-LMW-epi-K5-N-sulfate hergestellt mittels eines Verfahrens, das umfasst Unterwerfen eines K5-N-sulfats gemäß irgendeiner Anordnung,

(i) einer C5-Epimerisierung mit einer D-Glukuronyl C5-Epimerase, isoliert, gereinigt und in Lösung oder immobilisiert auf einem festen Träger, bei einem pH von ungefähr 7, bei einer Temperatur von ungefähr 30°C and für eine Zeitdauer von 12–24 Stunden in Gegenwart mindestens eines zweiwertigen Ions ausgewählt unter Kalzium, Magnesium, Barium und Mangan; und
(ii) einer Depolymerisierung mit salpetriger Säure gefolgt von einer Reduktion, üblicherweise mit Natriumborhydrid.

Der Ausdruck „in irgendeiner Anordnung" bedeutet, dass das Verfahren in gleicher Weise durchgeführt werden kann entweder in der Richtung (i)–(ii), d. h. in der oben angegebenen Reihenfolge, oder in umgekehrter Richtung (ii)–(i), d. h. durch Unterwerfen des K5-N-sulfats zuerst einer Depolymerisierungsreaktion mit salpetriger Säure, gefolgt von einer Reduktion mit Natriumborhydrid und dann der C5-Epimerisierung unter den vorstehend angegebenen Bedingungen. Die bevorzugte Anordnung ist in der Richtung (i) → (ii). Die Abfolge (ii) → (i) wird vorzugsweise angewendet ausgehend von LMW-K5-N-sulfaten mit einem mittleren Molekulargewicht von mehr als 4 000, vorzugsweise ausgehend von etwa 6 000. Man kann beispielsweise die Menge Natriumnitrit bestimmen, das ausgehend von 1 g epi-K5-N-sulfat den Erhalt eines LMW-epi-K5-N-sulfats mit einem mittleren Molekulargewicht von mehr als 4 000, insbesondere mindestens 6 000 ermöglicht, um für die Herstellung von entsprechenden LMW-epi-K5-N,O-sulfaten mit einem Sulfatierungsgrad von 2,3 bis 2,9 brauchbare Zwischenprodukte zu erhalten. Tatsächlich wird vorliegendenfalls in Stufe (ii) der Prozentsatz optimaler Epimerisierung erzielt. Wenn die Herstellung des depolymerisierten LMW-epi-K5-N-sulfats ausgeführt wird gemäß der Abfolge (ii) → (i), so erfolgt die Epimerisierung in optimaler Weise, wenn sie ausgeführt wird an einem depolymerisierten LMW-epi-K5-N-sulfat mit einem mittleren Molekulargewicht höher als 4 000, vorteilhafter Weise von 5 000 bis 7 500, vorzugsweise von 6 000 bis 7 500.
Die Symbole (i) und (ii), wie sie nachfolgend verwendet werden, bezeichnen die Depolymerisierungsstufe, bzw. die C5-Epimerisierungsstufe, wie immer die Anordnung ist, in der diese Stufen durchgeführt werden.
Die C5-Epimerase kann in Lösung oder immobilisiert auf einem inerten festen Träger verwendet werden. Im letztgenannten Fall ist die C5-Epimerase, vorzugsweise rekombinant, isoliert und gereinigt, beispielsweise nach Campbell 1994, Wo 98/48006 , Jin-Ping 2001 oder Crawford 2001, auf einem inerten Träger in Gegenwart des Substrats, d. h. in Gegenwart von Ausgangs-K5-N-sulfat oder LMW-K5-N-sulfat immobilisiert, wobei letztgenanntes üblicherweise ein mittleres Molekulargewicht von mehr als 4 000, vorteilhafter Weise von 4 000 bis 7 500, und besonders vorteilhafter Weise von 5 000 bis 7 500, vorzugsweise mindestens 6 000 hat. Die Immobilisierung wird ausgeführt nach konventionellen Methoden, z. B. wie in WO 01/72848 beschrieben.
Die C5-Epimerisierungsreaktion wird ausgeführt unter Rückführung von 20–1 000 ml einer 25 mM HEPES Lösung bei einem pH von ungefähr 7 enthaltend 0,001–10 g Substrat (K5-N-sulfat oder LMW-K5-N-sulfat, letztgenanntes normaler Weise mit einem mittleren Molekulargewicht von mehr als 4 000, insbesondere 4 000 bis 7 500) und ein Kation ausgewählt unter Kalzium, Magnesium, Barium und Mangan in einer Konzentration von 10 bis 60 mM durch eine Säule enthaltend 1,2 × 10⁷ bis 3 × 10¹¹ cpm des immobilisierten Enzyms, bei Aufrechterhaltung des pH-Wertes auf ungefähr 7 bei ungefähr 30°C bei einem Fluss von 30–220 ml/Stunde für eine Zeitdauer von 12–24 Stunden, vorteilhafter Weise 15–24 Stunden.
Vorzugsweise wird die Lösung bei einem Fluss von ungefähr 200 ml/Stunde über Nacht (15–20 Stunden) rückgeführt. Das erhaltene Produkt wird gereinigt und abgetrennt nach bekannten Methoden, beispielsweise mittels Ultrafiltration und Präzipitation mit Ethanol. Das so erhaltene Produkt besteht entweder aus epi-K5-N-sulfat (und in einem solchen Fall wird es in Wasser gelöst und der Depolymerisation unterworfen) oder aus LMW-epi-K5-N-sulfat (in einem solchen Fall ist es das Endprodukt). Der Prozentsatz der Epimerisierung, in der Praxis die Menge von Iduron-Einheiten bezogen auf die Glukuron-Einheiten, wird berechnet unter Verwendung von ¹H-NMR nach dem in WO 96/4425 beschriebenen Verfahren.
Die Depolymerisierungsreaktion mit salpetriger Säure wird gemäß bekannter Depolymerisierungsmethoden von Heparin, z. B. gemäß der Methode, beschrieben in EP 37319 , WO 82/03627 oder nach der Depolymerisierungsmethode von einem K5-N-sulfat, beschrieben in EP 544592 , jedoch ausgehend von einem K5-N-sulfat oder einem epi-K5-N-sulfat, enthaltend 0 bis nicht mehr als 5% Acetyl-Gruppen. Auf die Depolymerisierung, ausgeführt mit Natriumnitrit und Salzsäure an einem epi-K5-N-sulfat folgt eine Reduktion in situ mit Natriumborhydrid.
In der Praxis wird ein kalte wässerige Lösung von (epi)K5-N-sulfat auf einen sauren pH (ungefähr 2) mit Salzsäure gebracht und noch in der Kälte mit Natriumnitrit behandelt bei Aufrechterhaltung der Temperatur (ungefähr 4°C) und eines konstanten pII (ungefähr 2) und nach Beendigung der Depolymerisierung (ungefähr 15–30 Minuten) und dann die Lösung mit Natriumhydroxid neutralisiert und noch bei ungefähr 4°C mit einer wässerigen Natriumborhydridlösung behandelt. Nach Beendigung der Reduktion (ungefähr 4 Stunden) wird das überschüssige Natriumborhydrid mit Salzsäure zerstört, die Lösung mit Natriumhydroxid neutralisiert und das depolymerisierte (und reduzierte) Produkt wird nach bekannten Methoden, z. B. mittels direkter Präzipitation mit Ethanol oder Aceton isoliert.
Das am Ende der Depolymerisierung erhaltene Produkt kann entweder ein LMW-epi-K5-N-sulfat (in einem solchen Fall stellt es das Endprodukt dar) oder ein LMW-K5-N-sulfat (und in einem solchen Fall wird es direkt einer C5-Epimerisierung wie oben gezeigt nach Isolierung unterworfen) sein, insbesondere wenn es ein mittleres Molekulargewicht von mehr als 4 000, vorteilhafter Weise 4 000 bis 7 500, besonders vorteilhaft von 5 000 bis 7 500, vorzugsweise von mindestens 6 000 hat. Durch geeignete Steuerung der Depolymerisierungsreaktion, insbesondere unter Verwendung unterschiedlicher Mengen von Natriumnitrit/Salzsäure sind LMW-K5-N-sulfate oder LMW-epi-K5-N-sulfate mit einem mittleren Molekulargewicht im Gesamtbereich von ungefähr 1 500 bis ungefähr 12 000, vorteilhafter Weise von ungefähr 1 500 bis ungefähr 10 000, vorzugsweise von ungefähr 1 500 bis ungefähr 7 500, berechnet mittels ¹³C-NMR Spektrum durch die Integrierung des für C2 von 2,5-Anhydromannitnl charakteristischen Signals mit demjenigen des anomeren Kohlenstoffs des Glukosamins in der Polysaccharidkette.
Nach einer allgemeinen Vorgangsweise ausgehend z. B. von 1 g epi-K5-N-sulfat, wird das Ausgangsprodukt in 100–200 ml deionisiertem Wasser gelöst und auf einer Temperatur von 4°C gehalten. Dann wird eine Menge von Natriumnitrit zugesetzt, um das gewünschte mittlere Molekulargewicht zu erhalten. Zum Erhalt beispielsweise eines LMW-(epi)K5-N-sulfats mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 2 000 bis etwa 4 000 ausgehend von einem (epi)K5-N-sulfat mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 20 000 (gemessen mittels HPLC Methode ausgerüstet mit einer BioRadSil 250 Säule und unter Verwendung eines Heparinstandards bekannten Molekulargewichts) ist die Zugabe von 330 bis 480 mg Natriumnitrit gelöst in einer 0,2%igen wässerigen Lösung erforderlich. Die das (epi)K5-N-sulfat und Natriumnitrit enthaltende Lösung wird auf 4°C gehalten und durch Zugabe von auf 4°C gekühlter 0,1 N HCl auf einen pH 2 gebracht. Unter langsamem Rühren während 20–40 Minuten wird sie reagieren gelassen, und dann mit 0,1 N NaOH neutralisiert. Die das so erhaltene Produkt enthaltende Lösung wird auf Raumtemperatur gebracht und mit einem Reduktionsmittel, wie z. B. Natriumborhydrid (250–500 mg in 50–100 ml Wasser gelöst) behandelt und 4–8 Stunden reagieren gelassen. Das überschüssige Natriumborhydrid wird beseitigt, wobei der pH auf 5–5,5 mit 0,1 N HCl gebracht wird und die Mischung weitere 2–4 Stunden stehen gelassen wird. Am Ende wird die Mischung mit 0,1 N NaOH neutralisiert und das Produkt wird durch Fällung mit Aceton oder Ethanol gewonnen, nachdem das Produkt durch Eindampfung unter vermindertem Druck konzentriert wurde.
Analoger Weise können die Mengen an Natriumnitrit ausgehend von 1 g K5-N-sulfat oder epi-K5-N-sulfat bestimmt werden, um den Erhalt eines depolymerisierten LMW-K5-N-sulfats oder eines depolymerisierten LMW-epiK5-N-sulfat mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 4 000 bis etwa 12 000, vorteilhafter Weise von etwa 4 000 bis etwa 7 500, insbesondere von 6 000–7 500 zu ermöglichen.
Die so erhaltenen depolymerisierten LMW-epi-K5-N-sulfate mit einem Iduronsäuregehalt von 40% bis 60%, vorteilhafter Weise von 50–55% und vorzugsweise praktisch frei von NH₂ und N-Acetyl-Gruppen, mit einem mittleren Molekulargewicht von ungefähr 1 500 bis ungefähr 12 000, vorteilhafter Weise von ungefähr 1 500 bis ungefähr 10 000, vorzugsweise von ungefähr 1 500 bis ungefähr 7 500 und ihre chemisch oder pharmazeutisch zulässigen Salze sind Ausgangsmaterialien bei der Herstellung der depolymerisierten LMW-epi-K5-N,O-sulfaten der vorliegenden Erfindung.
Vorteilhafter Weise sind die Ausgangsmaterialien zur Herstellung der depolymerisierten LMW-epi-K5-N,O-sulfate der vorliegenden Erfindung depolymerisierte LMW-epi-K5-N-sulfat-Derivate bestehend aus einem Gemisch von Ketten, in welchen mindestens 90% dieser Ketten die Formel I haben
in der 40%–60%, vorzugsweise 50%–55% der Uronsäure-Einheiten aus Iduronsäure bestehen, n eine ganze Zahl von 2 bis 20, vorteilhafter Weise von 3 bis 15, ist und das entsprechende Kation ein chemisch und pharmazeutisch zulässiges ist.
In diesem Zusammenhang bezieht sich der Terminus „chemisch" auf ein Kation, das in der chemischen Synthese verwendbar ist, wie Natrium-, Ammonium-, Tetra(C₁-C₄)alkylammoniumionen, oder zur Reinigung des Produkts.
Vorteilhafte Kationen sind solche, die von Alkalimetallen, Erdalkalimetallen, Ammonium, Tetra(C₁-C₄)alkylammonium, Aluminium und Zink abgeleitet sind. Bevorzugte Kationen sind die Natrium-, Kalzium- und Tetraalkylammoniumionen.
Die depolymerisierten LMW-epi-K5-N-sulfate, bestehend aus einem Gemisch von Ketten, worin mindestens 90% der Ketten die oben angegebene Formel I haben, die mittels Depolymerisierung mit salpetriger Säure der entsprechenden epi-K5-N-sulfate wie oben dargelegt und nachfolgender Reduktion, z. B. mit Natriumborhydrid erhalten werden, sind besonders interessante Ausgangsverbindungen. Unter diesen sind depolymerisierte LMW-epi-K5-N-sulfate, bestehend aus einem Gemisch von Ketten, in der die vorherrschende Spezies die Formel I'a
hat, worin 40%–60% der Uronsäure-Einheiten solche von Iduronsäure sind, p ein ganze Zahl von 4 bis 8 und das entsprechende Kation ein chemisch und pharmazeutisch zulässiges ist, besonders vorteilhafte Ausgangsmaterialien. Das mittlere Molekulargewicht dieser Produkte ist von etwa 2 000 bis etwa 4 000.
Der Entstehung dieser epi-K5-N-sulfate von einer Stufe der Depolymerisierung mit salpetriger Säure gefolgt von einer Reduktion mit beispielsweise Natriumborhydrid bringt am reduzierenden Ende der Mehrzahlder Ketten in der Ketten Gemisch die Gegenwart einer 2,5-Anhydromannitol-Einheit der Strukturformel (a)
mit sich, worin X eine Hydroxymethyl-Gruppe bedeutet. Demgemäß wird das reduzierende Ende der Mehrzahl der Ketten aktuell dargestellt durch die Strukturformel (b)
worin X wie oben definiert ist.
Andere besonders vorteilhafte depolymerisierte LMW-epi-K5-N-sulfate als Ausgangsmaterialien gemäß vorliegender Erfindung bestehen aus Gemischen von Ketten, in welchen die überwiegende Spezies eine Verbindung der Formel I'b
ist, worin X Hydroxymethyl ist, m 4, 5 oder 6 ist, das entsprechende Kation ein chemisch oder pharmazeutisch zulässiges Ion ist und die Glukuronsäure- und Iduronsäure-Einheiten abwechselnd vorhanden sind, wobei das nicht-reduzierende Ende eine Glukuronsäure- oder Iduronsäure-Einheit ist. In einem solchen Fall ist das Glukuronsäure/Iduronsäure-Verhältnis 45/55 bis 55/45, d. h. ungefähr 50/50.
Die Verwendung der C5-Epimerase, vorzugsweise rekombinant, vorzugsweise immobilisiert auf einem festen Träger unter den oben angegebenen Bedingungen ermöglicht daher nicht die „Cluster"-Epimerisierung von K5-N-sulfat-Derivaten in epi-K5-N-sulfat-Derivate, wie sie in der Natur auftritt, sondern in einer regelmäßigen Weise.
Bei der Herstellung der neuen depolymerisierten LMW-epi-K5-N,O-sulfaten gemäß oben dargelegtem Verfahren (a)–(d) besteht Stufe (a) aus einer O-Sulfatierung der depolymerisierten Ausgangs-LMW-epi-K5-N-sulfate, die nach irgendwelchen in der Literatur beschriebenen Methoden ausgeführt werden kann, z. B. nach der Methode C, beschrieben von Casu et al., oder nach Variationen der gleichen Methode, z. B. wie in US 2002/0062019 beschrieben, um ein depolymerisiertes LMW-epi-K5-amin-O-sulfat zu erhalten.
Die Entstehung der depolymerisierten LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfate aus depolymerisierten LMW-epi-K5-sulfaten, erhalten mittels Depolymerisierung mit salpetriger Säure und nachfolgender Reduktion mit z. B. Natriumborhydrid, schließt am reduzierenden Ende der Mehrzahlder Ketten in dem Gemisch von Ketten die Gegenwart einer sulfatierten 2,5-Anhydromannitol-Einbeit der Strukturformel (a')
ein, in der R Wasserstoff oder SO₃ ^– bedeutet.
So wird das reduzierende Ende der Mehrzahl der Ketten in dem Gemisch von Ketten dargestellt durch die Strukturformel (b')
in der R, R' und R'' H oder SO₃ ^– bedeuten und die Uronsäure-Einheit Glukuronsäure oder Iduronsäure sein kann.
Nach einer Vorgangsweise, wie in US 2002/0062019 beschrieben, wird eine Lösung enthaltend das depolymerisierte LMW-epi-K5-N-sulfat in einer Konzentration von 10% auf 10°C gekühlt und dann über ein Kationenaustauscherharz IR-120 H⁺ oder ein Äquivalent hiervon (35–100 ml) geleitet. Sowohl die Säule als auch der Behälter enthaltend das Eluat werden auf 10°C gehalten. Nach dem Durchleiten der Lösung wird das Harz mit deionisiertem Wasser gewaschen, bis der pH-Wert des Permeats höher als 6 (ungefähr 3 Volumina deionisiertes Wasser) ist. Die Säurelösung wird mit einer tertiären oder quaternären organischen Base, z. B. Tetrabutylammoniumhydroxid (15%ige wässerige Lösung) zur Neutralität gebracht, um das entsprechende Ammoniumsalz zu erhalten. Die Lösung wird auf ein Minimumvolumen eingeengt und lyophilisiert. Das erhaltene Produkt wird in 20–500 ml Dimethylformamid (DMF) oder Dimethylsulfoxid (DMSO) suspendiert. und 15–300 g eines Sulfatierungsmittels, wie Pyridin·SO₃ Addukt, in fester Form oder gelöst in DMF oder DMSO werden zugesetzt. Die Lösung wird auf 20–70°C, vorzugsweise 40–60°C für 2–24 Stunden gehalten.
Ein Volumen Wasser wird zugesetzt, um die Reaktion zu stoppen, der pH wird mit 1N NaOH zur Neutralität gebracht. Die Probe wird zurückgewonnen durch Präzipitation mit einer gesättigten Lösung von NaCl in Aceton. Das Präzipitat wird aus dem Lösungsmittel durch Filtrieren abgetrennt. Der erhaltene Feststoff wird in 100 ml deionisiertem Wasser gelöst und von den Rückstandssalzen durch Ultrafiltration gereinigt. Das erhaltene Produkt zeigt ein Sulfat/Carboxyl-Verhältnis von 2 bis maximal 3,2, berechnet nach Casu et al. Carbohydrate Res. 1975, 39, 168–176. Die 6-Stellung des Aminozuckers ist zu 80–95% sulfatiert und die 2-Stellung ist nicht sulfatiert. Die anderen Sulfatgruppen sind an der 3-Stellung des Aminozuckers und in der 2- und 3-Stellung der Uronsäure vorhanden.
Ein depolymerisiertes LMW-epi-K5-amin-O-sulfat mit einem höheren Sulfat/Carboxyl-Verhältnis, nämlich mindestens 3,4, vorteilhafter Weise mindestens 3,5 und besonders vorteilhaft von 3,55 bis 4, vorzugsweise 3,55 bis 3,8 wird erhalten nach der Verfahrensweise gemäß obiger Stufe (a) durch

(a1) Behandlung eines depolymerisierten LMW-epi-K5-N-sulfats in Säureform mit tertiärer oder quaternärer organischer Base, Stehen lassen der Reaktionsmischung für eine Zeitdauer von 30–60 Minuten, Aufrechterhaltung des pH der Lösung auf einem Wert von ungefähr 7 durch Zugabe dieser tertiären oder quaternären organischen Base und Isolieren des Salzes mit organischer Base;
(a2) Behandlung diese organischen Basensalzes des depolymerisierten LMW-epi-K5-N-sulfats mit einem O-Sulfatierungsmittel unter O-Überrsulfatierungsbedingungen und Isolieren des depolymerisierten LMW-epi-K5-amin-O-sulfats.

Das am Ende der Stufe (a) oder der Stufen (a1) + (a2) erhaltene depolymerisierte LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfat hat einen Sulfatierungsgrad von 2 bis 4 und ein mittleres Molekulargewicht von ungefähr 2 500 bis ungefähr 12 500, vorteilhafter Weise von ungefähr 2 500 bis ungefähr 10 500, vorzugsweise von ungefähr 2 500 bis ungefähr 8 000 und das entsprechende Kation ist chemisch oder pharmazeutisch zulässig.
So kann angemerkt werden, dass ungeachtet der Zugabe von 1–3 SO₃ ^– Gruppen pro Disaccharid, ausgehend von einem depolymerisierten LMW-epi-K5-sulfat mit einem mittleren Molekulargewicht von ungefähr 1 500 bis ungefähr 12 000, ein depolymerisiertes LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfat mit einem mittleren Molekulargewicht von ungefähr 2 500 bis ungefähr 12 500, nämlich geringfügig höher als das des Ausgangsmaterials an Statt eines theoretischen Molekulargewichtsbereichs von ungefähr 2 000 bis ungefähr 15 000 am Ende der Stufe (a) erhalten wird. Diese Verminderung des Molekulargewichts wird verursacht durch ein weitere Depolymerisierung zufolge des stark sauren Mediums, in dem Stufe (a) durchgeführt wird.
Die depolymerisierten LMW-epi-K5-amin-O-sulfate werden vorteilhafter Weise gebildet aus einem Gemisch von Ketten, worin mindestens 90% der Ketten die Formel II
in welcher 40%–60%, vorzugsweise 50%–55%, der Uronsäure-Einheiten solche von Iduronsäure sind, R, R' und R'' Wasserstoff oder eine SO₃ ^– Gruppe für einen Sulfatierungsgrad von 2 bis 4 bedeuten, q eine ganze Zahl von 2 bis 17, vorteilhafter Weise 2 bis 14, vorzugsweise 2 bis 11 ist, eine Einheit (a') wie oben definiert am reduzierenden Ende der Mehrzahl der Ketten vorhanden ist und das entsprechende Kation ein chemisch oder pharmazeutisch zulässiges ist.
Depolymerisierte LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfate mit sehr hohem Sulfatierungsgrad (mindestens 3,4, vorteilhafter Weise mindestens 3,5, besonders vorteilhaft von 3,55 bis 4, vorzugsweise 3,55 bis 3,8) erhaltbar gemäß der oben angegebenen Stufen (a1) + (a2) werden gebildet durch ein Gemisch von Ketten, worin mindestens 90% der Ketten die Formel II haben, worin 40%–60%, vorzugsweise 50%–55% der Uronsäure-Einheiten solche der Iduronsäure sind, R mindestens 40%, vorteilhafter Weise 50%–80%, vorzugsweise ungefähr 65% SO₃ ^– ist, R' und R'' jeweils SO₃ ^– oder eines von diesen Wasserstoff und das andere 5%–10% SO₃ ^– in Glukuronsäure und 10%–15% SO₃ ^– in Iduronsäure sind, q wie oben definiert ist und das entsprechende Kation ein chemisch oder pharmazeutisch zulässiges ist.
In Stufe (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die selektive O-Desulfatierung des depolymerisierten LMW-epi-K5-amin.O-Übersulfats erhalten am Ende der Stufe (a) durch Behandlung des depolymerisierten LMW-epi-K5-N-sulfats mit einem Gemisch von DMSO/Methanol 8/1, z. B. nach den von A. Naggi et al., Carboxyhydrate Research, 2001, 336, 283–290, in WO 01/72848 oder in US 2002/0062019 beschriebenen Verfahren ausgeführt.
In der Praxis wird eine Lösung des depolymerisierten LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfats erhalten am Ende der Stufe (a) einem Kationenaustauscherharz, wie IR-120 H⁺ zugeführt mittels Waschen mit deionisiertem Wasser und die perkolierte Lösung wird auf einen pH von 6 bis 7 mit einer tertiären oder quaternären organischen Base, wie Pyridin gebracht. Das Salz des depolymerisierten LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfats mit der organischen Base, z. B. das Pyridinsalz, wird mittels Lyophilisierung der entsprechend konzentrierten Lösung isoliert. Das erhaltene Produkt wird mit einer Lösung Dimethylsulfoxid/Methanol ungefähr 9/1 (V/V) behandelt und die erhaltene Lösung auf 45–90°C für eine Zeitdauer von 1 bis 8 Stunden, vorteilhafter Weise von 2 bis 4 Stunden, vorzugsweise von 135 bis 155 Minuten gehalten. Das teilweise O-desulfatierte Produkt bestehend aus einem depolymerisierten LMW-epi-K5-amin-O-sulfat teilweise desulfatiert vornehmlich an den primären Hydroxygruppen und N DEN Hydroxygruppen der Uronsäuren wird mittels Fällung aus der Lösung durch Zugabe von deionisiertem Wasser und nachfolgend von gegebenenfalls Natriumchlorid in einer Menge bis zur Sättigung enthaltendem Aceton isoliert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Mischung Dimethylsulfoxid/Methanol ungefähr 9/1 (V/V) zuvor auf die gewünschte Temperatur erwärmt, das depolymerisierte LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfatsalz zugesetzt und die Dauer der O-Desulfatierungsreaktion wird als von dem Moment ausgehend angesehen, in dem die Gesamtheit der Reaktionsteilnehmer auf der zuvor ausgewählten Temperatur ist. Das depolymerisierte LMW-epi-K5-amin-O-sulfat, teilweise desulfatiert vornehmlich an den primären Hydroxygruppen und den Hydroxygruppen der Uronsäuren, wird wie oben beschrieben, isoliert. Eine kleine Probe kann zur Charakterisierung abgetrennt werden und das verbleibende Produkt wird für die nachfolgende 6-O-Sulfatierungsstufe (c) verwendet.
In Stufe (c) wird das Präzipitat von Aceton mit Aceton gewaschen, in Wasser gelöst und die Lösung auf einen pH von ungefähr 7,5 mit 2 N NaOH gebracht, durch ein IR-120 H⁺ Harz geleitet, dann mit einer tertiären oder quaternären organischen Base, wie Pyridin oder Tetraammoniumhydroxid neutralisiert und das erhaltene Salz mittels Lyophilisierung isoliert. Die 6-O-Sulfatierung wird ausgeführt durch Lösen des zuvor genannten Salzes in DMF und Zusetzen des Sulfatierungsmittels, z. B. Pyridin·SO₃, auch gelöst in DMF, in einer Menge von 2,15 g pro g des Produkts (Tetrabutylammoniumsalz). Die Reaktion wird ausgeführt durch Halten der Mischung auf ungefähr 0°C ungefähr 60–120 Minuten lang und das 6-O-sulfatierte Produkt wird durch Neutralisieren der Lösung mit NaCl und nachfolgender Fällung mit gegebenenfalls Natriumchlorid in einer Menge bis zur Sättigung enthaltendem Aceton isoliert. Der Präzipitationsvorgang kann mehrere Male wiederholt werden. Das so erhaltene 6-O-resulfatierte depolymerisierte LMW-epi-K5-amin-O-sulfat hat einen 6-O-sulfat-Gehalt von mindestens 80%.
In Stufe (d) wird das 6-O-resulfatierte depolymerisierte LMW-epi-K5-O-sulfat mit einem Sulfatierungsmittel unter klassischen N-Sulfatierungsbedingungen behandelt. Dieser Vorgang wird insbesondere ausgeführt durch Behandlung einer wässerigen Lösung des am Ende der Stufe (c) erhaltenen 6-O-resulfatierten depolymerisierten LMW-epi-K5-O-sulfats mit Natriumcarbonat und dann mit einem Sulfatierungsmittel, wie Pyridin·SO₃ bei einer Temperatur von 35–45°C, wobei das Endprodukt, bestehend aus dem depolymerisierten LMW-epi-K5-N,O-silufat mit einem Sulfatierungsgrad von 2,3 bis 2,9, als Natriumsalz, z. B. mittels Diafiltration isoliert wird. Die N-Sulfatierungsreaktion kann wiederholt werden.
Das Natriumsalz des depolymerisierten LMW-epi-K5-N,O-sulfats mit einem Sulfatierungsgrad von 2,3 bis 2,9 kann in ein anderes pharmazeutisch zulässiges Salz, wie in das eines anderen Alkalimetalls, eines Erdalkalimetalls, von Aluminium oder Zink nach bekannten Methoden umgewandelt werden, z. B. durch Ionenaustausch mit einem geeigneten Harz, durch Fällung mit Lösungsmitteln oder durch Ultrafiltration durch geeignete Membranen. Vorteilhafte Salze sind solche von Natrium, Kalium, Magnesium, Kalzium, Aluminium und Zink. Die Natrium- und Kalziumsalze sind bevorzugt.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von depolymerisierten LMW-epi-K5-N,O-sulfaten mit einem Sulfatierungsgrad von 2,3 bis 2,9 und von pharmazeutisch zulässigen Salzen vor, das umfasst

(ii) Unterwerfen eines K5-N-sulfats einer Depolymerisation mit salpetriger Säure, um ein depolymerisiertes LMW-K5-N-sulfat mit einem mittleren Molekulargewicht höher als 4 000, vorteilhafter Weise von 5 000 bis 7 500, vorzugsweise ungefähr 6 000 bis ungefähr 7 500 zu erhalten;
(i) Unterwerfen des so erhaltenen depolymerisierten LMW-K5-N-sulfats einer C5-Epimerisierung mit D-Glukuronyl-C5-Epimerase, um ein entsprechendes depolymerisiertes LMW-epi-K5-N-sulfat, enthaltend 40% bis 60% Iduronsäure-Einheiten zu erhalten; (a) Behandlung eines so erhaltenen tertiären oder quaternären organischen Basensalzes des depolymerisierten LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfats mit einem Sulfatierungsmittel unter O-Übersulfatierungsbedingungen, um ein depolymerisiertes LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfat zu erhalten; (b) Unterwerfen des so erhaltenen depolymerisierten LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfats einer selektiven O-Desulfatierung, um ein depolymerisiertes LMW-epi-K5-amin-O-sulfat zu erhalten; (c) Behandlung eines so erhaltenen tertiären oder quaternären organischen Basensalzes des depolymerisierten LMW-epi-K5-amin-O-sulfats mit einem O-Sulfatierungsmittel, um ein depolymerisiertes LMW-epi-K5-amin-O-sulfat, enthaltend mindestens 80% 6-O-sulfat zu erhalten; (d) Unterwerfen des so erhaltenen depolymerisierten LMW-epi-K5-amin-O-sulfats, enthaltend mindestens 80% 6-O-sulfat, einer N-Sulfatierungsreaktion und Isolieren des so erhaltenen depolymerisierten LMW-epi-K5-N,O-sulfats als Natriumsalz hiervon, das gegebenenfalls in ein anderes pharmazeutisch zulässiges Salz übergeführt wird.

Gemäß dieses bevorzugten Verfahrens werden depolymerisierte LMW-epi-K5-N,O-sulfate mit einem Sulfatierungsgrad von 2,3 bis 2,9 und einem mittleren Molekulargewicht von mindestens 6 000, insbesondere von etwa 6 000 bis etwa 12 000, vorteilhafter Weise von etwa 6 000 bis etwa 11 000 erhalten.
Die nach diesem bevorzugten Verfahren erhaltbaren depolymerisierten LMW-epi-K5-N,O-sulfate mit einem Sulfatierungsgrad von 2,3 bis 2,9 und ihre pharmazeutisch zulässigen Salze stellen eine andere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar. Die bevorzugten Salze sind die oben erwähnten, insbesondere die Natrium- und Kalziumsalze.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren vor, das ausgehend von einem K5-N-sulfat über die Verfahrensabfolge (i) → (ii) die Herstellung von depolymerisierten LMW-epi-K5-N,O-sulfaten mit einem Sulfatierungsgrad von 2,3 bis 2,9 und einem mittleren Molekulargewicht im Gesamtbereich von ungefähr 1 000 bis ungefähr 12 000 ermöglicht.
Dieses Verfahren, das insbesondere geeignet ist zur Herstellung von depolymerisierten LMW-epi-K5-N,O-sulfaten mit einem sehr niederen Molekulargewicht (von ca. 2 000 bis ca. 5 000), nicht erhältlich nach dem über die Verfahrensabfolge (ii)–(i) geführten Verfahren, umfasst

(i) Unterwerfen eines K5-N-sulfats einer C5-Epimerisierung mit einer D-Glukuronyl C5-Epimerase, isoliert, gereinigt und in Lösung oder immobilisiert auf einem festen Träger, bei einem pH von ungefähr 30°C und über eine Zeitdauer von 12–24 Stunden in Gegenwart von mindestens eines zweiwertigen Ions ausgewählt unter Kalzium, Magnesium, Barium und Mangan, um ein epi-K5-N-sulfat mit einem Gehalt an Iduronsäure von 40% bis 60% zu erhalten;
(ii) Unterwerfen des so erhaltenen epi-K5-N-sulfats einer Depolymerisation mit salpetriger Säure gefolgt von einer Reduktion, normaler Weise mit Natriumhorhydrid, um ein depolymerisiertes LMW-epi-K5-N-sulfat zu erhalten; (a) Behandeln eines tertiären oder quaternären organischen Basensalzes des so erhaltenen depolymerisierten LMW-epi-K5-N-sulfats mit einem Sulfatierungsmittel unter O-Sulfatierungsbedingungen, um ein depolymerisiertes LMW-epi-K5-amin-O-Sulfat zuerhalten; (b) Unterwerfen des so erhaltenen depolymerisierten LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfats einer selektiven O-Desulfatierung, um ein depolymerisiertes LMW-epi-K5-amin-O-sulfat zu erhalten; (c) Behandeln eines so erhaltenen tertiären oder quaternären organischen Basensalzes des so erhaltenen depolymerisierten LMW-epi-K5-amin-O-sulfats mit einem O-Sulfatierungsmittel, um ein depolymerisiertes, mindestens 80% 6-O-sulfat enthaltendes LMW-epi-K5-amin-O-sulfat zu erhalten; (d) Unterwerfen des depolymerisierten mindestens 80% 6-O-sulfat enthaltende LMW-epi-K5-amin-O-sulfats einer N-Sulfatierungsreaktion und Isolieren des so erhaltenen depolymerisierten LMW-epi-K5-N,O-sulfats als Natriumsalz hiervon, das gegebenenfalls in ein anderes pharmazeutisch zulässiges Salz umgewandelt wird.

Die depolymerisierten LMW-epi-K5-N,O-sulfate mit einem Sulaftierungsgrad von 2,3 bis 2,9 und ihre pharmazeutisch zulässigen Salze, erhaltbar durch dieses andere bevorzugte Verfahren, stellen eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar. Die bevorzugten Salze sind die oben erwähnten, insbesondere die Natrium- und Kalziumsalze.
Insbesondere bezieht sich nach diesem weiteren Aspekt die vorliegende Erfindung auf neue depolymerisierte LMW-epi-K5-N,O-sulfate mit einem Sulfatierungsgrad von 2,3 bis 2,9 und auf ihre pharmazeutisch zulässigen Salze, mit einem mittleren Molekulargewicht von ungefähr 1 500 bis ungefähr 12 000, jedoch insbesondere niedriger als 5 000, vorzugsweise niedriger als 4 000, vorteilhafter Weise von ungefähr 1 500 bis ungefähr 5 000, bevorzugter Weise von ungefähr 1 500 bis ungefähr 4 000.
Es ist anzumerken, dass das Molekulargewicht der neuen depolymerisierten LMW-epi-K5-N,O-sulfate annähernd gleich ist demjenigen der depolymerisierten Ausgangs-LMW-epi-K5-N-sulfate zufolge der teilweisen, in den O-Übersulfatierungsstufen (a) oder (a1) + (a2) auftretenden Depolymerisierung.
Nach ihrer am meisten bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung insbesondere depolymerisierte LMW-epi-K5-N,O-sulfate mit einem Sulfatierungsgrad von 2,3 bis 2,9, vorteilhafter Weise von 2,5 bis 2,9, vorzugsweise von 2,7 bis 2,9 und einem mittleren Molekulargewicht von ungefähr 1 500 bis ungefähr 12 000, vorteilhafter Weise von ungefähr 1 500 bis ungefähr 10 000, vorzugsweise von ungefähr 1 500 bis 8 000, und gekennzeichnet durch das Vorliegen der Struktur (a') am reduzierenden Ende der Mehrzahl ihrer Kette, und ihre pharmazeutisch zulässigen Salze. Ein depolymerisiertes LMW-epi-K5-N,O-sulfat oder ein pharmazeutisch zulässiges Salz hiervon zeigt eine interessante antithrombotische Wirksamkeit vergleichbar mit derjenigen von LMWH, aber mit einer 2,5- bis 4-fach geringeren Gefahr, zu Blutungen zu führen, als LMWH und hat ein mittleres Molekulargewicht von ungefähr 6 000. Vorzugsweise hat dieses depolymerisierte LMW-epi-K5-N,O-sulfat einen Sulfatierungsgrad von 2,7 bis 2,9, einen Gehalt von 80–95% in Glukosamin 6-O-sulfat, von 95–100% in Glukosamin N-sulfat, von 45–55% in Glukosamin 3-O-sulfat, von 35–45% in Glukuronsäure 3-O-sulfat, von 15–25% in Induronsäure 2-O-sulfat und weist eine Einheit (a') wie oben definiert am reduzierenden Ende der Mehrzahl der Ketten auf.
Vorteilhafte depolymerisierte LMW-epi-K5-N,O-sulfate der vorliegenden Erfindung bestehen aus Gemischen von Ketten, in welchen mindestens 80% der Ketten die Formel III
hat, worin die Uronsäure-Einheiten 40%–60% solcher von Iduronsäure sind, q eine ganze Zahl von 2 bis 17, vorteilhafter Weise von 2 bis 14, vorzugsweise von 2 bis 11 ist, R, R' und R'' Wasserstoff oder SO₃ ^– sind, für einen Sulfatierungsgrad von 2,3 bis 2,9 und das reduzierende Ende der Mehrzahl der Ketten in diesen Gemisch von Ketten eine sulfatierte 2,5-Anhyidromannitol-Einheit der Struktur (a')
aufweist, in der R Wasserstoff oder SO₃ ^– bedeutet, und das entsprechende Kation chemisch oder pharmazeutisch zulässig ist.
Ein bevorzugtes depolymerisiertes LMW-epi-K5-N,O-sulfat oder ein pharmazeutisch zulässiges Salz hiervon besteht aus einem Gemisch von Ketten, in welchen die überwiegende Spezies eine Verbindung der Formel III ist, worin q 8 oder 9 ist, R 45%–55% SO₃ ^– ist, R' 35%–45% SO₃ ^– in Glukuronsäure ist, R'' 15%–25% SO₃ ^– in Iduronsäure ist, für einen Sulfatierungsgrad von 2,7 bis 2,9, und eine sulfatierte 2,5-Anhydromannitol-Einheit der Struktur (a') wie oben definiert am reduzierenden Ende der Mehrzahl der Ketten aufweist.
Die neuen depolymerisierten LMW-epi-K5-N,O-sulfate der vorliegenden Erfindung besitzen eine interessante Aktivität auf die Koagulationsparameter. Tatsächlich haben sie hohe Anti-Xa und Anti-IIa Aktivitäten und bringen ein sehr geringes Risiko mit sich, zu Blutungen bei Patienten zu führen bei der Notwendigkeit einer Heparinbehandlung zur Regulierung der Koagulation. Depolymerisierte LMW-epi-K5-N,O-sulfate mit einem mittleren Molekulargewicht von ungefähr 6 000, 95–100% N-sulfatiert, 80–95% 6-O-sulfatiert am Glukosamin, 45–55% 3-O-sulfatiert am Glukosamin, 35–45% 3-O-sulfatiert an Glukuronsäure, 15–25% 2-O-sulfatiert an Iduronsäure, für einen Sulfatierungsgrad von 2,7 bis 2,9, am reduzierenden Ende der Mehrzahl der Ketten ein Einheit (a') aufweisend, und ihre pharmazeutisch zulässigen Salze sind besonders interessant. Eines dieser depolymerisierten LMW-epi-K5-N,O-sulfate, nachfolgend in Beispiel 1 dargestellt, wurden in den klassischen Tests der Anti-Xa und Anti-IIa Aktivitäten untersucht und ihr Effekt auf die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT) wurde ebenfalls untersucht.
Für die Bestimmung der Anti-IIa und Anti-Xa Aktivitäten verwendete Aktivitätsassays basieren auf der Inhibierung von Koagulationsenzymen durch den durch Heparin und Antithrombin III (ATIII) gebildeten Komplex. ATIII und Faktor IIa oder Faktor Xa werden im Überschuss zugesetzt. Restliches Gerinnungsenzym reagiert mit einem Substrat resultierend aus einer Freisetzung von spektrometrisch messbarem Paranitroanilin, dessen Anteil umgekehrt proportional zum Anteil des Gerinnungsenzyms. Die verwendeten Puffer sind: 0.9% NaCl in der Determination der Anti-Xa Aktivität und Tris 0,05 M + NaCl 0,15 M und 1% BSA (Bovine Serum Albumine, Rinderserumalbumin) in der Determination der Anti-IIa Aktivität. Die Aktivität des depolymerisierten LMW-epi-K5-N,O-sulfats und der Referenzverbindungen (ein handelsübliches, unfraktioniertes Heparin und ein handelsübliches LMWH) wurden gemessen gegenüber Internationalen LMWH Standards in Bezug auf Anti-Xa und Anti-IIa Aktivitäten. Eine Indikatorverdünnungsaktivität von ungefähr 0,5 U/ml in Bezug auf Anti-Xa Aktivität und 0,05 U/ml für Anti-IIa Aktivität wurden bestimmt. Eine spezifische Aktivität für unfraktioniertes Heparin von 160 U/ml wurde für Berechnungen angenommen.
Der Effekt des depolymerisierten LMW-epi-K5-N,O-sulfats gemäß der Erfindung und des Referenzproduktes wurde hinsichtlich APTT gemessen unter Verwendung von IL Test^TM APTT Lyophilized Silica Kit gemessen. Koagulation wird eingeleitet in Citratplasma durch Zusetzen von Phospholipiden, die erforderlich sind zur Bildung von Komplexen, die Faktor X und Prothrombin aktivieren. Ein Kontaktaktivator wird verwendet zur Stimulierung der Produktion von Faktor XIIa durch Schaffung einer Oberfläche für die Funktion von hochmolekularem Kininogen, Kalikrein und Faktor XIIa. Kalzium wird zugesetzt zum Triggern weiterer Reaktionen. Die zur Gerinnselbildung erforderliche Zeit wird gemessen.
Zum Vergleich der Wirkung der Test- und Referenzverbindungen auf die Koagulationszeit wurde eine veranschlagte Koagulation bewirkende Dosis von 100 sec verwendet. Um diesen Wert zu erhalten wird eine Dosis-Wirkungs-Kurve angefertigt unter Verwendung von Dosen Koagulation bewirkenden Zeiten im Bereich von 50 und 230 Sekunden. Eine eine Koagulationszeit bewirkende Dosis von 100 sec wurde erhalten durch Bewertung aus einer Trendlinie.
Aus den vorgenannten Tests ergibt sich dass die Anti-Xa und Anti-IIa Aktivitäten des erfindungsgemäßen depolymerisierten LMW-epi-K5-N,O-sulfats ungefähr 50% derjenigen von LMWH sind. Demzufolge kann das erfindungsgemäße depolymerisierte LMW-epi-K5-N,O-sulfat als antithrombotisches Mittel als ein LMWH mit Anti-Xa und Anti-IIa der gleichen Größenordnung betrachtet werden.
Daraus resultiert auch, dass die Wirkung des erfindungsgemäßen depolymerisierten LMW-epi-K5-N,O-sulfats zur Steigerung der Koagulation schwach ist. Im Vergleich zu unfraktioniertem Heparin und LMWH waren ungefähr 5-8-fache Dosen von depolymerisiertem LMW-epi-K5-N,O-sulfat erforderlich, um den gleichen Effekt auf APTT zu induzieren.
So schafft die vorliegende Erfindung zum ersten Mal ein Produkt abgeleitet vom Polysaccharid K5, das die gleichen biologischen Charakteristika wie das sLMWH aufweist, jedoch mit geringerem hämorrhagischem Risiko. Die neuen depolymerisiertem LMW-epi-K5-N,O-sulfate gemäß der vorliegenden Erfindung und ihre pharmazeutisch zulässigen Salze sind so wertvoll als Medikamente zur Regulierung der Koagulation und zur Prävention oder Behandlung von Thrombose ebenso wie als Wirkstoffe pharmazeutischer Massen für die oben angegebenen Indikationen.
Nach einem weiteren Aspekt schafft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Masse, enthaltend als einen Wirkstoff eine pharmazeutisch wirksame Menge eines depolymerisierten LMW-epi-K5-N,O-sulfats wie oben dargelegt, insbesondere ein depolymerisiertes LMW-epi-K5-N,O-sulfat mit einem Sulfatierungsgrad von 2,3 bis 2,9, einem mittleren Molekulargewicht von etwa 1 500 bis etwa 12 000 und mit der oben angegebenen Struktur (a') am reduzierenden Ende der Mehrzahl der Ketten, oder einpharmazeutisch zulässiges Salz hiervon unter Zumischung eines pharmazeutischen Trägers.
In den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Massen zur oralen, subkutanen, intravenösen, transdermalen, ophthalmischen oder topischen Anwendung sind die Wirkstoffe vorzugsweise als Dosiseinheiten zugesetzt unter Zusatz von klassischen pharmazeutischen Trägern oder Vehikeln.
Die Dosis kann in weiten Grenzen schwanken in Funktion von Alter, Gewicht und Gesundheitsbedingungen des Patienten. Diese Dosis schließt ein die Verabreichung einer Dosierungseinheit von 1 bis 1 000 mg, vorteilhafter Weise von 10 bis 750 mg, vorzugsweise von 250 bis 500 mg, ein bis drei Mal täglich auf intravenösem, subkutanem, oralem, transdermalem, ophthalmischem oder topischem Wege. Bei parenteraler (subkutaner oder intravenöser) Verabreichung ist die bevorzugte Dosis 5 bis 100 mg.
Vorteilhafter Weise umfassen die pharmazeutischen Massen gemäß der vorliegenden Erfindung als Wirkstoff ein depolymerisiertes LMW-epi-K5-N,O-sulfat herstellbar ausgehend von K5-N-sulfat nach den Stufen (i) → (ii) → (a)–(d) oder (ii) → (i) → (a)–(d) des oben dargelegten Verfahrens, oder ein pharmazeutisch zulässigen Salzes hiervon. Besonders vorteilhaft ist dieser Wirkstoff ein depolymerisiertes LMW-epi-K5-N,O-sulfat mit einem Sulfatierungsgrad von 2,3 bis 2,9, einem mittleren Molekulargewicht von ungefähr 1 500 bis ungefähr 12 000 und der oben angegebenen Struktur (a') am reduzierenden Ende der Mehrzahl der Ketten. Vorzugsweise hat das depolymerisierte LMW-epi-K5-N,O-sulfat ein mittleres Molekulargewicht von ungefähr 6 000, ist 80%–95% 6-O-sulfatiert an Glukosamin, 45%–55% 3-O-sulfatiert an Glukosamin, 35%–45% 3-O-sulfatiert an Glukuronsäure, 15%.25% 2-O-sulfatiert an Iduronsäure für einen Sulfatioerungsgrad von 2,7 bis 2,9.
Nach einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Regulierung der Koagulation in Säugern vor, die die Verabreichung einer wirksamen Menge eines oben dargelegten depolymerisierten LMW-epi-K5-N,O-sulfats an Säuger zur Regulierung der Koagulation umfasst. Überdies sieht die Erfindung ein Verfahren zur Prävention und Behandlung von Thrombose bei einem Säuger vor, die die Verabreichung einer wirksamen Menge eines oben dargelegten depolymerisierten LMW-epi-K5-N,O-sulfats an Säuger umfasst. Zur Regulierung der Koagulation oder zur Prävention oder Behandlung von Thrombose beträgt die wirksame Menge an depolymerisiertem LMW-epi-K5-N,O-sulfat von 5 bis 100 mg. Diese wirksame Menge wird in einer der oben angegebenen pharmazeutischen Masse verabreicht. Vorteilhafter Weise hat das depolymerisierte LMW-epi-K5-N,O-sulfat einen Sulfatierungsgrad von 2,3 bis 2,9, ein mittleres Molekulargewicht von etwa 1 500 bis 12 000 und weist die oben angegebene Struktur (a') am reduzierenden Ende der Mehrzahl der Ketten auf.
Vorzugsweise hat das depolymerisierte LMW-epi-K5-N,O-sulfat ein mittleres Molekulargewicht von ungefähr 6 000, ist 95%–100% N-sulfatiert, 80%–95% 6-O-sulfatiert an Glukosamin, 45%–55% 3-O-sulfatiert an Glukosamin, 35%–45% 3-O-sulfatiert an Glukuronsäre, 15%–25% 2-O-sulfatiert an Iduronsäure für einen Sulfatierungsgrad von 2,7 bis 2,9.
Schließlich haben wie vorstehend angegeben alle (epi)K5-amin-O-Übersulfat-Derivate mit einem Sulaftierungsgrad von 2 bis 4 mikrobizide Aktivität und sind Wirkstoffe pharmazeutischer Massen zur Behandlung von infektiösen, insbesondere viralen Erkrankungen. Vorteilhafter Weise umfassen diese pharmazeutischen Massen als Wirkstoff eine pharmazeutisch wirksame Menge eines (epi)K5-amin-O-Übersulfat-Derivats mit einem Sulfatierungsgrad von 2 bis 4, erhaltbar durch Behandlung eines tertiären oder quaternären organischen Basensalzes eines (epi)K5-N-sulfats mit einem Sulfatierungsmittel unter O-Übersulfatierungsbedingungen, oder eines pharmazeutisch zulässigen Salzes hiervon unter Zusatz eines pharmazeutischen Trägers.
Die Erfindung sieht insbesondere nach einem anderen Aspekt eine pharmazeutische Masse vor, umfassend als Wirkstoff eine pharmakologisch wirksame Menge eines (epi)K5-amin-O-Übersulfat-Derivats mit einem Sulfatierungsgrad von 2 bis 4, oder eines pharmazeutisch zulässigen Salzes hiervon, erhaltbar durch Behandlung eines tertiären oder quaternären organischen Basensalzes eines (epi)K5-N-sulfat-Derivats mit einem O-Sulfatierungsmittel unter O-Übersulfatierungsbedingungen und Isolierung des (epi)K5-N-sulfat-Derivatsalzes mit der organischen Base nach bekannten Methoden, insbesondere mittels Lyophilisieren unmittelbar nach seiner Bildung bei einem pH von ungefähr 5 bis ungefähr 8, unter Zumischung eines pharmazeutischen Trägers.
Genauer gesagt ist das (epi)K5-amin-O-Übersulfat-Derivat verwendet als Wirkstoff der erfindungsgemäßen Massen herstellbar durch

(a1') Behandlung eines (epi)K5-N-sulfat-Derivats in seiner Säureform mit einer tertiären oder quaternären organischen Base und Isolierung des Salzes mit tertiärer oder quaternärer organischer Base unmittelbar nach seiner Bildung bei einem pH von ungefähr 5 bis ungefähr 9;
(a2') Behandlung dieses tertiären oder quaternären organischen Basensalzes dieses (epi)K5-N-sulfat-Derivats mit einem O-Sulfatierungsmittel unter den Bedingungen einer O-Übersulfatierung und Isolieren des (epi)K5-O-Übersulfat-Derivats als Natriumsalz hiervon, das nachfolgend in ein anderes Salz übergeführt werden kann.

In die pharmazeutischen Massen der vorliegenden Erfindung zur oralen, subkutanen, intravenösen, transdermalen, ophthalmischen oder topischen Verabreichung werden die Wirkstoffe (epi)K5-amin-O-Übersulfat-Derivate vorzugsweise in Form von Dosierungseinheiten in Mischung mit den klassischen pharmazeutischen Exzipienten oder Vehikel zugesetzt. Das Dosisregime kann sehr weit schwanken abhängig von dem Alter, dem Gewicht und der Gesundheitsbedingung des Patienten. Dieses Dosisregime umfasst die Verabreichung einer Dosis eines (epi)K5-amin-O-Übersulfat-Derivats von 1 bis 1 000 mg, vorteilhafter Weise von 10 bis 750 mg, vorzugsweise 250 bis 500 mg von ein bis drei Mal täglich bei intravenöser, subkutaner, oraler, transdermaler, ophthalmischer oder topischer Verabreichung.
Solche pharmazeutische Massen enthaltend ein (epi)K5-amin-O-Übersulfat-Derivat, wie sie oben dargelegt sind, sind mit den klassischen, für die verschiedenen Verabreichungswege geeigneten Trägern formuliert. Besonders bevorzugt sind die Formulierungen in Form von für die lokale Verabreichnung geeigneten Cremes, Salben, Linimenten, Gels, Schäumen, Balsams, Vaginalpessarien, Suppositorien, Lösungen oder Suspensionen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
HERSTELLUNG I
(i) Epimerisierung zu epi-K5-N-sulfat
10 g K5-N-sulfat erhalten wie in Beispiel 2, Stufen (i) und (ii), der WO 02/068477 beschrieben, dessen ¹H-NMR Spektrum keine Signale bezüglich Acetylgruppen oder NH₂ zeigen, werden in 600 ml 25 mM HEPES Puffer bei pH 7, enthaltend CaCl₂ in einer Konzentration von 50 mM, gelöst und die so erhaltene Lösung wird durch eine 50 ml Säule, gefüllt mit Sepharose 4B Harz, enthaltend 5 g rekombinante C5-Epimerase ( WO 96/14425 ) immobilisiert wie in Beispiel 1 der WO 01/72848 beschrieben, rezirkulieren gelassen. Die Reaktion wird bei 30°C bei pH 7 mit einem Fluss von 200 ml/h 24 Stunden lang ausgeführt. Das erhaltene Produkt wird mittels Ultrafiltration und Fällung mit Ethanol gereinigt. So wird ein epi-K5-N-sulfat mit einem Iduronsäuregehalt von 54% erhalten.
(ii) Depolymerisierung von epi-K5-N-sulfat
Einer Lösung von 1 g des so erhaltenen Produkts in 25 ml destilliertem Wasser werden 230 mg Natriumnitrit gelöst in 115 ml destilliertem Wasser zugesetzt. Die Lösung wird dann auf 4°C gebracht, der pH-Wert auf 2 mit 0,1 N HCl eingestellt und 30 Minuten aufrechterhalten. Am Ende der Reaktion wird die Lösung auf Zimmertemperatur und der pH-Wert auf 7 mit 0,1 N NaOH gebracht. Die Lösung wird dann mit 450 mg NaBH₄ versetzt und 4 Stunden reagieren gelassen. Das Produkt wird gewonnen mittels Präzipitation mit 3 Volumina Aceton bei 4°C, Filtrieren mit Filtertrichter, und bei 40°C im Vakuumofen getrocknet, um 900 mg depolymerisiertes LMW-epi-K5-N-sulfat mit einem Iduronsäuregehalt von 54% und einer Molekulargewichtsverteilung von 1 000 bis 4 000, gemessen mittels HPLC-Methode zu erhalten.
HERSTELLUNG II
Depolymerisiertes LMW-epi-K5-N-sulfat mit mittlerem Molekulargewicht von ungefähr 5 000. Verfahrensabfolge (ii) → (i)
(ii). Depolymerisierung von K5-N-sulfat
2 g K5-N-sulfat, erhalten wie in Beispiel 2, Stufen (i) und (ii), der WO 02/068477 beschrieben, wird wie in Stufe (ii) der oben genannten HERSTELLUNG 1 beschrieben unter Verwendung von 100 mg Natriumnitrit und 300 mg Natriumborhydrid depolymerisiert. Eine Menge von 1,8 g depolymerisiertes LMW-K5-N-sulfat mit einem mittleren Molekulargewicht von 5 000 wird erhalten.
(i) Epimerisierung von depolymerisiertem LMW-K5-N-sulfat
1 g in oben genannter Stufe (ii) erhaltenes depolymerisiertes K5-N-sulfat wird wie in Stufe (i) der HERSTELLUNG 1 behandelt. Ein epimerisiertes Produkt mit einem Iduronsäure/Glukuronsäure-Verhältnis von 44/56 gegenüber einem Verhältnis von 0/100 des Ausgangsprodukts wird erhalten mit einer Molekulargewichtsverteilung von 2 000 bis 10 000 und mit einem mittleren Molekulargewicht von 5 000 D. Die Ausbeute an depolymerisiertem LMW-epi-K5-N-sulfat, berechnet durch Messung des Gehalts von Uronsäuren gegenüber einem Standard mittels der Carbazolmethode (Bitter und Muir, Anal. Biochem. 1971, 39, 88–92), ist 90%.
HERSTELLUNG III
Depolymerisiertes LMW-epi-K5-N-sulfat. Verfahrensabfolge (i) → (ii)
(i) Epimerisierung von K5-N-sulfat
Eine Menge von 2 g K5-N-sulfat, erhalten wie in Beispiel 2, Stufen (i) und (ii), der WO 02/068477 beschrieben, wird in 120 ml von 25 mM HEPES Puffer, pH 7, enthaltend 50 mM CaCl₂ gelöst. Die erhaltene Lösung wird durch eine 50 ml Säule, gefüllt mit dem Harz, enthaltend das immobilisierte, wie in WO 96/14425 beschrieben erhaltene Enzym rezirkulieren gelassen. Dieser Vorgang wird bei 30°C bei einem Fluss von 200 ml/h 24 Stunden lang ausgeführt. Das erhaltene Produkt wird gereinigt mittels Ultrafiltration durch eine 1 000 D Membran und Leiten über eine IR 120 H⁺ Ionenaustauschersäule, wobei das Eluat mit IN NaOH neutralisiert wird. Die Probe wird gewonnen mittels Fällung mit Ethanol und Aceton. Ein epimerisiertes Produkt wird erhalten mit einem Iduronsäure/Glukuronsäure-Verhältnis von 55/45 gegenüber einem Verhältnis von 0/100 des Ausgangsprodukts. Der Prozentsatz der Epimerisierung wird mittels ¹H-NMR nach der in WO 96/14425 beschriebenen Methode berechnet. Die Ausbeute an epi-K5-N-sulfat, berechnet durch Messung des Gehaltes an Uronsäuren gegenüber einem Standard nach der Carbazolmethode (Bitter und Muir Anal. Biochem. 39, 88-92-1971) ist 90%.
(ii) Depolymerisierung von epi-K5-N-sulfat
1 g des in Stufe (a) erhaltenen Produkt wird depolymerisiert gemäß der Degradierungsmethode mit salpetriger Säure und nachfolgender Reduktion des sich bildenden Aldehyds. Der Vorgang wird ausgeführt insbesondere durch Lösen des Produkts in 25 ml destilliertem Wasser und Versetzen desselben mit 230 mg in 115 ml destilliertem Wasser gelöstem Natriumnitrit. Die Lösung wird dann auf 4°C und der pH auf 2 mit 0,1 N HCl gebracht und 30 Minuten so gehalten. Am Ende der Reaktion wird die Lösung auf Raumtemperatur und der pH auf 7 mit 0,1 M NaOH gebracht. Die Lösung wird anschließend mit 450 mg NaBH₄ versetzt und 4 Stunden reagieren gelassen. Das Produkt wird gewonnen mittels Fällung mit 3 Volumina Aceton bei 4°C, Filtrieren mit Filtertrichter, und bei 40°C im Vakuumofen getrocknet, um 900 mg depolymerisiertes LMW-epi-K5-N-sulfat mit einer Molekulargewichtsverteilung gemessen nach der HPLC Methode, die zwischen 1 000 und 4 000 liegt, und mit einem Gehalt an Glukuronsäure-Einheiten von 45% und einem Gehalt an Iduronsäure-Einheiten von 55%.
HERSTELLUNG IV
Depolymerisiertes LMW-epi-K5-N-sulfat mit mittlerem Molekulargewicht von ungefähr 2 000
Einer Lösung von 1 g epi-K5-N-sulfat, erhalten wie in Beispiel 12, Absätze [0251]–[0265] der US 2002/0062019 beschrieben, in 200 ml destilliertem Wasser werden 480 mg Natriumnitrit, gelöst in 240 ml destilliertem Wasser zugesetzt. Die Lösung wird dann auf 4°C gebracht, der pH auf 2 mit 0,1 N HCl eingestellt und 30 Minuten so gehalten. Am Ende der Reaktion wird die Lösung auf pH 7 mit 0,1 M NaOH und anschließend auf Raumtemperatur gebracht. Die Lösung wird dann mit 450 mg NaBH₄ versetzt und 4 Stunden reagieren gelassen. Das überschüssige NaBH₄ durch Einstellen des pH auf 5–6 mit HCl eliminiert. Das mit 0,1 M NaOH neutralisierte Produkt wird gewonnen durch Fällung mit 3 Volumina Aceton bei 4°C, Filtrieren mit Filtertrichter, und bei 40°C in einem Vakuumofen getrocknet. 900 mg depolymerisiertes LMW-epi-K5-N-sulfat werden gewonnen mit einem mittleren Molekulargewicht von ungefähr 2 000, bestehend aus einem Gemisch von Ketten, in welchen die überwiegende Spezies eine Verbindung der Formel I'b ist, in der m 4 ist.
HERSTELLUNG V
Depolymerisiertes LMW-epi-K5-N-sulfat mit mittlerem Molekulargewicht von 6 000
Ausgangs-K5-N-sulfat
Eine Lösung von 8 g 95% reinem K5 in 800 ml 2 N NaOH wird auf 60°C über 24 Stunden erwärmt. Nach Abkühlen wird die Lösung auf pH 7 mit 6 N HCl gebracht. Zu der so neutralisierten Lösung werden zuerst 12,8 g Natriumkarbonat und dann portionsweise in 4 Stunden 12,8 g Pyridin·SO₃ Addukt in fester Form zugesetzt. Nach Entfernung der Salze durch Ultrafiltration mit Millipore Prepscale TFF 1000 D cut-off Membran wird das erhaltene Produkt gewonnen durch Fällung mit 3 Volumina Aceton. Es werden so 8 g K5-N-sulfat erhalten. Sein ¹H-NMR Spektrum zeigt eine 100%ige Sulfatierung (Fehlen von Signalen von NH₂- und Acetylgruppen).
Depolymerisiertes LMW-epi-K5-N-sulfat. Verfahrensabfolge (i) → (ii)

(i) Epimerisierung. 8 g so erhaltenes K5-N-sulfat werden in 200 ml di HEPES 0,25 M pH 7 Puffer, enthaltend 50 mM CaCl₂, gelöst und in Lösung mit 9,6 × 10¹⁰ cpm rekombinanter C5-Epimerase bei 30°C 24 Stunden lang bei pH 7 behandelt. Am Ende der Reaktion wird die Probe gereinigt durch Entfernung der Salze durch Ultrafiltration mit Millipore Prepscale TFF 1000 D cut-off Membran und dann mit 3 Volumina Aceton gefällt. Es werden so 7,5 g epi-K5-N-sulfat erhalten. Der Prozentsatz seiner Epimerisierung, in der Praxis die Menge von Iduronsäure-Einheiten bezogen auf die Glukuronsäure-Einheiten, berechnet mittels ¹H-NMR gemäß der in WO 96/4425 beschriebenen Methode, ist 52%.
(ii) Depolymerisierung. 7,5 g des so erhaltenen K5-N-sulfats werden in 150 ml Wasser gelöst und die Lösung auf gleicher Temperatur von 4°C gehalten, dann der pH auf 2,2 mit zuvor gekühlter 1 M HCl gebracht. Der Lösung werden 431,2 mg Natriumnitrit, entsprechend 21,55 ml einer 2%igen Lösung von Natriumnitrit in Wasser, zugesetzt. Der pH wird wiederum auf 2,2 gebracht und die Reaktionsmischung 20 Minuten unter Rühren auf 4°C gehalten. Nach Neutralisieren auf pH 7,0 mit 6 N HCl werden 1,35 g Natriumborhydrid der Lösung zugesetzt. Die Reduktion wird ausgeführt, indem die Reaktionsmischung auf Raumtemperatur während 4 Stunden gehalten wird, dann das überschüssige Reduktionsmittel zerstört wird, indem der pH auf 5 mit 1 N HCl gebracht und bis zum Verschwinden des Aufschäumens gerührt wird. Der pH wird wiederum auf 7–7,2 mit 1 M NaOH gebracht. Das depolymerisierte Produkt wird gewonnen durch Ultrafiltration mit Millipore Prepscale TFF 1000 D cut-off Membran und nachfolgendem Fällen mit 3 Volumina Aceton. Es werden so 7 g depolymerisiertes LMW-epi-K5-N-sulfat erhalten. Das mittlere Molekulargewicht dieses Produktes, berechnet über HPLC, ist 6 000 D.

Beispiel 1
(a) Übersulfatierung
(a1) Tetrabutylammoniumsalz des depolymerisierten LMW-epi-K5-N-sulfats.
Eine Lösung von 17 g depolymerisiertem LMW-K5-N-sulfat, erhalten gemäß HERSTELLUNG V in 350 ml Wasser wird durch eine IR-120 H⁺-Säule geführt. Der pH des Eluats ist 2,91. Die perkolierte Lösung wird auf pH 7 mit einer 15%igen Lösung von Tetrabutylammoniumhydroxid (42,2 ml) gebracht und 1 Stunde auf Raumtemperatur mit Kontrollen gehalten, um den pH auf einem Wert von 7 zu halten. Nach Konzentrieren des Tetrabutylammoniumsalzes in einem Rotationsverdampfer wird die Probe gefroren und lyophilisiert. Es werden so 10,9 g Tetrabutylammoniumsalz des depolymerisierten Ausgangs-LMW-epi-K5-N-sulfats erhalten.
(a2) O-Übersulfatierung.
Das so erhltene Tetrabutylammoniumsalz wird in 158 ml Dimethylformamid gelöst, danach werden 28,8 g Pyridin·SO₃, gelöst in 158 ml DMF, zugesetzt und die Reaktionsmischung wird auf 45°C während 18 Stunden gehalten. Ein Volumen von 316 ml Wasser wird zugesetzt, um die Reaktion zu stoppen, und der pH wird auf 7 mit 30%iger NaOH gebracht. Das depolymerisierte LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfat wird durch Präzipitation mit 3 Volumina Aceton gesättigt mit NaCl (1,896 Liter) und nachfolgender Diafiltration an Millipore TFF 1 000 D Membran bis zur Beseitigung des Salzes gewonnen.
(b) Selektive O-Sulfatierung
Die das in (a) erhaltene depolymerisierte LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfat enthaltende Lösung wird über ein Ionenaustauscherharz IR 120 H⁺ bei Raumtemperatur geführt und der pH auf 6,7 mit Pyridin gebracht. Die Lösung wird dann gefroren und einer Lyophilisierung unterworfen. Das so erhaltene Pyridinsalz (10,73 g) wird in einer 97 ml Dimethylformamid und 11 ml Methanol enthaltenden Lösung gelöst. Das Pyridinsalz des depolymerisierten LMW-epi-K5-amin-O-Übersulfats wird zugesetzt, wobei das Lösungmittel auf gleicher Temperatur von 65°C gehalten wird. Der Beginn der Reaktion wird gesehen, wenn das Lösungsmittel auf 65°C ist und ab diesem Moment startet, und die Reaktionsmischung wird auf dieser Temperatur während 2 ½ Stunden gehalten (bei Herstellung war der pH am Ende 2,24). Die Reaktionsmischung wird gekühlt unter Verwendung von Eiswasser, um ungefähr 30°C zu erreichen, und dann werden 4,5 ml Wasser zugesetzt. Die Probe wird gewonnen durch Perkolierung 5 Volumina Aceton in die Lösung und das sich bildende Präzipitat wird gewonnen durch Filtration an Gautsch G4 (guch G4). Der Filterkuchen wird mit Aceton gewaschen und dann wiederum in Wasser gelöst. Der pH wird auf 7,5 mit 2 N NaOH gebracht. Das so erhaltene 300 MHz ¹³C-NMR Spektrum des depolymerisierten LMW-K5-amin-O-sulfats ist in 1 gezeigt.
(c) 6-O-Sulfatierung
Die Lösung wird über ein IR 120 H⁺ Harz geleitet und mit einer 15%igen Lösung von Tetrabutylammoniumhydroxid neutralisiert. Das so erhaltene Salz wird lyophilisiert, um 12,34 g eines teilweise O-desulfatierten Produktes bestehend aus dem Tetrabutylammoniumsalz des obigen depolymerisierten LMW-K5-amin-O-sulfat zu ergeben. Das so erhaltene Tetrabutylammoniumsalz wird in 150 ml DMF gelöst und 14 g Pyridin·SO₃ Addukt gelöst in 75 ml DMF werden der Lösung zugesetzt. Die Reaktionsmischung wird 90 Minuten auf 0°C gehalten, worauf 110 ml Wasser zugesetzt werden, um die Reaktion zu stoppen. Der pH der Mischung am Ende der Reaktion (3.4 bei der Herstellung) wird auf 7,2 mit 2 N NaOH gebracht. Die Probe wird gewonnen durch Fällung mit 3 Volumina mit NaCl gesättigtem Aceton. Einige Tropfen von mit NaCl gesättigtem Aceton werden zur Begünstigung der Fällung zugesetzt. Ein weißes Präzipitat wird gebildet. Bei einer Herstellung wird der Vorgang zwei Mal wiederholt, um 6,8 g depolymerisiertes LMW-epi-K5-amin O-sulfat mit einem Gehalt von 80% an 6-O-sulfatiertem Glukosamin, 50% an 3-O-sulfatiertem Glukosamin, 40% an 3-O-sulfatierer Glukuronsäure und 20% an 2-O-sulfatierter Iduronsäure. Das ¹³C-NMR Spektrum ist in 2 gezeigt.
(d) N-Sulfatierung
Das am Ende der Stufe (c) erhaltene depolymerisierte LMW-epi-K5-amin-O-sulfat wird in 500 ml Wasser gelöst und 12,8 g Natriumkarbonat gelöst in 500 ml Wasser werden der Lösung zugesetzt. Der pH der Lösung nach Zugabe des Karbonats ist 10.51. Nach Halten der Lösung auf gleicher Temperatur von 40°C werden portionsweise und in 4 Stunden 12,8 g festes Pyridin·SO₃ zugesetzt. Bei der Herstellung war der endgültige pH der Lösung 7,2. Die Probe wird diafiltriert in Gegenwart von NaCl und dann mit Wasser. Es wird eine Menge von 8,0 g depolymerisiertes LMW-epi-K5-N.O-sulfat mit einem Sulfatierungsgrad von 2,83 und einem Gehalt von 95–100% an N-sulfatiertem Glukosamin, von 80% an 6-O-sulfatiertem Glukosamin, von 50% 3-O-sulfatiertem Glukosamin, von 40% an 3-O-sulaftierter Gkukuronsäure und von 20% 2-O-sulfatierter Iduronsäure erhalten. Das ¹³C-NMR Spektrum zeigt eine Verschiebung der Signale in der Zone zwischen 80 und 90 ppm, was die Sulfatierung des Kohlenstoffatoms in den 1-, 3- und 6-Stellungen des 2,5-Anhydromannitols anzeigt.
Beispiel 2
Bei einem Arbeiten wie in Beispiel 1 beschrieben wird durch Unterwerfen des in HERTSELLUNG II erhaltenen depolymerisierten LMW-K5-N-sulfats mit einem mittleren Molekulargewicht von 5 000 einer O-Übersulfatierung wie in (a), Behandeln des Pyridinsalzes des so erhaltenen LMW-epi-K5-amin-O-sulfats mit einer Mischung DMF/Methanol ungefähr 9/1 bei 70°C während 150 Minuten wie in (b), Behandeln des so erhaltenen Tetrabutylammoniumsalzes des teilweise O-sulfatierten Produkts mit Pyridin·SO₃ bei 0°C während 90 Minuten wie in (c) und schließlich Behandeln des 6-Oresulfatierten Produkts zuerst mit Natriumkarbonat und dann mit Pyridin·SO₃ wie in (d) ein depolymerisiertes LMW-epi-K5-N,O-sulfat mit einem mittleren Molekulargewicht von 5 000, einem Sulfatierungsgrad von 2,8 und einem Gehalt von 95–100% in N-sulfatiertem Glukosamin, von 85% in 6-O-sulfatiertem Glukosamin, von 48% in 3-O-sulaftiertem Glukosamin, von 38% in 3-O-sulfatierter Glukuronsäure und 20% in 2-O-Iduronsäure erhalten.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines depolymerisierten niedermolekularen epi-K5-N,O-sulfats, enthaltend 40%–60% an Iduronsäure-Einheiten, und einen Sulfatierungsgrad von 2,3 bis 2,9 aufweisend und gekennzeichnet durch die Struktur (a'),
wobei R Wasserstoff oder SO₃ ^– bedeutet, am reduzierenden Ende der Mehrzahl von dessen Ketten, wobei das Verfahren umfasst: (a) Behandlung eines ternären oder quaternären organischen Basensalzes des depolymerisierten niedermolekularen epi-K5-N-sulfats, enthaltend 40%–60% an Iduronsäure-Einheiten, erhalten durch Unterwerfen eines epi-K5-N-sulfats einer Depolymerisation mit salpetriger Säure, gefolgt von Reduktion, mit einem Sulfatierungsmittel unter O-Übersulfatierungsbedingungen, um ein depolymerisiertes niedermolekulares epi-K5-amin-O-Übersulfat zu erhalten; (b) Unterwerfen des so erhaltenen depolymerisierten niedermolekularen epi-K5-amin-O-Übersulfats einer selektiven O-DeSulfatierung, um ein depolymerisiertes niedermolekulares epi-K5-amin-O-sulfat zu erhalten; (c) Behandlung eines ternären oder quaternären organischen Basensalzes des so erhaltenen depolymerisierten niedermolekularen epi-K5-amin-O-sulfats mit einem O-Sulfatierungsmittel, um ein depolymerisiertes niedermolekulares epi-K5-amin-O-sulfat zu erhalten, welches wenigstens 80% an 6-O-Sulfat enthält; (d) Unterwerfen des so erhaltenen depolymerisierten niedermulekularen epi-K5-amin-O-sulfats, enthaltend wenigstens 80% an 6-O-Sutfat, einer N-Sulfatierungsreaktion und Isolierung des so erhaltenen depolymerisierten niedermolekularen epi-K5-N,O-sulfats.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das so erhaltene depolymerisierte niedermolekulare epi-K5-N,O-sulfat als Natriumsalz desselben isoliert wird, welches optional in ein anderes pharmazeutisch zulässiges Salz desselben umgewandelt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das andere Salz jenes ist, welches ein anderes Alkalimetall, ein Erdalkalimetall, Aluminium oder Zink aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das als Ausgangssubstanz verwendete depolymerisierte niedermolekulare epi-K5-N-sulfat erhalten wird durch Unterwerfen eines K5-N-sulfats, in beliebiger Reihenfolge, (i) einer C5-Epimerisierung mit einer D-Glucuronyl-C5-Epimerase, isoliert, gereinigt und entweder in Lösung oder auf einem festen Träger immobilisiert vorliegend, bei einem pH von ungefähr 7, bei einer Temperatur von ungefähr 30°C und für eine Zeitdauer von 12–24 Stunden in der Gegenwart von wenigstens einem zweiwertigen Ion, ausgewählt unter Kalzium, Magnesium, Barium und Mangan; und (ii) einer Depolymerisation mit salpetriger Säure, gefolgt von Reduktion, üblicherweise mit Natriumborhydrid.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das als Ausgangssubstanz verwendete depolymerisierte niedermolekulare epi-K5-N-sulfat aus Schritt (a) erhalten wird gemäß der Abfolge (i)–(ii) und welches ein mittleres Molekulargewicht von 1 500 bis 12 000 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das mittlere Molekulargewicht von 1 500 bis 7 500 reicht.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das als Ausgangssubstanz verwendete depolymerisierte niedermolekulare epi-K5-N-sulfat erhalten wird gemäß der Abfolge (ii)–(i) und ein mittleres Molekulargewicht von 4 000 bis 12 000 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht von 5 000 bis 7 500 reicht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das als Ausgangssubstanz verwendete depolymerisierte niedermolekulare epi-K5-N-sulfat aus Schritt (a) aus einem Gemisch von Ketten besteht, wobei wenigstens 90% dieser Ketten die Formel I aufweisen,
wobei 40%–60% der Uronsäure-Einheiten jene der Iduronsäure sind, n eine Ganzzahl von 2 bis 20 ist, aufweisend ein 2,5-Anhydromannitol der Struktur (a),
wobei X eine Hydroxymethylgruppe bedeutet, am reduzierenden Ende der Mehrzahl der Ketten in dem Gemisch von Ketten, und das entsprechende Kation chemisch oder pharmazeutisch zulässig ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das als Ausgangssubstanz verwendete depolymerisierte niedermolekulare epi-K5-N-sulfat aus einem Gemisch von Ketten besteht, wobei die überwiegende Spezies die Formel I'a aufweist,
wobei 40% bis 60% der Uronsäure-Einheiten jene der Iduronsäure sind, aufweisend ein 2,5-Anhydromannitol der Struktur (a),
wobei X eine Hydroxymethyl-Gruppe bedeutet, am reduzierenden Ende der Mehrzahl der Ketten in dem Gemisch von Ketten, und p eine Ganzzahl von 4 bis 8 ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, dass das als Ausgangssubstanz verwendete depolymerisierte niedermolekulare epi-K5-N-sulfat aus Schritt (a) aus einem Gemisch von Ketten besteht, wobei die überwiegende Spezies die Formel 1'b aufweist,
wobei X Hydroxymethyl ist, m 4, 5 oder 6 ist, das entsprechende Kation ein chemisch oder pharmazeutisch zulässiges Ion ist und die Glukuron- und Iduronsäure-Einheiten abwechselnd vorliegen, wobei das nicht-reduzierende Ende eine Glukuron- oder Iduronsäure-Einheit ist, mit einem Verhältnis von Glukuron-/Iduronsäure von 45/55 bis 55/45.
Depolymerisiertes niedermolekulares epi-K5-N,O-sulfat, welches erhalten werden kann nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
Depolymerisiertes niedermolekulares epi-K5-N,O-sulfat, einen Sulfatierungsgrad von 2,3 bis 2,9, ein mittleres Molekulargewicht von 1 500 bis 12 000 und, am reduzierenden Ende der Mehrzahl von dessen Ketten, die Struktur (a') aufweisend,
wobei R Wasserstoff oder SO₃ ^– bedeutet, oder ein pharmazeutisch zulässiges Salz davon.
Depolymerisiertes niedermolekulares epi-K5-N,O-sulfat nach Anspruch 13, aufweisend ein mittleres Molekulargewicht von 1 500 bis 8 000 und einen Sulfatierungsgrad von 2,5 bis 2,9.
Depolymerisiertes niedermolekulares epi-K5-N,O-sulfat nach Anspruch 14, aufweisend einen Sulfatierungsgrad von 2,7 bis 2,9.
Depolymerisiertes niedermolekulares epi-K5-N,O-sulfat nach Anspruch 20, aufweisend ein mittleres Molekulargewicht von 6 000 ± dem theoretischen Gewicht einer Disaccharid-Einheit.
Depolymerisiertes niedermolekulares epi-K5-N,O-sulfat nach einem der Ansprüche 13 bis 16, aufweisend ein mittleres Molekulargewicht von 6 000 ± dem theoretischen Gewicht einer Disaccharid-Einheit, einen Sulfatierungsgrad von 2,7 bis 2,9, einen Gehalt von 80%–95% an Glukosamin-6-O-sulfat, von 95%–100% an Glukosamin-N-sulfat, von 45%–55% an Glukosamin-3-O-sulfat, von 35%–45% an Glucuronsäure-3-O-sulfat, von 15%–25% an Iduronsäure-2-O-sulfat und am reduzierenden Ende der Mehrzahl von dessen Ketten eine Einheit (a¹) aufweisend, oder ein pharmazeutisch zulässiges Salz davon.
Depolymerisiertes niedermolekulares epi-K5-N,O-sulfat nach Anspruch 13, bestehend aus einem Gemisch von Ketten, wobei wenigstens 80% der Ketten die Formel III aufweisen,
wobei die 40%–60% der Uronsäure-Einheiten jene der Iduronsäure sind, q eine Ganzzahl von 2 bis 17 ist, R, R' und R'' Wasserstoff oder SO₃ ^– sind zu einem Sulfatierungsgrad von 2,3 bis 2,9, und das reduzierende Ende der Mehrzahl der Ketten in dem Gemisch von Ketten eine sulfatierte 2,5-Anhydromannitol-Einheit der Struktur (a¹) aufweist,
wobei R Wasserstoff oder SO₃ ^– bedeutet und das entsprechende Kation chemisch oder pharmazeutisch zulässig ist.
Depolymerisiertes niedermolekulares epi-K5-N,O-sulfat nach Anspruch 18, bestehend aus einem Gemisch von Ketten, wobei wenigstens 80% der Ketten die Formel III aufweisen, wobei q eine Ganzzahl von 2 bis 14 ist.
Depolymerisiertes niedermolekulares epi-K5-N,O-sulfat nach Anspruch 18, bestehend aus einem Gemisch von Ketten, wobei wenigstens 80% der Ketten die Formel III aufweisen, wobei q eine Ganzzahl von 2 bis 11 ist.
Depolymerisiertes niedermolekulares epi-K5-N,O-sulfat nach Anspruch 18, bestehend aus einem Gemisch von Ketten, wobei die überwiegende Spezies eine Verbindung nach Formel III ist, wobei q 8 oder 9 ist, R 45%–55% SO₃ ^– ist, R' 35%–45% SO₃ ^– in Glukuronsäure ist, R'' 15%–25% SO₃ ^– in Iduronsäure ist, zu einem Sulfatierungsgrad von 2,7 bis 2,9.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als einen Wirkstoff eine pharmakologisch wirksame Menge eines depolymerisierten niedermolekularen epi-K5-N,O-sulfats nach einem der Ansprüche 12 bis 21, oder ein pharmazeutisch zulässiges Salz davon, unter Beigabe eines pharmazeutischen Trägers.